Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

מישורי צבע מערכת דיפוזיה לחקירת Chemotaxis בקולגן מטריקס 3D

doi: 10.3791/52948 Published: June 12, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

התנועה העדיפה תאי כיוון מפל ריכוזים, הידוע בשם chemotaxis, ממלאת תפקיד חשוב בתהליכים פתולוגיים ופיסיולוגיים בגוף. דוגמאות כאלה הן ריפוי עור ורירית פצע 1, המורפוגנזה 2, דלקת 3, ו4,5 צמיחת גידול. כמו כן, הוכיח כי תאים סרטניים יכולים לנדוד דרך שתי אסטרטגיות תא-ההגירה האישיות וקולקטיביות 6. יתר על כן, מנגנוני חוסר יציבות diffusional יכולים לגרום להפרדה של תאים בודדים או התקבצו מגוף / אובייקט tumorous ואז יכול לעלות לכיוון מקור של חומרים מזינים ובכך לפלוש אזורים ורקמות 7 רחבים יותר.

יתר על כן, הוכיח כי מנגנוני הגירה מגוונים יכולים להיות פעילים ב2D וב3D, בשל תפקידים שונים של מולקולות הידבקות 8. לכן, מעבר לרלוונטי מבחינה פיזיולוגית במבחני מבחנה לחקור תנועתיות תא בmeasureablדואר ודרך פשוטה הוא בעל משמעות בהבנת תנועת תא תופעות 9. למרבה הצער, הקושי בניתוח נדידת תאים, assay chemotaxis כימות מקיף בדרך כלל דורש שיטה מייגע ארוכה, שנוסדה על המדידה של דגמי תנועתיות תא ותופעות תחבורה נטולי פניות.

גישות ניסיוניות עבר לחקור chemotaxis תא כוללות תא וידן 10 ומתחת assay agarose 11. עם זאת, בתוך מבחני המוקדמים אלה, ניסויי נדידת תאים לא לפקח על התנועה בכבוד לעת. יותר, וחשוב, הדרגתיים ריכוז המשמש לניסויים אינם מוגדר היטב או מובן לחלוטין תוך שמירת האיתות ללא יותר מכמה שעות בלבד. יתר על כן, ניסיונות קאמריים chemotaxis מוקדם מוגבלים נדידת תאים לשני ממדים ולא לאפשר אחד כדי לפקח על קינטיקה של הגירה 12. מסתכל על חדר בוידן, assay נקודות קצהלא יאפשר לחוקר לבחון הגירה מבחינה ויזואלית ולא יכל להבחין ישירות chemotaxis (תנועה כיוונית) מchemokinesis (תנועה אקראית). בנוסף, מספר משתנה-הבדלים בגודל הנקבובית ועובי של קרומי תוצרת קאמריים קשה מאוד לשחזר בקלות והסתירו את התגובה של תאים זרות לכמוקינים 13,14.

עם ההבנה החדשה של מיקרופלואידיקה, תאים חדשים ומיקרו-מכשירים נחקרו ככלי לחקור תנועת תא תחת תנאי זרימת ביניים או Chemotaxis 15,16. תחת מכשירים החדשים אלה, מדדי תא חדשים הוכנסו ונחקרו, כמו ההשפעה של לחץ גזירה על תא 17,18. לרוע המזל, תאי chemotaxis microfluidic עבר ובהווה מוגבלים מחקרים של נדידת תאים למצעים-2D נסיגה חשובה שכן רבים תהליכים ביולוגיים, כוללים פלישת תאים סרטניים וגרורות, וimנדידת תאי mune, כרוכה הגירת 3D.

תאים-בי תצפית ישירה פתרון chemoattractant הוא במגע עם ג'ל 3D המכיל תאים יש גם דיווחו גם 19,20. יש תאים אלה שני תאים, אחד המכיל chemoattractant ואחד המכיל תאים, הם הצטרפו לצד אחד את השני בצורה אופקית 21 או כטבעות קונצנטריות 22. מערכות אלה הצביעו בכיוון הנכון, אבל לא שומרות מערכת chemotaxis לתקופה ארוכה של זמן.

יתר על כן, חוקרים בחנו גם diffusivity דרך קרומי תאי קולגן בדיאליזה, כמו גם דיפוזיה של מולקולות נותב דרך דגימות קולגן נתון ללחץ ההידרוסטטי 23-25. ניסויי דיפוזיה חלק בג'ל קולגן להסתמך על שינויים פיזיים וכימיים של ג'ל באמצעות שדות מגנטיים והתאגדות כימית 26. שיטה פופולרית לדוגמנות diffusivity בcollaרקמות genous מסתמכת על ההדמיה הקרינה של photobleaching נקודה הרציף. שיטה זו חשפה אנאיזוטרופיה במקדמי דיפוזיה של מולקולות גדולות ברקמות collagenous בכיוון. ובכל זאת, photobleaching נעשה שימוש בסחוס במפרק ולא קולגן מטריצות. בעוד דומה, חייבים להתבצע ניסויי דוגמנות צורך בהבנה במיוחד מקדם דיפוזיה של ג'ל קולגן. וחשוב יותר, המערכות לא לנצל שיטה למדידת דור כוח התא.

למרבה הצער, רוב המערכות נראות חסרות מרכיבים מרכזיים אחד או שתיים למערכת אידיאלית: מאפשרים מעקב של תא, הבנת שיפוע דיפוזיה עם גורם chemotactic באמצעות המטריצה, להגדיר פשוט יחסית עם הקלות של שחזור, מזעור תאי תאים אינטראקציות, ואת היכולת למדוד יחידות ממדיות לכימות (כלומר, מהירות, כוח, ריכוז ספציפי). Moghe et al. 27 הציע מערכת שמלאה את רוב הדרישות אלה שבתאים היו בתחילה מפוזרים בג'ל ולא התרכזו בשטח המסנן, אבל היה קשה למדוד כוחות שהתא מייצר.

למטרה זו, אנו מציגים מערכת דיפוזיה השיפוע מישוריים לחקור chemotaxis במטריצת קולגן 3D, המאפשר לאדם להתגבר על מגבלות תא דיפוזיה מודרניות של מבחני קיימים, המבוסס על מיקרוסקופיה זמן לשגות, בשילוב עם טכניקות ניתוח תמונה למדוד תא כוחות בסביבת 3D. פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה, עדיין חדשנית של יצירת תא דיפוזיה פשוטה 3D שיכול לשמש כדי לחקור chemotaxis 3D בתאים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

עיצוב עובש 1. 3D וחלקים

  1. עובש
    1. לפני העבודה, לקבל ערכת אלסטומר סיליקון, חדר הדמיה תא חי, coverslip זכוכית 22 מ"מ, וקוביית מתכת אלומיניום במכונה עם ממדים 10.07 מ"מ x 3.95 מ"מ x 5.99 מ"מ. הכן את חדר ההדמיה תא החי לדפוס על ידי הצבת coverslip בבעל תחתית והרכבה שאר הקאמרית בבימויו של כספק.
    2. בשלב הבא, באמצעות מלקחיים, למקם את קוביית מתכת ואלומיניום במכונה באמצע דיור תא ההדמיה תא החי ועל גבי coverslip, ולאחר מכן מניח בצד.
    3. מערבבים פתרונות אלסטומר סיליקון על פי הפרוטוקול של היצרן לעשות 5 מיליליטר של אלסטומר.
    4. , בעזרת מרית מעבדה חד פעמית לשפוך פתרון אלסטומר סיליקון להתקנת תא הדמיה תא חי ולהבטיח שלא להזיז קוביית מתכת ואלומיניום במכונה ממוקמת. הנח את המערכת על ספסל המעבדה, בO בטוח מיקום / N לריפוי.
    5. למחרת בבוקר, לפרקחדר ההדמיה תא החי, כפי שהומלץ על ידי היצרן ולשלוף עובש באמצעות מלקחיים. בעזרת מלקחיים, לחלץ בזהירות קוביית מתכת ואלומיניום במכונה מעובש. עבור לכיור ולשטוף את התבנית עם מים ללא יונים. מניחים את התבנית על מגבת נייר לייבוש.
    6. לאחר יבש, באמצעות סכין שירות תחביב, לחתוך חריצים באמצעות העובש, במרווחים של 2.34 מ"מ מכל צד אורך, בתוך תבנית סיליקון. ודא שהיות העובש במקום בטוח ויבש עד שיהיו מוכנים לבנות המערכת לניסוי.
  2. הידרופילי והידרופובי זכוכית Coverslips הכנה
    1. כדי לאפשר את מטריצת קולגן לדבוק פני השטח, ליצור coverslips הידרופילי:
      1. בעזרת פיפטה חד פעמית, למדוד את 150 μl של 3-aminopropyl-trimethoxysilane ויוצקים פתרון בצינור 50 מיליליטר. להוסיף 30 מיליליטר של אתנול 100% לצינור 50 מיליליטר עם טפטפת חד פעמי שני ולסגור את המכסה. מערבולת הפתרון עבור 2 דקות, כדי להבטיח ערבוב מלא. Pהפתרון שלנו בצלחת פטרי מזכוכית ומניח בצד.
      2. יוצקים 15 מיליליטר של 100% אתיל אלכוהול בצלחת פטרי שנייה ומניח בצד (לוודא לתייג מנות).
      3. בעזרת פיפטה חד פעמית חדשה, למדוד את 30 מיליליטר של מים ללא יונים ויוצקים פתרון לתוך צינור 50 מיליליטר. בשלב הבא, באמצעות מדד פיפטה חד פעמי חדש מתוך 1,875 μl של glutaraldehyde ויוצקים פתרון לתוך צינור 50 מיליליטר ולסגור את המכסה. מערבולת הפתרון עבור 2 דקות, כדי להבטיח ערבוב מלא. יוצקים את התערובת לתוך צלחת פטרי שלישית, ומניח בצד.
      4. בעזרת מלקחיים, להוציא coverslip זכוכית עגולה 22 מ"מ אחד ולשטוף שני הצדדים עם 100% תערובת אתנול באמצעות פיפטה חד פעמית.
      5. מניחים coverslip זכוכית שטף לתוך 3-aminopropyl-trimethoxysilane עם 30 מיליליטר של 100% אתנול צלחת פתרון ולאפשר לשבת בפתרון במשך 5 דקות.
      6. עם מלקחיים, להוציא coverslip זכוכית ולשטוף שוב עם 100% פתרון אתנול עם פיפטה חד פעמית.
      7. זרוק coverslip זכוכית שטוף ל1,875μl של glutaraldehyde ו -30 מיליליטר של תערובת מים ללא יונים ומניחים בצד למשך 30 דקות.
      8. לאחר 30 דקות, להסיר את coverslip זכוכית עם מלקחיים ולשטוף עם מים ללא יונים ומניח על גבי O רקמה היבש / N לייבוש על RT.
      9. טבילה חוזרת coverslip ומרגש עבור coverslips לפי צורך עם הפתרונות שנוצרו זהים.
    2. הפוך coverslips הידרופובי על ידי הפרוטוקול נתון.
      1. הוסף 500 μl של tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl, של חומצה אצטית 100 μl ו19.4 מיליליטר של הקסאן בצינור 50 מיליליטר ומערבולת למשך 2 דקות. יוצקים פתרון בצלחת פטרי מזכוכית ומניח בצד.
      2. בעזרת מלקחיים נקיים, להוציא coverslip כוס אחת ושחרר לפתרון מעורב הכין עבור 2 דקות. לאחר 2 דקות חלפו, להוציא coverslip זכוכית עם מלקחיים ולשטוף עם מים ללא יונים באמצעות coverslip פיפטה והמקום הפנוי על O רקמה היבש / N לייבוש על RT. coverslip חנות בצלחות פטרי פלסטיק עד שימוש.
      3. DIPP coverslip חזורing ומרגש עבור coverslips לפי צורך עם הפתרונות שנוצרו זהים.

עצרת 2. עובש

  1. לפני שימוש בתבניות, באמצעות פיפטה חד פעמית לשטוף את התבנית עם 90% אתיל אלכוהול על מיכל פסולת כימי. בשלב הבא, למקם את התבנית בצלחת פטרי מלאה במים ללא יונים ולאפשר לשבת O / N.
  2. קח עובש מהפתרון באמצעות מלקחיים ומניחים על מגבת לייבוש באוויר לפני שמתחיל ההרכבה העובש.
  3. בעוד העובש הוא אוויר ייבוש, לחתוך את coverslips הידרופילי הריבוע לשני מלבנים מעט הגדול יותר 3.95 מ"מ x 5.99 מ"מ באמצעות כלי scribing יהלומי דיוק גבוה. להחליק כל coverslip מלבן לחתוך לתוך החריצים לחתוך לתוך תבנית סיליקון.
  4. הפוך את התבנית הפוכה ולמרוח משחה ואקום לאורך תחתית תבנית סיליקון באמצעות פיפטה חד פעמית. בשלב הבא, להפוך את התבנית בחזרה בצד ימני ולחץ על תחתית התבנית על גבי מכסה הזכוכית הידרופילי המעגלימס שפות כדי ליצור חותם.
  5. עם כפפות חד פעמיות, להרים את העובש התאסף ומקום לתוך צלחת פטרי חד פעמית ולאחר מכן ליו-מכסה המנוע. הפעל מנורת יו-ברדס UV במשך שעה 1 לעקר את התבנית לפני ניסויים מתרחש.

3. תערובת קולגן ו3D מטריקס

  1. לפני הכנת תערובת קולגן, הכתם ולהכין תאים להדמיה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 28.
  2. באמצעות שימוש בטכניקות מעבדה סטנדרטית ופרוטוקולים 29,30, ביו-מכסה המנוע, לערבב תקשורת סלולארי וchemoattractant בצינור 15 מיליליטר לריכוז chemoattractant רצוי. פיפטה 5 מיליליטר של תמיסת ריכוז תאים ספציפית מדיה-chemoattractant לתוך צינור 15 מ"ל ולהעביר את הפתרון לתוך אמבט מים מחומם.
  3. בעזרת פיפטה, לחלץ 5 מיליליטר של תקשורת סלולארי רק לתוך צינור 15 מיליליטר שני ומקום באמבט מים מחומם כדי לחמם את הפתרון לניסויים במיקרוסקופ.
  4. ביו-למכסה המנוע, 30 μl פיפטה של ​​10x חיץ פוספטפתרון אד (PBS) לתוך צינור צנטריפוגות מיקרו. הוסף 6 μl של הידרוקסיד נתרן 1 N (NaOH) לאותו צינור צנטריפוגות מיקרו ומערבולת למשך 15 שניות.
  5. השג פתרון זנב עכברוש אני קולגן מהמקרר ולעבור ליו-מכסה המנוע תוך שימוש בטכניקות מעבדה סטנדרטית ופרוטוקולים 29. ודא קולגן הוא עדיין קר. פיפטה 168.3 μl של קולגן לאותו צינור צנטריפוגות מיקרו.
  6. לאחר מכן, להוסיף 18 μl של microspheres-שונה carboxylate ניאון צהוב-ירוק בעזרת פיפטה לאותו צינור צנטריפוגות מיקרו. מערבולת צינור צנטריפוגות מיקרו עם כל הפתרונות למשך 30 שניות.
  7. להוסיף 77.7 μl של תערובת מדיה-תא תא רצוי (כ 2 x 10 6 תאים / מיליליטר ריכוז) לצינור צנטריפוגות מיקרו ולערבב באמצעות קצה פיפטה במשך 20 שניות. במידת צורך, לשנות את צפיפות המטריצה ​​על ידי ביצוע תערובת קולגן המותאם אישית מותאמת לתוספת של חרוזי ניאון ושולחן כדאיות תא (טבלה 1).
  8. פיפטה 300 & #181; L של תערובת קולגן תאים למרכז היטב (גם מס '2) של ההרכבה העובש מוכנה. מניחים את התבנית על צלחת פטרי חד פעמית ולהעביר אותו לחממה סטנדרטית עבור 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
  9. הסר מערכת מהחממה ולמקם בחזרה ליו-מכסה המנוע. בעזרת מלקחיים, להסיר את שני התלושים לכסות הידרופובי על ידי כיווץ על החלק העליון של כל coverslip ומושך כלפי מעלה והרחק מהתבנית.
  10. הזז את המערכת כולה למיקרוסקופיה ותמונה הרצויות על מנת להבטיח צדדים עובש קולגן עדיין ישר, כדי לאפשר שיפוע דיפוזיה מישוריים.
  11. עם המערכת עדיין מתחת למיקרוסקופ, באמצעות פיפטה ערוץ יחיד 100 μl, להוסיף מדיה תא 100 μl ולמס '1. בשלב הבא, בעזרת פיפטה ערוץ יחיד 100 μl להוסיף של תקשורת תא עם ריכוז chemoattractant רצוי 100 μl ולמס '3.
  12. מייד לאחר הוספת פתרונות לשתי הבארות, להתחיל הדמיה.

4. הדמיה ודיפוזיהדוגמנות

  1. אם אחד לא רוצה למצוא את מקדם הדיפוזיה לצפיפות קולגן הספציפי כדי לחשב את הריכוז המסוים, בצע את הפרוטוקול שלהלן:
    1. בצע את הפרוטוקול שניתן לעיל תחת הכותרת "תערובת קולגן ו3D מטריקס," במקום לייצר תקשורת תא עם ריכוז chemoattractant רצוי, לעשות rhodamine 5 מיקרומטר בצינור 15 מיליליטר באמצעות חישובים ופרוטוקולים סטנדרטיים 30.
    2. תמונת מטריצות קולגן 3D עם מערכת confocal רכובים על מיקרוסקופ הפוכה באמצעות לייזר ארגון (488 ננומטר) כדי ללכוד את הקרינה. תמונה כל שניות 2 או 3 עד 7 שעות.
  2. לדוגמנות דיפוזיה: שימוש במודל המתמטי שמוצג להלן, לכתוב קוד תוכנה חישובית לעיבוד וניתוח בצעדים הכלליים אלה.
    משוואת 1
    1. יבוא תמונות לתוך תוכנה חישובית לrescaling ונרמול ידי inten המרביסיטי. המרת תמונות לצבע מפה אפורה של התמונה כדי לבחור את הקצה. בחר ציר לאורך מרכז התמונה, מימין למרכז ושמאלה מהמרכז.
    2. שימוש בקוד התוכנה חישובית, העלילה העצמה המנורמלת, יחד עם עוצמת האמיתית וההבדל בין שתיים.
    3. בשלב הבא, קלט הפרמטרים הדרושים להרכבה (ריכוז, זמן, ואורך).
    4. עלילה הריכוז המנורמל לעומת זמן ופרופיל הריכוז על פני ציר x עם פולינום לנכון את הנתונים.
    5. לחשב את מקדם דיפוזיה באמצעות קוד התוכנה חישובית.

5. מדידות ניסויי

  1. בהתייחסו בחזרה למשוואת דיפוזיה, לשכתב את המשוואה כדי למצוא את הריכוז הספציפי בכל מקום במערכת כפי שמוצג בהמשך.
    משוואה 2
    איפה:
    L = אורך של המטריצת קולגן דואר
    x = מיקום תחת חקירה
    D = מקדם דיפוזיה
    t = זמן שחלף
  2. במהלך ניסויי chemotaxis, להבטיח להקליט זמן המסוים שchemokine הרגע התווספה למערכת. ברגע שתנועת נדידת תאים נמצאת, להבטיח להקליט הקלטת הזמן לשגות confocal, ושים לב לזמן מסוים ומיקום מהקצה שבו התרחש הדמיה.
  3. במהלך ניתוח הנתונים, לחבר את ציין שחלף הזמן, מיקום ומקדם דיפוזיה לתא הספציפי למשוואה כדי למצוא את הריכוז הספציפי המנורמל בכל נקודה בתוך קולגן עבור דיפוזיה וניסויים תא.

6. נדידת תאי מעקב ניצול TFM

  1. כדי לעקוב אחר נדידת תאים תוך שימוש בטכניקות TFM / DVC לעקוב אחר הפרוטוקול להלן:
    1. לאחר התוספת של ריכוז chemoattractant רצוי ולמס '3, להתחיל הדמיה מטריצות קולגן 3D עם מערכת confocal רכובה על MICR הפוךoscope למצוא תא לחקור.
    2. ברגע שתא נע נמצא, למקם את התא באמצע שדה הראייה ולנצל מנוע פיזואלקטריים (לתמונה בציר z), תמונה כל דקות 1 או 2.
    3. לחישוב דור כוח התא ועיוות, ליצור קוד חישובית כדי למצוא את ההתקות של חרוזים הקרינה הבאים פרוטוקולי TFM / DVC 31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

היכולת של assay זה להעריך את ההגירה של התאים במדויק מסתמכת על הגדרה טובה של המערכת. לכן, זה קריטי עבור לוודא לעצב את תבנית מערכת דיפוזיה מדויקת ודואגים גדולים בהצבת coverslips שני הידרופובי והידרופילי, כפי שמודגם באיור 1. אם המערכת מתוכננת כראוי ובשלב דוגמנות דיפוזיה הבטחה למצוא מאוד טוב קו הזינוק ליניארי, אחד הוא מסוגל להשיג נחמד מאיר תמונות, כמתואר באיור 2, לניתוח דיפוזיה של המערכת.

המפתח לניתוח chemotaxis התא מוצלח דוגמנות דיפוזיה ופתרון משוואת דיפוזיה הכללית כדי למצוא את המקדם של דיפוזיה ומשוואת ריכוז ספציפית באמצעות קוד שנוצר תוכנה חישובית. לאחר יבוא התמונות לתוך תוכנה חישובית והפעלת ניתוח (איור 3), מקדם דיפוזיהניתן להעריך (טבלה 2). איור 4 מייצג את החלקות של דיפוזיה של rhodamine דרך חמישה ריכוזי קולגן נבדקו. הצורות של עלילת דיפוזיה להתאים את הצורה המסורתית של מודל דיפוזיה ליניארי. ניתן לראות כי דיפוזיה של rhodamine היא ביחס הפוך לריכוז של קולגן-צפיפות הקולגן הנמוכה יותר מהר דיפוזיה. זה היה צפוי, כריכוז של קולגן יש נקבוביות גבוהה יותר. הקווים אופקיים בעלילת דיפוזיה קולגן בריכוז של 1.5 מיליליטר / מ"ג (איור 4) הם פשוט התוצאה של מעל הרוויה של האות נותב. יותר מכך, כפי שמוצג באיור 4 כל שורה מייצגת נקודה ספציפית (x, y) בתוך קולגן, ולאילו הזמן מגביר את הריכוז המנורמל לא עולה על הנקודה הקודמת באותו הזמן (DT), המצביע על שום היפוך הכימי. זהו מאפיין חשוב של צ'התא motaxis כדי לאפשר זרימה ישירה של chemoattractant ללא זרימה הפוכה.

על ידי בחינת עשר התמונות שעברה בכל מיקום x, אחד הוא מסוגל ליצור עלילה של ריכוז המצב היציב של rhodamine בכל אחד מהמקומות. באמצעות אקסטרפולציה על פני אורך המדגם כולו (איור 5), אחד יכול להסתכל על כל המדגם. זה מצביע על כך ששיפוע דיפוזיה יניארי עקבי לאורך כל אורך המדגם, אשר יכול להיות מנוצל לניסויי תא (איור 6).

איור 1
איור 1: סכמטי של הרכבה עובש מערכת מישוריים דיפוזיה השיפוע בתא הדמיה תא חי (1) ביצוע מחשב של המערכת השלמה המורכבת מ( מלמטה למעלה) דיור תחתון coverslip 22 מ"מ הידרופילי (ג), עובש,. דיור עליון, וכיסוי זכוכית. (2) ממדים של מו LD שם () לחתוך מוסיף מוצג. עובש עם מטריצת קולגן עם (ב) coverslips הידרופובי בכל צד החליק לתוך מוסיף לחתוך כדי ליצור את מערכת 3 היטב (3). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: דוגמא של תמונות מיקרוסקופיה rhodamine בקולגן נציג תמונות שצולמו במהלך ניסויי דיפוזיה rhodamine, באותו מיקום Z- ציר, במערכת דיפוזיה השיפוע מישוריים עם 1.0 מ"ג / מיליליטר ריכוז קולגן.. בר סולם = 500 מיקרומטר שם (א) היא 0 דקות 3 דקות (ג) (ב) 7 דק ', ו- (ד) 15 דקות לאחר rhodamine התווסף לתא. החץ מצביע על כיוון של דיפוזיה של rhodamine באמצעות מטריצת קולגן."Target =" _ e.com/files/ftp_upload/52948/52948fig2large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. דוגמא לניתוח והסיכום של חישובי דיפוזיה שנוצרו על ידי קוד תוכנה חישובית עם 2.5 מ"ג / מיליליטר ריכוז קולגן () טיוח שחור ולבן של תמונה ראשונית (DT = 0) נטען לתוך תוכנה חישובית לניתוח. נקודות ספציפיות (ב) נבחרו על ידי המשתמש להשוואת עוצמה ולחישובי דיפוזיה (x, ציר y הם בפיקסלים). פרופיל (C) דיפוזיה של rhodamine ברחבי מטריצת קולגן שבו כל שורה בקורלציה לנקודה אדומה בפרופיל ריכוז ב (ד) תמונה של rhodamine ברחבי מטריצת הקולגן במצב יציב. השוואה (E) בין הנתונים החליקו (Bluנקודת ה) ונתונים אמיתיים מניסוי דיפוזיה (נקודה אדומה) עם הבדל בין (נקודה ירוקה מוחלקת ואמיתית). (F) ריכוז מנורמל של (נקודה אדומה) אמיתית ו( נקודה ירוקה) מצוידת נתונים מקוד תוכנה חישובית לאורך הניסוי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4:. דוגמא לפרופיל דיפוזיה דרך מטריצת קולגן באמצעות מערכת דיפוזיה השיפוע מישוריים בנקודות שונות כל שורה מציינת נקודות הנתונים שנבחרו שונות שנבחרו מקוד התוכנה חישובית על ידי המשתמש. מטריצת הקולגן בצפיפות של 1.0 מ"ג / 1.5 מ"ג / מיליליטר (ג) 2.0 מ"ג / מיליליטר (ד) מיליליטר (א) (ב) 2.2 מ"ג / מ"ל ו( E Rong>) 2.5 מ"ג / מיליליטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5:. מעגלי דוגמא לריכוז פרופיל (מנורמל) של rhodamine ברחבי מטריצת קולגן באמצעות מערכת דיפוזיה השיפוע מישוריים במצב יציב הם נקודות נתונים ספציפיות שנבחרו אף קוד תוכנה חישובית על ידי המשתמש. קו אדום נבנה באמצעות נקודות נתונים וחיוץ קו-כושר הטוב ביותר (עם ערך 2 R מוצג) כדי להראות ריכוז rhodamine לאורך כל מטריצת קולגן. מטריצת הקולגן בצפיפות של 1.0 מ"ג / 1.5 מ"ג / מיליליטר (ג) 2.0 מ"ג / מיליליטר (ד) מיליליטר (א) (ב) 2.2 מ"ג / מ"ל ו( E) 2.5 מ"ג / מיליליטר. "Target =" _ 2948fig5large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6: דוגמא לניסויי נדידת תאי תמונת מיקרוסקופ Z-פרוסת נויטרופילים הנודדים במערכת השיפוע מישוריים 3D.. נויטרופילים נודדים לכיוון שיפוע chemoattractant (חץ לבן מתאר כיוון השיפוע והמשולש תערוכות פרופיל הריכוז שלה), שבו הכוכב מציין את המיקום הראשוני של התא בתחילת הניסוי. עלילת משנת תערוכות תא בחלל 3D, שבו מצביע חץ כיוון נקודת הזמן הבא. בר סולם = 10 מיקרומטר. DT = 5 דקות בין תמונות (כלומר, א.ב.). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ng = "0">
צפיפות תאי קולגן PBS חרוזי ניאון NaOH זנב קולגן אני עכברוש תקשורת
2.5 מ"ג / מיליליטר 10% 6% 2% 70.20% 11.80%
2.2 מ"ג / מיליליטר 10% 6% 2% 61.70% 20.30%
2.0 מ"ג / מיליליטר 10% 6% 2% 56.10% 25.90%
1.5 מ"ג / מיליליטר 10% 6% 2% 42.10% 39.90%
1.0 מ"ג / מיליליטר 10% 6% 2% 28.10% 53.90%

טבלת 1: המותאם אישית גתערובת ollagen המותאמת לתוספת של חרוזי ניאון וכדאיויות תא.

ריכוז של ג'ל קולגן מקדם של דיפוזיה (2 סנטימטר / sec)
2.5 מ"ג / מיליליטר 1.03 x 10 -6 ± 2.54 x 10 -7
2.2 מ"ג / מיליליטר 1.28 x 10 -6 ± 3.53 x 10 -7
2.0 מ"ג / מיליליטר 6.48 x 10 -6 ± 1.66 x 10 -7
1.5 מ"ג / מיליליטר 1.05 x 10 -5 ± 2.04 x 10 -7
1.0 מ"ג / מיליליטר 1.39 x 10 -5 ± 1.06 x 10 -7
מים 1.50 x 10 -5

טבלה 2: מקדמי דיפוזיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

השלבים הקריטיים ביותר לניסויי דיפוזיה מוצלחים עם או בלי תאים הם: כראוי הקמת ההרכבה העובש; פיתוח המיומנות הידנית הנחוצה כדי למנוע נזק במהלך החילוץ של coverslips הידרופובי; הבטחה למצוא קו זינוק ליניארי טוב מאוד כדי לחשב את מקדם הדיפוזיה כראוי; לתקן חישובים ניסיוניים של שני קולגן וchemoattractant; נכון להשתמש במערכת הדמיה תא חי כדי להבטיח מטריצה ​​לא להתייבש; ושמירה על תרבות סטרילי, בריאה.

בעת ביצוע ניסויי דיפוזיה, זה הכרחי כדי לוודא מגרשי דיפוזיה להתאים את הצורות המסורתיות של מודל דיפוזיה ליניארי (איור 4).

ריצת הניתוח בכמה X-מקומות שונים בכל מדגם, ניתן לחשב את המקדמים הממוצע של דיפוזיה לrhodamine בריכוזים השונים של collagens, כפי שדווח בTa ble 2. תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם מחקר-מקדם הקודם של דיפוזיה דרך ירידות ג'ל קולגן כריכוז של קולגן ירד כתוצאה מגידול של נקבוביות במטריצה.

על פי משוואת מודל דיפוזיה במצב יציב, אחד מצפה לנו פרופיל ריכוז ליניארית בערכי x. על ידי התאמת פונקציה ליניארית לנקודות, אפשר לראות שהם כולם, בעובדה, ליניארי. R 2 הערך של התאמת קו מגמה ליניארי עבור כל אחד מהקווים בכושר הטובים ביותר בשלושת ריכוזי קולגן היה בבית או מעל 0.92. הנורמות של השאריות בכל החלקות להסיק היו 0.0227, מה שמעיד על כושר טוב. קשר לינארי זה בהסכם עם הפתרון אנליטי. הריכוז לא מתחיל ב 100%, כפי שניתן היה לצפות, כי ההדמיה לא מתחילה ממש בקצה של מדגם קולגן. זה גם בלתי אפשרי לכייל את ההדמיה בצורה מושלמת.

_content "> בנוסף, הצלחנו להפנות עיתונים אחרים שנראו בדיפוזיה בג'לים כדי להשוות תוצאות. Shenoy ורוזנבלט מצאו את מקדם דיפוזיה של BSA (רדיוס = 4 ננומטר) ב30 מ"ג / מיליליטר פתרון קולגן succinylated להיות 2.2 x 10 -7 סנטימטרים 2 / sec 32. הרדיוס של rhodamine הוא 0.78 ננומטר, מה שמסביר זמן דיפוזיה המהירה שלה באמצעות קולגן 24. במחקרי דיפוזיה, מקובל לנצל את הרדיוס כדי להשוות מולקולות. ככל שעולה הרדיוס, המשקל המולקולרי גם מגדיל. Ramanujan et al. מצא את מקדם הדיפוזיה של dextran (רדיוס = 6 ננומטר) בג'ל קולגן 20% פולימר (שווה ערך של 2.0 מ"ג / ג'לי ריכוז מיליליטר) להיות 4.72 x 10 סנטימטר 2 -8 / 24 שניות. שוב, זה דומה למקדם הדיפוזיה צפינו ל2.0 מ"ג / מיליליטר ג'ל הריכוז (D = 1.28 x 10 -6 סנטימטרים 2 / sec), אם ניקח בחשבון את ההבדל בגודל המולקולה. ההרבעה Leddy וGuilakמטען דיפוזיה של dextrans דרך סחוס במפרק 33. אפשר להשוות דיפוזיה דרך מטריצות קולגן ודרך סחוס במפרק, כי כשני שליש מהמסה של סחוס במפרק הוא קולגן פולימרים (סוג הרובה השני). Leddy וGuilak מצאו את מקדם דיפוזיה של 3 dextran kDa דרך סחוס במפרק להיות בין 6-10 x 10 -7 סנטימטרים 2 / sec 33. בידיעה שהמערכת עובדת כמו שצריך היינו אז מסוגל לחשב את הריכוז הספציפי בכל מקום במערכת, תוך שימוש במודלים זגזגו והעברת חום מערכת חולפת. מדד נוסף זה יכול לשמש בניסויי תא כדי לעקוב אחר הבנת תא-ריכוז ומדרון שיפוע.

משך זמן של ניסויים עשוי להיות גורם מגביל בעת השימוש בגישה שלנו. לכן, חשוב להשתמש בכיסוי למערכת ההדמיה תא החי כדי להבטיח את המטריצה ​​לא להתייבש. שימוש בכיסוי במהלך experimenTS, שהיינו מסוגל לעקוב אחר הצלחת דיפוזיה של rhodamine עד 7 שעות ו 4 שעות במהלך ניסויי תא ללא ייבוש ג'ל. אם אחד לא משתמש בכיסוי, ג'ל עשוי להתייבש מהר יותר ומשפיע על דיפוזיה ונדידה של תאים באופן משמעותי.

הפרוטוקול המתואר במסמך זה עושה שימוש במודל דיפוזיה מישוריים / מערכת מבוקרת היטב כדי להיות מסוגל למדוד כוחות התא בסביבת 3D בchemotaxis. כאן אנו מציגים מערכת פשוטה חדש שפותחה שיכול להיות מנוצלת לניסויי TFM / DVC. באמצעות מערכת זו, החוקרים יוכלו: 1) דיפוזיה מודל הצלחה באמצעות מטריצות קולגן 3D ולוודא, על ידי התאמת הנתונים לביטוי אנליטי, כי מערכת דיפוזיה השיפוע מישוריים, כאשר זרע עם תאים, צריכה לקדם chemotaxis ולא chemokinesis; 2) לחשב את מקדם הדיפוזיה לקולגן של חמישה ריכוזים שונים; ו 3) למצוא את הריכוז המסוים של chemoattractant בתוך די בהצלחהתא ffusion. עם זה מתקרב, אפשר להוסיף ולבחון chemotaxis תא עם מדדים ספציפיים לא בקלות וזמינה ללא גישות מייגע של מערכות רב-גוניות והדרגתיים דיפוזיה מורכבת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicone elastomer kit Dow Corning Corp 182 SIL ELAST KIT .5KG a two-part misture with a 10:1 mix
Live cell imaging chamber Live Cell Instrument CM-B18-1 CMB for 18 mm round coverslips
22 mm Glass Coverslip Fisher Scientific NC0180281 Neuvitro Corp. cover slip 22 mm 1.5
Machined aluminum metal cube
Hobby utility knife X-Acto X3201
3-(aminopropyl) trimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778-5ML
Glutaraldehyde Polysciences, Inc 00216A-10 Glutaraldehyde, EM Grade, 8%
50 ml tube Fisher Scientific 14-432-22 Standard floor model and tabletop centrifuges
Glass Petri dish Fisher Scientific 08-747A Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15 mm)
Forceps Fisher Scientific 22-327-379 Fine Point Forceps
Cover glasses Fisher Scientific 12-518-105A Rectangle; 30 x 22 mm; Thickness No. 1
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl Gelest SIT8174.0
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099 Acetic acid ACS reagent, ≥99.7%
Hexane Sigma-Aldrich 296090 anhydrous, 95%
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 200 proof, for molecular biology
High-precision diamond scribing tool Lunzer PV-081-3 Straight extended tip scribe, .020" (.50 mm) diameter by .200" (5.0 mm) tip length
Vacuum grease Dow Corning 14-635-5C High-Vacuum Grease
15 ml tube Fisher Scientific 14-959-49D 15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface
10x phosphate buffered solution Fisher Scientific BP399-500 1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer
1 N sodium hydroxide Sigma-Aldrich 38215 Sodium hydroxide concentrate
Collagen I, rat tail BD Biosciences 354236 Rat tail 
Micro centrifuge tube Fisher Scientific 02-681-332 Volume: 2.0 ml;
O.D. x L: 13 x 40 mm;
sterile; single-wrapped
Name Company Catalog Number Comments
Carboxylate-modified microspheres Invitrogen  F-8813 Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids
Rhodamine Sigma-Aldrich 83689 Rhodamine B for fluorescence

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adzick, N. S. The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair. Ann Surg. 225, (2), 236 (1997).
  2. Reddi, A. H. Bone morphogenetic proteins: an unconventional approach to isolation of first mammalian morphogens. Cytokine Growth F. R. 8, (1), 11-20 (1997).
  3. Coussens, , Werb, Z, L. M., Werb, Z. Inflammation and cancer. Nature. 420, (6917), 860-867 (2002).
  4. Vital-Lopez, F. G., Armaou, A., Hutnik, M., Maranas, C. D. Modeling the effect of chemotaxis on glioblastoma tumor progression. AIChE J. 57, (3), 778-792 (2011).
  5. Hughes-Alford, S. K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of gradient sensing: towards building predictive models of chemotaxis in cancer. Curr. Opin. Cell Biol. 24, (2), 284-291 (2012).
  6. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat. Rev. Mol Cell Bio. 10, (7), 445-457 (2009).
  7. Cristini, V. Morphologic Instability and Cancer Invasion. Clin. Cancer Res. 11, (19), 6772-6779 (2005).
  8. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453, (7191), 51-55 (2008).
  9. Parent, C. A., Devreotes, P. N. A cell's sense of direction. Science. 284, (5415), 765-770 (1999).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  11. Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, (6), 1650-1656 (1975).
  12. Rosoff, W. J., McAllister, R., Esrick, M. A., Goodhill, G. J., Urbach, J. S. Generating controlled molecular gradients in 3D gels. Biotechnol. Bioeng. 91, (6), 754-759 (2005).
  13. Wells, A., Kassis, J., Solava, J., Turner, T., Lauffenburger, D. A. Growth factor-induced cell motility in tumor invasion. Acta Oncol. 41, (2), 124-130 (2002).
  14. Wilkinson, P. C. Assays of leukocyte locomotion and chemotaxis. J. Immunol. Methods. 216, (1-2), 139-153 (1998).
  15. Bonvin, C., Overney, J., Shieh, A. C., Dixon, J. B., Swartz, M. A. A multichamber fluidic device for 3D cultures under interstitial flow with live imaging: development, characterization, and applications. Biotechnol. Bioeng. 105, (5), 982-991 (2010).
  16. Noo, L. J., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, (8), 826-830 (2002).
  17. Shao, J., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab Chip. 9, (21), 3118-3125 (2009).
  18. Haessler, U., Kalinin, Y., Swartz, M. A., Wu, M. An agarose-based microfluidic platform with a gradient buffer for 3D chemotaxis studies. Biomed. Microdevices. 11, (4), 827-835 (2009).
  19. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat. Rev. Cancer. 3, (5), 362-374 (2003).
  20. Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol. Biol. 769, 149-165 (2011).
  21. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J. Cell Biol. 75, (2 Pt 1), 606-616 (1977).
  22. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J. Cell. Sci. 99, (Pt 4), 769-775 (1991).
  23. Gilbert, D. L. Macromolecular diffusion through collagen membranes. Int. J. Pharm. 47, (1-3), 79-88 (1988).
  24. Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys. J. 83, (3), 1650-1660 (2002).
  25. Weadock, K., Silver, F. H., Wolff, D. Diffusivity of 125I-calmodulin through collagen membranes: effect of source concentration and membrane swelling ratio. Biomaterials. 7, (4), 263-267 (1986).
  26. Erikson, A., Andersen, H. N., Naess, S. N., Sikorski, P., Davies, C. dL. Physical and chemical modifications of collagen gels: impact on diffusion. Biopolymers. 89, (2), 135-143 (2008).
  27. Moghe, P. V., Nelson, R. D., Tranquillo, R. T. Cytokine-stimulated chemotaxis of human neutrophils in a 3-D conjoined fibrin gel assay. J. Immunol. Methods. 180, (2), 193-211 (1995).
  28. Sundd, P., et al. Live cell imaging of paxillin in rolling neutrophils by dual-color quantitative dynamic footprinting. Microcirculation. 18, (5), 361-372 (2011).
  29. Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors. J. Vis. Exp. (63), 2754 (2012).
  30. Stephenson, F. H. Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory 2e. Elsevier Science. (2010).
  31. Bar-Kochba, E., Toyjanova, J., Andrews, E., Kim, K., Franck, C. A Fast Iterative Digital Volume Correlation Algorithm for Large Deformations. Exp. Mech. In press, (2014).
  32. Shenoy, V., Rosenblatt, J. Diffusion of Macromolecules in Collagen and Hyaluronic Acid, Rigid-Rod-Flexible Polymer Composite Matrixes. Macromolecules. 28, (26), 8751-8758 (1995).
  33. Leddy, H., Guilak, F. Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching. Ann. Biomed. Eng. 31, (7), 753-760 (2003).
מישורי צבע מערכת דיפוזיה לחקירת Chemotaxis בקולגן מטריקס 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stout, D. A., Toyjanova, J., Franck, C. Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (100), e52948, doi:10.3791/52948 (2015).More

Stout, D. A., Toyjanova, J., Franck, C. Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (100), e52948, doi:10.3791/52948 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter