Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Planar Gradient Diffusion System för att undersöka Chemotaxis i en 3D kollagenmatris

doi: 10.3791/52948 Published: June 12, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den föredragna rörelsen hos celler mot en koncentrationsgradient, känd som kemotaxi, spelar en viktig roll i patologiska och fysiologiska processer i kroppen. Sådana exempel är hud och slemhinnor sårläkning 1, morfogenes 2, inflammation 3, och tumörtillväxt 4,5. Det har också visat sig att cancerceller kan migrera genom både individuella och kollektiva cellmigrationsstrategier 6. Dessutom kan diffusionssystem instabilitet mekanismer inducerar separation av enkla eller klustrade celler från en tumör kropp / object och sedan kan invandra till en källa av näringsämnen och därmed invadera större områden och vävnader 7.

Dessutom har det visat sig att olika mekanismer migrations kan vara aktiva i 2D och i 3D, på grund av olika roller adhesionsmolekyler 8. Därför en övergång till fysiologiskt relevant in vitro-analyser undersöka cellmotilitet i en measureable och enkelt sätt är av betydelse för att förstå cellrörelse fenomen 9. Tyvärr, det är svårt att analysera cellmigration, en omfattande kvantifierbar chemotaxis analys kräver oftast en lång mödosam metod, som bygger på mätning av objektiva cellmotilitet och transportfenomen modeller.

Tidigare experimentella metoder för att undersöka cell kemotaxi inkluderar Boyden kammare 10 och under agaros analys 11. Men inom dessa tidiga analyser, cellmigration Experiment har inte övervaka rörelsen i avseende på tiden. Mer, viktigare, koncentrationsgradienter används för experimenten var inte väl definierade eller helt klarlagda medan endast upprätthålla signaler för inte mer än ett fåtal timmar. Dessutom tidig kemotaxi kammarförsök begränsas cellmigration till två dimensioner och inte tillåter en att övervaka kinetiken migration 12. Om man tittar på Boyden kammare, en slutpunkt analysskulle inte tillåta forskare att observera migration visuellt och kunde inte direkt skilja kemotaxi (riktad rörelse) från kemokines (slumpmässiga rörelser). Dessutom har flera variabler-skillnader i porstorlek och tjocklek av membran gjorda kammaren mycket svårt att enkelt reproducera och dolde migrerande reaktion av celler till kemokiner 13,14.

Med den nya förståelsen för mikrofluidik, har nya avdelningar och mikro enheter undersökts som ett instrument för att undersöka cell förflyttning enligt mellanrumsflödesförhållanden eller chemotaxis 15,16. Under dessa nya enheter har nya cell statistik infördes och undersökas, liksom effekten av skjuvspänningen på en cell 17,18. Tyvärr, tidigare och nuvarande mikroflödes kemotaxi kammare begränsade studier av cellmigration till 2D-substrat-en viktig bakslag eftersom många biologiska processer, inklusive tumörcellinvasion och metastas, och immune cellmigration, involvera 3D migration.

Direkt observation kamrar-var en kemoattraherande lösning är i kontakt med en 3D-gel innehållande celler har också också rapporterats 19,20. Dessa kammare har två avdelningar, en som innehåller en chemoattractant och en som innehåller celler, förenas bredvid varandra horisontellt 21 eller som koncentriska ringar 22. Dessa system är pekade i rätt riktning, men inte hålla ett kemotaxi systemet under en längre tid.

Dessutom har forskarna också undersökt diffusiviteten genom kollagenmembran i dialysceller, liksom spridning av spårmolekyler genom kollagen prover utsattes för hydrostatiskt tryck 23-25. Vissa diffusion experiment i kollagengeler lita på fysikaliska och kemiska modifieringar av gelén med hjälp av magnetfält och kemisk inkorporering 26. En populär metod för att modellera diffusivitet i collaGenous vävnader bygger på fluorescens avbildning av kontinuerlig punkt fotoblekning. Denna metod har visat anisotropi i diffusionskoefficienterna av makromolekyler i orienterade kollagen vävnader. Ändå har fotoblekning använts i ledbrosk och inte kollagenmatriser. Medan liknande, måste nödvändiga modellerings experiment genomföras specifikt förstå diffusionskoefficient kollagengeler. Ännu viktigare, inte de system som inte utnyttjar ett förfarande för mätning av cellstyrke.

Tyvärr, de flesta system verkar sakna en eller två nyckelfaktorer för ett idealiskt system: det gör det möjligt att spåra cell, en diffusionsgradient förståelse med en kemotaktisk faktor genom matrisen, en relativt enkel installation med en enkel reproducerbarhet, minimering av cell-cell interaktioner, och förmågan att mäta måttenheter för kvantifiering (dvs, hastighet, styrka, specifik koncentrations). Moghe et al., 27 föreslagit ett system som uppfyllde de flesta av dessa krav i vilka cellerna ursprungligen dispergerade i gelén istället för koncentrerade på filterytan, men var svåra att mäta krafter som cellen genererar.

För detta ändamål, presenterar vi en plan gradient diffusionssystem att undersöka chemotaxis i en 3D kollagenmatris, vilket gör att man kan övervinna moderna diffusionskammaren begränsningar av befintliga analyser, som bygger på tidsförlopp mikroskopi, tillsammans med bildanalysteknik för att mäta cell krafter i en 3D-miljö. Detta protokoll ger en enkel, men ändå innovativt sätt att skapa en enkel 3D diffusionskammare som kan användas för att undersöka 3D kemotaxi i olika celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. 3D mögel design och delar

  1. Mögel
    1. Innan arbete, få en silikonelastomer kit, en levande cell imaging kammare, en 22 mm täckglas, och en bearbetad aluminium metall kub med måtten 10,07 mm x 3,95 mm x 5,99 mm. Förbered levande cell imaging kammare för formning genom att placera täck i bottenhållaren och montera resten av kammaren enligt anvisningar från leverantören.
    2. Nästa, med hjälp av pincett, placera bearbetad aluminium metall kub i mitten av den levande cell imaging kammare bostäder och på toppen av täck, och sedan avsätta.
    3. Blanda silikonelastomerlösningar enligt tillverkarens protokoll för att göra 5 ml elastomer.
    4. Med hjälp av en engångs labb spatel, häll silikon elastlösningen till levande cell imaging kammaren inställning och se till att inte flytta ut bearbetad aluminium metall kub. Placera systemet på labbänken, på en säker plats O / N för härdning.
    5. Nästa morgon, dekonstrueraden levande cell imaging kammare, som rekommenderas av tillverkaren och dra ut formen med pincett. Använd pincett, försiktigt extrahera bearbetad aluminium metall kub från mögel. Gå till vasken och skölj formen med avjoniserat vatten. Placera formen på en pappershandduk för att torka.
    6. När torr, med användning av en hobby mattkniv, skär slitsar genom formen, åtskilda 2,34 mm från varje längsgående ände, inuti silikonformen. Se form vistelser i en säker och torr plats tills du är redo att bygga system för ett experiment.
  2. Hydrofila och hydrofoba Glas Täck Förberedelse
    1. För att göra det möjligt för koUagenmatrisen att ansluta sig till en yta, skapa hydrofila täck:
      1. Med användning av en engångspipett, mäta upp 150 ul av 3-aminopropyl-trimetoxisilan och häll lösningen i ett 50 ml rör. Lägg 30 ml 100% etanol till 50 ml rör med en andra engångspipett och stäng locket. Vortex lösningen under 2 min, vilket garanterar fullständig blandning. Pvår lösning i ett glas petriskål och ställ åt sidan.
      2. Häll 15 ml av 100% etylalkohol i en andra petriskål och ställ åt sidan (se till att märka rätter).
      3. Med hjälp av en ny engångspipett, mäta upp 30 ml avjoniserat vatten och häll lösningen i en 50 ml tub. Därefter under användning av en ny engångspipett åtgärd ut 1875 il glutaraldehyd och häll lösningen i samma 50 ml rör och stäng locket. Vortex lösningen under 2 min, vilket garanterar fullständig blandning. Häll blandningen i tredje petriskål, och ställ åt sidan.
      4. Använd pincett, ta ut en 22 mm rund täckglas och skölj båda sidor med 100% etanol-blandning med hjälp av en engångspipett.
      5. Placera sköljdes glas täckglas i 3-aminopropyl-trimetoxisilan med 30 ml 100% etanollösning skålen och låt stå i lösning under 5 minuter.
      6. Med pincett, ta ut glastäckglas och skölj igen med 100% etanollösning med engångspipett.
      7. Släpp sköljas glas täck till 1.875il glutaraldehyd och 30 ml avjoniserat vatten-blandning och som avsatts för 30 minuter.
      8. Efter 30 minuter, ta bort täckglas med pincett och skölj med avjoniserat vatten och placera på torr tissue O / N för att torka vid rumstemperatur.
      9. Upprepa täckdoppning och flytta så många täck som behövs med samma genererade lösningar.
    2. Gör hydrofoba täck av givet protokoll.
      1. Lägg 500 pl av tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl, 100 | il ättiksyra och 19,4 ml hexan i en 50 ml rör och vortexblanda i 2 minuter. Häll lösningen i glas petriskål och ställ åt sidan.
      2. Med hjälp av rena pincett, ta ut ett glas täck och släppa in beredda blandade lösning under 2 min. Efter 2 minuter har gått, ta ut täckglas med pincett och skölj med avjoniserat vatten med en engångspipett och plats täck på torr vävnad O / N torka vid rumstemperatur. Butikstäckglas i plastpetriskålar tills de användes.
      3. Upprepa täck DIPPing och flytta så många täck som behövs med samma genererade lösningar.

2. formaggregat

  1. Innan användning av formar, med användning av en engångspipett skölj formen med 90% etylalkohol över en avfallsbehållare kemikalie. Därefter placera formen i en petriskål fylld med avjoniserat vatten och låt sitta O / N.
  2. Ta mögel ut ur lösningen med pincett och placera på en handduk att lufttorka innan formaggregatet.
  3. Även formen är lufttorkning, klippa fyrkantiga hydrofila täck i två rektanglar något större än 3,95 mm x 5,99 mm med hjälp av en hög precision diamant-ritsning verktyg. Skjut varje skär rektangel täck i spåren skurna i silikonformen.
  4. Flip gjutformen upp och ned och anbringa vakuum fett längs botten av silikonformen med användning av en engångspipett. Därefter vänder formen tillbaka åt rätt håll och tryck på botten av formen på de cirkulära hydrofila glas täckerläpp för att skapa en tätning.
  5. Med engångshandskar, plocka upp den sammansatta formen och placera i en engångspetriskål och sedan in i en bio-huva. Aktivera UV Bio-huv lampa under 1 h för att sterilisera gjutformen innan försöket sker.

3. Kollagen beredningen och 3D Matrix

  1. Innan du förbereder kollagenblandningen, bets och förbereda celler för avbildning enligt standardprotokoll 28.
  2. Med användning av standardlaboratorietekniker och protokoll 29,30, i en bio-huv, blanda cellmedier och kemoattraherande i ett 15 ml rör till önskade kemoattraherande koncentration. Pipett 5 ml av specifika cellmedie kemoattraherande koncentration lösning till en 15 ml rör och flytta lösningen i ett uppvärmt vattenbad.
  3. Med hjälp av en pipett, extrahera 5 ml bara cellmaterialet i en andra 15 ml rör och plats i ett uppvärmt vattenbad för att värma upp lösningen för mikroskopi experiment.
  4. I en bio-huv, pipett 30 ul av 10x fosfatbufferted lösning (PBS) i mikrocentrifugröret. Lägg 6 pl av en N natriumhydroxid (NaOH) i samma mikro centrifugrör och vortexblanda i 15 sek.
  5. Erhålla kollagen I råttsvans lösning från kylskåpet och flytta till bio-huv med användning av standardlaboratorietekniker och protokoll 29. Se till att kollagen är fortfarande kallt. Pipett 168,3 il kollagen i samma mikro centrifugrör.
  6. Lägg sedan 18 pl gulgröna fluorescerande karboxylat-modifierade mikrosfärer med hjälp av en pipett till samma mikrocentrifugröret. Vortex mikrocentrifugröret med alla lösningar för 30 sek.
  7. Lägg 77.7 il önskad cellmediecellblandningen (cirka 2 x 10 6 celler / ml koncentration) i mikrocentrifugröret och blanda med hjälp av pipettspetsen under 20 sekunder. Vid behov ändra matrisdensiteten genom att följa den anpassade kollagenblandningen anpassad för tillsats av fluorescerande pärlor och cellviabilitet tabell (tabell 1).
  8. Pipettera 300 & #181, l av kollagen-cellblandningen in i centrum väl (väl # 2) av det beredda formaggregatet. Placera formen på en engångs petriskål och flytta den till en standardinkubator under 20 minuter vid 37 ° C med 5% CO2.
  9. Ta bort systemet från inkubatorn och placera tillbaka i bio-huva. Använd pincett, ta bort båda hydrofoba täckglas genom att klämma på toppen av varje täck och dra uppåt och bort från formen.
  10. Flytta hela systemet till den önskade mikroskopi och bilden för att säkerställa kollagengjutformssidor fortfarande raka för att möjliggöra en plan diffusionsgradient.
  11. Med systemet fortfarande under mikroskop, med användning av en 100 | il enkanalig pipett, tillsätt 100 | il av cellmedia till brunn # 1. Nästa, med användning av en 100 | il enkanalig pipett till 100 | il cellmedia med önskade kemoattraherande koncentration till brunn # 3.
  12. Omedelbart efter höjande lösningar i båda brunnarna, påbörjas avbildning.

4. Imaging och DiffusionModellering

  1. Om man vill hitta diffusionskoefficienten för den specifika kollagen densitet för att beräkna den specifika koncentrationen, följa protokollet nedan:
    1. Följ givet protokoll ovan titeln "Kollagen beredningen och 3D Matrix" i stället för att generera cellmedia med önskad kemoattraherande koncentration, göra 5 iM rodamin i ett 15 ml rör med hjälp av vanliga beräkningar och protokoll 30.
    2. Bild 3D kollagenmatriser med ett konfokalt monterat på ett inverterat mikroskop med hjälp av en argonlaser (488 nm) för att fånga fluorescens. Bild varje 2 eller 3 sekunder upp till 7 timmar.
  2. För Diffusion Modellering: Använda den matematiska modell som visas nedan, skriv en beräknings programkod för bearbetning och analys med dessa allmänna steg.
    Ekvation 1
    1. Importera bilder till beräkningsprogram för omfördelning och normalisering av den maximala intensitet. Konvertera bilder till en grå färgkarta över bilden för att välja kanten. Välj en axel längs mitten av bilden, till höger om mitten och till vänster om mitten.
    2. Använda beräkningsprogramkoden, plotta den normaliserade intensiteten, tillsammans med den sanna intensiteten och skillnaden mellan de två.
    3. Nästa, mata in parametrar som är nödvändiga för montering (koncentration, tid och längd).
    4. Plotta den normaliserade koncentrationen mot tid och profilen koncentrationen över x-axeln med en polynomanpassning till data.
    5. Beräkna koefficienten för diffusion med hjälp av beräkningsprogramkoden.

5. Experimentella mätningar

  1. Med hänvisning tillbaka till diffusionsekvationen, skriva ekvationen för att hitta den specifika koncentrationen på valfri plats i systemet som visas i nedan.
    Ekvation 2
    Var:
    L = längd the kollagenmatris
    x = plats under utredning
    D = koefficienten för diffusion
    t = förfluten tid
  2. Under kemotaxi experiment, se till att registrera viss tid att ögonblicket kemokinet sattes till systemet. När cellmigration rörelse hittas säkerställa att spela konfokala time-lapse inspelning, och notera viss tid och plats från kanten där avbildning inträffade.
  3. Under dataanalys, anslut noteras förfluten tid, plats och koefficient diffusion för den specifika cellen i ekvationen för att hitta den normaliserade specifika koncentrationen vid vilken punkt som helst inom kollagen för både spridning och cellförsök.

6. Spårning Cell Migration Använda TFM

  1. För att spåra cell migration med hjälp av TFM / DVC tekniker följa protokollet nedan:
    1. Efter tillsats av önskade kemoattraherande koncentration till brunn # 3, börja avbildning 3D kollagenmatriser med ett konfokalt system monterat på ett inverterat MICRoscope att hitta en cell för att undersöka.
    2. När en rörlig cellen hittas placera cellen i mitten av synfältet och utnyttjar en piezoelektrisk motor (till bilden i z-axeln), bild varje en eller två minuter.
    3. För att beräkna cellstyrke och deformation, generera en beräknings kod för att hitta de förskjutningar av fluorescens pärlor efter de TFM / DVC protokoll 31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Förmågan hos denna analys för att exakt bedöma migreringen av cellen är beroende av en god inställning av systemet. Därför är det viktigt för se till att utforma diffusionssystem formen exakt och tar stor omsorg att placera både hydrofoba och hydrofila täck, som visas i figur 1. Om systemet är rätt utformad och under diffusion modellering skede säkerställa att hitta en mycket god linjär startlinjen, är en möjlighet att uppnå fin fluorescerar bilder, såsom visas i fig 2, för att analysera diffusion av systemet.

Nyckeln till en framgångsrik cell kemotaxi analys modellering av diffusion och lösa den allmänna diffusionsekvationen att hitta koefficienten diffusion och specifik koncentration ekvationen genom en beräknings programvara genererade koden. När du har importerat bilderna i beräknings programvara och kör analys (Figur 3), koefficienten diffusionkan bedömas (tabell 2). Figur 4 representerar kurvor för spridning av rodamin genom de fem testade kollagenkoncentrationer. Formerna hos diffusionen tomten matchar den traditionella formen av en linjär diffusionsmodell. Det kan ses att diffusion av rodamin är omvänt proportionell mot koncentrationen av kollagen-ju lägre kollagendensitet desto snabbare diffusion. Detta är att vänta, eftersom denna koncentration av kollagen har en högre porositet. De horisontella linjerna i kollagen diffusion tomten vid en koncentration av 1,5 mg / ml (Figur 4B) är helt enkelt resultatet av över mättnad av spårsignalen. Ännu viktigare, såsom visas i figur 4 varje rad representerar en specifik punkt (x, y) på insidan av kollagen, till medan tiden ökar den normaliserade koncentrationen aldrig överskrider den tidigare punkten samtidigt (dt), vilket indikerar att ingen återföring av kemikalien. Detta är en viktig egenskap hos en chemotaxis kammare för att tillåta direkt flöde av en chemoattractant utan omvänt flöde.

Genom att undersöka de senaste tio bilder på varje x-platsen, är en möjlighet att skapa en tomt på steady-state-koncentrationen av rodamin vid vart och ett av de platser. Genom att extrapolera över hela provet längd (Figur 5), kan man titta på hela provet. Detta tyder på att den linjära diffusionsgradient är konsekvent över hela provlängd, som kan användas för cellförsök (Figur 6).

Figur 1
Figur 1: En schematisk bild av plan lutning diffusionssystem formaggregatet i levande cell imaging kammare (1) En dator återgivande av hela systemet bestående av (från botten till toppen) en undre kåpa (c) en hydrofil 22 mm täck, mögel,. överdelen, och en glaskupa. (2) Mått mo ld där (a) skära skär visas. (3) Mögel med kollagen matris med (b) hydrofoba täck på varje sida gled in de skurna insatserna för att skapa 3-väl-systemet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2: Exempel på rodamin mikroskopi bilder i kollagen Bilderna tagna under rodamin diffusion experiment, på samma z-axel plats i den plana lutning diffusionssystem med 1,0 mg / ml kollagen koncentration.. Skalstreck = 500 | am, där (a) är 0 min (b) 3 min (c) 7 min och (d) 15 min efter rodamin sattes till kammaren. Pil anger riktningen för diffusion av rodamin genom kollagenmatrisen.e.com/files/ftp_upload/52948/52948fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3:. Exempel på analys och sammanfattning av spridningsberäkningar genereras av beräknings programkod med en 2,5 mg / ml kollagen koncentration (A) Svart och vitt utförande av initial (dt = 0) bilden laddas upp i beräkningsprogram för analys. (B) Särskilda punkter som valts av användaren för intensitets jämförelse och för diffusion beräkningar (x, y-axeln är i pixlar). (C) Diffusion profil rodamin hela kollagenmatrisen där varje rad korrelerar till en röd punkt i bilden B. (D) Koncentration profil rodamin hela kollagenmatrisen vid steady-state. (E) Jämförelse mellan de glättade data (blue prick) och sanna uppgifter från diffusion experiment (röd prick) med skillnaden mellan utjämnad och sann (grön prick). (F) Normaliserad koncentration av sann (röd prick) och utrustade (grön punkt) Uppgifter från beräknings programkod hela experimentet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4:. Exempel på diffusion profil genom kollagenmatris med hjälp av plana gradient diffusion systemet vid olika punkter Varje rad visar en annan utvalda datapunkter väljs från beräkningsprogramkoden av användaren. Kollagenmatris med en täthet av (A) 1,0 mg / ml (B) 1,5 mg / ml (C) 2,0 mg / ml (D) 2,2 mg / ml och (E Rong>) 2,5 mg / ml. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5:. Exempel på en koncentration (normaliserad) profil av rodamin hela kollagenmatrisen med hjälp av plana gradienten diffusionssystem vid steady state Cirklar är specifika datapunkter som valts även om beräkningsprogramkoden av användaren. Röd linje konstrueras med hjälp av datapunkter och extrapolering bästa line-fit (med 2 värde R visad) för att visa rodamin koncentration hela koUagenmatrisen. Kollagenmatris med en täthet av (A) 1,0 mg / ml (B) 1,5 mg / ml (C) 2,0 mg / ml (D) 2,2 mg / ml och (E) 2,5 mg / ml.2948fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Bild 6: Exempel på cellmigrations experiment En Z-slice mikroskopbild av en neutrofil migrerar i 3D plana gradientsystem.. Neutrofil migrerar mot kemoattraherande gradient (vit pil visar riktningen för gradienten och triangeln visar dess koncentrationsprofil), där stjärnan indikerar den initiala positionen av cellen vid början av experimentet. Subplot visar cell i 3D-rymden, där pilen visar nästa gång-punkt riktning. Skalstreck = 10 | im. dt = 5 min mellan bilder (dvs AB). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kollagen Celldensitet PBS Fluorescerande pärlor NaOH Kollagen I Rat Tail Media
2,5 mg / ml 10% 6% 2% 70,20% 11,80%
2,2 mg / ml 10% 6% 2% 61,70% 20,30%
2,0 mg / ml 10% 6% 2% 56,10% 25,90%
1,5 mg / ml 10% 6% 2% 42,10% 39,90%
1,0 mg / ml 10% 6% 2% 28,10% 53,90%

Tabell 1: Anpassad collagen blandning anpassad för tillsats av fluorescerande pärlor och cellviabilitet.

Koncentration av kollagengel Koefficient Diffusion (cm 2 / sek)
2,5 mg / ml 1,03 x 10 -6 ± 2,54 x 10 -7
2,2 mg / ml 1,28 x 10 -6 ± 3,53 x 10 -7
2,0 mg / ml 6,48 x 10 -6 ± 1,66 x 10 -7
1,5 mg / ml 1,05 X 10 -5 ± 2,04 x 10 -7
1,0 mg / ml 1,39 X 10 -5 ± 1,06 x 10 -7
Vatten 1,50 X 10 -5

Tabell 2: Koefficienter av diffusion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De mest kritiska stegen för framgångsrika diffusion experiment med eller utan celler är: korrekt inrättande av formaggregatet; utveckla nödvändig fingerfärdighet för att undvika skador vid utvinning av hydrofoba täck; garantera att hitta en mycket god linjär startlinjen för att korrekt beräkna diffusionskoefficienten; korrigera experimentella beräkningar av både kollagen och kemoattraherande; korrekt användning av levande cell imaging system för att säkerställa matris inte torka ut; och bibehålla en steril, hälsosam kultur.

När ledande diffusion experiment, är det absolut nödvändigt att se till att spridnings tomter matcha de traditionella formerna av en linjär diffusion modell (Figur 4).

Köra analysen på flera olika x-platser på varje prov, är det möjligt att beräkna den genomsnittliga koefficienterna diffusion för rodamin i olika koncentrationer av kollagen, som rapporterats i Ta ble 2. Dessa resultat överensstämmer med tidigare forskning-koefficient diffusion genom kollagengel minskar när koncentrationen av kollagen minskade på grund av en ökning av porositet i matrisen.

Enligt spridningen modellekvationen vid steady state, räknar man att ha en linjär koncentrationsprofil över x-värden. Genom att anpassa en linjär funktion till de punkter, kan man se att de alla är i själva verket, linjär. Värdet av att montera en linjär trendlinje för varje av de bästa passningslinjerna för de tre kollagenkoncentrationer R 2 var vid eller över 0,92. Normerna för förbättringarna i alla extrapolerade tomter var 0,0227, vilket tyder på en bra passform. Detta linjärt samband överensstämmer med den analytiska lösningen. Koncentrationen börjar inte vid 100%, såsom kunde förväntas, eftersom avbildning inte börjar direkt vid kanten av kollagenprovet. Det är också omöjligt att perfekt kalibrera avbildning.

_content "> Dessutom kunde vi referera till andra papper som tittade på diffusion i geler att jämföra resultat. Shenoy och Rosenblatt fann diffusionskoefficienten BSA (radie = 4 nm) i en 30 mg / ml succinylerad kollagenlösningen till 2,2 x 10 -7 cm 2 / s 32. radie rodamin är 0,78 nm, vilket förklarar dess snabbare diffusionstid genom kollagen 24. I diffusion studier, är det vanligt att använda radien för att jämföra molekyler. Som radie ökar, molekylvikt ökar också. Ramanujan et al. fann diffusionskoefficienten av dextran (radie = 6 nm) i polymeriserade 20% kollagengeler (motsvarande 2,0 mg / ml koncentration geler) att vara 4,72 x 10 -8 cm 2 / s 24. Återigen, Detta är jämförbart med diffusionskoefficienten vi observerade för 2,0 mg / ml koncentration gel (D = 1,28 x 10 -6 cm 2 / s), om vi tar hänsyn till molekylstorlek skillnaden. Leddy och Guilak studerat spridningen av dextraner genom ledbrosk 33. Det är möjligt att jämföra diffusion genom kollagenmatriser och genom ledbrosk eftersom ungefär två tredjedelar av massan av ledbrosk är polymerkollagen (övervägande typ II). Leddy och Guilak fann diffusionskoefficienten för 3 kDa dextran genom ledbrosk att vara mellan 6-10 x 10 -7 cm 2 / s 33. Att veta att systemet fungerar vi sedan kunna beräkna den specifika koncentrationen någonstans i systemet, med hjälp av sågtand och övergående systemet värmeöverförings modeller. Denna extra metriska kan användas under cell experiment för att spåra cell koncentration förståelse och lutning lutning.

Tidsvaraktighet för experiment kan vara en begränsande faktor vid användning av vår metod. Därför är det viktigt att använda ett hölje för den levande cell imaging system för att säkerställa matrisen torkar inte ut. Med hjälp av ett lock under experiments, kunde vi framgångsrikt övervaka spridningen av rodamin upp till 7 timmar och 4 timmar under cellförsök utan gelen torkar upp. Om man inte använder ett lock, kan gelen torkar upp snabbare och avsevärt påverka spridning och migrering av celler.

Protokollet som beskrivs här använder en välkontrollerad plan diffusion modell / system för att kunna mäta cell krafter i en 3D-miljö under kemotaxi. Här presenterar vi en nyutvecklad enkelt system som kan användas för TFM / DVC experiment. Med hjälp av detta system kommer forskarna att kunna: 1) framgångsrikt modell diffusion genom 3D kollagenmatriser och kontrollera, genom anpassning av data till analytiska uttryck, att den plana lutning diffusionssystem när ympades med celler, bör främja kemotaxi och inte kemokines; 2) beräkna koefficienten för diffusion för kollagen av fem olika koncentrationer; och 3) kunna hitta den specifika koncentrationen av chemoattractant i diffusion kammaren. Med detta tillvägagångssätt, kan man ytterligare undersöka cell kemotaxi med specifika mått inte enkelt och lätt tillgängliga utan mödosamma metoder av mångfacetterade system och komplexa spridnings gradienter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicone elastomer kit Dow Corning Corp 182 SIL ELAST KIT .5KG a two-part misture with a 10:1 mix
Live cell imaging chamber Live Cell Instrument CM-B18-1 CMB for 18 mm round coverslips
22 mm Glass Coverslip Fisher Scientific NC0180281 Neuvitro Corp. cover slip 22 mm 1.5
Machined aluminum metal cube
Hobby utility knife X-Acto X3201
3-(aminopropyl) trimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778-5ML
Glutaraldehyde Polysciences, Inc 00216A-10 Glutaraldehyde, EM Grade, 8%
50 ml tube Fisher Scientific 14-432-22 Standard floor model and tabletop centrifuges
Glass Petri dish Fisher Scientific 08-747A Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15 mm)
Forceps Fisher Scientific 22-327-379 Fine Point Forceps
Cover glasses Fisher Scientific 12-518-105A Rectangle; 30 x 22 mm; Thickness No. 1
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl Gelest SIT8174.0
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099 Acetic acid ACS reagent, ≥99.7%
Hexane Sigma-Aldrich 296090 anhydrous, 95%
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 200 proof, for molecular biology
High-precision diamond scribing tool Lunzer PV-081-3 Straight extended tip scribe, .020" (.50 mm) diameter by .200" (5.0 mm) tip length
Vacuum grease Dow Corning 14-635-5C High-Vacuum Grease
15 ml tube Fisher Scientific 14-959-49D 15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface
10x phosphate buffered solution Fisher Scientific BP399-500 1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer
1 N sodium hydroxide Sigma-Aldrich 38215 Sodium hydroxide concentrate
Collagen I, rat tail BD Biosciences 354236 Rat tail 
Micro centrifuge tube Fisher Scientific 02-681-332 Volume: 2.0 ml;
O.D. x L: 13 x 40 mm;
sterile; single-wrapped
Name Company Catalog Number Comments
Carboxylate-modified microspheres Invitrogen  F-8813 Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids
Rhodamine Sigma-Aldrich 83689 Rhodamine B for fluorescence

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adzick, N. S. The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair. Ann Surg. 225, (2), 236 (1997).
  2. Reddi, A. H. Bone morphogenetic proteins: an unconventional approach to isolation of first mammalian morphogens. Cytokine Growth F. R. 8, (1), 11-20 (1997).
  3. Coussens, , Werb, Z, L. M., Werb, Z. Inflammation and cancer. Nature. 420, (6917), 860-867 (2002).
  4. Vital-Lopez, F. G., Armaou, A., Hutnik, M., Maranas, C. D. Modeling the effect of chemotaxis on glioblastoma tumor progression. AIChE J. 57, (3), 778-792 (2011).
  5. Hughes-Alford, S. K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of gradient sensing: towards building predictive models of chemotaxis in cancer. Curr. Opin. Cell Biol. 24, (2), 284-291 (2012).
  6. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat. Rev. Mol Cell Bio. 10, (7), 445-457 (2009).
  7. Cristini, V. Morphologic Instability and Cancer Invasion. Clin. Cancer Res. 11, (19), 6772-6779 (2005).
  8. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453, (7191), 51-55 (2008).
  9. Parent, C. A., Devreotes, P. N. A cell's sense of direction. Science. 284, (5415), 765-770 (1999).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  11. Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, (6), 1650-1656 (1975).
  12. Rosoff, W. J., McAllister, R., Esrick, M. A., Goodhill, G. J., Urbach, J. S. Generating controlled molecular gradients in 3D gels. Biotechnol. Bioeng. 91, (6), 754-759 (2005).
  13. Wells, A., Kassis, J., Solava, J., Turner, T., Lauffenburger, D. A. Growth factor-induced cell motility in tumor invasion. Acta Oncol. 41, (2), 124-130 (2002).
  14. Wilkinson, P. C. Assays of leukocyte locomotion and chemotaxis. J. Immunol. Methods. 216, (1-2), 139-153 (1998).
  15. Bonvin, C., Overney, J., Shieh, A. C., Dixon, J. B., Swartz, M. A. A multichamber fluidic device for 3D cultures under interstitial flow with live imaging: development, characterization, and applications. Biotechnol. Bioeng. 105, (5), 982-991 (2010).
  16. Noo, L. J., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, (8), 826-830 (2002).
  17. Shao, J., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab Chip. 9, (21), 3118-3125 (2009).
  18. Haessler, U., Kalinin, Y., Swartz, M. A., Wu, M. An agarose-based microfluidic platform with a gradient buffer for 3D chemotaxis studies. Biomed. Microdevices. 11, (4), 827-835 (2009).
  19. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat. Rev. Cancer. 3, (5), 362-374 (2003).
  20. Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol. Biol. 769, 149-165 (2011).
  21. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J. Cell Biol. 75, (2 Pt 1), 606-616 (1977).
  22. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J. Cell. Sci. 99, (Pt 4), 769-775 (1991).
  23. Gilbert, D. L. Macromolecular diffusion through collagen membranes. Int. J. Pharm. 47, (1-3), 79-88 (1988).
  24. Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys. J. 83, (3), 1650-1660 (2002).
  25. Weadock, K., Silver, F. H., Wolff, D. Diffusivity of 125I-calmodulin through collagen membranes: effect of source concentration and membrane swelling ratio. Biomaterials. 7, (4), 263-267 (1986).
  26. Erikson, A., Andersen, H. N., Naess, S. N., Sikorski, P., Davies, C. dL. Physical and chemical modifications of collagen gels: impact on diffusion. Biopolymers. 89, (2), 135-143 (2008).
  27. Moghe, P. V., Nelson, R. D., Tranquillo, R. T. Cytokine-stimulated chemotaxis of human neutrophils in a 3-D conjoined fibrin gel assay. J. Immunol. Methods. 180, (2), 193-211 (1995).
  28. Sundd, P., et al. Live cell imaging of paxillin in rolling neutrophils by dual-color quantitative dynamic footprinting. Microcirculation. 18, (5), 361-372 (2011).
  29. Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors. J. Vis. Exp. (63), 2754 (2012).
  30. Stephenson, F. H. Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory 2e. Elsevier Science. (2010).
  31. Bar-Kochba, E., Toyjanova, J., Andrews, E., Kim, K., Franck, C. A Fast Iterative Digital Volume Correlation Algorithm for Large Deformations. Exp. Mech. In press, (2014).
  32. Shenoy, V., Rosenblatt, J. Diffusion of Macromolecules in Collagen and Hyaluronic Acid, Rigid-Rod-Flexible Polymer Composite Matrixes. Macromolecules. 28, (26), 8751-8758 (1995).
  33. Leddy, H., Guilak, F. Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching. Ann. Biomed. Eng. 31, (7), 753-760 (2003).
Planar Gradient Diffusion System för att undersöka Chemotaxis i en 3D kollagenmatris
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stout, D. A., Toyjanova, J., Franck, C. Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (100), e52948, doi:10.3791/52948 (2015).More

Stout, D. A., Toyjanova, J., Franck, C. Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (100), e52948, doi:10.3791/52948 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter