Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Planar Gradient Diffusion System for å etterforske Chemotaxis i en 3D Collagen Matrix

doi: 10.3791/52948 Published: June 12, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den foretrukne bevegelse av celler mot en konsentrasjonsgradient, kjent som kjemotaxis, spiller en viktig rolle i patologiske og fysiologiske prosesser i kroppen. Slike eksempler er hud og slimhinner sårheling 1, morfogenese 2, 3 inflammasjon, tumorvekst og 4,5. Det er også blitt vist at kreftceller kan migrere gjennom både individuelle og kollektive celle-migrering strategier 6. Videre kan diffusjonelle ustabilitet mekanismer tale skillet mellom enkle eller gruppert celler fra en tumorous kropp / objekt og deretter kan immigrere mot en kilde til næringsstoffer og dermed invadere større områder og vev 7.

Videre har det vist seg at forskjellige migrasjons mekanismer kan være aktive i 2D og 3D, på grunn av forskjellige roller av adhesjonsmolekyler 8. Derfor, for å flytte til fysiologisk relevant in vitro undersøke cellemotilitet i en measureable og enkel måte er av betydning for å forstå celle bevegelse fenomener 9. Dessverre, vanskeligheten i å analysere cellemigrasjon, en omfattende kvantifiserbare kjemotaksis analysen krever vanligvis en lang strevsom metoden, som ble grunnlagt på måling av artikler cellemotilitet og transport fenomener modeller.

Tidligere eksperimentelle tilnærminger for å undersøke celle kjemotaksis inkluderer Boyden kammeret 10 og de ​​under agarose analysen 11. Men innenfor disse tidlige analyser, cellemigrasjon eksperimenter ikke overvåke bevegelser i forhold til tid. Mer, viktigere, konsentrasjonsgradienter anvendt for eksperimentene var ikke godt definert, eller helt ut forstått, mens bare opprettholde signalisering for ikke mer enn noen få timer. Videre tidlig kjemotaksis kammerforsøk begrenset celle migrasjon til to dimensjoner og ikke tillate en å overvåke kinetikk ved migrasjon 12. Ser på Boyden kammer, et endepunkt assayville ikke tillate forskeren å observere migrasjon visuelt og kunne ikke direkte skille kjemotaksis (directional bevegelse) fra chemokinesis (tilfeldig bevegelse). I tillegg flere variabler-forskjeller i størrelse pore og tykkelse av membraner lagde kammeret svært vanskelig for enkelt å reprodusere og skjulte migrant reaksjon av celler til chemokiner 13,14.

Med den nye forståelsen av MicroFluidics har nye kamre og mikro-enheter blitt etterforsket som et instrument for å undersøke cellebevegelse henhold interstitiell strømningsforhold eller kjemotaksis 15,16. Under disse nye enheter, ble nye celletall innført og undersøkt, som effekten av skjærspenning på en celle 17,18. Dessverre, tidligere og nåværende microfluidic kjemotaksis kamre begrenset studier av cellemigrasjon til 2D underlag-en viktig tilbakeslag siden mange biologiske prosesser, herunder svulst celle invasjon og metastasering, og immune cellemigrasjon, involvere 3D migrasjon.

Direkte observasjon-kamre, hvor en kjemoattraktant løsning er i kontakt med en 3D-gel inneholdende celler har også blitt rapportert også 19,20. Disse kamre har to avdelinger, en som inneholder en kjemoattraktant og en inneholdende celler, er sammenføyet ved siden av hverandre horisontalt 21 eller som konsentriske ringer 22. Disse systemene er påpekt i riktig retning, men ikke holde en kjemotakse systemet i en lengre tidsperiode.

Videre har forskere også undersøkt diffusivitet gjennom kollagen membraner i dialyseceller, samt diffusjon av sporstoffmolekyler gjennom kollagen prøvene utsatt for hydrostatisk trykk 23-25. Noen eksperimenter diffusjon i kollagen-geler er avhengige av fysiske og kjemiske modifikasjoner av den under anvendelse av magnetiske felt og kjemisk inkorporering 26. En populær metode for modellering diffunderbarhet i collagenous vev er avhengig av fluorescens avbildning av kontinuerlig punkt fotobleking. Denne metoden har vist anisotropi i diffusjonskoeffisientene av makromolekyler i orienterte kollagenholdige vev. Likevel har fotobleking blitt brukt i leddbrusk og ikke kollagen matriser. Mens lignende, må de nødvendige modellforsøk gjennomføres spesielt å forstå diffusjonskoeffisienten av kollagen geler. Enda viktigere, gjør systemene ikke benytter en metode for å måle cellestyrkegenerering.

Dessverre har de fleste systemer synes å mangle en eller to sentrale elementer for et ideelt system: den tillater sporing av cellen, en diffusjon gradient forståelse med en kjemotaktisk faktor gjennom matriksen, et forholdsvis enkelt satt opp med en enkel reproduserbarhet, minimering av celle-celleinteraksjoner, og evnen til å måle dimensjons enheter for kvantifisering (dvs. hastighet, styrke, bestemt konsentrasjon). Moghe et al. 27 foreslått et system som oppfylte de fleste av disse krav, hvor cellene ble først dispergert i gelen i stedet for konsentrert på filterflaten, men var vanskelig å måle krefter som cellen genererer.

For dette formål, presenterer vi et plant gradient diffusjon system for å undersøke chemotaxis i et 3D kollagen matriks, som gjør det mulig å overvinne moderne diffusjonskammer begrensningene ved eksisterende analyser, som er basert på tidsforsinkelse mikroskopi, kombinert med bildeanalyseteknikker for å måle celle styrker i et 3D-miljø. Denne protokollen er en enkel, men likevel innovativ måte å skape en enkel 3D diffusjonskammer som kan brukes til å undersøke 3D chemotaxis i forskjellige celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. 3D Mold Design og deler

  1. Form
    1. Før du arbeider, få en silikon elastomer kit, en levende celle bildebehandling kammeret, en 22 mm dekkglass, og en maskinert aluminium metall kube med dimensjoner 10,07 mm x 3,95 mm x 5,99 mm. Forbered levende celle bildebehandling kammeret for støping ved å plassere dekkglass i bunnen holderen og montering resten av kammeret som anvist av leverandøren.
    2. Deretter bruker tang, plasserer maskinert aluminium metall kube i midten av levende celle bildebehandling kammerhuset og på toppen av dekkglass, og sett til side.
    3. Bland silikon elastomer løsninger i henhold til produsentens protokoll for å gjøre 5 ml elastomer.
    4. Ved hjelp av en disponibel lab slikkepott, hell silikon elastomer løsning i levende celle bildebehandling kammeret oppsett og sørge for ikke å flytte plassert maskinert aluminium metall kube. Plasser systemet på laboratoriebenken, på et trygt sted O / N for herding.
    5. Neste morgen, dekonstruerelevende celle bildebehandling kammer, som anbefalt av produsenten og trekk ut mold med tang. Bruk pinsett, nøye trekke ut maskinert aluminium metall kube fra mold. Gå til vasken og skyll formen med avionisert vann. Sett formen på et papir håndkle for å tørke.
    6. Når det er tørt, ved hjelp av en hobby verktøy kniv, skjære slisser gjennom formen, adskilt 2,34 mm fra hver langsgående ende, inne i silikonformen. Sikre form forblir i et trygt og tørt sted før du er klar til å bygge systemet for et eksperiment.
  2. Hydrofile og hydrofobe Glass Dekk Forberedelse
    1. Å tillate kollagenmatriksen å følge en overflate, lage hydrofile Dekk:
      1. Ved hjelp av en engangspipette, måle ut 150 ul av 3-aminopropyl-trimetoksysilan og helle løsningen i et 50 ml rør. Tilsett 30 ml av 100% etanol til 50 ml rør med et andre engangs pipettes og lukke lokket. Vortex løsningen i 2 min, noe som sikrer fullstendig blanding. Pvår løsning i et glass petriskål og sett til side.
      2. Hell 15 ml 100% etylalkohol i en andre petriskål og sett til side (husk å merke retter).
      3. Ved hjelp av en ny engangs pipettes, måle ut 30 ml avionisert vann og helle løsningen i et 50 ml rør. Deretter bruker en ny engangs pipettes måle ut 1875 ul glutaraldehyd og helles oppløsningen inn i samme 50 ml rør og lukke lokket. Vortex løsningen i 2 min, noe som sikrer fullstendig blanding. Hell blandingen i tredje petriskål, og sett til side.
      4. Bruk pinsett, ta ut en 22 mm runde dekkglass og skyll begge sider med 100% etanol blanding ved hjelp av en engangs pipette.
      5. Plasser renset dekkglass i 3-aminopropyl-trimetoksysilan med 30 ml 100% etanol-løsning fatet og la den sitte i oppløsningen i 5 minutter.
      6. Med pinsett, tar ut glass dekkglass og skylles igjen med 100% etanol-løsning med engangspipette.
      7. Drop skylles dekkglass i 1875ul av glutaraldehyd og 30 ml avionisert vann og blandingen satt til side i 30 minutter.
      8. Etter 30 minutter fjernes dekkglass med pinsett og skylles med avionisert vann, og plasser den tørre vev O / N for å tørke ved romtemperatur.
      9. Gjenta dekk dypping og beveger seg til så mange som nødvendig dekk med de samme genererte løsninger.
    2. Gjør hydrofobe Dekk av den gitte protokollen.
      1. Legg 500 mL av tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl, 100 pl eddiksyre og 19,4 ml heksan i et 50 ml rør og vortex i 2 min. Hell løsningen i glass petriskål og sett til side.
      2. Ved hjelp av rene pinsett, ta ut ett glass dekkglass og slippe inn forberedt blandet løsning for 2 min. Etter 2 minutter har gått, ta ut dekkglass med pinsett og skyll med avionisert vann ved hjelp av en engangs pipette og sted dekkglass på tørt vev O / N tørke ved RT. Oppbevares dekk i plast petriskåler til det brukes.
      3. Gjenta dekk dipping og beveger seg til så mange som nødvendig dekk med de samme genererte løsninger.

2. Mold Assembly

  1. Før du bruker former ved hjelp av en engangspipette skyll formen med 90% etylalkohol over en beholder for kjemisk avfall. Deretter plasserer formen i en petriskål fylt med avionisert vann og la det sitte O / N.
  2. Ta formen ut av løsningen ved hjelp av pinsett og legg på et håndkle for å lufttørke før du starter formsammenstillingen.
  3. Mens formen er lufttørking, kuttet de firkantede file Dekk i to rektangler litt større enn 3,95 mm x 5,99 mm ved hjelp av en høy presisjon diamantrisseverktøy. Slide hvert kutt rektangel dekkglass i sporene skåret i silikonformen.
  4. Flip formen opp ned og anvend vakuum fett langs bunnen av silikonformen ved hjelp av en engangspipette. Neste, snu formen tilbake høyre side opp og trykker på bunnen av formen på de runde hydrofile glassdekslerleppe for å skape en tetning.
  5. Med engangshansker, plukke opp den sammensatte formen og legg inn en engangspetriskål og deretter inn i en bio-hette. Slå på UV Bio-hette lampe for 1 time å sterilisere formen før eksperimentering oppstår.

3. Kollagen blandingen og 3D Matrix

  1. Før fremstilling av kollagen blandingen, beis og forberede celler for avbildning i henhold til standard protokoller 28.
  2. Ved hjelp av standard laboratorieteknikker og protokoller 29,30, i en bio-hette, bland celle medier og kjemotiltrekkende i en 15 ml tube til ønsket kjemotiltrekkende konsentrasjon. Pipette 5 ml bestemt celle media-kjemotiltrekkende konsentrasjon løsning i en 15 ml tube og flytte løsningen i et oppvarmet vannbad.
  3. Ved hjelp av en pipette, trekke ut 5 ml bare celle medier i en annen 15 ml tube og plasser i en oppvarmet vannbad for å varme opp løsningen for mikroskopi eksperimenter.
  4. I en bio-hette, pipette 30 mL av 10x fosfatbuffered løsning (PBS) inn i mikro- sentrifugerør. Tilsett 6 pl 1 N natriumhydroksyd (NaOH) i samme mikro- sentrifugerør og vortex i 15 sek.
  5. Skaff kollagen I rottehale løsning fra kjøleskapet og flytte til bio-hetten med standard laboratorieteknikker og protokoller 29. Sørg for at kollagen er fortsatt kaldt. Pipette 168,3 mL av kollagen i samme mikro sentrifugerør.
  6. Tilsett deretter 18 pl av gul-grønn fluorescerende karboksylsyremetylester-modifiserte mikrokuler ved anvendelse av en pipette til den samme mikrosentrifugerøret. Vortex mikrosentrifugerøret med alle løsningene i 30 sek.
  7. Legg 77,7 mL av ønsket cellemedier-celleblanding (ca. 2 x 10 6 celler / ml konsentrasjon) i mikro- sentrifugerør og blandes ved hjelp av pipettespissen i 20 sekunder. Som det er nødvendig, forandre matriksdensitet ved å følge den tilpassede kollagen blandingen tilpasset for tilsetning av fluorescerende kuler og celleviabilitet tabell (tabell 1).
  8. Pipette 300 & #181; l av kollagen-celleblanding i sentrum brønn (brønn # 2) av den tilberedte formsammenstillingen. Plasser formen på en engangs petriskål og flytte den inn i en standard inkubator i 20 minutter ved 37 ° C med 5% CO2.
  9. Fjern systemet fra inkubator og plassere tilbake i bio-hette. Ved hjelp av pinsett, fjerne både hydrofobe dekkglass ved å klemme inn på toppen av hver dekkglass og trekke opp og bort fra formen.
  10. Bevege hele systemet til det ønskede mikroskopi og bilde for å sikre kollagen støpeformsidene er fortsatt rett til å tillate en plan diffusjon gradient.
  11. Med systemet fremdeles under mikroskop, ved hjelp av en 100 pl enkelt-kanal pipette, tilsett 100 ul av cellematerialet inn i brønn # 1. Deretter bruker en 100 mL én kanal pipette legge 100 mL av cellemateriale med ønsket kjemotiltrekkende konsentrasjon i brønn # 3.
  12. Umiddelbart etter å ha lagt løsninger i begge brønnene, starte bildebehandling.

4. Imaging og DiffusionModellering

  1. Hvis man ønsker å finne diffusjonskoeffisienten for den spesifikke tetthet kollagen for å beregne den spesifikke konsentrasjon følge protokollen nedenfor:
    1. Følg gitt protokoll over tittelen "Kollagen blandingen og 3D Matrix", i stedet for å generere celle media med ønsket kjemoattraktant konsentrasjon, lage fem mikrometer rhodamin i en 15 ml tube ved hjelp av standard beregninger og protokoller 30.
    2. Bilde 3D kollagen matriser med konfokal system montert på et invertert mikroskop ved hjelp av en argonlaser (488 nm) for å fange fluorescens. Bilde hver 2 eller 3 sek for opptil 7 timer.
  2. For Diffusion Modeling: Bruke den matematiske modellen vist nedenfor, skrive et beregningsprogramvarekode for bearbeiding og analyse med disse generelle trinnene.
    Ligning 1
    1. Importere bilder til beregningsprogramvare for oppskalering og normalisering av den maksimale Intensity. Konvertere bilder til en grå farge-kart over bildet for å velge den kanten. Plukk en akse langs midten av bildet, til høyre for midten og til venstre for midten.
    2. Ved hjelp av beregningsprogramvarekoden, plotte den normaliserte intensiteten, sammen med den sanne intensitet og forskjellen mellom de to.
    3. Neste, innspill parametrene som er nødvendige for montering (konsentrasjon, tid og lengde).
    4. Plott den normaliserte konsentrasjonen som funksjon av tiden, og konsentrasjonsprofilen over x-aksen med en polynomisk tilpasning til dataene.
    5. Beregn koeffisienten for diffusjon ved hjelp av beregningsprogramvarekode.

5. Eksperimentelle målinger

  1. Med henvisning tilbake til diffusjonsligningen, omskrive ligningen for å finne den spesifikke konsentrasjon på ethvert sted i systemet som er vist i nedenfor.
    Ligning 2
    Hvor:
    L = Lengde på the kollagenmatriksen
    x = plassering under etterforskning
    D = koeffisient for diffusjon
    t = medgått tid
  2. Under kjemotaksi eksperimenter, sørge for å registrere bestemt tidspunkt at det øyeblikket kjemokinet ble lagt inn i systemet. Når cellemigrasjon bevegelse blir funnet, må du sørge for å registrere konfokal intervallopptak, og legg merke til bestemt tid og sted fra kanten der bildebehandling skjedde.
  3. Under dataanalyse, kobler den kjente medgått tid, sted og koeffisient for diffusjon av den spesifikke celle inn i ligningen for å finne den normaliserte konsentrasjonen bestemt ved ethvert punkt innenfor kollagen for både diffusjon og celleforsøk.

6. Tracking Cell Migration Utnytte TFM

  1. Å spore celle migrasjon ved hjelp TFM / DVC teknikker følge protokollen under:
    1. Etter tilsetning av ønskede kjemoattraktant konsentrasjon i brønn # 3, begynner å avbilde 3D kollagen matriser med et konfokalt system montert på en omvendt MICRoscope å finne en celle for å undersøke.
    2. Når en celle beveger seg blir funnet ved å plassere cellen i midten av synsfeltet, og benytter en piezoelektrisk motor (til bildet i z-aksen), bildet hver 1 eller 2 minutter.
    3. For beregning av cellestyrkegenerering og deformasjon, generere en beregningsorientert kode for å finne de forskyvninger av fluorescens perlene etter de TFM / DVC protokoller 31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Muligheten av denne analysen for nøyaktig å vurdere migrering av cellen er avhengig av et godt oppsett av systemet. Derfor er det avgjørende for sørge for å utforme diffusjon system mold nøyaktig og tar stor forsiktighet i å plassere både hydrofobe og hydrofile Dekk, som vist i figur 1. Hvis systemet er riktig utformet og i løpet av diffusjon modellering scenen sikre å finne en svært god lineær startstreken, er man i stand til å oppnå fin fluorescerer bilder, som vist i figur 2, for å analysere diffusjon av systemet.

Nøkkelen til en vellykket celle kjemotaksis-analyse er modellering diffusjon og å løse den generelle diffusjonsligningen for å finne koeffisienter for diffusjon og spesifikk konsentrasjon ligning gjennom en beregningsprogramvare generert kode. Etter import bildene inn i beregningsprogramvare og kjører analysen (figur 3), koeffisienten diffusjonkan undersøkes (tabell 2). Figur 4 viser plott av diffusjon av rodamin gjennom de fem testede konsentrasjoner kollagen. Formene av diffusjonen plottet møter den tradisjonelle form av en lineær diffusjonsmodell. Det kan sees at diffusjon av rodamin er omvendt proporsjonal med konsentrasjonen av kollagen-lavere kollagenet densitet jo raskere diffusjon. Dette er å forvente, da denne konsentrasjon av kollagen har en høyere porøsitet. De horisontale linjer i kollagen diffusjon tomt i en konsentrasjon på 1,5 mg / ml (figur 4B) er ganske enkelt et resultat på over metning av sporsignalet. Enda viktigere, som vist i figur 4 Hver linje representerer et bestemt punkt (x, y) på innsiden av kollagen, mens til tid øker den normaliserte konsentrasjonen overskrider aldri tidligere punkt samtidig (dt), som indikerer ingen reversering av kjemikaliet. Dette er en viktig egenskap ved et Chemotaxis kammeret for å tillate direkte strøm av en kjemoattraktant uten tilbakestrømning.

Ved å undersøke de siste ti bilder på hver X sted, er man i stand til å generere et plott av steady-state-konsentrasjon av rodamin på hvert av stedene. Ved å ekstrapolere over hele prøven lengde (figur 5), kan man se på hele utvalget. Dette indikerer at den lineære gradient diffusjon er konsistent over hele prøvelengde, som kan benyttes for celleforsøk (figur 6).

Figur 1
Figur 1: En skjematisk av planar gradient diffusjon system mold montering i levende celle bildebehandling kammeret (1) En datamaskin gjengivelse av komplett system bestående av (fra bunn til topp) en bunnhus (c) en hydrofil 22 mm dekkglass, mold,. top boliger, og et glassdeksel. (2) Mål på mo ld der (a) kuttet inserts vises. (3) Mold med kollagen matrise med (b) hydrofobe Dekk på hver side raste i kuttet setter inn for å opprette tre-godt system. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Eksempel på rodamin mikroskopi bilder i collagen Representative bilder tatt under rhodamin diffusjon eksperimenter, på samme z-aksen stedet, i planar gradient diffusjon system med 1,0 mg / ml kollagen konsentrasjon.. Skala bar = 500 um, hvor (a) er 0 min (b) 3 min (c) 7 min, og (d) 15 min etter rodamin ble tilsatt til kammeret. Pilen indikerer retningen for diffusjon av rodamin gjennom kollagenmatriksen.e.com/files/ftp_upload/52948/52948fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Fig. 3: Eksempel på analyse og oppsummering av diffusjon beregninger som genereres av beregningsprogramvare kode med en 2,5 mg / ml collagen-konsentrasjon (A) svart-hvitt gjengivelse av utgangs (dt = 0) image lastet inn i beregningsprogramvare for analyse. (B) Spesifikke punkter valgt av brukeren for intensitet sammenligning og for diffusjon beregninger (x, y-aksen er i piksler). (C) Diffusjon profil rodamin hele kollagenmatriksen, hvor hver linje korrelerer til et rødt punkt i bildet B. (D) konsentrasjonsprofil av rodamin i løpet av kollagen matriks ved steady-state. (E) Sammenligning mellom glattet data (blue dot) og sanne data fra diffusjon eksperiment (rød prikk) med forskjellen mellom glattet og sann (grønn prikk). (F) Normalisert konsentrasjon av sann (rød prikk) og utstyrt (grønn prikk) data fra beregningsprogramvarekode gjennom hele forsøket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Fig. 4: Eksempel på diffusjon gjennom profil kollagen matrise ved hjelp av plane gradient diffusjon system på forskjellige punkter Hver linje indikerer en annen valgt datapunkter valgt fra beregningsprogramvarekode av brukeren. Kollagenmatriksen ved en tetthet av (a) 1,0 mg / ml (B) 1,5 mg / ml (c) 2,0 mg / ml (d) 2,2 mg / ml og (E rong>) 2,5 mg / ml. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5:. Eksempel på en konsentrasjon (normalisert) profil rodamin hele kollagen matrise ved hjelp av planar gradient diffusjon system ved steady-state Circles er spesifikke datapunkter valgt om beregningsprogramvarekoden av brukeren. Rød linje konstruert ved hjelp av datapunkter og ekstrapolere beste line-fit (med R2 verdi vist) for å vise rhodamin konsentrasjon gjennom hele kollagen matrise. Kollagenmatriksen ved en tetthet av (a) 1,0 mg / ml (B) 1,5 mg / ml (c) 2,0 mg / ml (d) 2,2 mg / ml og (E) 2,5 mg / ml.2948fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6: Eksempel på cellemigrering eksperimentene A Z-skive mikroskopbilde av en nøytrofil migrering i 3D-planar gradientsystem.. Neutrofil migrerer mot kjemotiltrekkende gradient (hvite pilen viser retningen av gradienten og trekant viser den konsentrasjonsprofil), hvor stjernen indikerer startposisjonen for cellen ved starten av forsøket. Subplot viser celle i 3D-rom, hvor pilen indikerer neste gang-punkt retning. Scale bar = 10 mikrometer. dt = 5 min mellom bilder (dvs. AB). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Kollagen Cell Density PBS Fluoriserende perler NaOH Collagen jeg Rat Tail Media
2,5 mg / ml 10% 6% 2% 70.20% 11.80%
2,2 mg / ml 10% 6% 2% 61,70% 20.30%
2,0 mg / ml 10% 6% 2% 56.10% 25.90%
1,5 mg / ml 10% 6% 2% 42.10% 39.90%
1,0 mg / ml 10% 6% 2% 28.10% 53.90%

Tabell 1: Custom collagen blanding tilpasset for tilsetning av fluorescerende kuler og celleviabilitet.

Konsentrasjon av kollagen Gel Koeffisient av Diffusion (cm 2 / sek)
2,5 mg / ml 1,03 x 10 -6 ± 2.54 x 10 -7
2,2 mg / ml 1,28 x 10 -6 ± 3.53 x 10 -7
2,0 mg / ml 6,48 x 10 -6 ± 1.66 x 10 -7
1,5 mg / ml 1.05 x 10 -5 ± 2.04 x 10 -7
1,0 mg / ml 1,39 x 10 -5 ± 1,06 x 10 -7
Vann 1,50 x 10 -5

Tabell 2: Faktor for diffusjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De mest kritiske trinn for vellykket spredningsforsøk med eller uten celler er: riktig å sette opp mold forsamlingen; utvikle den nødvendige fingerferdighet for å hindre skader under ekstraksjon av hydrofobe Dekk; sørge for å finne en veldig god lineær startstreken til riktig beregne diffusjonskoeffisient; korrigere eksperimentelle beregninger av både kollagen og kjemotiltrekkende; riktig bruk av levende celle imaging system for å sikre matrise tørker ikke ut; og opprettholde en steril, sunn kultur.

Når du driver diffusjon eksperimenter, er det viktig å sørge for at diffusjon tomter matche tradisjonelle former av en lineær diffusjon modell (figur 4).

Kjøre analyse på flere forskjellige x-steder på hver prøve, er det mulig å beregne den gjennomsnittlige koeffisientene til diffusjon for rhodamin i de forskjellige konsentrasjoner av kollagen, som rapportert i Ta old 2. Disse resultatene er i overensstemmelse med tidligere undersøkelser-koeffisient av diffusjon gjennom kollagen gel avtar når konsentrasjonen av kollagen redusert på grunn av en økning av porøsitet i grunnmassen.

Ifølge diffusjon modelligningen ved steady-state, forventer man å ha en lineær konsentrasjonsprofil over x-verdier. Ved å tilpasse en lineær funksjon til punktene, kan man se at de er, faktisk, lineær. R 2 Verdien av å tilpasse en lineær trendlinje for hver av de best tilpassede linjer for de tre kollagenkonsentrasjon var på eller over 0,92. Normer residualene i alle ekstrapolert tomter var 0,0227, noe som indikerer en god passform. Dette lineære forhold er i overensstemmelse med den analytiske løsning. Konsentrasjonen begynner ikke ved 100%, som ville være forventet, fordi bilde ikke begynner direkte ved kanten av kollagen prøven. Det er også umulig å perfekt kalibrere bildebehandling.

_content "> I tillegg var vi i stand til å referere til andre papirer som så på diffusjon i gels å sammenligne resultater. Shenoy og Rosenblatt fant diffusjonskoeffisient BSA (radius = 4 nm) i en 30 mg / ml succinylated kollagen løsning å være 2,2 x 10 -7 2 cm / sek 32. Radien av rodamin er 0,78 nm, noe som forklarer dens hurtigere diffusjon gang gjennom 24 kollagen. I diffusjon studier, er det vanlig å benytte radius for å sammenligne molekyler. som radius øker, vil molekylvekten også øker. Ramanujan et al. fant diffusjonskoeffisienten dekstran (radius = 6 nm) i 20% kollagen polymeriserte gel (tilsvarende 2,0 mg / ml konsentrasjon gels) til å være 4,72 x 10 -8 2 cm / sek 24. Igjen Dette er sammenlignbart med diffusjonskoeffisienten vi observert for 2,0 mg / ml konsentrasjon gel (D = 1,28 x 10 -6 2 cm / sek), hvis vi tar hensyn til molekylstørrelse forskjell. Leddy og Guilak studIED diffusjonen av dekstraner gjennom leddbrusk 33. Det er mulig å sammenligne diffusjon gjennom kollagen-matriser og gjennom leddbrusk fordi omtrent to tredjedeler av massen av leddbrusk er polymere kollagen (overveiende type II). Leddy og Guilak funnet diffusjonskoeffisienten av 3 kDa dekstran gjennom leddbrusk til å være mellom 6-10 x 10 -7 2 cm / sek 33. Å vite at systemet fungerer som det skal vi var da i stand til å beregne den spesifikke konsentrasjonen hvor som helst i systemet, ved hjelp av sagtannet og forbigående system varmeoverføring modeller. Denne ekstra beregning kan brukes under celleforsøk for å spore celle-konsentrasjon forståelse og gradient skråningen.

Varigheten av eksperimenter kan være en begrensende faktor når du bruker vår tilnærming. Derfor er det viktig å bruke et dekke for live cell imaging system for å sikre matrisen ikke tørker ut. Ved hjelp av et deksel under experiments, var vi i stand til å overvåke spredningen av rodamin opp til 7 timer og 4 timer i løpet av celleforsøk uten gelen tørke opp. Hvis man ikke bruker et deksel, kan gelen tørke opp raskere og påvirke diffusjon og migrasjon av celler.

Protokollen beskrevet her anvender en velkontrollert planar diffusjonsmodell / system for å være i stand til å måle celle krefter i et 3D-miljø under kjemotakse. Her presenterer vi en nyutviklet enkelt system som kan benyttes for TFM / DVC eksperimenter. Ved hjelp av dette systemet, vil forskerne kunne: 1) vellykket modell diffusjon gjennom 3D kollagen matriser og bekrefte, ved å tilpasse data til analytiske uttrykk, at planar gradient diffusjon system, når sådd med celler, bør fremme kjemotaksis og ikke chemokinesis; 2) beregne koeffisienten til diffusjon for kollagen av fem forskjellige konsentrasjoner; og 3) med hell finne den spesifikke konsentrasjonen av kjemoattraktant i diffusion kammeret. Med denne tilnærminger, kan man videre undersøke celle kjemotaksis med konkrete beregninger ikke lett og lett tilgjengelig uten arbeidskrevende metoder for mangefasetterte systemer og komplekse diffusjon stigninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicone elastomer kit Dow Corning Corp 182 SIL ELAST KIT .5KG a two-part misture with a 10:1 mix
Live cell imaging chamber Live Cell Instrument CM-B18-1 CMB for 18 mm round coverslips
22 mm Glass Coverslip Fisher Scientific NC0180281 Neuvitro Corp. cover slip 22 mm 1.5
Machined aluminum metal cube
Hobby utility knife X-Acto X3201
3-(aminopropyl) trimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778-5ML
Glutaraldehyde Polysciences, Inc 00216A-10 Glutaraldehyde, EM Grade, 8%
50 ml tube Fisher Scientific 14-432-22 Standard floor model and tabletop centrifuges
Glass Petri dish Fisher Scientific 08-747A Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15 mm)
Forceps Fisher Scientific 22-327-379 Fine Point Forceps
Cover glasses Fisher Scientific 12-518-105A Rectangle; 30 x 22 mm; Thickness No. 1
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl Gelest SIT8174.0
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099 Acetic acid ACS reagent, ≥99.7%
Hexane Sigma-Aldrich 296090 anhydrous, 95%
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 200 proof, for molecular biology
High-precision diamond scribing tool Lunzer PV-081-3 Straight extended tip scribe, .020" (.50 mm) diameter by .200" (5.0 mm) tip length
Vacuum grease Dow Corning 14-635-5C High-Vacuum Grease
15 ml tube Fisher Scientific 14-959-49D 15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface
10x phosphate buffered solution Fisher Scientific BP399-500 1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer
1 N sodium hydroxide Sigma-Aldrich 38215 Sodium hydroxide concentrate
Collagen I, rat tail BD Biosciences 354236 Rat tail 
Micro centrifuge tube Fisher Scientific 02-681-332 Volume: 2.0 ml;
O.D. x L: 13 x 40 mm;
sterile; single-wrapped
Name Company Catalog Number Comments
Carboxylate-modified microspheres Invitrogen  F-8813 Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids
Rhodamine Sigma-Aldrich 83689 Rhodamine B for fluorescence

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adzick, N. S. The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair. Ann Surg. 225, (2), 236 (1997).
  2. Reddi, A. H. Bone morphogenetic proteins: an unconventional approach to isolation of first mammalian morphogens. Cytokine Growth F. R. 8, (1), 11-20 (1997).
  3. Coussens, , Werb, Z, L. M., Werb, Z. Inflammation and cancer. Nature. 420, (6917), 860-867 (2002).
  4. Vital-Lopez, F. G., Armaou, A., Hutnik, M., Maranas, C. D. Modeling the effect of chemotaxis on glioblastoma tumor progression. AIChE J. 57, (3), 778-792 (2011).
  5. Hughes-Alford, S. K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of gradient sensing: towards building predictive models of chemotaxis in cancer. Curr. Opin. Cell Biol. 24, (2), 284-291 (2012).
  6. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat. Rev. Mol Cell Bio. 10, (7), 445-457 (2009).
  7. Cristini, V. Morphologic Instability and Cancer Invasion. Clin. Cancer Res. 11, (19), 6772-6779 (2005).
  8. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453, (7191), 51-55 (2008).
  9. Parent, C. A., Devreotes, P. N. A cell's sense of direction. Science. 284, (5415), 765-770 (1999).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  11. Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, (6), 1650-1656 (1975).
  12. Rosoff, W. J., McAllister, R., Esrick, M. A., Goodhill, G. J., Urbach, J. S. Generating controlled molecular gradients in 3D gels. Biotechnol. Bioeng. 91, (6), 754-759 (2005).
  13. Wells, A., Kassis, J., Solava, J., Turner, T., Lauffenburger, D. A. Growth factor-induced cell motility in tumor invasion. Acta Oncol. 41, (2), 124-130 (2002).
  14. Wilkinson, P. C. Assays of leukocyte locomotion and chemotaxis. J. Immunol. Methods. 216, (1-2), 139-153 (1998).
  15. Bonvin, C., Overney, J., Shieh, A. C., Dixon, J. B., Swartz, M. A. A multichamber fluidic device for 3D cultures under interstitial flow with live imaging: development, characterization, and applications. Biotechnol. Bioeng. 105, (5), 982-991 (2010).
  16. Noo, L. J., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, (8), 826-830 (2002).
  17. Shao, J., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab Chip. 9, (21), 3118-3125 (2009).
  18. Haessler, U., Kalinin, Y., Swartz, M. A., Wu, M. An agarose-based microfluidic platform with a gradient buffer for 3D chemotaxis studies. Biomed. Microdevices. 11, (4), 827-835 (2009).
  19. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat. Rev. Cancer. 3, (5), 362-374 (2003).
  20. Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol. Biol. 769, 149-165 (2011).
  21. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J. Cell Biol. 75, (2 Pt 1), 606-616 (1977).
  22. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J. Cell. Sci. 99, (Pt 4), 769-775 (1991).
  23. Gilbert, D. L. Macromolecular diffusion through collagen membranes. Int. J. Pharm. 47, (1-3), 79-88 (1988).
  24. Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys. J. 83, (3), 1650-1660 (2002).
  25. Weadock, K., Silver, F. H., Wolff, D. Diffusivity of 125I-calmodulin through collagen membranes: effect of source concentration and membrane swelling ratio. Biomaterials. 7, (4), 263-267 (1986).
  26. Erikson, A., Andersen, H. N., Naess, S. N., Sikorski, P., Davies, C. dL. Physical and chemical modifications of collagen gels: impact on diffusion. Biopolymers. 89, (2), 135-143 (2008).
  27. Moghe, P. V., Nelson, R. D., Tranquillo, R. T. Cytokine-stimulated chemotaxis of human neutrophils in a 3-D conjoined fibrin gel assay. J. Immunol. Methods. 180, (2), 193-211 (1995).
  28. Sundd, P., et al. Live cell imaging of paxillin in rolling neutrophils by dual-color quantitative dynamic footprinting. Microcirculation. 18, (5), 361-372 (2011).
  29. Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors. J. Vis. Exp. (63), 2754 (2012).
  30. Stephenson, F. H. Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory 2e. Elsevier Science. (2010).
  31. Bar-Kochba, E., Toyjanova, J., Andrews, E., Kim, K., Franck, C. A Fast Iterative Digital Volume Correlation Algorithm for Large Deformations. Exp. Mech. In press, (2014).
  32. Shenoy, V., Rosenblatt, J. Diffusion of Macromolecules in Collagen and Hyaluronic Acid, Rigid-Rod-Flexible Polymer Composite Matrixes. Macromolecules. 28, (26), 8751-8758 (1995).
  33. Leddy, H., Guilak, F. Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching. Ann. Biomed. Eng. 31, (7), 753-760 (2003).
Planar Gradient Diffusion System for å etterforske Chemotaxis i en 3D Collagen Matrix
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stout, D. A., Toyjanova, J., Franck, C. Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (100), e52948, doi:10.3791/52948 (2015).More

Stout, D. A., Toyjanova, J., Franck, C. Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (100), e52948, doi:10.3791/52948 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter