Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

مستو التدرج نظام إنتشار المعنية بالتحقيق في الانجذاب الكيميائي في الكولاجين مصفوفة 3D

doi: 10.3791/52948 Published: June 12, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

حركة يفضل الخلايا نحو الانحدار تركيز، والمعروفة باسم الكيميائي، تلعب دورا هاما في العمليات المرضية والفسيولوجية في الجسم. هذه الأمثلة هي الجلد والغشاء المخاطي التئام الجروح 1، 2 التشكل، التهاب 3، و4،5 نمو الورم. وقد تبين أيضا أن الخلايا السرطانية يمكن أن تهاجر من خلال استراتيجيات كل من الخلية الهجرة الفردية والجماعية 6. وعلاوة على ذلك، يمكن لآليات عدم الاستقرار الأنتشارى لحث على فصل الخلايا واحد أو عنقودية من الجسم ورمي / الكائن ومن ثم يمكن أن يهاجر نحو مصدر من المواد الغذائية، وبالتالي غزو المناطق والأنسجة 7 أوسع.

وعلاوة على ذلك، فقد تبين أن آليات الهجرة المتنوعة يمكن أن تكون نشطة في 2D و 3D في، وذلك بسبب الأدوار المختلفة للجزيئات الالتصاق 8. لذلك، خطوة إلى أهمية من الناحية الفسيولوجية في فحوصات المختبر للتحقيق في الحركة خلية في measureablه وسيلة بسيطة غير ذات أهمية في فهم حركة الخلية الظواهر 9. لسوء الحظ، وصعوبة في تحليل الهجرة الخليوي، وفحص شامل الكيميائي الكمي وعادة ما يتطلب طريقة شاقة طويلة، تقوم على قياس حركية الخلية والظواهر النقل نماذج محايدة.

وتشمل النهج التجريبية الماضية للتحقيق الكيميائي خلية الغرفة بويدن 10 وتحت الفحص الاغاروز 11. ومع ذلك، في هذه المقايسات في وقت مبكر، والتجارب الهجرة الخلية لم ترصد الحركة في احترام لآخر. أكثر من ذلك، الأهم من ذلك، التدرجات تركيز المستخدمة في التجارب لم تكن واضحة المعالم أو مفهومة تماما مع الحفاظ فقط إشارات لمدة لا تتجاوز بضع ساعة. وعلاوة على ذلك، الكيميائي في وقت مبكر محاولات غرفة تقييد الهجرة الخلية على بعدين، ولم تسمح لأحد لمراقبة حركية الهجرة 12. أبحث في غرفة بويدن، وهو فحص نقطة النهايةلن يسمح للباحث لمراقبة الهجرة بصريا، ولا يمكن التفريق مباشرة الكيميائي (حركة الاتجاه) من تنشيط كيميائي (حركة عشوائية). بالإضافة إلى ذلك، العديد من المتغيرات على الاختلافات في حجم المسام وسمك الأغشية جعل غرفة صعبة للغاية لتتكاثر بسهولة وأخفى رد فعل المهاجرين من الخلايا لكيموكينات 13،14.

مع الفهم الجديد من على microfluidics، وقد تم التحقيق غرف جديدة والأجهزة الدقيقة كأداة لتحقيق تنقل الخلية تحت ظروف تدفق فراغي أو الكيميائي 15،16. في ظل هذه الأجهزة الجديدة، أدخلت مقاييس خلية جديدة والتحقيق، مثل تأثير إجهاد القص على خلية 17،18. للأسف، غرف الكيميائي ميكروفلويديك السابقة والحالية دراسات الهجرة خلية تقتصر على ركائز و2D نكسة مهمة لأن العديد من العمليات البيولوجية، بما في ذلك غزو الخلايا السرطانية وورم خبيث، والتراسل الفوريهجرة الخلايا المناعية، تنطوي الهجرة 3D.

حل جاذب كيميائي في اتصال مع هلام 3D التي تحتوي على الخلايا كما تم ذكر فيها غرف للمراقبة المباشرة أيضا 19،20. هذه الدوائر واثنين من مقصورات، واحدة تحتوي على جاذب كيميائي واحدة تحتوي على الخلايا، وانضم بجانب بعضها البعض أفقيا 21 أو حلقات متحدة المركز 22. وأشار هذه النظم في الاتجاه الصحيح، ولكن لا تبقي نظام الكيميائي لفترة طويلة من الزمن.

وعلاوة على ذلك، درس الباحثون أيضا انتشارية من خلال الأغشية الكولاجين في خلايا غسيل الكلى، فضلا عن انتشار جزيئات التتبع من خلال عينات الكولاجين تعرض لضغط الهيدروستاتيكي 23-25. بعض التجارب نشر في المواد الهلامية الكولاجين تعتمد على التعديلات الفيزيائية والكيميائية للالجل باستخدام المجالات المغناطيسية والتأسيس الكيماوية 26. وهناك طريقة شعبية لنمذجة الانتشارية في أعناقالأنسجة genous تعتمد على التصوير مضان المستمر نقطة photobleaching من. وقد كشفت هذه الطريقة تباين في معاملات نشر من الجزيئات في الأنسجة الكولاجينية المنحى. بعد، وقد استخدمت photobleaching من في الغضروف المفصلي وليس الكولاجين المصفوفات. في حين ما شابه ذلك، يجب أن تتم التجارب النمذجة اللازمة من خلال فهم على وجه التحديد معامل انتشار المواد الهلامية الكولاجين. الأهم من ذلك أن الأنظمة لا تستخدم وسيلة لقياس الجيل قوة الخلية.

للأسف، يبدو أن معظم الأنظمة ليكون في عداد المفقودين واحد أو اثنين من العناصر الرئيسية للنظام مثالي: والسماح للتتبع الخلية، فهم نشرها التدرج مع عامل الكيميائي من خلال مصفوفة، مجموعة بسيطة نسبيا حتى مع سهولة استنساخ، والتقليل من التفاعلات خلية خلية، والقدرة على قياس وحدة الأبعاد لالكمي (أي السرعة، القوة، وتركيز معين). Moghe وآخرون. 27 اقترح نظاما الوفاء معظم هذه المتطلبات في الخلايا التي فرقت البداية في جميع أنحاء هلام بدلا من ركز على سطح المرشح، ولكن كان من الصعب قياس القوى التي تولد الخلية.

لهذا الغرض، نقدم نظام مستو التدرج نشرها للتحقيق الكيميائي في الكولاجين مصفوفة 3D، الذي يسمح احد للتغلب على القيود غرفة نشر الحديثة للفحوصات الحالية، التي تقوم على أساس الوقت الفاصل بين المجهري، إلى جانب تقنيات تحليل الصور لقياس الخلية القوات في بيئة 3D. يوفر هذا البروتوكول وسيلة بسيطة، لكنها مبتكرة لخلق 3D بسيطة نشرها الغرفة التي يمكن استخدامها لتحقيق الكيميائي 3D في خلايا مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. 3D قالب تصميم وأجزاء

  1. قالب
    1. قبل العمل، الحصول على عدة سيليكون المطاط الصناعي، وغرفة التصوير الخلية الحية، وكوب 22 ملم ساترة، وتشكيله المعادن مكعب مع أبعاد 10.07 مم × 3.95 مم × 5.99 ملم. إعداد الحية غرفة التصوير الخلية صب من خلال وضع ساترة في حامل القاع، وتجميع ما تبقى من الغرفة وفقا لتوجيهات من قبل البائع.
    2. المقبل، وذلك باستخدام ملقط، ضع تشكيله مكعب معدن الألمنيوم في وسط الحي التصوير الخلية غرفة السكن وعلى رأس ساترة، ثم توضع جانبا.
    3. مزيج حلول المطاط الصناعي السيليكون وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لجعل 5 مل من المطاط الصناعي.
    4. باستخدام مختبر ملعقة المتاح، صب سيليكون حل المطاط الصناعي في العيش التصوير الخلية إعداد غرفة وضمان عدم نقل ضعت تشكيله مكعب معدن الألمنيوم. وضع النظام على مقاعد البدلاء المختبر في موقع آمن O / N لعلاج.
    5. في صباح اليوم التالي، تفكيكغرفة التصوير الخلية الحية، على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة وسحب العفن باستخدام الملقط. باستخدام ملقط، استخراج بعناية تشكيله مكعب معدن الألمنيوم من العفن. الذهاب إلى الحوض وشطف القالب بالماء منزوع الأيونات. وضع القالب على منشفة ورقية لتجف.
    6. الجاف مرة واحدة، وذلك باستخدام سكين فائدة هواية، وقطع الشقوق من خلال القالب، متباعدة 2.34 مم وبصرف النظر عن كل نهاية الطولية، داخل القالب السيليكون. ضمان إقامة العفن في مكان آمن وجاف حتى كنت على استعداد لبناء نظام للتجربة.
  2. مع الماء والزجاج مسعور إعداد Coverslips
    1. للسماح للمصفوفة الكولاجين التمسك السطح، وخلق coverslips ماء:
      1. باستخدام ماصة القابل للتصرف، وقياس من 150 ميكرولتر من 3 أمينو-trimethoxysilane وتصب حل في أنبوب 50 مل. إضافة 30 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى أنبوب 50 مل مع ماصة المتاح الثانية وإغلاق الغطاء. دوامة الحل لمدة 2 دقيقة، وضمان خلط كاملة. Pالحل لدينا في طبق بتري الزجاج ويوضع جانبا.
      2. صب 15 مل من 100٪ الكحول الإيثيلي في طبق بيتري الثاني ويوضع جانبا (تأكد من تسمية الأطباق).
      3. باستخدام ماصة المتاح جديدة، وقياس من 30 مل من الماء منزوع الأيونات وتصب حل في أنبوب 50 مل. المقبل، وذلك باستخدام مقياس ماصة للتصرف جديد من 1875 ميكرولتر من غلوتارالدهيد وتصب الحل في نفس أنبوب 50 مل وإغلاق الغطاء. دوامة الحل لمدة 2 دقيقة، وضمان خلط كاملة. صب الخليط في طبق بيتري الثالث، ويوضع جانبا.
      4. باستخدام ملقط، واخراج واحد 22 ملم الزجاج جولة ساترة وشطف كلا الجانبين مع 100٪ خليط من الإيثانول باستخدام ماصة المتاح.
      5. وضع تشطف ساترة الزجاج إلى 3-أمينو-trimethoxysilane مع 30 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ طبق الحل والسماح للجلوس في حل لمدة 5 دقائق.
      6. بالملقط، واخراج الزجاج ساترة وشطف مرة أخرى مع 100٪ من محلول الإيثانول مع ماصة المتاح.
      7. إسقاط تشطف ساترة الزجاج في 1875ميكرولتر من غلوتارالدهيد و 30 مل من خليط الماء منزوع الأيونات ويوضع جانبا لمدة 30 دقيقة.
      8. بعد 30 دقيقة، وإزالة الزجاج ساترة مع ملقط وشطف مع الماء منزوع الأيونات ومكان على O الأنسجة الجافة / N لتجف في RT.
      9. تكرار غمس ساترة ونقل عن العديد من coverslips حسب الحاجة مع حلول لدت نفسها.
    2. جعل coverslips مسعور بواسطة بروتوكول معين.
      1. إضافة 500 ميكرولتر من tridecafluoro-1،1،2،2-tetrahydrooctyl، 100 ميكرولتر من حمض الخليك و 19.4 مل من الهكسان في أنبوب 50 مل ودوامة لمدة 2 دقيقة. صب الحل في الزجاج طبق بتري وتوضع جانبا.
      2. باستخدام ملقط نظيفة، واخراج واحدة ساترة الزجاج وتسقط في تحضير محلول مختلط لمدة 2 دقيقة. بعد مرور 2 دقيقة، واخراج الزجاج ساترة مع ملقط وشطف مع الماء منزوع الأيونات باستخدام المتاح ماصة ومكان ساترة O الأنسجة الجافة / N لتجف في RT. متجر ساترة في أطباق بتري بلاستيكية حتى استخدامها.
      3. كرر ساترة DIPPجي والتحرك لأكبر عدد ممكن من coverslips حسب الحاجة مع حلول لدت نفسها.

الجمعية 2. القالب

  1. قبل استخدام القوالب، وذلك باستخدام ماصة المتاح شطف القالب مع 90٪ ايثيل الكحول أكثر من حاوية النفايات الكيميائية. بعد ذلك، وضع القالب في طبق بيتري مملوءة بالماء منزوع الأيونات والسماح للجلوس O / N.
  2. تأخذ قالب من الحل باستخدام ملقط ومكان على منشفة على الهواء الجاف قبل بدء التجمع العفن.
  3. في حين أن العفن هو تجفيف الهواء، وقطع لل coverslips ماء مربع الى قسمين المستطيلات أكبر قليلا من 3.95 مم × 5.99 مم باستخدام أداة يخدش الماس عالية الدقة. حرك كل ساترة قطع مستطيل في فتحات قطع في قالب السيليكون.
  4. الوجه العفن رأسا على عقب وتطبيق الشحوم فراغ على طول الجزء السفلي من القالب السيليكون باستخدام ماصة المتاح. المقبل، والوجه العفن الظهر من الناحية اليمنى فوق واضغط على الجزء السفلي من العفن على دائرية يغطي الزجاج ماءالشفاه لإنشاء ختم.
  5. مع القفازات القابل للتصرف، والتقاط العفن تجميعها ووضعها في طبق بتري المتاح ومن ثم إلى غطاء محرك السيارة الحيوي. تشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية الحيوية غطاء محرك السيارة لمدة 1 ساعة لتعقيم العفن قبل حدوث التجريب.

3. الكولاجين الخلطات و مصفوفة 3D

  1. قبل إعداد مزيج الكولاجين، وصمة عار، وإعداد الخلايا لتصوير وفقا لبروتوكولات القياسية 28.
  2. باستخدام التقنيات المخبرية المعيارية والبروتوكولات 29،30، في القلنسوة الحيوية، مزيج سائل الاعلام الخلية وجاذب كيميائي في أنبوب 15 مل إلى تركيز جاذب كيميائي المطلوب. ماصة 5 مل من خلية حل معين وسائل الإعلام جاذب كيميائي التركيز في أنبوب 15 مل ونقل الحل في حمام الماء الساخن.
  3. باستخدام ماصة، استخراج 5 مل من وسائل الاعلام الخلايا عادلة في الثانية أنبوب 15 مل ومكان في حمام الماء الساخن لتسخين حل للتجارب المجهري.
  4. في القلنسوة الحيوي، ماصة 30 ميكرولتر من 10X العازلة الفوسفاتإد حل (PBS) في أنبوب الطرد المركزي الجزئي. إضافة 6 ميكرولتر من 1 هيدروكسيد الصوديوم N (هيدروكسيد الصوديوم) في نفس أنبوب الطرد المركزي الصغيرة ودوامة لمدة 15 ثانية.
  5. الحصول على الكولاجين أنا حل ذيل فأر من الثلاجة والانتقال إلى غطاء محرك السيارة الحيوي باستخدام التقنيات المخبرية المعيارية والبروتوكولات 29. ضمان الكولاجين لا يزال باردا. ماصة 168.3 ميكرولتر من الكولاجين في نفس أنبوب الطرد المركزي الجزئي.
  6. المقبل، إضافة 18 ميكرولتر من المجهرية المعدلة الكربوكسيل الفلورسنت الأصفر والأخضر باستخدام ماصة لنفس أنبوب الطرد المركزي الجزئي. دوامة أنبوب الطرد المركزي الجزئي مع جميع الحلول لمدة 30 ثانية.
  7. إضافة 77.7 ميكرولتر من المطلوب خليط الخلية خلية الإعلام (حوالي 2 × 10 6 خلية / مل تركيز) إلى أنبوب الطرد المركزي الصغيرة وتخلط باستخدام ماصة لمدة 20 ثانية. عند الضرورة، تغيير كثافة مصفوفة باتباع الخليط الكولاجين مخصص تكييفها لإضافة الخرز الفلورسنت والجدول بقاء الخلية (الجدول 1).
  8. ماصة 300 & #181؛ ل من مزيج خلايا الكولاجين في مركز جيد (جيد # 2) من التجمع قالب استعداد. وضع القالب على طبق بتري المتاح ونقلها إلى الحاضنة القياسية لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  9. إزالة النظام من الحاضنة والمكان مرة أخرى إلى الحيوي غطاء محرك السيارة. باستخدام ملقط، إزالة كل زلات غطاء مسعور من قبل تحامل على الجزء العلوي من كل ساترة وسحب ما يصل، وبعيدا عن القالب.
  10. نقل النظام برمته إلى المجهر المطلوبة وصورة للتأكد من الجانبين الكولاجين العفن لا تزال على التوالي للسماح التدرج مستو نشرها.
  11. مع نظام لا يزال تحت المجهر، وذلك باستخدام 100 ميكرولتر على قناة واحدة ماصة، إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الاعلام الخلية إلى جانب # 1. المقبل، وذلك باستخدام 100 ميكرولتر على قناة واحدة ماصة إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الاعلام الخلية مع تركيز جاذب كيميائي المطلوب في بئر رقم 3.
  12. على الفور بعد إضافة الحلول في كلا البئرين، بدء التصوير.

4. التصوير وإنتشارتصميم

  1. إذا كان أحد يريد أن يجد معامل الانتشار لكثافة الكولاجين محددة لحساب تركيز محدد، اتبع بروتوكول أدناه:
    1. متابعة بروتوكول معين بعنوان فوق "الكولاجين الخلطات و مصفوفة 3D"، بدلا من توليد وسائل الاعلام الخلية مع تركيز جاذب كيميائي المطلوب، وجعل رودامين 5 ميكرومتر في أنبوب 15 مل باستخدام العمليات الحسابية والبروتوكولات 30 القياسية.
    2. صورة مصفوفات الكولاجين 3D مع نظام متحد البؤر التي شنت على مجهر مقلوب باستخدام الليزر الأرجون (488 نانومتر) لالتقاط مضان. صورة كل 2 أو 3 ثانية لمدة تصل إلى 7 ساعات.
  2. لإنتشار النمذجة: استخدام نموذج رياضي هو مبين أدناه، وكتابة رمز البرنامج الحاسوبي لمعالجة وتحليل هذه الخطوات العامة.
    المعادلة 1
    1. استيراد الصور إلى برنامج حاسوبي لإعادة قياس وتطبيع كتبها أقصى intenSITY. تحويل الصور إلى اللون الرمادي اللون خريطة الصورة لتحديد الحافة. اختيار محور على طول وسط الصورة، إلى يمين الوسط ويسار الوسط.
    2. باستخدام رمز البرنامج الحسابي، رسم كثافة طبيعية، جنبا إلى جنب مع كثافة الحقيقية والفرق بينهما.
    3. المقبلة، وإدخال المعلمات الضرورية للتركيب (تركيز، والوقت، وطول).
    4. رسم تركيز تطبيع مقابل الوقت وبيان التركيز عبر محور س مع نوبة متعدد الحدود على البيانات.
    5. حساب معامل الانتشار باستخدام شفرة برمجية الحسابية.

5. القياسات التجريبية

  1. وبالعودة إلى معادلة الانتشار، إعادة كتابة المعادلة للعثور على تركيز معين في أي مكان داخل النظام كما هو مبين في أدناه.
    المعادلة 2
    أين:
    L = طول عشرالبريد الكولاجين مصفوفة
    س = الموقع قيد التحقيق
    D = معامل الانتشار
    ر = الوقت المنقضي
  2. خلال التجارب الكيميائي، وضمان لتسجيل وقت محدد أن chemokine اللحظة التي تم إضافتها إلى النظام. مرة واحدة يتم العثور على حركة الهجرة الخلية، وضمان لتسجيل متحد البؤر تسجيل مرور الزمن، ولاحظ في الوقت المحدد والمكان من حافة حيث وقعت التصوير.
  3. خلال تحليل البيانات، والمكونات وأشار انقضى الوقت والمكان ومعامل الانتشار للخلية معينة في المعادلة للعثور على تركيز معين تطبيع في أي نقطة داخل الكولاجين لكلا نشر والتجارب الخلية.

6. تتبع هجرة الخلايا الاستفادة TFM

  1. لتتبع هجرة الخلايا باستخدام تقنيات TFM / DVC اتباع البروتوكول التالي:
    1. بعد إضافة تركيز جاذب كيميائي المطلوب في بئر رقم 3، بدء التصوير المصفوفات الكولاجين 3D مع نظام متحد البؤر التي شنت على ميكر مقلوبoscope للعثور على خلية للتحقيق.
    2. مرة واحدة تم العثور على خلية تتحرك، وضع الخلية في منتصف مجال الرؤية والاستفادة من محرك كهربائي ضغطي (للصورة في محور ض)، وصورة كل 1 أو 2 دقيقة.
    3. لحساب جيل قوة الخلية وتشوه، وتوليد رمز الحسابية للعثور على النزوح من الخرز مضان بعد بروتوكولات TFM / DVC 31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

قدرة هذا الاختبار إلى تقييم دقيق للهجرة الخلية تعتمد على الإعداد الجيد للنظام. لذا، فمن الأهمية بمكان للتأكد من تصميم القالب نظام نشر بدقة وعناية كبيرة في وضع coverslips على حد سواء مسعور وماء، كما هو موضح في الشكل رقم 1. إذا تم تصميم النظام بشكل صحيح وخلال مرحلة نمذجة انتشار ضمان لإيجاد جدا حسن خط البداية الخطي، واحد قادر على تحقيق طيفة تتفلور الصور، كما هو مبين في الشكل 2، لتحليل نشر النظام.

المفتاح لتحليل الكيميائي خلية الناجح هو نمذجة انتشار وحل معادلة الانتشار العامة للعثور على معامل نشر ومعادلة تركيز محددة من خلال الشفرة التي تم إنشاؤها البرمجيات الحاسوبية. بعد استيراد الصور في البرنامج الحاسوبي وتشغيل تحليل (الشكل 3)، ومعامل الانتشاريمكن تقييمها (الجدول 2). ويمثل الشكل 4 قطع من نشر رودامين من خلال تركيزات الكولاجين اختبار خمسة. أشكال المؤامرة نشر تطابق الشكل التقليدي للنموذج الانتشار الخطي. ويمكن أن نرى أن نشر رودامين يتناسب عكسيا مع تركيز الكولاجين وانخفاض كثافة الكولاجين وأسرع نشر. هذا أمر متوقع، وهذا التركيز من الكولاجين لديه المسامية العالية. خطوط أفقية في مؤامرة الكولاجين نشر بتركيز 1.5 ملغ / مل (الشكل 4B) هي ببساطة نتيجة لأكثر من تشبع إشارة التتبع. الأهم من ذلك، كما هو مبين في الشكل (4) كل سطر يمثل نقطة محددة (X، Y) داخل الكولاجين، لحين الوقت يزيد من تركيز تطبيع أبدا يتجاوز النقطة السابقة في نفس الوقت (DT)، مما يدل على عدم انعكاس للمادة الكيميائية. هذا هو سمة هامة من تشيغرفة motaxis للسماح بتدفق المباشر للجاذب كيميائي دون التدفق العكسي.

عن طريق فحص عشر صور مشاركة في كل مكان العاشر، واحد قادر على توليد مؤامرة لتركيز ثابت للدولة من رودامين في كل موقع من المواقع. ومن خلال استقراء عبر كامل طول العينة (الشكل 5)، يمكن للمرء أن ننظر إلى مجمل العينة. هذا يدل على أن الانحدار الخطي نشر متناسقة عبر طول عينة بأكمله، والتي يمكن استخدامها لاجراء تجارب الخلية (الشكل 6).

الشكل 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لمستو التدرج نشرها التجمع قالب النظام في حي غرفة التصوير الخلية (1) A التسليم الكمبيوتر من نظام متكامل يتكون من (من أسفل إلى أعلى) السكن السفلي (ج) ماء 22 مم ساترة والعفن، و. السكن العلوي، والغطاء الزجاجي. (2) أبعاد مو وترد دينار حيث (أ) قطع ملحقة. (3) مقلب مع الكولاجين مصفوفة مع (ب) انخفضت coverslips مسعور على كل جانب في خفض إدراج لإنشاء نظام 3-جيدا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2: مثال على الصور رودامين المجهري في الكولاجين صور الممثل اتخذت خلال رودامين التجارب نشرها، في نفس المكان ض محور، في نظام نشر مستو التدرج مع 1.0 ملغ / مل تركيز الكولاجين. شريط النطاق = 500 ميكرون حيث (ع) 0 دقيقة (ب) 3 دقيقة (ج) 7 دقائق، و (د) 15 دقيقة بعد رودامين أضيف إلى الغرفة. السهم يشير إلى اتجاه نشر رودامين من خلال مصفوفة الكولاجين.e.com/files/ftp_upload/52948/52948fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: مثال على التحليل وملخص الحسابات نشرها التي تم إنشاؤها بواسطة رمز البرنامج الحاسوبي مع 2.5 ملغ / مل تركيز الكولاجين (A) تقديم أبيض وأسود من الأولية (DT = 0) الصور التي يتم تحميلها إلى البرامج الحسابية للتحليل. (B) نقاط محددة يختارها المستخدم للمقارنة كثافة وللحسابات نشرها (X، Y محاور هي بالبكسل). (C) لمحة إنتشار رودامين في جميع أنحاء مصفوفة الكولاجين حيث يرتبط كل سطر إلى نقطة حمراء في الصورة B. (D) لمحة تركيز رودامين في جميع أنحاء مصفوفة الكولاجين في حالة مستقرة. (E) مقارنة بين البيانات ممهدة (بلوالبريد نقطة) والبيانات الحقيقية من تجربة نشر (النقطة الحمراء) مع الفرق بين ممهدة وحقيقية (نقطة خضراء). (F) تركيز تطبيع الحقيقية (النقطة الحمراء) وتركيبها (نقطة خضراء) البيانات من رمز البرنامج الحاسوبي في كافة مراحل التجربة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الشكل 4: مثال على الملف الشخصي نشرها من خلال مصفوفة الكولاجين باستخدام التدرج نظام نشر مستو في نقاط مختلفة تشير كل سطر مختلف نقاط البيانات المحددة اختياره من رمز البرنامج الحاسوبي من قبل المستخدم. مصفوفة الكولاجين في كثافة (A) 1.0 ملغ / مل (B) 1.5 ملغ / مل (C) 2.0 ملغ / مل (D) 2.2 ملغ / مل و (E رونغ>) 2.5 ملغ / مل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5: مثال على تركيز (تطبيع) لمحة من رودامين في جميع أنحاء مصفوفة الكولاجين باستخدام التدرج نظام نشر مستو في حالة استقرار الدوائر هي نقاط البيانات المحددة التي اختيرت على الرغم من أن رمز البرنامج الحاسوبي من قبل المستخدم. إنشاء خط أحمر باستخدام نقاط البيانات واستقراء أفضل خط مناسبا (مع R 2 القيمة المعروضة) لإظهار تركيز رودامين في جميع أنحاء مصفوفة الكولاجين بأكملها. مصفوفة الكولاجين في كثافة (A) 1.0 ملغ / مل (B) 1.5 ملغ / مل (C) 2.0 ملغ / مل (D) 2.2 ملغ / مل و (E) 2.5 ملغ / مل. 2948fig5large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6: مثال لتجارب الهجرة الخلية A Z-شريحة صورة المجهر من العدلات المهاجرة في النظام مستو التدرج 3D. العدلات يهاجر نحو التدرج جاذب كيميائي (السهم الأبيض يصور اتجاه الانحدار ويظهر مثلث الشخصي تركيزه)، حيث تشير نجمة الموقف المبدئي من الخلية عند بداية التجربة. معارض حبكة فرعية خلية في الفضاء 3D، حيث يشير السهم القادم الاتجاه الوقت نقطة. = شريط نطاق 10 ميكرون. دينارا = 5 دقائق بين الصور (أي، AB). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

نانوغرام = "0">
الكولاجين كثافة الخلية PBS حبات الفلورسنت هيدروكسيد الصوديوم أنا الكولاجين ذيل الجرذ وسائل الإعلام
2.5 ملغ / مل 10٪ 70.20٪ 11.80٪
2.2 ملغ / مل 10٪ 61.70٪ 20.30٪
2.0 ملغ / مل 10٪ 56.10٪ 25.90٪
1.5 ملغ / مل 10٪ 42.10٪ 39.90٪
1.0 ملغ / مل 10٪ 28.10٪ 53.90٪

الجدول 1: عرف جخليط ollagen تكييفها لإضافة الخرز الفلورسنت وبقاء الخلية.

تركيز جل الكولاجين معامل إنتشار (سم 2 / ثانية)
2.5 ملغ / مل 1.03 × 10 -6 ± 2.54 × 10 -7
2.2 ملغ / مل 1،28 × 10 -6 ± 3.53 × 10 -7
2.0 ملغ / مل 6.48 × 10 -6 ± 1.66 × 10 -7
1.5 ملغ / مل 1.05 × 10 -5 ± 2.04 × 10 -7
1.0 ملغ / مل 1.39 × 10 -5 ± 1.06 × 10 -7
ماء 1.50 × 10 -5

الجدول 2: معاملات نشرها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الخطوات الأكثر أهمية للتجارب الناجحة نشر مع أو بدون الخلايا هي: إعداد بشكل صحيح تصل الجمعية العفن. تطوير ما يلزم من البراعة اليدوية لمنع الضرر أثناء استخراج coverslips مسعور. ضمان للعثور على خط الانطلاق خطي جيد جدا لحساب معامل الانتشار بشكل صحيح؛ تصحيح الحسابات التجريبية من كل من الكولاجين وجاذب كيميائي. استخدام صحيح للنظام تصوير الخلايا الحية لضمان مصفوفة لا تجف. والحفاظ على عقيمة، ثقافة صحية.

عند إجراء التجارب نشرها، لا بد من التأكد من المؤامرات نشر تطابق الأشكال التقليدية للنموذج الانتشار الخطي (الشكل 4).

تشغيل التحليل في عدة مختلفة X-المواقع على كل عينة، فمن الممكن لحساب متوسط ​​معامل الانتشار لرودامين في تركيزات مختلفة من الكولاجين، كما ورد في تا بلي 2. وهذه النتائج متسقة مع السابق البحوث معامل الانتشار من خلال انخفاض جل الكولاجين كما انخفض تركيز الكولاجين يرجع إلى زيادة المسامية في المصفوفة.

وفقا للمعادلة نموذج نشرها في حالة مستقرة، يتوقع المرء الحصول على صورة تركيز الخطي عبر قيم س. من المناسب دالة خطية إلى نقطة يمكن للمرء أن يرى أنهم جميعا، في الواقع، خطي. وكانت قيمة R 2 من تركيب خط الاتجاه الطولي لكل من أفضل خطوط يصلح لتركيزات الكولاجين ثلاثة عند أو فوق 0.92. كانت قواعد المخلفات في جميع المؤامرات استقراء 0.0227، مما يدل على حسن صالح. هذه العلاقة الخطية هي بالاتفاق مع الحل التحليلي. لا يبدأ تركيز 100٪، كما هو متوقع، وذلك لأن التصوير لم يبدأ مباشرة على حافة العينة الكولاجين. كما أنه من المستحيل لمعايرة تماما التصوير.

_content "> بالإضافة إلى ذلك، كنا قادرين على الرجوع غيرها من الأوراق التي بدت في الانتشار في المواد الهلامية لمقارنة النتائج. وجدت شينوي وروزنبلات معامل انتشار BSA (نصف قطرها = 4 نانومتر) في 30 ملغ / مل حل الكولاجين succinylated إلى 2.2 س 10 -7 سم 2 / ثانية (32). في دائرة نصف قطرها من رودامين هو 0،78 نانومتر، وهو ما يفسر أسرع وقت الانتشار من خلال الكولاجين 24. وفي دراسات نشرها، ومن الشائع أن الاستفادة من دائرة نصف قطرها لمقارنة الجزيئات. كما يزيد نصف قطرها، والوزن الجزيئي يزيد أيضا. رامانوجان وآخرون. وجدت معامل انتشار ديكستران (نصف قطرها = 6 نانومتر) في بلمرة 20٪ والمواد الهلامية الكولاجين (ما يعادل 2.0 ملغ / مل تركيز المواد الهلامية) إلى 4.72 × 10 -8 سم 2 / ثانية 24 مرة أخرى، هذا هو مماثل لمعامل الانتشار لاحظنا عن 2.0 ملغ / مل جل تركيز (D = 1.28 × 10 -6 سم 2 / ثانية)، إذا أخذنا بعين الاعتبار اختلاف حجم الجزيء. Leddy وGuilak عشيقالعبوات الناسفة نشر dextrans من خلال الغضروف المفصلي 33. فمن الممكن أن يقارن نشرها من خلال مصفوفات الكولاجين وخلال الغضروف المفصلي لحوالي ثلثي كتلة الغضروف المفصلي هو الكولاجين البوليمر (نوع يغلب II). Leddy وGuilak جدت معامل الانتشار من 3 كيلو دالتون ديكستران من خلال الغضروف المفصلي أن تكون بين 6-10 × 10 -7 سم 2 / ثانية 33. مع العلم أن النظام يعمل بشكل صحيح كنا قادرين بعد ذلك على حساب تركيز معين في أي مكان داخل النظام، وذلك باستخدام سن منشار ونظام عابر نقل الحرارة النماذج. هذا المقياس إضافية يمكن استخدامها خلال التجارب خلية لتتبع فهم خلية التركيز والتدرج المنحدر.

المدة الزمنية من التجارب قد تكون عاملا مقيدا عند استخدام نهجنا. وبالتالي، فمن المهم استخدام غطاء للنظام تصوير الخلايا الحية لضمان المصفوفة لا تجف. باستخدام غطاء خلال التجربهالخبر، كنا قادرين على مراقبة بنجاح نشر رودامين تصل إلى 7 ساعة و 4 ساعة خلال التجارب الخلية دون هلام تجفيف. إذا كان أحد لا تستخدم غطاء، وهلام قد تجف بشكل أسرع وتؤثر تأثيرا كبيرا على نشرها وهجرة الخلايا.

بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم نموذج مستو نشر / نظام جيد للرقابة لتكون قادرة على قياس قوى الخلايا في بيئة 3D خلال الكيميائي. هنا نقدم نظام بسيط وضعت حديثا التي يمكن استخدامها لاجراء تجارب TFM / DVC. باستخدام هذا النظام، فإن الباحثين أن يكون قادرا على: 1) نشر النموذج بنجاح من خلال مصفوفات الكولاجين 3D والتحقق، من خلال تركيب البيانات إلى التعبير التحليلي، أن نظام نشر مستو التدرج، عندما المصنف مع الخلايا، أن تعزز الكيميائي وعدم تنشيط كيميائي. 2) حساب معامل الانتشار لالكولاجين من خمسة تركيزات مختلفة؛ و3) العثور على تركيز معين من جاذب كيميائي في دي بنجاحffusion الغرفة. مع هذا النهج، يمكن للمرء أن مواصلة دراسة الكيميائي الخلية مع مقاييس محددة ليس من السهل ومتاحة بسهولة دون النهج شاقة من أنظمة متعددة الأوجه والتدرجات نشر المعقدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicone elastomer kit Dow Corning Corp 182 SIL ELAST KIT .5KG a two-part misture with a 10:1 mix
Live cell imaging chamber Live Cell Instrument CM-B18-1 CMB for 18 mm round coverslips
22 mm Glass Coverslip Fisher Scientific NC0180281 Neuvitro Corp. cover slip 22 mm 1.5
Machined aluminum metal cube
Hobby utility knife X-Acto X3201
3-(aminopropyl) trimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778-5ML
Glutaraldehyde Polysciences, Inc 00216A-10 Glutaraldehyde, EM Grade, 8%
50 ml tube Fisher Scientific 14-432-22 Standard floor model and tabletop centrifuges
Glass Petri dish Fisher Scientific 08-747A Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15 mm)
Forceps Fisher Scientific 22-327-379 Fine Point Forceps
Cover glasses Fisher Scientific 12-518-105A Rectangle; 30 x 22 mm; Thickness No. 1
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl Gelest SIT8174.0
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099 Acetic acid ACS reagent, ≥99.7%
Hexane Sigma-Aldrich 296090 anhydrous, 95%
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 200 proof, for molecular biology
High-precision diamond scribing tool Lunzer PV-081-3 Straight extended tip scribe, .020" (.50 mm) diameter by .200" (5.0 mm) tip length
Vacuum grease Dow Corning 14-635-5C High-Vacuum Grease
15 ml tube Fisher Scientific 14-959-49D 15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface
10x phosphate buffered solution Fisher Scientific BP399-500 1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer
1 N sodium hydroxide Sigma-Aldrich 38215 Sodium hydroxide concentrate
Collagen I, rat tail BD Biosciences 354236 Rat tail 
Micro centrifuge tube Fisher Scientific 02-681-332 Volume: 2.0 ml;
O.D. x L: 13 x 40 mm;
sterile; single-wrapped
Name Company Catalog Number Comments
Carboxylate-modified microspheres Invitrogen  F-8813 Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids
Rhodamine Sigma-Aldrich 83689 Rhodamine B for fluorescence

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adzick, N. S. The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair. Ann Surg. 225, (2), 236 (1997).
  2. Reddi, A. H. Bone morphogenetic proteins: an unconventional approach to isolation of first mammalian morphogens. Cytokine Growth F. R. 8, (1), 11-20 (1997).
  3. Coussens, , Werb, Z, L. M., Werb, Z. Inflammation and cancer. Nature. 420, (6917), 860-867 (2002).
  4. Vital-Lopez, F. G., Armaou, A., Hutnik, M., Maranas, C. D. Modeling the effect of chemotaxis on glioblastoma tumor progression. AIChE J. 57, (3), 778-792 (2011).
  5. Hughes-Alford, S. K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of gradient sensing: towards building predictive models of chemotaxis in cancer. Curr. Opin. Cell Biol. 24, (2), 284-291 (2012).
  6. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat. Rev. Mol Cell Bio. 10, (7), 445-457 (2009).
  7. Cristini, V. Morphologic Instability and Cancer Invasion. Clin. Cancer Res. 11, (19), 6772-6779 (2005).
  8. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453, (7191), 51-55 (2008).
  9. Parent, C. A., Devreotes, P. N. A cell's sense of direction. Science. 284, (5415), 765-770 (1999).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  11. Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, (6), 1650-1656 (1975).
  12. Rosoff, W. J., McAllister, R., Esrick, M. A., Goodhill, G. J., Urbach, J. S. Generating controlled molecular gradients in 3D gels. Biotechnol. Bioeng. 91, (6), 754-759 (2005).
  13. Wells, A., Kassis, J., Solava, J., Turner, T., Lauffenburger, D. A. Growth factor-induced cell motility in tumor invasion. Acta Oncol. 41, (2), 124-130 (2002).
  14. Wilkinson, P. C. Assays of leukocyte locomotion and chemotaxis. J. Immunol. Methods. 216, (1-2), 139-153 (1998).
  15. Bonvin, C., Overney, J., Shieh, A. C., Dixon, J. B., Swartz, M. A. A multichamber fluidic device for 3D cultures under interstitial flow with live imaging: development, characterization, and applications. Biotechnol. Bioeng. 105, (5), 982-991 (2010).
  16. Noo, L. J., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, (8), 826-830 (2002).
  17. Shao, J., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab Chip. 9, (21), 3118-3125 (2009).
  18. Haessler, U., Kalinin, Y., Swartz, M. A., Wu, M. An agarose-based microfluidic platform with a gradient buffer for 3D chemotaxis studies. Biomed. Microdevices. 11, (4), 827-835 (2009).
  19. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat. Rev. Cancer. 3, (5), 362-374 (2003).
  20. Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol. Biol. 769, 149-165 (2011).
  21. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J. Cell Biol. 75, (2 Pt 1), 606-616 (1977).
  22. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J. Cell. Sci. 99, (Pt 4), 769-775 (1991).
  23. Gilbert, D. L. Macromolecular diffusion through collagen membranes. Int. J. Pharm. 47, (1-3), 79-88 (1988).
  24. Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys. J. 83, (3), 1650-1660 (2002).
  25. Weadock, K., Silver, F. H., Wolff, D. Diffusivity of 125I-calmodulin through collagen membranes: effect of source concentration and membrane swelling ratio. Biomaterials. 7, (4), 263-267 (1986).
  26. Erikson, A., Andersen, H. N., Naess, S. N., Sikorski, P., Davies, C. dL. Physical and chemical modifications of collagen gels: impact on diffusion. Biopolymers. 89, (2), 135-143 (2008).
  27. Moghe, P. V., Nelson, R. D., Tranquillo, R. T. Cytokine-stimulated chemotaxis of human neutrophils in a 3-D conjoined fibrin gel assay. J. Immunol. Methods. 180, (2), 193-211 (1995).
  28. Sundd, P., et al. Live cell imaging of paxillin in rolling neutrophils by dual-color quantitative dynamic footprinting. Microcirculation. 18, (5), 361-372 (2011).
  29. Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors. J. Vis. Exp. (63), 2754 (2012).
  30. Stephenson, F. H. Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory 2e. Elsevier Science. (2010).
  31. Bar-Kochba, E., Toyjanova, J., Andrews, E., Kim, K., Franck, C. A Fast Iterative Digital Volume Correlation Algorithm for Large Deformations. Exp. Mech. In press, (2014).
  32. Shenoy, V., Rosenblatt, J. Diffusion of Macromolecules in Collagen and Hyaluronic Acid, Rigid-Rod-Flexible Polymer Composite Matrixes. Macromolecules. 28, (26), 8751-8758 (1995).
  33. Leddy, H., Guilak, F. Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching. Ann. Biomed. Eng. 31, (7), 753-760 (2003).
مستو التدرج نظام إنتشار المعنية بالتحقيق في الانجذاب الكيميائي في الكولاجين مصفوفة 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stout, D. A., Toyjanova, J., Franck, C. Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (100), e52948, doi:10.3791/52948 (2015).More

Stout, D. A., Toyjanova, J., Franck, C. Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (100), e52948, doi:10.3791/52948 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter