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Bioengineering

Planar Gradient système de diffusion d'enquêter Chimiotactisme dans une matrice de collagène 3D

doi: 10.3791/52948 Published: June 12, 2015

Introduction

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Le mouvement préféré de cellules vers un gradient de concentration, connu comme le chimiotactisme, joue un rôle important dans les processus physiologiques et pathologiques dans le corps. De tels exemples sont la peau et les muqueuses une cicatrisation des plaies, la morphogenèse 2, 3 inflammation, et 4,5 de la croissance tumorale. Il a également été montré que les cellules cancéreuses peuvent migrer à travers les deux stratégies de migration de cellule 6 individuels et collectifs. En outre, des mécanismes d'instabilité diffusionnels peuvent induire la séparation des cellules individuelles ou groupées d'un corps / objet tumorale et peuvent ensuite immigrer vers une source de nutriments et donc envahir des zones plus vastes et les tissus 7.

En outre, il a été montré que divers mécanismes de migration peuvent être actifs en 2D et en 3D, en raison de différents rôles des molécules d'adhésion 8. Par conséquent, un passage à physiologiquement pertinente des essais in vitro pour étudier la motilité cellulaire dans un measureable et de façon simple est d'importance dans la compréhension de mouvement cellulaire phénomènes 9. Malheureusement, la difficulté à analyser la migration cellulaire, un test complet de chimiotactisme quantifiable nécessite habituellement une longue méthode laborieuse, fondée sur la mesure des modèles de la motilité cellulaire et les phénomènes de transport impartiaux.

Approches expérimentales passées pour enquêter sur la chimiotaxie de cellules comprennent la chambre de Boyden 10 et le titre d'essai agarose 11. Cependant, dans ces premiers essais, des expériences de migration cellulaire ne surveillaient pas le mouvement dans le temps. De plus, surtout, les gradients de concentration utilisées pour les expériences ne sont pas bien définies ou complètement compris, tandis que seulement le maintien de la signalisation de pas plus de quelques heures. En outre, chimiotaxie début tentatives de chambre restreinte migration cellulaire à deux dimensions et ne permettent de surveiller la cinétique de la migration 12. En regardant la chambre de Boyden, un test de point de terminaisonne permettrait pas au chercheur d'observer visuellement la migration et ne pouvait pas différencier directement chimiotaxie (mouvement directionnel) de chimiokinèse (mouvement aléatoire). En outre, plusieurs des variables-différences dans la taille des pores et l'épaisseur des membranes réalisés à la chambre très difficile à reproduire facilement dissimulés et la réaction des cellules migrant vers les chimiokines 13,14.

Avec la nouvelle compréhension de la microfluidique, de nouvelles chambres et micro-dispositifs ont été étudiés comme un instrument pour étudier la locomotion cellulaire dans des conditions d'écoulement interstitiels ou chimiotactisme 15,16. En vertu de ces nouveaux appareils, de nouvelles mesures de cellules ont été introduits et étudiés, comme l'effet de la contrainte de cisaillement sur ​​une cellule 17,18. Malheureusement, les chambres de chimiotactisme microfluidiques précédents et actuels études de la migration des cellules limitées à des substrats 2D-un recul important puisque de nombreux processus biologiques, y compris l'invasion et la métastase de cellules tumorales, et imla migration cellulaire mune, implique la migration 3D.

Chambres, où d'observation directe d'une solution de chimioattractant est en contact avec un gel 3D contenant des cellules ont également été également rapporté 19,20. Ces chambres ont deux compartiments, l'un contenant un chimioattractive et l'un contenant des cellules, sont reliés côté de l'autre horizontalement 21 ou 22 anneaux concentriques. Ces systèmes sont pointés dans la bonne direction, mais ne gardent pas un système de chimiotactisme pour une période de temps prolongée.

En outre, les chercheurs ont également examiné la diffusivité à travers des membranes de collagène dans des cellules de dialyse, ainsi que la diffusion de molécules de traceur à travers des échantillons de collagène est soumis à une pression hydrostatique de 23 à 25. Des expériences de diffusion dans des gels de collagène reposent sur ​​des modifications physiques et chimiques du gel à l'aide de champs magnétiques et incorporation chimique 26. Une méthode populaire pour la modélisation de diffusion dans collatissus Genous repose sur l'imagerie de fluorescence du point photoblanchiment continue. Cette méthode a révélé une anisotropie dans les coefficients de diffusion des macromolécules dans les tissus de collagène orientées. Cependant, photoblanchiment a été utilisé dans le cartilage articulaire et les matrices de collagène non. Bien que semblable, les expériences de modélisation nécessaires doivent être effectuées par la compréhension spécialement le coefficient de diffusion de gels de collagène. Plus important encore, les systèmes ne pas utiliser un procédé de mesure de génération de force de cellule.

Malheureusement, la plupart des systèmes semblent manquer un ou deux éléments clés pour un système idéal: l'permettant de suivi de la cellule, une compréhension de gradient de diffusion avec un facteur chimiotactique à travers la matrice, un ensemble relativement simple avec une facilité de reproductibilité, la minimisation de interactions cellule-cellule, et la capacité de mesurer les unités de mesure pour la quantification (c., la vitesse, la force, la concentration spécifique). Moghe et al. 27 proposé un système qui accomplit la plupart de ces exigences, dans lequel les cellules sont initialement dispersées dans le gel plutôt que concentrés sur la surface du filtre, mais il était difficile de mesurer les forces qui génère la cellule.

Pour cette fin, nous présentons un système de diffusion de gradient plane pour enquêter sur la chimiotaxie dans une matrice de collagène en 3D, qui permet de surmonter modernes limitations de la chambre de diffusion de tests existants, qui est basé sur la microscopie time-lapse, couplées avec des techniques d'analyse d'images pour mesurer cellulaire forces dans un environnement 3D. Ce protocole fournit un moyen simple, mais innovant de création d'une chambre de diffusion 3D simple qui peut être utilisé pour étudier la chimiotaxie 3D dans des cellules différentes.

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Protocol

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1. 3D Mold Design et pièces de rechange

  1. Moule
    1. Avant de travailler, obtenir une trousse d'élastomère de silicone, une chambre d'imagerie des cellules vivantes, une lamelle de verre de 22 mm, et un cube de métal aluminium usiné avec des dimensions de 10,07 mm x 3,95 mm x 5,99 mm. Préparer la chambre d'imagerie des cellules vivantes pour le moulage en plaçant la lamelle couvre-objet dans le support inférieur et l'assemblage du reste de la chambre comme indiqué par le fournisseur.
    2. Ensuite, en utilisant une pince, placez le cube en aluminium usiné de métal dans le milieu de la imagerie cellulaire logements en direct de la chambre et sur le dessus de la lamelle, puis mis de côté.
    3. Mélanger les solutions d'élastomère de silicone selon le protocole du fabricant à faire 5 ml d'élastomère.
    4. Utiliser un laboratoire spatule jetable, verser la solution d'élastomère de silicone dans la configuration en direct de la chambre de l'imagerie cellulaire et veiller à ne pas bouger placé usiné cube de métal d'aluminium. Placez le système sur le banc de laboratoire, dans un endroit sécuritaire O / N pour le durcissement.
    5. Le lendemain matin, déconstruirela chambre de l'imagerie de cellules vivantes, tel que recommandé par le fabricant et tirez moule en utilisant une pince. En utilisant des pinces, retirez délicatement le cube usinés en aluminium métallique de moule. Aller à l'évier et rincer le moule avec de l'eau déminéralisée. Placer le moule sur une serviette en papier pour sécher.
    6. Une fois sec, à l'aide d'un couteau de passe-temps, des fentes pratiquées à travers le moule, espacés de 2,34 mm de distance de chaque extrémité longitudinale, à l'intérieur du moule en silicone. Assurer les séjours de moisissures dans un endroit sûr et sec jusqu'à ce que vous êtes prêt à construire le système pour une expérience.
  2. Hydrophiles et hydrophobes Lamelles verre Préparation
    1. Pour permettre à la matrice de collagène à adhérer à une surface, de créer des lamelles hydrophiles:
      1. En utilisant une pipette jetable, mesurer 150 ul de 3-aminopropyl-triméthoxysilane et verser la solution dans un tube de 50 ml. Ajouter 30 ml d'éthanol à 100% sur le tube de 50 ml avec un deuxième pipette jetable et fermer le couvercle. Vortexer la solution pendant 2 minutes, assurant un mélange complet. Pnotre solution dans une boîte de Pétri en verre et mis de côté.
      2. Verser 15 ml d'alcool éthylique de 100% dans une seconde boîte de Pétri et mettre de côté (assurez-vous d'étiqueter plats).
      3. En utilisant une nouvelle pipette jetable, mesurez 30 ml d'eau déminéralisée et verser la solution dans un tube de 50 ml. Ensuite, en utilisant une nouvelle mesure de pipette jetable sur 1875 pi de glutaraldéhyde et verser la solution dans le même tube de 50 ml et fermer le couvercle. Vortexer la solution pendant 2 minutes, assurant un mélange complet. Verser le mélange dans la troisième boîte de Pétri, et mettre de côté.
      4. En utilisant des pinces, prendre un 22 mm lamelle de verre ronde et rincer les deux côtés avec le mélange d'éthanol à 100% à l'aide d'une pipette jetable.
      5. Placez rincé lamelle de verre en 3-aminopropyltriméthoxysilane avec 30 ml d'éthanol à 100% plat de solution et laisser reposer dans la solution pendant 5 min.
      6. Avec une pince, sortez lamelle de verre et rincer de nouveau avec une solution d'éthanol à 100% avec pipette jetable.
      7. Déposez rincé lamelle de verre en 1875pi de glutaraldéhyde et 30 ml de mélange d'eau déminéralisée et mettre de côté pendant 30 min.
      8. Après 30 min, retirez lamelle de verre avec une pince et rincer avec de l'eau déminéralisée et placer sur O de tissu sec / N à sécher à température ambiante.
      9. Répéter l'immersion de lamelle et émouvant pour autant lamelles au besoin avec les mêmes solutions générées.
    2. Assurez lamelles hydrophobes par le protocole donné.
      1. Ajouter 500 ul de tridécafluoro-1,1,2,2-tétrahydrooctyl, 100 ul d'acide acétique et 19,4 ml d'hexane dans un tube de 50 ml et vortex pendant 2 min. Verser la solution dans le verre boîte de Pétri et mettre de côté.
      2. En utilisant des pinces propres, prendre une lamelle de verre et déposez-les dans une solution mixte préparé pendant 2 min. Après 2 min ont passé, prendre lamelle de verre avec une pince et rincer avec de l'eau déminéralisée à l'aide d'une pipette et le lieu lamelle disponible sur O de tissu sec / N à sécher à température ambiante. lamelle de magasin dans les plats en plastique de Pétri jusqu'à utilisation.
      3. Répétez lamelle dippING et déplacer autant de lamelles selon les besoins avec les mêmes solutions générées.

2. Assemblée Mold

  1. Avant d'utiliser des moules, en utilisant une pipette jetable rincer le moule avec de l'alcool éthylique à 90% par rapport à un récipient de déchets chimiques. Ensuite, placez le moule dans une boîte de Pétri remplie d'eau déminéralisée et laisser reposer O / N.
  2. Prenez moule de la solution en utilisant une pince et placer sur une serviette sécher à l'air avant de commencer l'assemblage de moule.
  3. Alors que le moule est séchage à l'air, couper les lamelles hydrophiles carrés en deux rectangles légèrement plus grand que 3,95 mm x 5,99 mm en utilisant un outil de diamant traçage de haute précision. Glissez chaque lamelle de rectangle de coupe dans les fentes taillées dans le moule en silicone.
  4. Retourner le moule à l'envers et appliquer de la graisse à vide le long du fond du moule en silicone en utilisant une pipette jetable. Ensuite, retournez le moule arrière droite et appuyez sur le fond du moule sur les couvercles en verre hydrophiles circulaireslèvres pour créer un joint.
  5. Avec des gants jetables, ramasser le moule assemblé et le placer dans une boîte de Pétri jetables, puis dans un bio-capot. Allumez la lampe UV Bio-capot pendant 1 heure pour stériliser le moule avant l'expérimentation se produit.

3. Le collagène Mélange et 3D Matrix

  1. Avant de préparer le mélange de collagène, de la teinture et préparer des cellules pour former une image selon des protocoles standard 28.
  2. En utilisant des techniques et des protocoles 29,30 laboratoire standard, dans un bio-capot, mélangez jamais des supports cellulaires et chimioattractive dans un tube de 15 ml à la concentration chimioattractive souhaitée. Pipette 5 ml de solution de la concentration des médias-chimioattractive cellulaire spécifique dans un tube de 15 ml et déplacer la solution dans un bain d'eau chauffée.
  3. En utilisant une pipette, extraire 5 ml de milieu de cellules seulement dans un second tube de 15 ml et placer dans un bain d'eau chauffé pour chauffer la solution pour des expériences de microscopie.
  4. Dans un bio-aspirante, pipette 30 ul de 10x tampon phosphatesolution ed (PBS) en micro tube de centrifugeuse. Ajouter 6 ul de 1 N d'hydroxyde de sodium (NaOH) en même tube de centrifugation et micro vortex pendant 15 s.
  5. Obtenir une solution de collagène I de queue de rat dans le réfrigérateur et passer à la bio-hotte en utilisant des techniques et des protocoles 29 laboratoire standard. Vérifiez que le collagène est encore froid. Introduire à la pipette 168,3 pi de collagène dans un même tube de centrifugeuse micro.
  6. Ensuite, ajouter 18 pi de microsphères modifiées par carboxylate jaune-vert fluorescents à l'aide d'une pipette dans le même tube de centrifugeuse micro. Vortexer le tube de centrifugeuse micro avec toutes les solutions pendant 30 secondes.
  7. Ajouter 77,7 pi de mélange cellulaire médias cellule souhaitée (environ 2 x 10 6 cellules / ml de concentration) en micro tube de centrifugeuse et mélanger à l'aide pointe de la pipette pendant 20 sec. Le cas échéant, modifier la densité de la matrice en suivant le mélange de collagène personnalisé adapté pour l'addition de billes fluorescentes et une table de la viabilité des cellules (tableau 1).
  8. Pipette 300 & #181; l de mélange de collagène cellule dans le centre de bien (le puits n ° 2) de l'ensemble de moule préparé. Placer le moule sur une boîte de Petri à usage unique et de le déplacer dans un incubateur standard de 20 minutes à 37 ° C avec 5% de CO 2.
  9. Déposer le système de l'incubateur et remettez en bio-capot. En utilisant une pince, retirer les deux lamelles hydrophobes par serrage sur le dessus de chaque lamelle et tirant vers le haut et loin de la moule.
  10. Déplacer l'ensemble du système pour la microscopie et l'image souhaitée pour assurer côtés collagène de moule sont toujours rectiligne pour permettre un gradient de diffusion plane.
  11. Avec le système encore sous le microscope, en utilisant un seul canal pipette 100 pi, ajouter 100 ul de milieu de cellules dans le puits n ° 1. Ensuite, en utilisant un seul canal pipette 100 ul ajouter 100 pi de milieu cellulaire avec concentration chimioattractive souhaitée dans le puits n ° 3.
  12. Immédiatement après l'ajout des solutions dans les deux puits, commencera imagerie.

4. Imagerie et DiffusionModélisation

  1. Si l'on veut trouver le coefficient de diffusion de la densité de collagène spécifique pour calculer la concentration spécifique, suivre le protocole ci-dessous:
    1. Suivez le protocole donné ci-dessus intitulée «Mélange collagène et matricielle 3D," au lieu de générer les médias de la cellule avec une concentration chimioattractive désiré, faire 5 uM rhodamine dans un tube de 15 ml en utilisant des calculs et des protocoles 30 standard.
    2. Image en les matrices de collagène 3D avec un système confocal montés sur un microscope inversé en utilisant un laser à argon (488 nm) pour capter la fluorescence. Image toutes les 2 ou 3 secondes pour un maximum de 7 heures.
  2. Pour Diffusion Modélisation: à l'aide du modèle mathématique illustré ci-dessous, écrire un code de logiciel de calcul pour le traitement et l'analyse de ces étapes générales.
    Equation 1
    1. Importer des images dans le logiciel de calcul pour mise à l'échelle et la normalisation par l'inten maximalesité. Convertir des images à une couleur gris-plan de l'image pour sélectionner le bord. Choix d'un axe le long du centre de l'image, à droite du centre et à la gauche du centre.
    2. En utilisant le code de logiciel informatique, tracer l'intensité normalisée, avec le vrai intensité et la différence entre les deux.
    3. Ensuite, entrez les paramètres nécessaires pour le montage (concentration, le temps, et de la longueur).
    4. Tracer la concentration normalisée en fonction du temps et le profil de concentration dans l'axe des x avec un ajustement polynomial pour les données.
    5. Calculer le coefficient de diffusion à l'aide du code de logiciel informatique.

5. Mesures expérimentales

  1. Revenant à l'équation de diffusion, réécrire l'équation pour trouver la concentration spécifique à tout emplacement dans le système, comme indiqué ci-dessous.
    Equation 2
    Où:
    L = longueur de ee matrice de collagène
    x = emplacement sous enquête
    D: coefficient de diffusion
    t = temps écoulé
  2. Pendant les expériences de chimiotaxie, en sorte d'enregistrer le moment précis que le moment chimiokine a été ajouté au système. Une fois que le mouvement de migration cellulaire est trouvé, s'assurer d'enregistrer confocale enregistrement time-lapse, et notez le moment précis et le lieu à partir du bord où l'imagerie produite.
  3. Lors de l'analyse de données, branchez le noter le temps écoulé, l'emplacement et le coefficient de diffusion pour la cellule spécifique dans l'équation pour trouver la concentration spécifique normalisée à un point quelconque dans le collagène à la fois pour la diffusion et expériences sur les cellules.

6. Suivi de la migration cellulaire Utilisant TFM

  1. Pour suivre la migration des cellules en utilisant des techniques TFM / CVN suivent le protocole ci-dessous:
    1. Après l'addition de la concentration de facteur chimiotactique souhaitée dans le puits n ° 3, commencer l'imagerie des matrices de collagène 3D avec un système confocal monté sur un micr inverséoscope pour trouver une cellule d'enquêter.
    2. Une fois qu'une cellule se trouve en mouvement, placer la cellule dans le milieu du champ de vision et d'utiliser un moteur piézo-électrique (à l'image dans l'axe z), une image toutes les deux ou min.
    3. Pour le calcul de génération de force de la cellule et de la déformation, générer un code de calcul pour trouver les déplacements des perles de fluorescence suivant les protocoles TFM / CVN 31.

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Representative Results

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La capacité de cet essai pour évaluer avec précision la migration de la cellule repose sur un bon réglage du système. Par conséquent, il est essentiel pour Assurez-vous de concevoir le moule du système de diffusion précise et prendre grand soin de placer des lamelles à la fois hydrophobes et hydrophiles, comme illustré sur la figure 1. Si le système est bien conçu et pendant la phase de modélisation de la diffusion assurer de trouver un très bonne ligne de départ linéaire, on est en mesure d'atteindre belle fluoresce images, comme le montre la figure 2, pour analyser la diffusion du système.

La clé de la réussite d'une analyse de chimiotactisme cellulaire est la modélisation de la diffusion et de résoudre l'équation de diffusion générale pour trouver le coefficient de diffusion et l'équation de concentration spécifique à travers un code généré de logiciels de calcul. Après avoir importé les images dans le logiciel de calcul et l'analyse en cours d'exécution (Figure 3), le coefficient de diffusionpeuvent être évaluées (tableau 2). La figure 4 représente les tracés de la diffusion de la rhodamine par l'intermédiaire des cinq concentrations de collagène testés. Les formes de l'intrigue de diffusion correspondent à la forme traditionnelle d'un modèle de diffusion linéaire. On peut voir que la diffusion de la rhodamine est inversement proportionnelle à la concentration de collagène de la densité de collagène la plus faible plus la diffusion. Ceci doit être prévu, en tant que cette concentration de collagène a une porosité plus élevée. Les lignes horizontales dans le diagramme de diffusion de collagène à une concentration de 1,5 mg / ml (Figure 4B) sont simplement le résultat de plus de saturation du signal de traceur. Plus important, comme le montre la figure 4 chaque ligne représente un point spécifique (x, y) à l'intérieur du collagène, tandis que le temps de augmente la concentration normalisée ne dépasse jamais le point précédent dans le même temps (dt), indiquant l'absence de reprise de la substance chimique. Ceci est une caractéristique importante d'une chechambre motaxis pour permettre l'écoulement direct d'un chimioattractive sans écoulement inverse.

En examinant les dix dernières images à chaque emplacement x, on est en mesure de générer un tracé de la concentration à l'état d'équilibre de la rhodamine à chacun des emplacements. En extrapolant sur ​​toute la longueur de l'échantillon (figure 5), on peut regarder l'ensemble de l'échantillon. Ceci indique que le gradient de diffusion linéaire est constante dans toute la longueur de l'échantillon, qui peut être utilisé pour des expériences de cellules (figure 6).

Figure 1
Figure 1: Un schéma du plan de diffusion de gradient ensemble de moule de système dans la chambre d'imagerie des cellules vivantes (1) Une interprétation de l'ordinateur du système complet constitué de (de bas en haut) un boîtier inférieur (c) une hydrophile 22 mm de lamelle, les moisissures,. boîtier supérieur, et un couvercle de verre. (2) Dimensions de mo ld où (a) inserts coupé sont présentées. (3) Mold avec la matrice de collagène avec (b) des lamelles hydrophobes sur chaque côté glissées dans les inserts de coupe pour créer le système 3-bien. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Exemple d'images de microscopie en collagène de type rhodamine représentatifs des images prises au cours d'expériences de diffusion de rhodamine, au même emplacement d'axe z, dans le système de diffusion de gradient plane avec 1,0 mg / ml concentration de collagène.. La barre d'échelle = 500 um où (a) est de 0 min (b) 3 min (c) 7 min, et (d) 15 min après la rhodamine a été ajouté à la chambre. La flèche indique la direction de diffusion de la rhodamine à travers la matrice de collagène.e.com/files/ftp_upload/52948/52948fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3:. Exemple d'analyse et résumé des calculs de diffusion générées par le code des logiciels de calcul avec un 2,5 mg / ml concentration de collagène (A) rendu en noir et blanc image initiale (dt = 0) d'téléchargé dans le logiciel de calcul pour l'analyse. (B) Les points spécifiques choisies par l'utilisateur pour la comparaison de l'intensité et pour les calculs de diffusion (axe Y, x sont en pixels). (C) le profil de diffusion de la rhodamine dans la matrice de collagène où chaque ligne est en corrélation avec un point rouge dans l'image B. (D) le profil de concentration de la rhodamine dans la matrice de collagène à l'état d'équilibre. (E) La comparaison entre les données lissées (blue point) et de véritables données de l'expérience de diffusion (point rouge) avec différence entre lissé et vrai (point vert). Les données de code de logiciel de calcul pendant toute l'expérience (F) concentration normalisée de la vraie (point rouge) et équipé (point vert). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4:. Exemple de profil de diffusion à travers la matrice de collagène à l'aide du système de diffusion de gradient plane à différents points Chaque ligne indique un des points de données sélectionnés choisis dans le code du logiciel de calcul par l'utilisateur. matrice de collagène à une densité de (A) 1,0 mg / ml (B) 1,5 mg / ml (C) 2,0 mg / ml (D) 2,2 mg / ml et (E rong>) de 2,5 mg / ml. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5:. Exemple d'un profil de concentration (normalisé) de la rhodamine dans toute la matrice de collagène à l'aide du système de diffusion de gradient plane à l'état d'équilibre cercles sont des points de données spécifiques choisis si le code de logiciel de calcul par l'utilisateur. Ligne rouge construit en utilisant des points de données et en extrapolant meilleure ligne d'ajustement (avec R 2 valeur indiquée) pour montrer la concentration de la rhodamine dans toute la matrice de collagène. matrice de collagène à une densité de (A) 1,0 mg / ml (B) 1,5 mg / ml (C) 2,0 mg / ml (D) 2,2 mg / ml et (E) 2,5 mg / ml.2948fig5large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Exemple d'expériences de migration cellulaire Une image de microscope Z-tranche de neutrophiles migration dans le système de gradient de plan 3D.. Neutrophiles migre vers le gradient chimiotactique (flèche blanche représente direction de gradient et le triangle présente son profil de concentration), où l'étoile indique la position initiale de la cellule au début de l'expérience. Subplot montre cellule dans l'espace 3D, où la flèche indique la prochaine direction point de temps. La barre d'échelle = 10 um. dt = 5 min entre les images (par exemple, AB). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Collagène Densité cellulaire PBS Billes fluorescentes NaOH Tail collagène I Rat Médias
2,5 mg / ml 10% 6% 2% 70.20% 11,80%
2,2 mg / ml 10% 6% 2% 61.70% 20.30%
2,0 mg / ml 10% 6% 2% 56.10% 25.90%
1,5 mg / ml 10% 6% 2% 42.10% 39.90%
1,0 mg / ml 10% 6% 2% 28.10% 53.90%

Tableau 1: c personnaliséeollagen mélange apte à l'addition de billes fluorescentes et la viabilité des cellules.

Concentration Gel de collagène Coefficient de diffusion (cm2 / s)
2,5 mg / ml 1,03 x 10 -6 ± 2,54 x 10 -7
2,2 mg / ml 1,28 x 10 -6 ± 3,53 x 10 -7
2,0 mg / ml 6,48 x 10 -6 ± 1,66 x 10 -7
1,5 mg / ml 1,05 x 10 -5 ± 2,04 x 10 -7
1,0 mg / ml 1,39 x 10 -5 ± 1,06 x 10 -7
Eau 1,50 x 10 -5

Tableau 2: Coefficients de diffusion.

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Discussion

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Les étapes les plus critiques pour les expériences réussies de diffusion avec ou sans cellules sont: configurer correctement l'ensemble de moule; le développement de la dextérité manuelle nécessaire pour empêcher des dommages lors de l'extraction des lamelles hydrophobes; assurer de trouver une très bonne ligne de départ linéaire pour calculer correctement le coefficient de diffusion; corriger les calculs expérimentaux de collagène et chimioattractive; utiliser correctement de système d'imagerie de cellules vivantes pour assurer la matrice ne sèche pas; et le maintien d'une saine culture stérile.

Lorsque la réalisation d'expériences de diffusion, il est impératif d'assurer que les parcelles de diffusion correspondent aux formes traditionnelles d'un modèle de diffusion linéaire (Figure 4).

Exécution de l'analyse à plusieurs différents endroits x-sur chaque échantillon, il est possible de calculer les coefficients moyens de diffusion pour la rhodamine dans les différentes concentrations de collagènes, comme indiqué dans Ta ble 2. Ces résultats sont cohérents avec la recherche précédente coefficient de diffusion à travers les diminutions de gel de collagène en tant que la concentration de collagène diminué en raison d'une augmentation de la porosité de la matrice.

Selon l'équation du modèle de diffusion à l'état d'équilibre, on attend d'avoir un profil de concentration linéaire sur les valeurs de x. En ajustant une fonction linéaire des points, on peut voir qu'ils sont tous, en fait, linéaire. La valeur R 2 de montage d'une ligne de tendance linéaire pour chacun des meilleures lignes d'ajustement pour les trois concentrations de collagène était égal ou supérieur à 0,92. Les normes des résidus dans toutes les parcelles étaient extrapolées 0,0227, indiquant un bon ajustement. Cette relation linéaire est en accord avec la solution analytique. La concentration ne commence pas à 100%, comme on pouvait s'y attendre, car la formation d'image ne débute pas directement au niveau du bord de l'échantillon de collagène. Il est également impossible de calibrer parfaitement l'imagerie.

_content "> En outre, nous avons pu faire référence à d'autres documents qui ont consulté la diffusion dans des gels de comparer les résultats. Shenoy et Rosenblatt trouvé le coefficient de diffusion de BSA (rayon = 4 nm) dans un / ml solution de collagène succinylé de 30 mg à 2,2 x 10 -7 cm 2 / s 32. Le rayon de la rhodamine est de 0,78 nm, ce qui explique son temps de diffusion plus rapide par le collagène 24. Dans les études de diffusion, il est courant d'utiliser le rayon de comparer molécules. Comme le rayon augmente, le poids moléculaire augmente également. Ramanujan et al. ont trouvé le coefficient de diffusion de dextrane (rayon = 6 nm) dans polymérisés 20% de gels de collagène (équivalent de 2,0 mg / ml de gel de concentration) pour 4,72 x 10 -8 cm 2 / s 24. Encore une fois, ce qui est comparable au coefficient de diffusion, nous avons observé pour le gel de concentration de 2,0 mg / ml (D = 1,28 x 10 -6 cm 2 / sec), si l'on tient compte de la différence de taille des molécules. Leddy et Guilak studié la diffusion de dextranes travers le cartilage articulaire 33. Il est possible de comparer la diffusion à travers les matrices de collagène par le cartilage articulaire et parce que les deux tiers environ de la masse du cartilage articulaire est le collagène polymère (principalement de type II). Leddy et Guilak trouve le coefficient de diffusion de 3 kDa dextrane à travers le cartilage articulaire à être comprise entre 6-10 × 10 -7 cm 2 / s 33. Sachant que le système fonctionne correctement, nous étions alors en mesure de calculer la concentration spécifique n'importe où dans le système, en utilisant des modèles en dents de scie et de transfert de chaleur du système transitoire. Cette mesure supplémentaire peut être utilisé au cours des expériences cellulaires pour suivre compréhension de concentration cellulaire et la pente gradient.

La durée du temps d'expériences peut être un facteur limitant pour l'utilisation de notre approche. Par conséquent, il est important d'utiliser un couvercle pour le système d'imagerie des cellules vivantes afin d'assurer la matrice ne sèche pas. L'utilisation d'un couvercle pendant expérits, nous étions en mesure de suivre avec succès la diffusion de la rhodamine jusqu'à 7 h et 4 h pendant les expériences cellulaires, sans gel assèchement. Si l'on ne veut pas utiliser un couvercle, le gel pourrait se tarir rapidement et affecter de manière significative la diffusion et la migration des cellules.

Le protocole décrit ici utilise un modèle de diffusion plane / système bien contrôlé pour pouvoir mesurer les forces de cellules dans un environnement 3D en cours chimiotaxie. Nous présentons ici un système simple nouvellement développé qui peut être utilisé pour des expériences TFM / DVC. Grâce à ce système, les chercheurs seront en mesure de: 1) la diffusion succès modèle à travers des matrices de collagène 3D et de vérifier, en ajustant les données à l'expression analytique, que le système de diffusion de gradient plane, lorsque ensemencé avec des cellules, devrait promouvoir le chimiotactisme et pas chimiokinèse; 2) calculer le coefficient de diffusion pour le collagène de cinq concentrations différentes; et 3) réussir à trouver la concentration spécifique de la chimioattractive dans le dichambre de FFusion. Avec cette approche, on peut en outre examiner la chimiotaxie cellulaire avec des mesures spécifiques pas facilement et rapidement disponible sans les approches laborieuses de systèmes multiples et des gradients de diffusion complexes.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicone elastomer kit Dow Corning Corp 182 SIL ELAST KIT .5KG a two-part misture with a 10:1 mix
Live cell imaging chamber Live Cell Instrument CM-B18-1 CMB for 18 mm round coverslips
22 mm Glass Coverslip Fisher Scientific NC0180281 Neuvitro Corp. cover slip 22 mm 1.5
Machined aluminum metal cube
Hobby utility knife X-Acto X3201
3-(aminopropyl) trimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778-5ML
Glutaraldehyde Polysciences, Inc 00216A-10 Glutaraldehyde, EM Grade, 8%
50 ml tube Fisher Scientific 14-432-22 Standard floor model and tabletop centrifuges
Glass Petri dish Fisher Scientific 08-747A Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15 mm)
Forceps Fisher Scientific 22-327-379 Fine Point Forceps
Cover glasses Fisher Scientific 12-518-105A Rectangle; 30 x 22 mm; Thickness No. 1
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl Gelest SIT8174.0
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099 Acetic acid ACS reagent, ≥99.7%
Hexane Sigma-Aldrich 296090 anhydrous, 95%
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 200 proof, for molecular biology
High-precision diamond scribing tool Lunzer PV-081-3 Straight extended tip scribe, .020" (.50 mm) diameter by .200" (5.0 mm) tip length
Vacuum grease Dow Corning 14-635-5C High-Vacuum Grease
15 ml tube Fisher Scientific 14-959-49D 15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface
10x phosphate buffered solution Fisher Scientific BP399-500 1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer
1 N sodium hydroxide Sigma-Aldrich 38215 Sodium hydroxide concentrate
Collagen I, rat tail BD Biosciences 354236 Rat tail 
Micro centrifuge tube Fisher Scientific 02-681-332 Volume: 2.0 ml;
O.D. x L: 13 x 40 mm;
sterile; single-wrapped
Name Company Catalog Number Comments
Carboxylate-modified microspheres Invitrogen  F-8813 Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids
Rhodamine Sigma-Aldrich 83689 Rhodamine B for fluorescence

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References

  1. Adzick, N. S. The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair. Ann Surg. 225, (2), 236 (1997).
  2. Reddi, A. H. Bone morphogenetic proteins: an unconventional approach to isolation of first mammalian morphogens. Cytokine Growth F. R. 8, (1), 11-20 (1997).
  3. Coussens, , Werb, Z, L. M., Werb, Z. Inflammation and cancer. Nature. 420, (6917), 860-867 (2002).
  4. Vital-Lopez, F. G., Armaou, A., Hutnik, M., Maranas, C. D. Modeling the effect of chemotaxis on glioblastoma tumor progression. AIChE J. 57, (3), 778-792 (2011).
  5. Hughes-Alford, S. K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of gradient sensing: towards building predictive models of chemotaxis in cancer. Curr. Opin. Cell Biol. 24, (2), 284-291 (2012).
  6. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat. Rev. Mol Cell Bio. 10, (7), 445-457 (2009).
  7. Cristini, V. Morphologic Instability and Cancer Invasion. Clin. Cancer Res. 11, (19), 6772-6779 (2005).
  8. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453, (7191), 51-55 (2008).
  9. Parent, C. A., Devreotes, P. N. A cell's sense of direction. Science. 284, (5415), 765-770 (1999).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  11. Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, (6), 1650-1656 (1975).
  12. Rosoff, W. J., McAllister, R., Esrick, M. A., Goodhill, G. J., Urbach, J. S. Generating controlled molecular gradients in 3D gels. Biotechnol. Bioeng. 91, (6), 754-759 (2005).
  13. Wells, A., Kassis, J., Solava, J., Turner, T., Lauffenburger, D. A. Growth factor-induced cell motility in tumor invasion. Acta Oncol. 41, (2), 124-130 (2002).
  14. Wilkinson, P. C. Assays of leukocyte locomotion and chemotaxis. J. Immunol. Methods. 216, (1-2), 139-153 (1998).
  15. Bonvin, C., Overney, J., Shieh, A. C., Dixon, J. B., Swartz, M. A. A multichamber fluidic device for 3D cultures under interstitial flow with live imaging: development, characterization, and applications. Biotechnol. Bioeng. 105, (5), 982-991 (2010).
  16. Noo, L. J., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, (8), 826-830 (2002).
  17. Shao, J., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab Chip. 9, (21), 3118-3125 (2009).
  18. Haessler, U., Kalinin, Y., Swartz, M. A., Wu, M. An agarose-based microfluidic platform with a gradient buffer for 3D chemotaxis studies. Biomed. Microdevices. 11, (4), 827-835 (2009).
  19. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat. Rev. Cancer. 3, (5), 362-374 (2003).
  20. Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol. Biol. 769, 149-165 (2011).
  21. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J. Cell Biol. 75, (2 Pt 1), 606-616 (1977).
  22. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J. Cell. Sci. 99, (Pt 4), 769-775 (1991).
  23. Gilbert, D. L. Macromolecular diffusion through collagen membranes. Int. J. Pharm. 47, (1-3), 79-88 (1988).
  24. Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys. J. 83, (3), 1650-1660 (2002).
  25. Weadock, K., Silver, F. H., Wolff, D. Diffusivity of 125I-calmodulin through collagen membranes: effect of source concentration and membrane swelling ratio. Biomaterials. 7, (4), 263-267 (1986).
  26. Erikson, A., Andersen, H. N., Naess, S. N., Sikorski, P., Davies, C. dL. Physical and chemical modifications of collagen gels: impact on diffusion. Biopolymers. 89, (2), 135-143 (2008).
  27. Moghe, P. V., Nelson, R. D., Tranquillo, R. T. Cytokine-stimulated chemotaxis of human neutrophils in a 3-D conjoined fibrin gel assay. J. Immunol. Methods. 180, (2), 193-211 (1995).
  28. Sundd, P., et al. Live cell imaging of paxillin in rolling neutrophils by dual-color quantitative dynamic footprinting. Microcirculation. 18, (5), 361-372 (2011).
  29. Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors. J. Vis. Exp. (63), 2754 (2012).
  30. Stephenson, F. H. Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory 2e. Elsevier Science. (2010).
  31. Bar-Kochba, E., Toyjanova, J., Andrews, E., Kim, K., Franck, C. A Fast Iterative Digital Volume Correlation Algorithm for Large Deformations. Exp. Mech. In press, (2014).
  32. Shenoy, V., Rosenblatt, J. Diffusion of Macromolecules in Collagen and Hyaluronic Acid, Rigid-Rod-Flexible Polymer Composite Matrixes. Macromolecules. 28, (26), 8751-8758 (1995).
  33. Leddy, H., Guilak, F. Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching. Ann. Biomed. Eng. 31, (7), 753-760 (2003).
Planar Gradient système de diffusion d'enquêter Chimiotactisme dans une matrice de collagène 3D
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Stout, D. A., Toyjanova, J., Franck, C. Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (100), e52948, doi:10.3791/52948 (2015).More

Stout, D. A., Toyjanova, J., Franck, C. Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (100), e52948, doi:10.3791/52948 (2015).

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