Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Planar Gradient Diffusion System Chemotaxis onderzoeken in een 3D collageenmatrix

doi: 10.3791/52948 Published: June 12, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De geprefereerde beweging van cellen naar een concentratiegradiënt, bekend als chemotaxis, speelt een belangrijke rol bij pathologische en fysiologische processen in het lichaam. Dergelijke voorbeelden zijn huid en slijmvliezen wondgenezing 1, morfogenese 2, 3 ontsteking en tumorgroei 4,5. Ook is aangetoond dat kankercellen kunnen migreren door zowel individuele als collectieve cel migratiestrategieën 6. Bovendien kan instabiliteit diffusie mechanismen scheiding van enkele of geclusterde cellen van een tumor die / object induceren en dan kan immigratie naar een bron van voedingsstoffen en dus binnendringen grotere gebieden en weefsels 7.

Bovendien is aangetoond dat diverse migratiemechanismen actief kunnen zijn in 2D en 3D, vanwege verschillende rollen van adhesiemoleculen 8. Daarom is een verhuizing naar fysiologisch relevante in vitro assays om celbeweeglijkheid te onderzoeken in een measureable en eenvoudige manier van belang is bij het ​​begrijpen van de cel beweging verschijnselen 9. Helaas, de moeilijkheid bij het analyseren van celmigratie, een uitgebreide kwantificeerbare chemotaxis assay vereist meestal een lange moeizame methode, gebaseerd op de meting van onpartijdig celmotiliteit en transport verschijnselen modellen.

Past experimentele benaderingen naar cel chemotaxis onderzoeken onder meer de Boyden kamer 10 en de onder agaroseanalyse 11. Echter, in deze vroege assays, celmigratie experimenten niet de beweging met betrekking tot tijd te controleren. More, belangrijker, de concentratie gradiënten voor de experimenten waren niet goed gedefinieerd of volledig begrepen terwijl slechts het behoud van de signalering niet meer dan een paar uur. Bovendien vroeg chemotaxis kamer pogingen beperkt cel migratie naar twee dimensies en niet toestaan ​​dat de ene naar de kinetiek van migratie 12 bewaken. Kijkend naar de Boyden kamer, een eindpunt assayzou niet toestaan ​​dat de onderzoeker migratie visueel observeren en kon niet direct onderscheid chemotaxis (directionele beweging) van chemokinesis (random beweging). Bovendien zijn een aantal variabelen-verschillen in de porie grootte en dikte van de membranen-maakte de kamer zeer moeilijk om gemakkelijk te reproduceren en verborgen de migrant reactie van cellen om chemokines 13,14.

Met het nieuwe begrip van microfluidics, hebben nieuwe kamers en micro-apparaten onderzocht als een instrument om mobiele motoriek onder interstitiële stroom omstandigheden te onderzoeken of chemotaxis 15,16. Onder deze nieuwe apparaten, werden nieuwe cel metrics geïntroduceerd en onderzocht, zoals het effect van shear stress op een mobiele 17,18. Helaas, het verleden en de huidige microfluïdische chemotaxis kamers beperkt studies van de cel migratie naar 2D-substraten een belangrijke tegenslag omdat veel biologische processen, met inbegrip van de tumorcel invasie en metastase, en immune celmigratie, betrekken 3D migratie.

Directe observatie-kamers waar chemoattractant oplossing in contact met een 3D gel met cellen zijn eveneens ook gemeld 19,20. Deze kamers hebben twee compartimenten, een met een chemoattractant en één bevattende cellen zijn verbonden naast elkaar horizontaal 21 of concentrische ringen 22. Deze systemen worden aangegeven in de juiste richting, maar geen chemotaxis systeem houdt gedurende langere tijd.

Daarnaast hebben onderzoekers ook onderzocht door middel van diffusie collageenmembranen in dialyse-cellen, alsook de diffusie van tracer moleculen door collageen monsters onderworpen aan hydrostatische druk 23-25. Sommige diffusie experimenten collageen gels afhankelijk fysische en chemische modificaties van de gel met behulp van magnetische velden en chemische incorporatie 26. Een populaire methode voor het modelleren van diffusiviteit in collaGenous weefsels gebaseerd op de fluorescentie beeldvorming van continue punt fotobleken. Deze werkwijze is geopenbaard anisotropie in de diffusie coëfficiënten van macromoleculen in georiënteerde collagene weefsels. Toch is fotobleken gebruikt in gewrichtskraakbeen en niet-collageen matrices. Terwijl soortgelijke dienen de nodige modelleren experimenten doorgevoerd specifiek begrip van de diffusiecoëfficiënt van collageen gels. Wat nog belangrijker is, zijn de systemen niet een methode voor het meten van mobiele troepenmacht benutten.

Helaas zijn de meeste systemen lijken te ontbreken een of twee belangrijkste elementen voor een ideaal systeem: het toestaan ​​van cell tracking, een diffusie gradiënt begrip met een chemotactische factor door de matrix, een relatief eenvoudige set-up met een gemak van de reproduceerbaarheid, het minimaliseren van cel-cel interacties, en het vermogen om dimensionele eenheden voor het kwantificeren (bijvoorbeeld snelheid, kracht, specifieke concentratie) te meten. Møghe et al. 27 voorgesteld een systeem dat de meeste van deze eisen waarbij cellen oorspronkelijk werden gedispergeerd door de gel in plaats gericht op het filteroppervlak voldaan, maar was moeilijk krachten die de cel genereert meten.

Hiervoor presenteren we een vlakke gradiënt diffusiesysteem chemotaxis onderzoeken 3D collageenmatrix, waarmee men moderne diffusiekamer beperkingen van bestaande assays, die is gebaseerd op time-lapse microscopie, samen met beeldanalyse technieken om cellen te meten overwinnen krachten in een 3D-omgeving. Dit protocol is een eenvoudige, maar innovatieve manier om een ​​eenvoudige 3D diffusiekamer die kunnen worden gebruikt om 3D chemotaxis in verschillende cellen te onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. 3D-Mold ontwerp en Onderdelen

  1. Schimmel
    1. Voor het werken, het verkrijgen van een siliconenelastomeer kit, een live-cell imaging kamer, een 22 mm glazen dekglaasje en een bewerkte aluminium metalen kubus met afmetingen 10,07 mm x 3,95 mm x 5,99 mm. Bereid de live cell imaging kamer te vormen door het plaatsen van het dekglaasje in de onderste houder en monteren van de rest van de kamer overeenkomstig de door de leverancier.
    2. Vervolgens, met behulp van een tang, plaatst u de bewerkte aluminium kubus in het midden van het live-cell imaging kamer huisvesting en op de top van het dekglaasje, en stel vervolgens opzij.
    3. Meng siliconenelastomeer oplossingen volgens het protocol van de fabrikant tot 5 ml van elastomeer te maken.
    4. Met behulp van een wegwerp lab spatel, giet siliconenelastomeer oplossing in live cell imaging kamer Setup en niet geplaatst gefreesd aluminium metalen kubus bewegen. Plaats het systeem op het lab bank, op een veilige plaats O / N voor het genezen.
    5. De volgende ochtend, deconstruerende live-cell imaging kamer, zoals aanbevolen door de fabrikant en trek mal met behulp van een tang. Met behulp van een tang, voorzichtig pak het bewerkte aluminium metalen kubus van schimmels. Ga naar de gootsteen en spoel de mal met gedemineraliseerd water. Plaats de vorm op keukenpapier gedroogd.
    6. Eenmaal droog, met een hobby mes, snijd spleten door de schimmel, afstand van 2,34 mm van elkaar langseinde, binnen de siliconen mal. Zorg ervoor dat de mal blijft op een veilige en droge plaats tot u klaar bent om het systeem te bouwen voor een experiment zijn.
  2. Hydrofiele en hydrofobe dekglaasjes Bereiding
    1. Om de collageen matrix te hechten aan een oppervlak hydrofiel maakt dekglaasjes:
      1. Met behulp van een wegwerp pipet, te meten uit 150 ul van 3-aminopropyl-trimethoxysilaan en giet oplossing in een 50 ml buis. Voeg 30 ml 100% ethanol aan de 50 ml buis met een tweede wegwerppipet en sluit het deksel. Vortex de oplossing gedurende 2 minuten, zodat een volledige menging. Ponze oplossing in een glazen petrischaal en zet apart.
      2. Giet 15 ml van 100% ethylalcohol in een tweede petrischaal en zet opzij (zorg ervoor om gerechten te labelen).
      3. Met behulp van een nieuwe disposable pipet, te meten uit 30 ml gedemineraliseerd water en giet oplossing in een 50 ml buis. Dan worden op een nieuwe wegwerpbare pipet handeling uit 1875 gl glutaaraldehyde en giet oplossing in dezelfde 50 ml buis en sluit het deksel. Vortex de oplossing gedurende 2 minuten, zodat een volledige menging. Giet het mengsel in de derde petrischaal, en zet apart.
      4. Met behulp van een tang, neem een ​​22 mm ronde glazen dekglaasje en spoel beide kanten met 100% ethanol mengsel met behulp van een wegwerp pipet.
      5. Plaats gespoeld glazen dekglaasje in 3-aminopropyl-trimethoxysilaan met 30 ml 100% ethanol oplossing schaal en laat zitten in oplossing gedurende 5 min.
      6. Met een pincet, neem glas dekglaasje en spoel opnieuw met 100% ethanol-oplossing met wegwerp pipet.
      7. Drop gespoeld glas dekglaasje in 1875pl glutaaraldehyde en 30 ml gedeïoniseerd water mengsel en laat gedurende 30 min.
      8. Na 30 minuten, verwijder glazen dekglaasje met een pincet en spoelen met gedeïoniseerd water en plaats op droge tissue O / N drogen bij kamertemperatuur.
      9. Herhaal dekglaasje dompelen en bewegen voor zoveel als nodig dekglaasjes met dezelfde gegenereerde oplossingen.
    2. Maak hydrofobe dekglaasjes door het gegeven protocol.
      1. Voeg 500 ul van tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl, 100 gl azijnzuur en 19,4 ml hexaan in een 50 ml buis en vortex gedurende 2 min. Giet oplossing in een glazen petrischaal en zet apart.
      2. Met behulp van schone tang, neem een ​​glas dekglaasje en neerzetten in bereide gemengde oplossing gedurende 2 minuten. Na 2 minuten zijn verstreken, neem glas dekglaasje met een pincet en spoelen met gedemineraliseerd water met behulp van een wegwerp pipet en plaats dekglaasje op het droge tissue O / N drogen bij kamertemperatuur. WINKEL dekglaasje in plastic Petrischalen tot gebruik.
      3. Herhaal dekglaasje DIPPing en bewegen voor zoveel als nodig dekglaasjes met dezelfde gegenereerde oplossingen.

2. vormstelsel

  1. Voor het gebruik van mallen, met behulp van een wegwerp pipet spoel de mal met 90% ethylalcohol over een chemisch afval container. Vervolgens plaatst de vorm in een petrischaal gevuld met gedemineraliseerd water en laten zitten O / N.
  2. Neem de schimmel uit de oplossing met behulp van een tang en leg ze op een handdoek aan de lucht drogen voordat u de vormstelsel.
  3. Terwijl de mal is de lucht drogen, snijd het plein hydrofiele dekglaasjes in twee rechthoeken iets groter dan 3,95 mm x 5,99 mm met een hoge precisie-diamant schrijvende tool. Schuif elke snede rechthoek dekglaasje in de sleuven gesneden in de siliconen mal.
  4. Draai de mal ondersteboven en breng vacuüm vet langs de bodem van de siliconen mal met een wegwerpbare pipet. Vervolgens, draai de mal rechts achter-kant naar boven en druk op de bodem van de vorm op de cirkelvormige hydrofiele glas coverslip een afdichting.
  5. Met wegwerphandschoenen, pak de samengestelde mal en plaats in een wegwerp petrischaal en vervolgens in een bio-kap. Schakel UV Bio-kap lamp voor 1 uur te steriliseren de mal voordat experimenten optreedt.

3. Collageen mengsel en 3D Matrix

  1. Voor het bereiden van het mengsel collageen, kleurstof en cellen te bereiden voor beeldvorming volgens standaardprotocollen 28.
  2. Met behulp van standaard laboratoriumtechnieken en protocollen 29,30, in een bio-kap, meng cel media en chemoattractant in een 15 ml buis chemoattractant gewenste concentratie. Pipetteer 5 ml specifieke celmedium-chemoattraetantconcentratie oplossing in een 15 ml buisje en zet de oplossing in een verwarmd waterbad.
  3. Met behulp van een pipet, extract 5 ml van alleen mobiele media in een tweede 15 ml buis en plaats in een verwarmd waterbad op te warmen de oplossing voor microscopie experimenten.
  4. In een bio-kap, pipet 30 ui 10X fosfaatbuffered oplossing (PBS) in microcentrifuge buis. Voeg 6 pi van 1 N natriumhydroxide (NaOH) in dezelfde micro centrifugebuis en vortex gedurende 15 seconden.
  5. Verkrijgen van collageen I staart rat oplossing uit de koelkast en te verplaatsen naar de bio-kap met behulp van standaard laboratoriumtechnieken en protocollen 29. Zorg ervoor dat het collageen nog koud is. Pipet 168.3 ul van collageen in dezelfde micro centrifugebuis.
  6. Voeg vervolgens 18 ul van geel-groen fluorescent-carboxylaat gemodificeerde microsferen met een pipet aan dezelfde micro-centrifugebuis. Vortex de microcentrifuge buis met alle oplossingen voor 30 sec.
  7. Voeg 77,7 ul van gewenste cel media-cel-mengsel (ongeveer 2 x 10 6 cellen / ml concentratie) in micro centrifugebuis toe en meng met een pipet tip voor 20 sec. Zonodig weg matrixdichtheid door de aangepaste collageen mengsel aangepast aan de toevoeging van fluorescerende kralen en cellevensvatbaarheid tabel (Tabel 1).
  8. Pipetteer 300 & #181; l van collageen-cel mengsel in het centrum goed (goed # 2) van de bereide vormstelsel. Plaats de vorm op een wegwerp petrischaaltje verplaatsen in een standaard incubator gedurende 20 minuten bij 37 ° C met 5% CO 2.
  9. Verwijder het systeem uit incubator en plaats terug in de bio-kap. Behulp van een tang, verwijder beide hydrofobe dekglaasjes door klemmen op de bovenkant van elk dekglaasje en trekken omhoog en van de matrijs.
  10. Verplaats het hele systeem om de gewenste microscopie en image te zorgen collageen schimmel kanten zijn nog steeds rechtstreeks naar zorgen voor een vlakke diffusie verloop.
  11. Met het systeem nog onder de microscoop, telkens met 100 ul enkel-kanaals pipet, voeg 100 pl celmedium in well 1. Vervolgens, telkens met 100 gl enkelkanaals pipet voeg 100 pl celmedium met chemoattractant gewenste concentratie in well 3.
  12. Onmiddellijk na het toevoegen van oplossingen in zowel putjes begonnen imaging.

4. Imaging en DiffusionModellering

  1. Als men wil de diffusiecoëfficiënt voor de specifieke collageen dichtheid aan de specifieke concentratie te berekenen vinden, volg dan de onderstaande protocol:
    1. Volg de gegeven protocol bovenstaande titel "Collageen mengsel en 3D Matrix," in plaats van het genereren van mobiele media met chemoattractant gewenste concentratie, maken 5 uM rhodamine in een 15 ml buis met behulp van standaard berekeningen en protocollen 30.
    2. Afbeelding 3D collageen matrices met een confocale gemonteerd op een omgekeerde microscoop met een argon laser (488 nm) om de fluorescentie te vangen. Afbeelding elke 2 of 3 seconden tot 7 uur.
  2. Voor Diffusion Modeling: Het gebruik van het wiskundige model hieronder weergegeven, schrijven computational software code voor de verwerking en analyse van deze algemene stappen.
    Vergelijking 1
    1. Importeer afbeeldingen in computational software voor herschalen en het normaliseren van de maximale Intendiversiteit. Zet beelden naar een grijze kleur-kaart van het beeld om de rand te selecteren. Kies een as langs het midden van de afbeelding, rechts van het midden en links van het midden.
    2. De computationele softwarecode, trek de genormaliseerde intensiteit samen met de werkelijke intensiteit en het verschil tussen de twee.
    3. Vervolgens, het invoeren van de parameters die nodig zijn voor de montage (concentratie, tijd en lengte).
    4. Zet de genormaliseerde concentratie versus tijd en concentratieprofiel over de x-as met de kromme aan de gegevens.
    5. Bereken de coëfficiënt van diffusie met behulp van de computationele softwarecode.

5. Experimentele Metingen

  1. Terugverwijzend naar de diffusievergelijking, herschrijven van de vergelijking om de specifieke concentratie vinden op iedere plaats binnen het systeem als getoond in onderstaande.
    Vergelijking 2
    Waar:
    L = lengte van the collageenmatrix
    x = locatie in onderzoek
    D = coëfficiënt van diffusie
    t = verstreken tijd
  2. Tijdens chemotaxis experimenten zorgen voor de specifieke tijd dat moment chemokine toegevoegd aan het systeem op te nemen. Zodra celmigratie beweging wordt gevonden, ervoor te zorgen dat confocale time-lapse-opname op te nemen en noteer de specifieke tijd en locatie van de rand waar de beeldvorming voorgedaan.
  3. Tijdens data-analyse, sluit de bekende verstreken tijd, plaats en diffusie coëfficiënt voor de specifieke cel in de vergelijking met de genormaliseerde specifieke concentratie op enig punt in het collageen voor zowel diffusie celexperimenten vinden.

6. Tracking Cell Migratie Gebruik makend van TFM

  1. Om celmigratie volgen met behulp van TFM / DVC technieken Volg de onderstaande protocol:
    1. Na toevoeging van chemoattractant gewenste concentratie in well 3, start de 3D beeldvorming van collageen matrices met een confocale gemonteerd op een omgekeerde microscope te vinden een cel te onderzoeken.
    2. Zodra een bewegende cel wordt gevonden, plaatst de cel in het midden van het gezichtsveld en gebruiken een piëzo-elektrische motor (om de afbeelding in de z-as), het elke 1 of 2 min.
    3. Voor de berekening van de cel troepenmacht en vervorming, het genereren van een computationeel code om de verplaatsingen van de fluorescentie kralen na de TFM / DVC protocollen 31 te vinden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het vermogen van de test om de migratie van de cellen nauwkeurig te beoordelen vertrouwt op een goede opzet van het systeem. Daarom is het essentieel voor zorgen dat het diffusiesysteem matrijs nauwkeurig ontwerpen en grote zorg in het plaatsen van hydrofobe en hydrofiele dekglaasjes, zie figuur 1. Als het systeem goed ontworpen en tijdens de diffusie modelleringsfase zorgen voor een voorbeeld goede lineaire startlijn, men in staat fijn bereiken fluoresceert beelden, zoals weergegeven in figuur 2, voor het analyseren van diffusie van het systeem.

De sleutel tot een succesvolle cel chemotaxis analyse is het modelleren van de verspreiding en het oplossen van de algemene diffusie vergelijking met de coëfficiënt van diffusie en specifieke concentratie vergelijking vinden via een computational software gegenereerde code. Na het importeren van de beelden in computational software en lopende analyse (figuur 3), de coëfficiënt van diffusiekan worden bepaald (tabel 2). Figuur 4 geeft de plots van de verspreiding van rhodamine door de vijf geteste concentraties collageen. De vormen van de diffusie plot overeenkomen met de traditionele vorm van een lineair verspreidingsmodel. Te zien is dat diffusie van rhodamine is omgekeerd evenredig met de concentratie van collageen-lager de collageendichtheid hoe sneller de diffusie. Dit is te verwachten, aangezien deze concentratie van collageen een hogere porositeit. De horizontale lijnen in de grafiek diffusie collageen in een concentratie van 1,5 mg / ml (Figuur 4B) is louter het gevolg van oververzadiging van de tracer signaal. Belangrijker, zie figuur 4 elke lijn een specifiek punt (x, y) in het collageen om terwijl doorlooptijd van de genormaliseerde concentratie nooit hoger dan het vorige punt tegelijkertijd (dt), aangeeft dat er geen omkering van de chemische stof. Dit is een belangrijk kenmerk van een chemotaxis kamer om directe stroom van een chemoattractant zonder terugstroom mogelijk te maken.

Door onderzoek van de laatste tien beelden op elke locatie x, men in staat een grafiek van de steady-state concentratie van rhodamine genereren op elk van de locaties. Door extrapoleren over de gehele monsterlengte (figuur 5), kan men kijken naar het gehele monster. Dit betekent dat de lineaire diffusiegradiënt consistent over de gehele lengte sample, die kunnen worden gebruikt voor celexperimenten (figuur 6).

Figuur 1
Figuur 1: Een schematische vlakke gradiënt diffusiesysteem malsamenstelling in live cell imaging kamer (1) Een computer vertolking van het volledig systeem zijn (van beneden naar boven) een onderste behuizing (c) een hydrofiel 22 mm dekglaasje, schimmel. top behuizing en een glazen afdekplaat. (2) Afmetingen van mo ld indien (a) afgesneden inserts worden getoond. (3) Mold met collageen matrix met (b) hydrofoob dekglaasjes aan elke kant geschoven in de uitsparing inzetstukken aan de 3-goed systeem te creëren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Voorbeeld van rhodamine microscopiebeelden collageen Representatieve beelden die tijdens rhodamine diffusie experimenten op dezelfde locatie z-as, in de vlakke gradiënt diffusie systeem met een 1,0 mg / ml collageen concentratie.. Schaal bar = 500 urn waarbij (a) 0 min (b) 3 min (c) 7 min, en (d) 15 minuten na rhodamine werd toegevoegd aan kamer. De pijl geeft de richting van de diffusie van rhodamine door de collageen matrix.e.com/files/ftp_upload/52948/52948fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3:. Voorbeeld van analyse en samenvatting van diffusie berekeningen gegenereerd door computational software code met een 2,5 mg / ml collageen concentratie (A) Zwart-wit rendering afbeelding initiële (dt = 0) van geüpload naar computationele software voor analyse. (B) Specifieke punten gekozen door de gebruiker voor de intensiteit vergelijking en voor diffusie berekeningen (x, y-as in pixels). (C) Diffusion profiel van rhodamine gedurende het collageen matrix, waar elke lijn correleert met een rode punt in afbeelding B. (D) Concentratie profiel van rhodamine gedurende de collageen matrix in steady-state. (E) Vergelijking tussen de gladgestreken data (blue dot) en echte gegevens van diffusie experiment (rode stip) met een verschil tussen de afgevlakte en ware (groene stip). (F) genormaliseerde concentratie van waar (rode stip) en voorzien van (groene stip) gegevens van computational software code gedurende het experiment. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4:. Voorbeeld diffusieprofiel tot collageenmatrix met de vlakke gradiënt diffusiesysteem op verschillende punten Elke lijn geeft een andere geselecteerde gegevenspunten gekozen uit de rekenkundige softwarecode van de gebruiker. Collageen matrix met een dichtheid van (A) 1,0 mg / ml (B) 1,5 mg / ml (C) 2,0 mg / ml (D) 2,2 mg / ml en (E rong>) 2,5 mg / ml. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5:. Voorbeeld van een concentratie (genormaliseerd) profiel van rhodamine gehele collageenmatrix met de vlakke gradiënt diffusiesysteem bij steady-state cirkels specifieke gegevenspunten hoewel de rekenkundige softwarecode gekozen door de gebruiker. Rode lijn gebouwd met behulp van gegevens punten en het extrapoleren van de beste line-fit (R 2 waarde getoond) rhodamine concentratie in de hele collageenmatrix tonen. Collageen matrix met een dichtheid van (A) 1,0 mg / ml (B) 1,5 mg / ml (C) 2,0 mg / ml (D) 2,2 mg / ml en (E) 2,5 mg / ml.2948fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6
Een Z-slice microscoop beeld van een neutrofielen migreren in de 3D ​​vlakke gradiëntsysteem Voorbeeld van celmigratie experimenten: Figuur 6.. Neutrofiel migreert naar de chemoattractant gradiënt (witte pijl geeft de richting van verloop en de driehoek geeft het concentratieprofiel), waarbij de ster geeft de uitgangspositie van de cel aan het begin van het experiment. Subplot toont cel in 3D-ruimte, waar de pijl geeft de volgende keer punt richting. Scale bar = 10 micrometer. dt = 5 min tussen de beelden (dwz, AB). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Collageen celdichtheid PBS Fluorescerende kralen NaOH Collageen I Rat Tail Media
2,5 mg / ml 10% 6% 2% 70.20% 11.80%
2,2 mg / ml 10% 6% 2% 61.70% 20.30%
2,0 mg / ml 10% 6% 2% 56.10% 25.90%
1,5 mg / ml 10% 6% 2% 42.10% 39.90%
1,0 mg / ml 10% 6% 2% 28.10% 53.90%

Tabel 1: Custom collagen mengsel aangepast aan de toevoeging van fluorescerende kralen en cellevensvatbaarheid.

Concentratie van collageengel Coëfficiënt van Diffusion (cm2 / sec)
2,5 mg / ml 1,03 x 10 -6 ± 2.54 x 10 -7
2,2 mg / ml 1,28 x 10 -6 ± 3.53 x 10 -7
2,0 mg / ml 6,48 x 10 -6 ± 1,66 x 10 -7
1,5 mg / ml 1.05 x 10 -5 ± 2.04 x 10 -7
1,0 mg / ml 1.39 x 10 -5 ± 1.06 x 10 -7
Water 1.50 x 10 -5

Tabel 2: Coëfficiënten van diffusie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De meest kritische stappen voor een succesvolle diffusie experimenten met of zonder cellen zijn: juist het opzetten van de mal vergadering; ontwikkeling van de benodigde handigheid om schade tijdens de extractie van hydrofobe dekglaasjes voorkomen; zorgen voor een zeer goede lineair startlijn te kunnen berekenen van de diffusiecoëfficiënt vinden; experimentele berekeningen van zowel collageen en chemoattractant corrigeren; correct gebruik van live cell imaging systeem om matrix zorgen niet uitdroogt; en onderhouden van een steriele, gezonde kweek.

Bij het ​​uitvoeren van diffusie experimenten, is het noodzakelijk te zorgen dat de diffusie plots overeenkomt met de traditionele vorm van een lineair verspreidingsmodel (figuur 4).

Het uitvoeren van de analyse op verschillende x-locaties op elk monster, kan men de gemiddelde coëfficiënten van verstrooiing voor rhodamine in de verschillende concentraties collageen, zoals gerapporteerd in Ta ble 2. Deze resultaten zijn consistent met eerder onderzoek-coëfficiënt van diffusie door de collageengel af naarmate de concentratie van collageen afgenomen door een toename van de poreusheid van de matrix.

Volgens de verspreiding modelvergelijking bij steady state, verwacht men een lineaire concentratie profiel over de x-waarden hebben. Door toepassing van een lineaire functie van de punten kan men zien dat ze allemaal in feite lineair. De R2 waarde van het monteren van een lineaire trend lijn voor elk van de best passende lijn voor de drie collageen concentraties op of boven 0,92. De normen van de residuen in alle geëxtrapoleerd percelen waren 0,0227, wat wijst op een goede pasvorm. Deze lineaire relatie is in overeenstemming met de analytische oplossing. De concentratie begint niet bij 100%, zoals te verwachten, omdat de weergave niet direct begint aan de rand van het collageen monster. Het is ook onmogelijk om perfect te kalibreren imaging.

_content "> Daarnaast konden wij verwijzen naar andere documenten die beschouwd diffusie in gels resultaten te kunnen vergelijken. Shenoy en Rosenblatt vond de diffusiecoëfficiënt van BSA (radius = 4 nm) in een 30 mg / ml gesuccinileerde collageenoplossing zijn 2,2 x 10 -7 2 cm / sec 32. De straal van rhodamine is 0,78 nm, die zijn snellere diffusietijd uitgelegd met collageen 24. In diffusie studies, is het gebruikelijk om de straal te vergelijken moleculen te gebruiken. Als de radius toeneemt, het molecuulgewicht Ook verhoogt. Ramanujan et al. vonden de diffusiecoëfficiënt van dextran (radius = 6 nm) in gepolymeriseerde 20% collageen gels (equivalent van 2,0 mg / ml concentratie gels) om 4,72 x 10 -8 2 cm / sec 24. Wederom Dit is vergelijkbaar met de diffusiecoëfficiënt we waargenomen voor de 2,0 mg / ml concentratie gel (D = 1,28 x 10 -6 cm 2 / sec), als we rekening houden met de molecuulgrootte verschil. Leddy en Guilak studied de verspreiding van dextranen door middel van gewrichtskraakbeen 33. Het is mogelijk om diffusie te vergelijken met collageen matrices en door het kraakbeen omdat ongeveer tweederde van de massa van articulair kraakbeen polymere collageen (voornamelijk type II). Leddy en Guilak vond de diffusiecoëfficiënt van 3 kDa dextran door middel van gewrichtskraakbeen te zijn tussen de 6-10 x 10 -7 cm 2/33 sec. Wetende dat het systeem werkt goed we waren dan in staat om de specifieke concentratie overal te berekenen binnen het systeem, met zaagtand en voorbijgaande systeem warmteoverdracht modellen. Deze extra metric kan worden gebruikt tijdens de cel experimenten tot cel-concentratie begrip en gradiënt helling volgen.

Tijdsduur van experimenten kan een beperkende factor zijn bij het gebruik van onze aanpak. Daarom is het belangrijk om een ​​bedekking te gebruiken voor de live cell imaging systeem om de matrix te garanderen niet uitdroogt. Met behulp van een deksel tijdens Experiments, konden we succesvol volgen de diffusie van rhodamine tot 7 uur en 4 uur bij celexperimenten zonder gel opdrogen. Als men geen cover gebruik maakt, kan de gel drogen sneller en significante invloed op de verspreiding en migratie van cellen.

De hierin beschreven protocol gebruikt een goed gecontroleerde planaire diffusie model / systeem kunnen cellen krachten in een 3D-omgeving te meten tijdens chemotaxis. Hier presenteren we een nieuw ontwikkeld eenvoudig systeem dat kan worden gebruikt voor TFM / DVC experimenten. Met dit systeem wordt de onderzoekers in staat om: 1) succesvol model diffusie door 3D collageenmatrices en controleren, door het aanbrengen van de data analytische uitdrukking, dat de vlakke gradiënt diffusiesysteem, na enting met cellen moeten chemotaxis en niet chemokinesis bevorderen; 2) het berekenen van de coëfficiënt van diffusie voor collageen van vijf verschillende concentraties; en 3) met succes de specifieke concentratie van de chemoattractant binnen de di vindenffusion kamer. Met deze benadert, kan men nader te onderzoeken cel chemotaxis specifieke metrics niet gemakkelijk en direct beschikbaar zonder de moeizame aanpak van veelzijdige en complexe diffusie gradiënten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicone elastomer kit Dow Corning Corp 182 SIL ELAST KIT .5KG a two-part misture with a 10:1 mix
Live cell imaging chamber Live Cell Instrument CM-B18-1 CMB for 18 mm round coverslips
22 mm Glass Coverslip Fisher Scientific NC0180281 Neuvitro Corp. cover slip 22 mm 1.5
Machined aluminum metal cube
Hobby utility knife X-Acto X3201
3-(aminopropyl) trimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778-5ML
Glutaraldehyde Polysciences, Inc 00216A-10 Glutaraldehyde, EM Grade, 8%
50 ml tube Fisher Scientific 14-432-22 Standard floor model and tabletop centrifuges
Glass Petri dish Fisher Scientific 08-747A Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15 mm)
Forceps Fisher Scientific 22-327-379 Fine Point Forceps
Cover glasses Fisher Scientific 12-518-105A Rectangle; 30 x 22 mm; Thickness No. 1
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl Gelest SIT8174.0
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099 Acetic acid ACS reagent, ≥99.7%
Hexane Sigma-Aldrich 296090 anhydrous, 95%
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 200 proof, for molecular biology
High-precision diamond scribing tool Lunzer PV-081-3 Straight extended tip scribe, .020" (.50 mm) diameter by .200" (5.0 mm) tip length
Vacuum grease Dow Corning 14-635-5C High-Vacuum Grease
15 ml tube Fisher Scientific 14-959-49D 15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface
10x phosphate buffered solution Fisher Scientific BP399-500 1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer
1 N sodium hydroxide Sigma-Aldrich 38215 Sodium hydroxide concentrate
Collagen I, rat tail BD Biosciences 354236 Rat tail 
Micro centrifuge tube Fisher Scientific 02-681-332 Volume: 2.0 ml;
O.D. x L: 13 x 40 mm;
sterile; single-wrapped
Name Company Catalog Number Comments
Carboxylate-modified microspheres Invitrogen  F-8813 Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids
Rhodamine Sigma-Aldrich 83689 Rhodamine B for fluorescence

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adzick, N. S. The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair. Ann Surg. 225, (2), 236 (1997).
  2. Reddi, A. H. Bone morphogenetic proteins: an unconventional approach to isolation of first mammalian morphogens. Cytokine Growth F. R. 8, (1), 11-20 (1997).
  3. Coussens, , Werb, Z, L. M., Werb, Z. Inflammation and cancer. Nature. 420, (6917), 860-867 (2002).
  4. Vital-Lopez, F. G., Armaou, A., Hutnik, M., Maranas, C. D. Modeling the effect of chemotaxis on glioblastoma tumor progression. AIChE J. 57, (3), 778-792 (2011).
  5. Hughes-Alford, S. K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of gradient sensing: towards building predictive models of chemotaxis in cancer. Curr. Opin. Cell Biol. 24, (2), 284-291 (2012).
  6. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat. Rev. Mol Cell Bio. 10, (7), 445-457 (2009).
  7. Cristini, V. Morphologic Instability and Cancer Invasion. Clin. Cancer Res. 11, (19), 6772-6779 (2005).
  8. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453, (7191), 51-55 (2008).
  9. Parent, C. A., Devreotes, P. N. A cell's sense of direction. Science. 284, (5415), 765-770 (1999).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  11. Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, (6), 1650-1656 (1975).
  12. Rosoff, W. J., McAllister, R., Esrick, M. A., Goodhill, G. J., Urbach, J. S. Generating controlled molecular gradients in 3D gels. Biotechnol. Bioeng. 91, (6), 754-759 (2005).
  13. Wells, A., Kassis, J., Solava, J., Turner, T., Lauffenburger, D. A. Growth factor-induced cell motility in tumor invasion. Acta Oncol. 41, (2), 124-130 (2002).
  14. Wilkinson, P. C. Assays of leukocyte locomotion and chemotaxis. J. Immunol. Methods. 216, (1-2), 139-153 (1998).
  15. Bonvin, C., Overney, J., Shieh, A. C., Dixon, J. B., Swartz, M. A. A multichamber fluidic device for 3D cultures under interstitial flow with live imaging: development, characterization, and applications. Biotechnol. Bioeng. 105, (5), 982-991 (2010).
  16. Noo, L. J., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, (8), 826-830 (2002).
  17. Shao, J., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab Chip. 9, (21), 3118-3125 (2009).
  18. Haessler, U., Kalinin, Y., Swartz, M. A., Wu, M. An agarose-based microfluidic platform with a gradient buffer for 3D chemotaxis studies. Biomed. Microdevices. 11, (4), 827-835 (2009).
  19. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat. Rev. Cancer. 3, (5), 362-374 (2003).
  20. Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol. Biol. 769, 149-165 (2011).
  21. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J. Cell Biol. 75, (2 Pt 1), 606-616 (1977).
  22. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J. Cell. Sci. 99, (Pt 4), 769-775 (1991).
  23. Gilbert, D. L. Macromolecular diffusion through collagen membranes. Int. J. Pharm. 47, (1-3), 79-88 (1988).
  24. Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys. J. 83, (3), 1650-1660 (2002).
  25. Weadock, K., Silver, F. H., Wolff, D. Diffusivity of 125I-calmodulin through collagen membranes: effect of source concentration and membrane swelling ratio. Biomaterials. 7, (4), 263-267 (1986).
  26. Erikson, A., Andersen, H. N., Naess, S. N., Sikorski, P., Davies, C. dL. Physical and chemical modifications of collagen gels: impact on diffusion. Biopolymers. 89, (2), 135-143 (2008).
  27. Moghe, P. V., Nelson, R. D., Tranquillo, R. T. Cytokine-stimulated chemotaxis of human neutrophils in a 3-D conjoined fibrin gel assay. J. Immunol. Methods. 180, (2), 193-211 (1995).
  28. Sundd, P., et al. Live cell imaging of paxillin in rolling neutrophils by dual-color quantitative dynamic footprinting. Microcirculation. 18, (5), 361-372 (2011).
  29. Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors. J. Vis. Exp. (63), 2754 (2012).
  30. Stephenson, F. H. Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory 2e. Elsevier Science. (2010).
  31. Bar-Kochba, E., Toyjanova, J., Andrews, E., Kim, K., Franck, C. A Fast Iterative Digital Volume Correlation Algorithm for Large Deformations. Exp. Mech. In press, (2014).
  32. Shenoy, V., Rosenblatt, J. Diffusion of Macromolecules in Collagen and Hyaluronic Acid, Rigid-Rod-Flexible Polymer Composite Matrixes. Macromolecules. 28, (26), 8751-8758 (1995).
  33. Leddy, H., Guilak, F. Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching. Ann. Biomed. Eng. 31, (7), 753-760 (2003).
Planar Gradient Diffusion System Chemotaxis onderzoeken in een 3D collageenmatrix
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stout, D. A., Toyjanova, J., Franck, C. Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (100), e52948, doi:10.3791/52948 (2015).More

Stout, D. A., Toyjanova, J., Franck, C. Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (100), e52948, doi:10.3791/52948 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter