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Bioengineering

Gradiente planar do sistema de difusão para investigar Quimiotaxia numa Matriz de Colagénio 3D

doi: 10.3791/52948 Published: June 12, 2015

Introduction

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A deslocação preferida de células para um gradiente de concentração, conhecido como quimiotaxia, desempenha um papel importante em processos fisiológicos e patológicos no organismo. Tais exemplos são a pele e mucosa 1 a cicatrização de feridas, a morfogénese 2, 3 inflamação, e 4,5 o crescimento do tumor. Também tem sido mostrado que as células cancerosas podem migrar através de duas estratégias individuais e colectivos-migração celular 6. Além disso, os mecanismos de difusão de instabilidade pode induzir a separação de células individuais ou agrupados a partir de um corpo / objeto tumoral e, em seguida, podem emigrar para uma fonte de nutrientes e, portanto, invadir áreas mais largas e 7 tecidos.

Além disso, foi demonstrado que diversos mecanismos de migração podem ser activa em 2D e em 3D, devido a diferentes funções de moléculas de adesão 8. Portanto, um movimento para fisiologicamente relevante em ensaios in vitro para investigar a motilidade celular em um measureable de modo simples e é de importância na compreensão de fenômenos movimento de 9 células. Infelizmente, a dificuldade em analisar a migração de células, um ensaio de quimiotaxia quantificável abrangente geralmente requer um método trabalhoso longo, fundada na medição da motilidade celular e fenômenos de transporte modelos imparciais.

Abordagens experimentais passadas para investigar quimiotaxia de células incluem a câmara de Boyden 10 eo ensaio sob agarose 11. No entanto, dentro destes primeiros ensaios, as experiências de migração de células não acompanhar o movimento em relação ao tempo. Mais, o mais importante, os gradientes de concentração utilizados para as experiências não foram bem definidas ou completamente compreendido, enquanto apenas para sustentar a sinalização para não mais do que algumas horas. Além disso, as tentativas de câmara de quimiotaxia precoce restrito a migração de células para duas dimensões e não permitem controlar a cinética da migração 12. Olhando para a câmara de Boyden, um ensaio endpointnão permitiria ao pesquisador observar visualmente a migração e não poderia diferenciar diretamente quimiotaxia (movimento direcional) de quimiocinese (movimento aleatório). Além disso, várias variáveis ​​diferenças no tamanho de poro e espessura de membranas feitas a câmara muito difícil de reproduzir de forma fácil e oculta a reacção migrante de células para quimiocinas 13,14.

Com o novo entendimento de microfluídica, novas câmaras e micro-dispositivos têm sido investigados como um instrumento para investigar a locomoção de células sob condições de fluxo intersticiais ou quimiotaxia 15,16. De acordo com estes novos dispositivos, novas métricas de células foram introduzidos e investigados, como o efeito da tensão de cisalhamento em uma célula 17,18. Infelizmente, câmaras de quimiotaxia microfluídicos passadas e atuais limitam estudos de migração celular para substratos um 2D revés importante, pois muitos processos biológicos, incluindo a invasão de células de tumores e metástases, e immigração celular Mune, envolvem a migração 3D.

Câmaras-onde a observação direta de uma solução chemoattractant está em contacto com um gel 3D contendo células também têm sido também relatados 19,20. Estas câmaras têm dois compartimentos, um contendo um quimioatractor e uma contendo células, são unidas ao lado uma da outra na horizontal 21 ou como anéis concêntricos 22. Estes sistemas são apontados na direção certa, mas não manter um sistema de quimiotaxia por um período prolongado de tempo.

Além disso, os investigadores examinaram também difusividade através de membranas de colagénio em células de diálise, bem como a difusão de moléculas marcadoras através de amostras de colagénio submetido a pressão hidrostática 23-25. Algumas experiências de difusão em géis de colagénio dependem de alterações físicas e químicas do gel usando campos magnéticos e incorporação química 26. Um método popular para a modelagem diffusivity em collatecidos endógenos baseia-se na imagem de fluorescência de ponto fotodegradação contínua. Este método revelou anisotropia nos coeficientes de difusão de macromoléculas em tecidos de colagénio orientadas. No entanto, a fotodegradação foi usado na cartilagem articular e não matrizes de colagénio. Embora semelhantes, os experimentos de modelagem necessárias devem ser realizadas através da compreensão especificamente o coeficiente de difusão de géis de colágeno. Mais importante ainda, os sistemas não utilizam um método para medir a força de geração de células.

Infelizmente, a maioria dos sistemas parecem estar faltando um ou dois elementos-chave para um sistema ideal: o que permite rastreamento de celular, uma compreensão gradiente de difusão com um fator quimiotático através da matriz, um conjunto relativamente simples com uma facilidade de reprodutibilidade, a minimização de célula-célula interações, e a capacidade de medir unidades dimensionais para quantificação (isto é, velocidade, força, concentração específica). Moghe et ai. 27 proposto um sistema que cumpriu a maioria destas exigências em que as células foram inicialmente dispersos por todo o gel em vez de concentradas na superfície do filtro, mas foi difícil de medir as forças que a célula gera.

Para este fim, apresentamos um sistema de gradiente de difusão planar para investigar quimiotaxia em uma matriz de colágeno 3D, que permite superar as limitações modernas câmara de difusão de ensaios existentes, que é baseado na microscopia de lapso de tempo, juntamente com técnicas de análise de imagem para medir celular forças em um ambiente 3D. Este protocolo proporciona uma maneira simples, contudo inovadora de criar uma câmara de difusão 3D simples que pode ser utilizado para investigar a quimiotaxia 3D em células diferentes.

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Protocol

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Mold Design 1. 3D e Peças

  1. Mofo
    1. Antes de trabalhar, obter um kit de elastômero de silicone, uma câmara de imagens de células vivas, uma lamela de vidro 22 mm, e um cubo de metal de alumínio usinado com dimensões 10,07 milímetros x 3,95 milímetros x 5,99 milímetros. Preparar a câmara de imagem de células vivas para moldagem, colocando a lamela inferior no suporte de montagem e o resto da câmara, conforme indicado pelo fornecedor.
    2. Em seguida, usando uma pinça, coloque o cubo de alumínio usinado de metal no meio da caixa de uma câmara ao vivo imagens de células e em cima da lamela, e, em seguida, reserve.
    3. Misturar as soluções de elastómero de silicone de acordo com o protocolo do fabricante para fazer 5 ml de elastómero.
    4. Usando uma espátula de laboratório descartável, despeje solução de elastômero de silicone em configuração ao vivo câmara de imagens de células e garantir para não mover colocado usinado cubo de metal de alumínio. Coloque o sistema na bancada do laboratório, em um local seguro O / N para a cura.
    5. Na manhã seguinte, desconstruira câmara de imagens de células vivas, como recomendado pelo fabricante e retirar o molde usando uma pinça. Utilizando uma pinça, extraia cuidadosamente o cubo de metal de alumínio usinado a partir do molde. Vá até a pia e lavar o molde com água deionizada. Coloque o molde em uma toalha de papel para secar.
    6. Depois de seco, usando uma faca passatempo, cortar fendas através do molde, espaçadas 2,34 milímetros para além de cada extremidade longitudinal, no interior do molde de silicone. Verifique se as estadias do molde em um lugar seguro e seco até que você esteja pronto para construir o sistema para uma experiência.
  2. Hidrofílicos e hidrofóbicos As lamelas de vidro Preparação
    1. Para permitir que a matriz de colagénio para aderir a uma superfície, criar lamelas hidrófilos:
      1. Usando uma pipeta descartável, medir 150 mL de 3-aminopropil-trimetoxissilano e despeje solução num tubo de 50 ml. Adicionar 30 ml de etanol a 100% para o tubo de 50 ml com uma pipeta descartável segundo e fechar a tampa. Vortex a solução durante 2 min, assegurando uma mistura completa. Pnossa solução em uma placa de Petri de vidro e reserve.
      2. Despeje 15 ml de álcool etílico 100% em uma segunda placa de Petri e reserve (certifique-se de rotular pratos).
      3. Usando uma nova pipeta descartável, medir 30 ml de água desionizada e uma solução para um tubo de 50 ml, deitar. Em seguida, usando uma pipeta descartável nova medida a 1875 ul de glutaraldeído e despeje solução para o mesmo tubo de 50 ml e fechar a tampa. Vortex a solução durante 2 min, assegurando uma mistura completa. Despeje a mistura na terceira placa de Petri, e reserve.
      4. Utilizando uma pinça, retire uma lamela de vidro 22 milímetros rodada e lave ambos os lados com 100% de mistura de etanol com uma pipeta descartável.
      5. Coloque lamela de vidro lavadas em 3-aminopropil-trimetoxi-silano com 30 ml de etanol a 100% e solução prato permitir a sentar-se na solução durante 5 minutos.
      6. Com uma pinça, retire lamela de vidro e lavar novamente com uma solução de etanol a 100% com pipeta descartável.
      7. Largar lamela de vidro lavado em 1875ul de glutaraldeído e 30 ml de uma mistura de água desionizada e retiradas durante 30 min.
      8. Após 30 min, remover lamela de vidro com uma pinça e enxaguar com água desionizada e coloque-O tecido seco / N para secar à temperatura ambiente.
      9. Dipping lamela Repita e movendo-se para o maior número de lamelas, conforme necessário com as mesmas soluções geradas.
    2. Faça lamelas hidrofóbicas pelo protocolo determinado.
      1. Adicionar 500 ul de tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl, 100 ul de ácido acético e 19,4 ml de hexano em um tubo de 50 mL e agitar com vortex durante 2 min. Despeje solução em vidro Petri prato e reserve.
      2. Utilizando uma pinça limpo, tire uma lamela de vidro e cair na solução mista preparado por 2 min. Após 2 min passaram, tirar lamela de vidro com uma pinça e enxágüe com água deionizada usando uma pipeta e lugar lamela descartáveis ​​para O tecido seco / N para secar em temperatura ambiente. Lamela loja em pratos de Petri de plástico até ser utilizado.
      3. Repita dipp lamelaing e movendo-se para o maior número de lamelas, conforme necessário com as mesmas soluções geradas.

Assembléia 2. Mold

  1. Antes de usar moldes, usando uma pipeta descartável lave o molde com álcool etílico a 90% ao longo de um recipiente para resíduos químicos. Em seguida, colocar o molde numa placa de Petri cheia de água desionizada e permitir a sentar O / N.
  2. Tome molde da solução usando uma pinça e coloque em uma toalha para o ar seco antes de iniciar a montagem de molde.
  3. Enquanto o molde é o ar de secagem, corte as lamelas hidrofílicos quadrados em dois retângulos um pouco maiores do que 3,95 milímetros x 5,99 milímetros usando uma ferramenta de traçagem de diamante de alta precisão. Deslize cada lamela corte retângulo nas ranhuras cortadas no molde de silicone.
  4. Vire o molde de cabeça para baixo e aplique graxa de vácuo ao longo da parte inferior do molde de silicone com uma pipeta descartável. Em seguida, vire o molde de volta com o lado direito para cima e pressione a parte inferior do molde para as circulares tampas de vidro hidrofílicoslábio para criar uma vedação.
  5. Com luvas descartáveis, pegar o molde montado e coloque em um prato descartável Petri e, em seguida, em um bio-hood. Ligue lâmpada UV Bio-capa para 1 hora para esterilizar o molde antes de ocorrer a experimentação.

3. O colagénio mistura e Matrix 3D

  1. Antes de preparar a mistura de colagénio, mancha e preparar as células para a imagiologia de acordo com protocolos padrão 28.
  2. Utilizando técnicas laboratoriais padrão e protocolos 29,30, num bio-capa, e meios da mistura de células em quimioatractor um tubo de 15 ml com a concentração desejada quimioatractor. Pipeta 5 ml de solução a concentração dos media-chemoattractant célula específica em um tubo de 15 ml e mover a solução em um banho de água aquecida.
  3. Usando uma pipeta, 5 ml de extracto de células de apenas meios de comunicação para um segundo tubo de 15 ml e colocar num banho de água aquecida para aquecer a solução para as experiências de microscopia.
  4. Em um bio-hood, pipeta 30 ul de 10x tampão fosfatoed solução (PBS) para dentro do tubo de micro centrífuga. Adicionar 6 ul de 1 N hidróxido de sódio (NaOH) em mesma micro tubo de centrifugação e de vórtice durante 15 seg.
  5. Obter solução de cauda de rato colágeno I da geladeira e passar para a bio-capa utilizando técnicas laboratoriais padrão e protocolos 29. Verifique se o colágeno ainda está frio. Pipetar 168,3 ul de colagénio no mesmo tubo de micro centrífuga.
  6. Em seguida, adicionar 18 ul de amarelo-verde microesferas modificadas com carboxilato fluorescentes, utilizando uma pipeta para o mesmo tubo de micro centrífuga. Vortex do tubo de microcentrífuga com todas as soluções durante 30 seg.
  7. Adicionar 77,7 uL de mistura de células meio celular pretendida (cerca de 2 X 10 6 células / ml de concentração) para dentro do tubo de micro centrífuga e misture utilizando a ponta da pipeta durante 20 seg. Conforme necessário, alterar a densidade da matriz seguindo-se a mistura de colagénio costume adaptado para a adição de contas fluorescentes e mesa de viabilidade celular (Tabela 1).
  8. Pipetar 300 & #181; l de mistura de células-colagénio para o centro do poço (bem como 2) do conjunto de molde preparado. Coloque o molde sobre um prato de Petri descartáveis ​​e movê-lo para uma incubadora padrão durante 20 minutos a 37 ° C com 5% de CO 2.
  9. Retirar sistema da incubadora e coloque de volta para bio-hood. Utilizando uma pinça, retire ambas as lamelas hidrofóbicos por aperto na parte superior de cada lamela e puxando para cima e longe do molde.
  10. Mover todo o sistema para a microscopia e imagem desejada para garantir os lados do molde de colagénio são ainda recta para permitir um gradiente de difusão planar.
  11. Com o sistema ainda sob o microscópio, utilizando uma pipeta de canal único 100 ul, adicionar 100 uL de meio celular para o poço # 1. Em seguida, usando uma pipeta de canal único 100 ul adicionar 100 ul de meios de células com a concentração desejada em quimioatractivo bem # 3.
  12. Imediatamente após a adição de soluções em ambos os poços, início de imagem.

4. Criação de Imagens e DifusãoModelagem

  1. Se se quer encontrar o coeficiente de difusão para a densidade específica de colagénio para calcular a concentração específica, seguir o protocolo abaixo:
    1. Siga o protocolo dado acima intitulado "Mistura de colágeno e Matrix 3D", em vez de gerar meios de células com a concentração chemoattractant desejar, faça rhodamine 5 M em um tubo de 15 ml usando cálculos e protocolos 30 padrão.
    2. Imagem as matrizes de colágeno 3D com um sistema confocal montado em um microscópio invertido usando um laser de argônio (488 nm) para capturar a fluorescência. Imagem a cada 2 ou 3 segundos para até 7 hr.
  2. Para Modelagem Difusão: Usando o modelo matemático apresentado abaixo, escrever um código de software computacional para processamento e análise com estas etapas gerais.
    Equação 1
    1. Importar imagens para software computacional para redimensionamento e normalizando pelo inten máximosidade. Converta imagens para um mapa de cor cinza da imagem para selecionar a borda. Escolha de um eixo ao longo do centro da imagem, para a direita do centro e para a esquerda do centro.
    2. Usando o código de software computacional, traçar a intensidade normalizada, juntamente com o verdadeiro intensidade e a diferença entre os dois.
    3. A seguir, introduza os parâmetros necessários para a montagem (concentração, tempo e duração).
    4. Traça-se a concentração normalizada em função do tempo e o perfil de concentração ao longo do eixo-x com um ajuste polinomial para os dados.
    5. Calcular o coeficiente de difusão utilizando o código de software computacional.

5. As medições experimentais

  1. Referindo de novo a equação de difusão, reescrever a equação para encontrar a concentração específica em qualquer local dentro do sistema como mostrado abaixo.
    Equação 2
    Onde:
    L = Comprimento do thmatriz de colágeno e
    x = localização sob investigação
    D = coeficiente de difusão
    T = tempo decorrido
  2. Durante as experiências de quimiotaxia, garantir para registrar o tempo específico que a quimiocina momento foi adicionado ao sistema. Uma vez que o movimento de migração celular é encontrado, garantir a gravar confocal gravação de lapso de tempo, e observe o tempo específico e localização da borda onde imaging ocorreu.
  3. Durante a análise de dados, conecte o observado o tempo decorrido, a localização e o coeficiente de difusão para a célula específica na equação para encontrar a concentração normalizada específica em qualquer ponto dentro do colagénio, tanto para difusão e experiências com células.

6. Acompanhamento de migração celular Utilizando TFM

  1. Para controlar a migração de células usando técnicas de TFM / DVC seguir o protocolo abaixo:
    1. Após a adição da concentração desejada em quimioatractor bem # 3, iniciar o Imaging as matrizes de colagénio em 3D com um sistema confocal montado num micr invertidooscope para encontrar uma célula para investigar.
    2. Uma vez que uma célula se encontra em movimento, colocar a célula no meio do campo de vista e utilizar um motor piezoeléctrico (para a imagem no eixo z), cada imagem 1 ou 2 minutos.
    3. Para calcular a geração de força e deformação celular, gerar um código computacional para encontrar os deslocamentos dos grânulos de fluorescência seguindo os protocolos TFM / DVC 31.

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Representative Results

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A capacidade do presente ensaio para avaliar com precisão a migração da célula depende de uma boa configuração do sistema. Portanto, é crucial para certificar-se de projetar o molde sistema de difusão de forma precisa e tomar muito cuidado na colocação de lamelas de ambos hidrofóbicos e hidrofílicos, como ilustrado na figura 1. Se o sistema for projetado corretamente e durante a etapa de modelagem difusão garantindo para encontrar um muito boa linha de partida linear, uma é capaz de alcançar agradável fluoresce imagens, tal como ilustrado na Figura 2, para a análise de difusão do sistema.

A chave para uma análise quimiotaxia celular bem-sucedida é a modelagem da difusão e resolvendo a equação de difusão geral para encontrar o coeficiente de difusão e equação concentração específica através de um código gerado software computacional. Depois de importar as imagens em software computacional e análise em execução (Figura 3), o coeficiente de difusãopode ser avaliada (Tabela 2). A Figura 4 representa as tramas de difusão de rodamina através dos cinco concentrações de colagénio testados. As formas da trama difusão coincidir com a forma tradicional de um modelo de difusão linear. Pode ser visto que a difusão de rodamina é inversamente proporcional à concentração de colagénio-a menor densidade do colagénio mais rápida será a difusão. Isto é para ser esperado, pois esta concentração de colagénio tem uma porosidade mais elevada. As linhas horizontais na trama de difusão de colagénio a uma concentração de 1,5 mg / ml (Figura 4B) são simplesmente o resultado do excesso de saturação do sinal do marcador. Mais importante, como mostrado na Figura 4 cada linha representa um ponto específico (x, y) dentro do colagénio, ao passo que para o tempo aumenta a concentração normalizada nunca excede o ponto anterior, ao mesmo tempo (dt), indicando que não houve inversão da química. Esta é uma característica importante de um chemotaxis câmara para permitir o fluxo directo de um quimioatractor sem fluxo reverso.

Ao examinar os últimos dez imagens em cada posição x, uma é capaz de gerar um gráfico da concentração em estado estacionário de rodamina em cada um dos locais. Extrapolando em todo o comprimento da amostra (Figura 5), pode-se olhar para toda a amostra. Isto indica que o gradiente de difusão linear é consistente ao longo de todo o comprimento da amostra, que pode ser utilizado para experiências de células (Figura 6).

Figura 1
Figura 1: um esquema de montagem de molde plana sistema gradiente de difusão na câmara de imagem de células vivas (1) Uma representação do computador do sistema completo composto por (de baixo para cima) um corpo inferior (c) um hidrófilo 22 milímetros lamela, molde,. alojamento superior, e uma tampa de vidro. (2) Dimensões do mo ld onde (a) inserções de corte são mostrados. (3) Mold com matriz de colagénio com (b) lamelas hidrofóbicos em cada lado deslizou para as inserções cortada para criar o sistema 3-bem. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Exemplo de imagens de microscopia rodamina em colagénio imagens representativas obtidas durante as experiências de difusão de rodamina, na mesma localização do eixo z, no sistema de gradiente de difusão planar com uma concentração de colagénio de 1,0 mg / ml.. Barra de escala = 500 um em que (a) é 0 min (b) 3 min (c) 7 minutos, e (d) 15 minutos após a rodamina foi adicionado à câmara. A seta indica a direcção da difusão de rodamina através da matriz de colagénio."target =" _ blank e.com/files/ftp_upload/52948/52948fig2large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3:. Exemplo de análise e síntese dos cálculos de difusão gerados pelo software de código computacional com uma concentração de colágeno 2,5 mg / ml (A) rendição preto e branco da imagem inicial (dt = 0) de carregado em software computacional para análise. (B) Os pontos específicos escolhidos pelo usuário para comparação intensidade e para cálculos de difusão (x, eixo y estão em pixels). (C) o perfil de difusão de rodamina por toda a matriz de colagénio, onde cada linha correlaciona com um ponto vermelho na imagem B. (D) perfil de concentração de rodamina por toda a matriz de colagénio no estado estacionário. (E) Comparação entre os dados suavizados (blue ponto) e os verdadeiros dados de experimento de difusão (ponto vermelho), com diferença entre alisado e verdadeiro (ponto verde). (F) Concentração Normalizado de verdade (ponto vermelho) e equipado (ponto verde) dados de código de software computacional durante todo o experimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4:. Exemplo de perfil de difusão através da matriz de colagénio utilizando o sistema de difusão de gradiente planar em diferentes pontos Cada linha indica a diferentes pontos de dados seleccionados escolhidos a partir do código de software computacional pelo utilizador. Matriz de colagénio a uma densidade de (A) 1,0 mg / ml (B) 1,5 mg / ml (C) 2,0 mg / ml (D) 2,2 mg / ml e (E rong>) 2,5 mg / ml. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5:. Exemplo de um perfil de concentração (normalizado) de rodamina por toda a matriz de colagénio utilizando o sistema de difusão de gradiente planar no estado estacionário círculos são escolhidos os pontos de dados específicos, embora o código de software computacional pelo utilizador. Linha vermelha construído usando pontos de dados e extrapolando melhor linha-fit (com valor de R 2 mostrada) para mostrar concentração rhodamine toda a matriz de colágeno todo. Matriz de colagénio a uma densidade de (A) 1,0 mg / ml (B) 1,5 mg / ml (C) 2,0 mg / ml (D) 2,2 mg / ml e (E) 2,5 mg / ml."Target =" _ blank 2948fig5large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6: Exemplo de experiências de migração de células A imagem do microscópio Z-slice de uma migração de neutrófilos no sistema 3D gradiente planar.. Neutrófilos migra para o gradiente quimioatractor (seta branca descreve direcção de inclinação e o triângulo mostra o perfil de concentração), onde o asterisco indica a posição inicial da célula no início da experiência. Subtrama mostra célula no espaço 3D, onde a seta indica a direcção do próximo ponto de tempo. Escala da barra = 10 m. dt = 5 min entre as imagens (ou seja, AB). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Colágeno Densidade celular PBS Esferas fluorescentes NaOH Colágeno I Rat cauda Mídia
2,5 mg / mL 10% 6% 2% 70,20% 11,80%
2,2 mg / mL 10% 6% 2% 61,70% 20,30%
2,0 mg / mL 10% 6% 2% 56,10% 25,90%
1,5 mg / mL 10% 6% 2% 42,10% 39,90%
1,0 mg / mL 10% 6% 2% 28,10% 53,90%

Tabela 1: feito sob encomenda cmistura ollagen adaptado para a adição de contas fluorescentes e a viabilidade celular.

A concentração do gel de colagénio Coeficiente de difusão (cm2 / s)
2,5 mg / mL 1,03 x 10 -6 2,54 x 10 ± -7
2,2 mg / mL 1,28 x 10 -6 3,53 x 10 ± -7
2,0 mg / mL 6,48 x 10 -6 1,66 x 10 ± -7
1,5 mg / mL 1,05 x 10 -5 ± 2,04 x 10 -7
1,0 mg / mL 1,39 x 10 -5 ± 1,06 x 10 -7
Água 1,50 x 10 -5

Tabela 2: Os coeficientes de difusão.

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Discussion

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Os passos mais críticos para as experiências bem-sucedidas de difusão com ou sem células são: configurar corretamente o conjunto de molde; desenvolver a destreza manual necessário para evitar danos durante a extracção de lamelas hidrofóbicos; garantindo a encontrar uma linha muito boa de partida linear para calcular correctamente o coeficiente de difusão; corrigir cálculos experimentais de colagénio e quimioatractiva; usar corretamente do sistema de imagens de células vivas para garantir matriz não secar; e a manutenção de uma cultura saudável estéril.

Quando a realização de experiências de difusão, é imperativo para se certificar as parcelas de difusão coincidir com as formas tradicionais de um modelo de difusão linear (Figura 4).

Executando a análise em vários locais diferentes de x em cada amostra, é possível calcular os coeficientes médios de difusão para rodamina nas várias concentrações de colagénios, como relatado em Ta ble 2. Estes resultados são consistentes com a pesquisa anterior do coeficiente de difusão através do gel de colagénio diminui medida que a concentração de colagénio diminuída devido a um aumento de porosidade na matriz.

De acordo com a equação modelo de difusão no estado de equilíbrio, que se espera que tenha um perfil de concentração linear entre os valores de x. Ajustando uma função linear para os pontos, pode-se ver que todos eles são, de fato, linear. O valor de R 2 de ajuste de uma linha de tendência linear para cada uma das melhores linhas de ajuste para as três concentrações de colágeno eram igual ou superior a 0,92. As normas dos resíduos em todas as parcelas foram extrapolados 0,0227, indicando um bom ajuste. Essa relação linear está de acordo com a solução analítica. A concentração não começa a 100%, como seria de esperar, porque a imagem não começa directamente na extremidade da amostra de colagénio. Também é impossível para calibrar perfeitamente a imagiologia.

_content "> Além disso, nós fomos capazes de fazer referência a outros documentos que olhavam para difusão em géis para comparar os resultados. Shenoy e Rosenblatt encontrado o coeficiente de difusão de BSA (raio = 4 nm) em uma solução de colágeno succinilado 30 mg / ml para ser 2,2 x 10 -7 cm 2/32 seg. O raio de rodamina é 0,78 nm, o que explica o seu tempo de difusão mais rápida através de colagénio 24. Em estudos de difusão, é comum utilizar o raio para comparar moléculas. medida que o raio aumenta, o peso molecular também aumenta. Ramanujan et ai. encontrado o coeficiente de difusão de dextrano (raio = 6 nM) em 20% polimerizados geles de colagénio (equivalente a 2,0 mg / ml géis de concentração) para ser 4,72 x 10 -8 cm2 / seg 24. Mais uma vez, Isto é comparável ao coeficiente de difusão que observada para o / gel de concentração de 2,0 mg ml (D = 1,28 x 10 @ 6 cm2 / seg), se tomarmos em consideração a diferença de tamanho molécula. Leddy e Guilak pernoied a difusão de dextranos através da cartilagem articular 33. É possível comparar difusão através de matrizes de colagénio e através da cartilagem articular devido aproximadamente dois terços da massa de cartilagem articular é colagénio polimérico (predominantemente do tipo II). Leddy e Guilak encontrado o coeficiente de difusão de 3 kDa de dextrano através da cartilagem articular-se entre 6-10 x 10 -7 cm 2/33 seg. Sabendo-se que o sistema funciona corretamente, então, foi capaz de calcular a concentração específica em qualquer lugar dentro do sistema, por meio de modelos de dente de serra e de transferência de calor do sistema transitório. Esta métrica adicional pode ser utilizado durante as experiências de células para controlar a compreensão célula-concentração e inclinação gradiente.

Tempo de duração de experimentos pode ser um fator limitante ao usar nossa abordagem. Portanto, é importante o uso de uma cobertura para o sistema de imagem de células vivas para assegurar a matriz não seca. Usando uma tampa durante experiments, fomos capazes de monitorar com sucesso a difusão de rodamina até 7 horas e 4 horas durante experimentos com células sem o gel secar. Se a pessoa não usar uma tampa, o gel pode secar mais rápido e afetar significativamente a difusão e migração das células.

O protocolo aqui descrito utiliza um modelo plano difusão / sistema bem controlada para ser capaz de medir as forças de células em um ambiente 3D durante quimiotaxia. Aqui apresenta-se um sistema recentemente desenvolvido simples que pode ser utilizado para experiências TFM / DVC. Usando este sistema, os investigadores serão capazes de: 1) difusão com sucesso através de matrizes de colagénio modelo 3D e verificar, através do ajuste dos dados à expressão analítica, que o sistema de difusão de gradiente planar, quando semeados com células, deve promover a quimiotaxia e a quimiocinese não; 2) calcular o coeficiente de difusão para o colagénio de cinco diferentes concentrações; e 3) encontrar com êxito a concentração específica da chemoattractant dentro do diffusion câmara. Com este se aproxima, pode-se analisar melhor a quimiotaxia celular com métricas específicas que não são facilmente e prontamente disponível sem as abordagens laboriosas de sistemas multifacetados e gradientes de difusão complexos.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicone elastomer kit Dow Corning Corp 182 SIL ELAST KIT .5KG a two-part misture with a 10:1 mix
Live cell imaging chamber Live Cell Instrument CM-B18-1 CMB for 18 mm round coverslips
22 mm Glass Coverslip Fisher Scientific NC0180281 Neuvitro Corp. cover slip 22 mm 1.5
Machined aluminum metal cube
Hobby utility knife X-Acto X3201
3-(aminopropyl) trimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778-5ML
Glutaraldehyde Polysciences, Inc 00216A-10 Glutaraldehyde, EM Grade, 8%
50 ml tube Fisher Scientific 14-432-22 Standard floor model and tabletop centrifuges
Glass Petri dish Fisher Scientific 08-747A Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15 mm)
Forceps Fisher Scientific 22-327-379 Fine Point Forceps
Cover glasses Fisher Scientific 12-518-105A Rectangle; 30 x 22 mm; Thickness No. 1
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl Gelest SIT8174.0
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099 Acetic acid ACS reagent, ≥99.7%
Hexane Sigma-Aldrich 296090 anhydrous, 95%
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 200 proof, for molecular biology
High-precision diamond scribing tool Lunzer PV-081-3 Straight extended tip scribe, .020" (.50 mm) diameter by .200" (5.0 mm) tip length
Vacuum grease Dow Corning 14-635-5C High-Vacuum Grease
15 ml tube Fisher Scientific 14-959-49D 15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface
10x phosphate buffered solution Fisher Scientific BP399-500 1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer
1 N sodium hydroxide Sigma-Aldrich 38215 Sodium hydroxide concentrate
Collagen I, rat tail BD Biosciences 354236 Rat tail 
Micro centrifuge tube Fisher Scientific 02-681-332 Volume: 2.0 ml;
O.D. x L: 13 x 40 mm;
sterile; single-wrapped
Name Company Catalog Number Comments
Carboxylate-modified microspheres Invitrogen  F-8813 Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids
Rhodamine Sigma-Aldrich 83689 Rhodamine B for fluorescence

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References

  1. Adzick, N. S. The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair. Ann Surg. 225, (2), 236 (1997).
  2. Reddi, A. H. Bone morphogenetic proteins: an unconventional approach to isolation of first mammalian morphogens. Cytokine Growth F. R. 8, (1), 11-20 (1997).
  3. Coussens, , Werb, Z, L. M., Werb, Z. Inflammation and cancer. Nature. 420, (6917), 860-867 (2002).
  4. Vital-Lopez, F. G., Armaou, A., Hutnik, M., Maranas, C. D. Modeling the effect of chemotaxis on glioblastoma tumor progression. AIChE J. 57, (3), 778-792 (2011).
  5. Hughes-Alford, S. K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of gradient sensing: towards building predictive models of chemotaxis in cancer. Curr. Opin. Cell Biol. 24, (2), 284-291 (2012).
  6. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat. Rev. Mol Cell Bio. 10, (7), 445-457 (2009).
  7. Cristini, V. Morphologic Instability and Cancer Invasion. Clin. Cancer Res. 11, (19), 6772-6779 (2005).
  8. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453, (7191), 51-55 (2008).
  9. Parent, C. A., Devreotes, P. N. A cell's sense of direction. Science. 284, (5415), 765-770 (1999).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  11. Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, (6), 1650-1656 (1975).
  12. Rosoff, W. J., McAllister, R., Esrick, M. A., Goodhill, G. J., Urbach, J. S. Generating controlled molecular gradients in 3D gels. Biotechnol. Bioeng. 91, (6), 754-759 (2005).
  13. Wells, A., Kassis, J., Solava, J., Turner, T., Lauffenburger, D. A. Growth factor-induced cell motility in tumor invasion. Acta Oncol. 41, (2), 124-130 (2002).
  14. Wilkinson, P. C. Assays of leukocyte locomotion and chemotaxis. J. Immunol. Methods. 216, (1-2), 139-153 (1998).
  15. Bonvin, C., Overney, J., Shieh, A. C., Dixon, J. B., Swartz, M. A. A multichamber fluidic device for 3D cultures under interstitial flow with live imaging: development, characterization, and applications. Biotechnol. Bioeng. 105, (5), 982-991 (2010).
  16. Noo, L. J., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, (8), 826-830 (2002).
  17. Shao, J., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab Chip. 9, (21), 3118-3125 (2009).
  18. Haessler, U., Kalinin, Y., Swartz, M. A., Wu, M. An agarose-based microfluidic platform with a gradient buffer for 3D chemotaxis studies. Biomed. Microdevices. 11, (4), 827-835 (2009).
  19. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat. Rev. Cancer. 3, (5), 362-374 (2003).
  20. Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol. Biol. 769, 149-165 (2011).
  21. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J. Cell Biol. 75, (2 Pt 1), 606-616 (1977).
  22. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J. Cell. Sci. 99, (Pt 4), 769-775 (1991).
  23. Gilbert, D. L. Macromolecular diffusion through collagen membranes. Int. J. Pharm. 47, (1-3), 79-88 (1988).
  24. Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys. J. 83, (3), 1650-1660 (2002).
  25. Weadock, K., Silver, F. H., Wolff, D. Diffusivity of 125I-calmodulin through collagen membranes: effect of source concentration and membrane swelling ratio. Biomaterials. 7, (4), 263-267 (1986).
  26. Erikson, A., Andersen, H. N., Naess, S. N., Sikorski, P., Davies, C. dL. Physical and chemical modifications of collagen gels: impact on diffusion. Biopolymers. 89, (2), 135-143 (2008).
  27. Moghe, P. V., Nelson, R. D., Tranquillo, R. T. Cytokine-stimulated chemotaxis of human neutrophils in a 3-D conjoined fibrin gel assay. J. Immunol. Methods. 180, (2), 193-211 (1995).
  28. Sundd, P., et al. Live cell imaging of paxillin in rolling neutrophils by dual-color quantitative dynamic footprinting. Microcirculation. 18, (5), 361-372 (2011).
  29. Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors. J. Vis. Exp. (63), 2754 (2012).
  30. Stephenson, F. H. Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory 2e. Elsevier Science. (2010).
  31. Bar-Kochba, E., Toyjanova, J., Andrews, E., Kim, K., Franck, C. A Fast Iterative Digital Volume Correlation Algorithm for Large Deformations. Exp. Mech. In press, (2014).
  32. Shenoy, V., Rosenblatt, J. Diffusion of Macromolecules in Collagen and Hyaluronic Acid, Rigid-Rod-Flexible Polymer Composite Matrixes. Macromolecules. 28, (26), 8751-8758 (1995).
  33. Leddy, H., Guilak, F. Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching. Ann. Biomed. Eng. 31, (7), 753-760 (2003).
Gradiente planar do sistema de difusão para investigar Quimiotaxia numa Matriz de Colagénio 3D
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Stout, D. A., Toyjanova, J., Franck, C. Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (100), e52948, doi:10.3791/52948 (2015).More

Stout, D. A., Toyjanova, J., Franck, C. Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (100), e52948, doi:10.3791/52948 (2015).

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