Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Valgt Reaktion Overvågning massespektrometri for Absolute Protein Kvantificering

Published: August 17, 2015 doi: 10.3791/52959
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cellular Networks Proteomics Unit, Laboratory of Systems Biology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

Introduction

Proteomiske eksperimenter, der bruger massespektrometri (MS) kan designes til at bruge enten ikke-øremærket (shotgun) eller målrettede metoder. Discovery proteomics generelt afhængig af bottom-up shotgun MS, enten ved hjælp af en traditionel data-afhængig erhvervelse tilstand, eller ved hjælp af en af de nyligt udviklede data-uafhængige teknikker (f.eks MS E, SWATH) 1,2. Shotgun proteomics er et stærkt værktøj til high-throughput peptididentifikation og relativ kvantificering, men det er generelt uegnet til absolut kvantificering eller til målretning små afgrænsede sæt (~ TEN) af proteiner. MS metode oftest bruges til målrettede proteomanalyse er valgt reaktion overvågning (SRM) på grund af sin høje følsomhed, hastighed og dynamikområde 3-5. Alternativer til SRM omfatter parallelle reaktion overvågning, som udnytter høj opløsning, fuld MS scanning 6.

SRM udføres sædvanligvis ved anvendelse af et nano-flow reversed-fase højtydende væskekromatografi (nano-RP-LC) instrument koblet til et nano-elektrosprayionisering (nano-ESI) ionkilde fastgjort til en tripel kvadrupol massespektrometer (QQQ-MS). I et typisk forsøg er prøveproteiner proteolytisk spaltet, og de resulterende peptider kromatografisk adskilt, desorberet og ioniseret. De resulterende precursor ioner er m / z filtreres af den første kvadrupol (Q1) og fragmenteret i den anden kvadrupol (q2) ved at støde dem med en kollision gas. Det resulterende fragment-ioner er m / z-filtreret i den tredje kvadrupol (Q3) og kvantificeres ved en dynode. Hver forløber og fragment ionpar omtales som en overgang, og hver overgang overvåges for en bestemt tidsperiode (opholdstiden, typisk 2-50 ms). Under LC-SRM, de QQQ-MS cykler gennem en foruddefineret liste over overgange (arbejdscyklus er typisk ≤3 sek), og et kromatogram af hver overgang produceres.

Alternativ strategerne til protein kvantificering bruger typisk immunoassays såsom dot blots, Western blots, ELISA, antistof microarrays, omvendt fase protein microarrays, mikrofluide immunoassays, digitale ELISA og mikrosfære-baserede immunoassays 7. De bedste immunassays kan være betydeligt mere følsomme end LC-SRM, og prøve gennemløb af immunassays kan være betydeligt højere end for LC-SRM 5. Dog kan udvikle immunoassays være dyrt og / eller tidskrævende, og de ​​resulterende analyser kan være sårbare over for krydsreaktivitet og / eller forstyrrelser, er uforenelig med celle / væv lyse / homogenisering metoder, og / eller ikke modtagelig for multipleksing 5,8. Nogle af disse spørgsmål kan løses ved at koble antistof-og MS-baserede teknikker. For eksempel kan målproteiner beriges under anvendelse af immunopræcipitation før proteolyse og LC-SRM 9-12. Alternativt SISCAPA teknik anvender immunfældning efter proteolyse ved peptidet level 13,14. Udover immunoenrichment strategier, kan immunodepletion høje tæthed proteiner anvendes til at øge LC-SRM følsomhed ved at reducere interferens ved co-eluerende analytter 15,16.

MS-baseret protein kvantificering kan opdeles i relativ og absolut kvantificering, og også i etiket-fri og stabil isotop mærkning (f.eks metabolisk mærkning, kemisk mærkning, og tung-mærket protein og peptid interne standarder). Label-free teknikker kan være nyttige for relativ protein kvantificering, men er uegnede til nøjagtig absolut kvantificering. Til sammenligning har mærkningsteknikker reduceret fejl i forbindelse med prøveforberedelse og MS varians, og anvendes ofte til relativ protein kvantificering 17. F.eks stabil isotop mærkede proteomanalyse standarder (SILAP) fremstilles under anvendelse af en dyrket human cellelinie aktiveret relativ kvantificering af potentielle biomarkører via LC-SRM af humant serum 18. Nøjagtig absolutte protein kvantificering af MS kræver, at renset, kvantificeret, isotopisk-mærket protein eller peptid interne standarder skal spidse-til biologiske prøver før MS. Inkorporering af tunge isotop mærkede interne standarder i en LC-SRM workflow muliggør absolut kvantificering som har vist sig at være meget reproducerbar og kan overføres mellem laboratorier 16,19.

Stabil isotop mærkede interne standarder for absolut protein kvantificering af MS omfatter peptid-standarder fremstillet under anvendelse af fastfasesyntese 20, proteiner bestående af sammenkædede protease-spaltelig peptid standarder 21, og fuld længde proteinstandarder 22. Target protein kovalent modifikation og ufuldstændig prøveforberedelse (dvs. ufuldstændig prøve lyse og homogenisering, og ufuldstændige protein opløselighed, denaturering, alkylering og proteolyse) kan underminere nøjagtig kvantificering. Intern protein standarder er de mindst tilbøjelige til at blive påvirket af de fleste af disse potentielle problemer, men de er som regel de mest vanskelige at forberede. Et alternativ er at analysere hver målprotein ved anvendelse af multiple indre peptid standarder, der er konstrueret til at omfatte amino- og carboxyterminale native flankerende rester. Uanset hvilken type af intern standard anvendes, skal det spidse-i de biologiske prøver ved så tidligt et tidspunkt under prøveforberedelse som muligt. Desuden bør multiple prøveforberedelse teknikker (f.eks forskellige denaturering betingelser) skal testes. Brugen af flere ortogonale eksperimentelle teknikker (eksperimentel cross-validering) er en bæredygtig strategi for at overvinde de fleste potentielle kvantificering udfordringer 23-25.

LC-SRM kvantificering af proteiner er en yderst fleksibel teknik, der har været anvendt i en lang række anvendelser. Især er det blevet anvendt til at undersøge peptid- og protein biomarkører indenkliniske prøver såsom serum, core biopsier, og finnåls aspirater 5. LC-SRM er også blevet anvendt til at måle støkiometrien af proteinkomplekser 5,26, for at opdage botulinumneurotoksiner 27, at kvantificere proteinphosphoryleringsbegivenheder dynamik inden signalveje 5, og til at kvantificere ændringer i protein konformation 28.

Vores laboratorium er ved LC-SRM at kvantificere signalproteiner der medierer makrofag kemotaksi at støtte udviklingen af ​​kemotaksi pathway simuleringer. Den samlede ordning af protokollen (figur 1) begynder med rangordning de foreløbige mål peptider. Efterfølgende rå peptid normer for ydre syntetiseret og anvendt til at udvikle LC-SRM assays for kvalitative analyser af biologiske prøver. Hvis der registreres den biologiske prøve-afledte målpeptid, er oprensede tunge-mærkede interne peptid standarder forberedt til kvantitativ LC-SRM. Denne protokol kan bruges til accurately kvantificere proteiner fra en bred vifte af biologiske prøver, og til at støtte undersøgelser af mange forskellige protein-targets.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Denne metode er tidligere blevet beskrevet 56.

1. Peptid Target Selection

  1. Udarbejde en liste over de målproteiner, og omfatter et lille antal husholdning proteiner til normalisering tværs biologiske prøver, og omfatter også en intern protein standard (f.eks ildflueluciferase). Fordøje målproteiner i tryptiske peptider i silico ved hjælp af en software-værktøj, såsom Protein Digestion Simulator 29,30.
  2. Kræve, at peptiderne er fuldt tryptiske og indeholder ingen manglende trypsin spaltningssites. Undgå peptider med tilgrænsende trypsin spaltningssteder for at undgå potentielt ufuldstændig trypsinfordøjelse 31.
  3. Kræv, at længden af ​​hvert peptid er 5-20 rester. Overvej længere peptider, men bemærk, at de generelt er dyrere at syntetisere.
  4. Undgå et peptid, hvis det svarer til en naturlig genetisk variant (fx en enkelt nucleotide polymorfisme). Også bekræfte, at trypsin steder er upåvirket (Trin 1.2).
  5. Undgå et peptid, hvis den svarer til en lokalitet af posttranslationel modifikation (PTM). Ligeledes undgå et peptid, hvis det ville være tilbøjelige til kemisk modifikation under LC-MS prøveforberedelse. Specifikt undgå peptider tilbøjelige til cystein og methionin oxidation, asparagin og glutamin deamidering, og amino-terminale glutamin dannelse af pyroglutamat. Bekræft, at trypsin steder er upåvirket (Trin 1.2).
    1. Endvidere undgå peptider, der stammer fra protein amino- og carboxy-termini, fordi protein termini er tilbøjelige til posttranslationel modifikation (aminoterminal methionin tab og acetylering, og carboxyterminale amidering).
  6. Kræve, at alle målpeptid er unik for hver målprotein. Hvis dette ikke er muligt, kræver, at peptidet er unik for et sæt af isoformer / homologer. Behandl peptider kun afviger med leucin / isoleucin-substitutionsom om de var identiske, når det bestemmes peptid unikke fordi disse udfører næsten identisk under LC-SRM.
    1. Hvis en omfattende transkriptomisk analyse af alle de biologiske prøver er blevet udført (f.eks RNA-seq), fastlægge peptid entydighed brug i silico oversættelser af transkriptet sekvenser 32 i stedet for at bruge hele proteom af arterne.
  7. Kræver, at target peptider er proteotypic. Identificere proteotypic peptider under anvendelse haglgevær massespektrometri 1,2 af de biologiske prøver, der undersøges. Alternativt, hente peptid identifikationer af proteotypic peptider fra online proteomikdatabanker såsom NIST massespektrometri bibliotekerne 33 (http://peptide.nist.gov/), Global Proteome Machine 34 (X HUNTER spektrale biblioteker fra http: // www .thegpm.org / HUNTER / index.html og GPMDB peptid identifikationer fra http://gpmdb.thegpm.org/), PeptideAtlas 35 36 (http://www.ebi.ac.uk/pride/archive/).
  8. Hvis kvantitativ transkript-niveau analyser af biologiske prøver er blevet udført (f.eks RNA-seq, qPCR), derefter undgå målretning peptider, som svarer til de relativt lav hyppighed transkripter.
  9. Vælg om nødvendigt target peptider, der kan anvendes til LC-SRM assays af målprotein ortologer (f.eks, til at analysere både humane og murine former af et målprotein).
  10. Vælge mindst to target peptider pr målprotein (om muligt).

2. Fremstilling af peptid Standards

BEMÆRK: Dette afsnit af protokollen beskriver fremstilling af et sæt af tyve frysetørrede peptid standarder (hver er 1 nmol i mængde) for downstream analyser. For et andet antal peptider, eller for forskellige peptid mængder, vil det være nødvendigt at justere i overensstemmelse hermed.

    20,37.
    1. Sikre, at cysteinresterne eksterne peptid standarder carbamidomethylated (den kemiske struktur er dannet af iodacetamid alkylering). I modsætning hertil sikre, at cysteinrester af indre peptid standarder er umodificeret (disse vil alkyleres under prøveforberedelsen beskrevet nedenfor).
    2. Designe indre peptid standarder, således at de indeholder amino- og carboxyterminale native flankerende rester (for at kontrollere for trypsinfordøjelse effektivitet hver er typisk 3-6 rester lang).
    3. Designe indre peptid standarder, således at de er stabile isotop mærkede. Overvej den naturlige isotopiske profil målpeptidet og massen målenøjagtighed af MS'en, når der vælges et peptid mærkning strategi. Brug ikke deutererede peptid standarder, fordi peptid deuteration årsager omvendt fase LC retentionstidens at flytte 38.
      Bemærk: Typisk tryptiske indre peptid standarder syntetiseret under anvendelse ~ 98% rent [13C 6, 15 N 4] Arg og [13C 6, 15 N2] Lys inkorporeret ved carboxy-termini.
    4. Rense interne peptid standarder ved hjælp af HPLC 39, og præcist tal på dem 40.
  1. Tilsættes 100 pi 0,1% v / v myresyre, kan 20% vol / vol acetonitril (ACN) til hver 1 nmol lyofiliserede peptid standard til at producere et peptid koncentration på 10 uM (brug omhu som det lyofiliserede peptid har en meget lav densitet og kan mistes let). Vortex prøverne for 2 min og bad sonikeres dem i 5 min for at sikre, at peptid opløsningen er fuldstændig.
  2. Pool de opløste peptider, og koncentrere den resulterende blanding i et vakuum koncentrator til et endeligt volumen på 80 pi. Tilføj 20 pi ACN at opløse enhver udfældet peptid.
    Bemærk: Prøven nu contains 10 uM af hvert peptid og 20% ​​v / v ACN.
  3. For de interne peptid standarder, udarbejde en fortyndingsrække til kvantitativ LC-SRM:
    1. Fremstilling af 100 pi af en 1 uM fortynding: kombinere 90 pi 20% v / v ACN og 10 pi af 10 uM peptidblanding.
    2. Fremstilling af 100 pi af en 100 nM fortynding: kombinere 90 pi 20% v / v ACN og 10 pi af 1 pM peptidblanding.
  4. For eksterne peptid standarder, fremstilling af 100 pi af en 1 uM fortynding for LC-MS ved at kombinere 90 pi 0,1% v / v myresyre og 10 pi af 10 uM peptidblanding.
    Bemærk: Prøven nu indeholder 1 uM af hvert peptid, 0,1% vol / vol myresyre og 2% v / v ACN, og er klar til at blive anvendt til LC-SRM assay udvikling.

3. LC-SRM Assay Development

  1. Analysere blandinger af de ydre peptid standarder (ca. 1-10 pmol af hvert peptid per injektion) ved shotgun MS under anvendelse af et nano-flow HPLC-systemet koblet til en tripel kvadrupol massespektrometer (LC-QQQ-MS (/ MS)).
    1. Brug en LC-MS-system er udstyret med en kapillær søjle pakket med C-18 medier (≤5 um diameter, ~ 200 en porer, længde ≥10 cm, id = 50-100 um) og en nano-ESI spids (typisk fremstillet ved hjælp af en laser-aftrækker). Sikre, at hver LC-MS run indbefatter en ~ 60 min lineær gradient (typisk 0-40% opløsningsmiddel B), en søjle regenerering trin (~ 80% opløsningsmiddel B), og en søjle re-ækvilibrering trin (~ 0% opløsningsmiddel B ) (Solvent A = 0,1% vol / vol myresyre i H2O, opløsningsmiddel B = 0,1% vol / vol myresyre i ACN, strømningshastighed = 200-800 nl / min, ESI spænding = 1.800 V, Q3 isolation width = 0,7 m / z, q2 argontryk = 1,5 mTorr).
    2. For hver forløber ion-scanning, dynamisk vælge top ~ 10 mest intense prækursor-ioner for tandem massespektrometri (MS / MS). Køre hver prøve in duplo, således at to forskellige kollisionsenergi ramper anvendes: en designet til optimalt at fragmentere +2 prækursor-ioner, og den andentil +3 forløber ioner 41.
    3. Udfør LC-QQQ-MS (/ MS) analyser bruger Q3 forløber ion scanning (Q1 forstadie ion-scanning kan forårsage tailing af forstadie ion toppe som følge af lavenergi argon kollisioner i Q2).
    4. Sørg for, at LC-MS systemet fungerer tilstrækkeligt ved at analysere QC prøver og tekniske replikater. Forebyg prøve fremførsel ved at bruge frisk gjort LC kolonner og ved at køre flere emner mellem prøverne.
  2. Analyser de resulterende shotgun LC-QQQ-MS (/ MS) data ved hjælp databasesøgning mod sekvenserne af de ydre peptid standarder 42. Hvis det er relevant, kassere tvetydige peptid identifikationer ved hjælp af peptid-identifikation tillid scores (f.eks forventning værdier) eller ved hjælp af statistisk modellering 42. Uanset, manuelt gennemgå alle de peptid identifikationer 43 for at sikre, at de alle er entydige.
  3. Brug shotgun MS peptid identifikationer at conkonstruere et spektrum bibliotek ved hjælp af et software program som Skyline.
    1. Forbered et LC-SRM overgang liste ved hjælp af de 3-10 mest intense overgange pr forløber ion (+2 og +3 prækursor-ioner, +1 og +2 fragment ioner, y-, B-, og a-ioner, der er ≥2 rester lang).
    2. Kassere en overgang, hvis precursor og fragment ion m / z-værdier overlapper inden massen målenøjagtighed af QQQ-MS (precursor ion fragmentering er undertiden ufuldstændig huske at overveje monoisotopisk og de tunge naturlige isotop former, såvel som det umærkede og heavy-mærkede former).
    3. Tilsvarende kassere en overgang, hvis fragment ion m / z overlapper den for en anden fragment-ion fra samme prækursor-ion.
  4. Bruge de resulterende lister overgangen til at udføre LC-SRM analyser af blandinger af de ydre peptid standarder (udføre massespektrometri som beskrevet i trin 3.1, Q1 og Q3 isolation width = 0,7 m / z; opholdstid = 2-50 ms).
  5. Manually gennemgå de resulterende LC-SRM data og slette eventuelle dårligt udfører analyser (analyse af LC-SRM data er beskrevet i afsnit 5).

4. LC-SRM Analyser af biologiske prøver

  1. Forbered retter af dyrkede celler 44. Hvis flere eksperimentelle betingelser, der sammenlignes, blok og randomisere prøverne for at reducere eventuelle systematiske afvigelser 45.
  2. For hver skål af celler, aspireres celledyrkningsmediet til affald og suspendere cellerne i et serumfrit buffer 44. Hvis det er nødvendigt, vaskes cellerne i et serumfrit puffer for at fjerne eventuelt resterende ekstracellulært protein.
  3. For hver prøve, tælle antallet af levedygtige og totale celler ved anvendelse af en levedygtighed farvning (f.eks, trypan blå) og et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller 44.
  4. Pelletere cellerne ved centrifugering, og aspireres supernatanterne til affald 44 (en typisk cellepellet volumen er ~ 30 pi).
  5. Hver prøve blandes under forsigtig pipettering, og overføre hver til et 2 ml rør (med skruelåg med en O-ring) indeholdende ~ 100 pi 0,1 mm zirconia / silica beads (bemærk, at perlerne kan forårsage snap-cap tubes at lække ). Lysere cellerne ved hvirvelblanding prøverne i 5 min ved fuld hastighed (dette lyserer cellerne ved bead beating).
    1. Alternativt lysere cellerne hjælp af en anden mekanisk metode (f.eks ved hjælp af en fransk presse eller homogenisering tip).
      Bemærk: Undgå centrifugering cellelysater fordi dette kan pelletere udfældet protein, der kunne otherwise blive tryptically fordøjet og detekteres ved LC-MS.
  6. For det overfladeaktive stof denaturerede prøver, inkubere dem ved 90 ° C i 10 min for at bistå prøve homogenisering og proteindenaturering.
  7. Bad sonikeres prøverne i 10 minutter ved stuetemperatur til at hjælpe homogenisering og proteindenaturering.
    Bemærk: lysater og lysisbuffer kan opbevares ved -80 ° C (bliver lysisbuffer være behov for trin 4.9 og 4.13).
  8. Udfør en proteinkoncentration assay 46 (fx en bicinchoninsyre-assay), i lysaterne (og af lysis buffer som et kontrolforsøg).
  9. For kvalitative analyser (dvs. vil uden indre peptid standarder spiked-ind prøverne), pipette 200 ug (protein masse) af cellelysat i en frisk 1,5 ml mikrocentrifugerør. For kvantitative analyser, forberede fire sådanne prøver til en stabil isotop fortyndingsrække.
  10. For hver prøve tilføje en intern protein standard (f.eks </ Em>, tilføje ~ 5 pmol ~ 98% rent ildflueluciferase).
  11. For kvantitative analyser, tilføje den stabile isotop fortyndingsserie af den ækvimolære blanding af indre peptid-standarder (fx 0, 0,2, 2, 20 pmol af hvert peptid) til prøverne.
    1. Parallelt hermed forberede kontrolprøver ved hjælp af de indre peptid standarder alene (dvs. ingen cellelysat) (f.eks, 0, 0,2, 2, 20 pmol af hvert peptid).
    2. Forberede Også kontrolprøver ved hjælp af de eksterne og interne peptid standarder (for eksempel: 2 pmol for hver ekstern peptid standard, og 0, 0,2, 2, og 20 pmol af hver intern peptid standard).
      Bemærk: Sørg for, at peptid standarder er fri myresyre, da det kan forstyrre trypsin fordøjelse.
  12. Tilføj lyseringspuffer så alle prøverne er identiske mængder. Bemærk: En typisk prøvevolumen er 70 pi, så dette volumen vil blive anvendt til denne protokol.
  13. Reducere protein cysteinrester ved tilsætning 0.7 pi 1 M DTT (frisk fremstillet) til hver prøve (den endelige DTT-koncentration er 10 mM) og inkubering af prøverne ved 60 ° C i 30 minutter.
  14. Alkylat protein cystiner ved at tilføje 7 pi pufret iodacetamid (500 mM iodacetamid, 1 M HEPES ∙ NaOH pH 8, frisklavet) til hver prøve (den endelige iodacetamid koncentration er 50 mM) og inkubere prøverne ved stuetemperatur i 20 minutter i mørke (iodoacetamid er lysfølsomt). Om nødvendigt udslukke den resterende iodacetamid ved tilsætning DTT til en slutkoncentration på 50 mM.
  15. For hver af prøverne denatureret ved anvendelse af urinstof, tilsættes 482 pi af 100 mM HEPES ∙ NaOH pH 8, således at den endelige urinstofkoncentration er 1 M (trypsin inhiberes væsentligt ved> 1 M urea 47).
  16. Tryptically fordøje proteinerne til peptider.
    1. For hver prøve, der indeholder cellelysat, tilsættes 8 pi 0,5 pg / pl sekventering modificeret trypsin således at den endelige trypsin koncentration 1:50 (protein vægt: vægt) trypsin: prøve, og inkubere prøven ved 37 ° C i 18 timer.
    2. For hver prøve, der ikke indeholder cellelysat, tilsættes 0,5 pi 0,5 pg / pl sekventeringskvalitet modificeret trypsin, og inkubere prøven ved 37 ° C i 2 timer (hver af disse prøver er for kontrolforsøg, og indeholder typisk kun 10 ng -10 ug af peptid + proteinmasse).
  17. For hver af urinstof denaturerede prøver, tilsættes 440 pi 2% v / v myresyre (den endelige myresyre koncentration er 1% v / v). Bekræfte, at disse prøver er pH ~ 3.
    1. For hver af de overfladeaktive denaturerede prøver, tilsættes 914 pi 0,5% v / v TFA (den endelige TFA koncentrationen er 0,5% v / v). Bekræfte, at disse prøver er pH ~ 1.5. Inkuber disse prøver ved 37 ° C i 60 minutter for at hydrolysere det overfladeaktive middel.
  18. Mikrocentrifuge alle prøverne ved 21.000 x g i 20 minutter ved stuetemperatur for at pelletere det overfladeaktive halegruppe og enhver anden PRECipitates som ville tilstoppe en C-18 SPE indsats.
  19. Fastfase udtrække hver af supernatanterne ved anvendelse af en engangs C-18 SPE indsats (Buffer A = 0,1% vol / vol myresyre; Buffer B = 0,1% vol / vol myresyre, 80% v / v ACN; ~ 100 mg C- 18 harpiks pr patron). Tvinge de mobile faser gennem C-18 SPE-beholder hjælp af en flad overflade gummi pære, under anvendelse af en ekstraktion manifold, eller ved centrifugering af patronen i et 15 ml centrifugerør ved 10 x g i 5 minutter.
    1. Fugt søjlen ved at anvende 1 ml puffer B, ækvilibrere det ved at anvende 1 ml Buffer A to gange, påføre prøven og vask patronen ved at anvende 1 ml Buffer A to gange. Eluere peptiderne ved anvendelse 1 ml puffer B langsomt (~ 2 min).
  20. Koncentrer hver eluat i et vakuum koncentrator til et endeligt volumen på 100 pi at fordampe væk ACN. Tilsæt 200 pi H2O til hver prøve, og koncentrere hver i et vakuum koncentrator til et endeligt volumen på 98 pi til at fordampe væk enhver mulig reresterende ACN.
  21. Tilsæt 2 pi 5% vol / vol myresyre i ACN til hver prøve (slutkoncentrationerne prøven er 0,1% v / v myresyre, 2% v / v ACN).
    Bemærk: Prøverne kan opbevares ved -80 ° C.
  22. Analyser af prøverne ved hjælp af LC-SRM (som i trin 3.4). For kvalitative LC-SRM-analyser, køre de biologiske prøver og de eksterne peptid standarder, og analysere alle de resulterende data sammen. Til kvantitativ LC-SRM analyser, køre isotop fortyndingsrække af hver biologisk prøve, og også køre prøverne består af peptid standarder alene, og analysere alle de resulterende data sammen.

5. LC-SRM Dataanalyse

BEMÆRK: Peptid identifikation og kvantificering kan meget forenklet og delvist automatiseret ved hjælp af software som Skyline, men det er stadig stærkt anbefales, at alle data anmærkning manuelt revideret. Også, er det bedst at udelukke information proteinniveau under manuel Annotation af LC-SRM data for at undgå bias.

  1. For hvert peptid identifikation, bekræfter, at formen af ​​hver overgang elueringsprofil er nogenlunde Gaussisk. For hver overgang, bekræfter, at elueringsprofilen er produktet af flere signaler, der måles af MS-detektor (dvs. er ikke et produkt af en eller to tilfældige pigge af MS støj).
  2. For hvert peptid identifikation, sikre, at hele peptid elueringsprofilen er valgt. Undgå manuel justering elueringsprofilen grænserne for underkomponenter af peptidet identifikation (den tunge-mærkede peptid form det umærkede form individuelle forstadiepartikler ioner, og individuelle overgange).
  3. Bekræfte, at hver overgang elueringsprofil har et signal-til-støj-forhold (S / N) ≥3. Bemærk: "Støj" henviser til tilfældig MS støj, ikke at reproducerbare signal fra co-eluerende analytter. Kromatogram udglatning funktioner i høj grad kan hjælpe analysen af ​​støjende data.
  4. For hvert peptid identifikation,bekræfter, at alle overgangene har næsten identiske elueringsprofiler (ikke blot lige toppens spids tider; elueringsprofilerne kan have forskellige amplituder).
  5. For LC-SRM analyser af en stor mængde af peptidet standarder (typisk ≥100 fmol af hvert peptid), bekræfter, at de tilsvarende peptid elueringsprofilerne er meget intens (typisk s / n ≥100), og at peptidet identifikationer er entydige. Bemærk: Disse meget selvsikre identifikationer vil være afgørende for at identificere de tilsvarende biologisk prøve-afledte peptider.
  6. For hvert peptid identifikation, bekræfter, at de relative overgangsintensiteter matcher de af selvsikkert identificerede peptid standard. Hvis det er nødvendigt, kassere støjende, relativt lav intensitet overgang elueringsprofiler, men bekræfter, at ingen af ​​de relativt intense overgange mangler. Se bort fra relativt intense overgang elueringsprofiler der er væsentligt og utvetydigt berørt af en coeluering kontaminant.
  7. For hvert peptid identifikation, vurderer sandsynligheden for, at den blev produceret tilfældigt af baggrunden signal (tilfældig MS støj plus reproducerbar signal fra co-eluerende analytter).
    1. Estimere denne sandsynlighed manuelt ved at undersøge hele LC-SRM kromatogram og estimere det unikke i hvert peptid identifikation. Fremstil et sæt selvsikre peptid identifikationer, der har en anslået falsk opdagelse sats (FDR) på 5%. Brug strengere kriterier (f.eks FDR ≤1%), hvis en højere tillid sæt identifikationer er påkrævet (brug af løsere kriterier ikke anbefales).
    2. Alternativt kan du bruge mProphet algoritmen 48 eller revisionen algoritmen 49, men manuelt gennemgår resultaterne.
  8. For hvert peptid identifikation, bekræfter, at den observerede elueringstid er i overensstemmelse med hydrofobiciteten af ​​peptidet (Skyline er designet til at udføre denne beregning).
  9. For hvert peptid, bekræfter, atdets elueringstid er konsistent på tværs af LC kører.
    BEMÆRK: LC-SRM analyser sommetider producere elueringsprofiler der systematisk skæv mellem kørsler. Systematiske forskydninger der må forventes efter instrument ændringer såsom udskiftning af en kolonne. Desuden kan tidligt eluerede peptider være tilbøjelige til at flytte (især hvis søjlen indlæst tæt på kapacitet), og sene eluering peptider kan også være tilbøjelige til at flytte. Peptid-identifikation er nu færdig.
  10. At forbedre peptid kvantificering, reinspect hvert peptid identifikation og kassere en overgang elueringsprofil hvis det er særligt støjende sammenlignet med de andre overgang elueringsprofiler af peptidet identifikation. Kassere en overgang elueringsprofil hvis dens relative overgangsintensitet er forkert (i forhold til peptidet standard).
  11. Undersøg grænserne for hver forløber ion og overgang elueringsprofil. Hvis det er nødvendigt, omhyggeligt justere Elueringsprofilen grænser for at beskære væk baggrund signal (eller jegmprove baggrundssignal estimation).
  12. For hver indre peptid standard, kontrollere, om det er kontamineret med en detekterbar mængde lys peptid (bestemt ved LC-SRM analyser af indre peptid standarderne alene, beskrevet ovenfor). Efterfølgende kassere lys peptid elueringsprofiler der var signifikant kompromitteret af lys-peptid forurening inden for de interne peptid standarder.
  13. Kvantificere hver overgang elueringsprofil ved at beregne dens LC topareal. Hvis det er relevant, fratrække den anslåede baggrund signal. Kvantificere hvert peptid elueringsprofil som summen af ​​de tilsvarende overgang kvantificering værdier (i det følgende, er dette benævnt "Sum_Peak_Area" værdi). For hver biologisk prøve peptid Sum_Peak_Area værdi, beregne den biologiske prøve peptid molære overflod ved hjælp af data fra LC-SRM af interne eller eksterne peptid standarder (brug kun de overgange, der lykkedes kvantificeret af både den biologiske prøve peptidLC-SRM og den for peptidet standard).
    1. Kvantificering brug af eksterne peptid standarder (ikke anbefalet):
      1. Plotte ekstern peptid standard Sum_Peak_Area værdier versus ekstern peptid standard molære overflod værdier. Fremstil en standardkurve ved at montere en lineær regression på de data (typisk, bør anvendes kun den lineære del af det dynamiske område, enhver lineær komponent bør anvendes med ekstrem forsigtighed). For hver biologisk prøve peptid Sum_Peak_Area værdi, bruger standardkurven til at beregne peptid molære overflod.
        Bemærk: Denne kvantificering metode kan ikke anbefales, da det kræver, at prøveforberedelse og LC-SRM være demonstrability robuste, fordi de biologiske prøver og eksterne peptid standarder udarbejdes og analyseres ved LC-SRM separat. Også, det ikke højde for matrix effekter (virkninger forårsaget af bestanddele i en anden end analyt prøven).
    2. Kvantificering ved brug af internepeptid standarder (anbefales):
      1. For hver biologisk prøve peptid Sum_Peak_Area værdi og tilsvarende tung-mærkede indre peptid standard Sum_Peak_Area værdi, beregnes lys / tunge ratio. Bruge dette forhold som et mål for den tilsvarende lys / tunge peptid molære forekomstforhold at beregne den molære overflod af den biologiske prøve peptid. Specifikt den biologiske prøve peptid molære overflod lig den indre peptid standard molær overflod multipliceret med lys / tunge Sum_Peak_Area ratio.
      2. For hver biologisk replikat og målpeptid, identificere den lineære område af LC-SRM kvantificering ved at skabe en standardkurve under anvendelse af en lineær regression. Konkret plotte interne peptid standard molær overflod værdier versus de tunge / lette Sum_Peak_Area forholdsværdier (bemærk, at den biologiske prøve massen er konstant på tværs af datasæt). Kræver, at enhver biologisk prøve peptid Sum_Peak_Area værdi er inden for det lineære område (typicallierede, bør kun den lineære del af det dynamiske område anvendes; enhver lineær komponent bør anvendes med ekstrem forsigtighed). Ligeledes udføre dette trin for hvert mål peptid overgang.
        Bemærk: analyt kvantificering ved LC-qqq-SRM bør være lineær over et bredt dynamikområde (~ 10.000). I den lave ende, vil baggrunden signal (tilfældig MS støj plus reproducerbar signal fra co-eluerende analytter) reducere kvantificering nøjagtighed og præcision. I den høje ende, vil detektor mætning forårsage ikke-linearitet (i sidste ende, kan dette medføre elueringsprofiler at være flad start på et bestemt signal intensitet).
  14. Hvis det er hensigtsmæssigt, foretage en global normalisering tværs af prøver, såsom en central tendens normalisering 50, for at korrigere for små forskelle i mængde prøve forud for spiking-in af de interne peptid standarder. Hvis det er nødvendigt, bruger kun de husholdning proteiner fra trin 1.1.
  15. Hvis det er nødvendigt, pålægge mangler quantification værdier 51,52.
    Bemærk: Det er forkert blot at erstatte manglende værdier med halvdelen den nedre grænse for kvantificering (LLOQ) eller halv detektionsgrænsen (LOD), fordi at gøre det kunstigt ville reducere kvantificering varians, og kan resultere i en statistisk test (fx en ANOVA ) producerer et falsk positivt resultat (en type I fejl). Dog kan ignorere manglende værdier også være problematisk. For eksempel hvis halvdelen af ​​sande overflod værdier er under LOD, og ​​den anden halvdel er over LLOQ, så middelværdien observerede overflod overvurdering af den betyde sande overflod.
  16. Sørg for, at analyserne opfylde de bredt anerkendte retningslinjer for LC-SRM 23-25. Især kræver, at variationskoefficienten for kvantificering værdier er typisk ≤25% for kliniske analyser og ≤35% for ikke-kliniske analyser 25. For LC-SRM analyser relateret til sundhedspleje eller veterinære produkter eller tjenester, der skal overvejes for det lovpligtige appRoval, kræver, at analyserne opfylder de skærpede præcision krav til sådanne analyser: "The præcision bestemmes ved hver koncentration må ikke overstige 15% af variationskoefficienten (CV) med undtagelse af LLOQ, hvor det ikke bør overstige 20% af den CV "23,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Udviklingen af prædiktive beregningsmodeller af signaltransduktionsveje er et af de grundlæggende mål for systembiologi 53. Uheldigvis, selv for signalveje der er blevet undersøgt i vid udstrækning og har en høj klinisk betydning, er det stadig ikke generelt muligt kvantitativt at forudsige pathway adfærd som reaktion på perturbationer (f.eks, dette er sandt for MAPK / ERK-vejen 54). For nylig en undersøgelse beskæftiget målrettede proteomics, transcriptomics og datamodellering og simulering til at studere mus makrofag kemotaksi signalvejen 56. Fokus for undersøgelsen var sphingosin-1-fosfat medieret kemotaksi af RAW 264.7-celler (en mus monocyt / makrofag cellelinie). For at lette pathway modellering, blev LC-SRM assays udviklet og udført for at måle den absolutte overflod af kemotaksi pathway proteiner i RAW 264.7-celler. De resulterende abundance værdier var brugd som parametre for pathway model.

Den overordnede eksperimentelle skema (figur 1) begyndte med en liste over målproteiner, som omfattede G i2, en heterotrimert G-protein-α-underenheden. Succesen med den overordnede protokol er meget afhængig af valget af peptid mål, som er proteotypic og quantotypic, såsom YDEAASYIQSK. Blandinger af eksterne peptid standarder blev fremstillet og analyseret ved shotgun LC-QQQ-MS (/ MS). Den resulterende YDEAASYIQSK tandem massespektret var sammensat af flere fragmentioner, og det havde en lav baggrund (figur 2). De spektre blev brugt til at komponere LC-SRM target lister med de ti mest intense fragmentioner pr forløber ion.

En blanding af 409 eksterne peptid standarder ("JPT409") blev analyseret i tre eksemplarer ved kvalitativ LC-SRM (data ikke vist). Denne prøve omfattede tre G i2 peptider og identifikation af alle tre varvurderes at være sikker. Efterfølgende RAW 264.7 prøver (biologiske replikater "raw1" og "raw2") og JPT409 prøve blev hver analyseret dobbelt (to LC-SRM tekniske replikater) ved kvalitativ LC-SRM (disse seks LC-SRM-analyser blev udført som på lignende måde som muligt). Den YDEAASYIQSK peptid blev identificeret pålideligt i alle seks analyser (figur 3A - C). De YDEAASYIQSK overgangsintensitet mønstre var konsistente på tværs af seks LC-SRM-analyser, og disse var nogenlunde svarende til shotgun LC-MS (/ MS) mønster ("Library" kopiere i figur 3C).

Mønsteret af overgangsintensiteter alene er ikke altid tilstrækkeligt til selvsikker identifikation af et peptid. Peptid hydrofobicitet og måles LC opholdstid skal være i overensstemmelse. Desuden skal de eksterne standarder peptid og de tilsvarende biologisk prøve peptider har ca.lige retentionstider. Hydrofobiciteten (estimeret ved brug af SSRCalc version 3.0 100 Å algoritme 55) og observerede retentionstid for YDEAASYIQSK fandtes at være konsekvent (figur 4A). Desuden blev YDEAASYIQSK retentionstid målt ved anvendelse både RAW 264.7 analyser og analyserne af de eksterne peptid standarder, og alle de retentionstid værdier var omtrent lige (figur 4B).

Det meste af den kvalitative LC-SRM analyser af biologiske prøver var vellykkede, så svarer heavy-mærket, oprenset kvantificeret indre peptid standarder blev fremstillet og tilsat-til RAW 264.7-cellelysater. Isotop fortyndingsrække LC-SRM blev brugt til at analysere prøver, der består af de interne peptid standarderne alene (prøve "R0"), den interne og eksterne peptid-standarder (prøve "R1"), og seks RAW 264.7 biologiske replikater (prøver "R2" - "R7"). To Forskelnt protein denatureringsmidler blev anvendt til at teste for eventuelle proteinopløseliggørelse, denaturering, alkylering, og / eller fordøjelse problemer, der kan underminere nøjagtig målprotein kvantificering (prøver R2-R4 anvendte urinstof og prøver R5-R7 brugte RapiGest SF). De lette og tunge former af YDEAASYIQSK indeholdt næsten identisk overgangsintensitet mønstre og elueringsprofiler (figur 5A - C). LC-SRM opsummerede toparealforhold blev brugt som et mål for relativ peptid overflod, og YDEAASYIQSK forhold blev anvendt til at beregne G i2 overflod værdier i enheder af kopier pr RAW 264.7 celle. Parallelt hermed en anden G i2 indre peptid standard (IAQSDYIPTQQDVLR) blev anvendt til at udføre kvantitative G i2 LC-SRM assays af samme RAW 264.7 prøver, og de ​​to assays produceret meget lignende G i2 abundance målinger tværs af alle de biologiske replikater (figur 5D). Aftalen af ​​de to G i2 LC-SRM assays var nøjagtige og præcise.

Samlet blev 35 proteiner kvantificeres ved anvendelse af 58 indre peptid standarder (tabel 1). Navnlig de LC-SRM assays af den interne protein standard (ildflueluciferase; Trin 4.11) var nøjagtige og præcise. Den omfattende sæt af Skyline data fra denne undersøgelse er tilgængelig på Panorama online LC-SRM database (i mappen Manes_RAW_Chemotaxis på https://panoramaweb.org/labkey/project/NIH_NitaLazar/begin.view).

Figur 1
Figur 1:. Oversigt over protokol Tre tentative mål peptider til G i2 (en heterotrimert G-protein-α-subunit) blev udvalgt til ekstern peptid standard syntese. Disse var ANALYzed af shotgun LC-MS (/ MS) at udvikle tre G i2 LC-SRM assays, og disse assays blev anvendt til at udføre kvalitative analyser af biologiske prøver. Alle tre G i2 target peptider blev identificeret, og to blev udvalgt til indre peptid standard forberedelse. Trypsin-spaltelige "JPT-tags" blev anvendt til at kvantificere de interne peptid standarderne bruger UV-spektrofotometri. De interne peptid standarder blev anvendt til at udføre kvantitative G i2 LC-SRM analyser af RAW 264.7 prøver. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2:. Shotgun LC-MS (/ MS) afbildet massespektrum stammede fra analyserne af en af de G i2 eksterne peptid standarder (YDEAASYIQSK). Til dette forstadiumion, de ti mest intense overgange blev udvalgt til LC-SRM (eksklusive a1 1+ fragment-ion på grund af dens korte længde). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3:. Kvalitativ LC-SRM af G i2 Den YDEAASYIQSK kromatogram fra JPT409 analyserne en meget lav baggrund, og peptidet blev identificeret pålideligt (A). De tilsvarende RAW 264.7 analyser resulterede i mere baggrundssignal, men peptidet identifikation var stadig utvetydig (B). De relative overgangsintensitet mønstre var konsistente på tværs af alle seks LC-SRM-analyser (to tekniske replikater af tre uafhængige prøver), og disse var nogenlunde similar til det tilsvarende shotgun LC-MS (/ MS) mønster ("Library" replikat) (C). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Peptid retentionstid forudsigelse og variation på tværs af kørsler En lineær regression blev beregnet ved hjælp af den anslåede hydrofobicitet og måles kvalitativt LC-SRM elueringstid på alle de target peptider, og de ​​forudsete og måles elueringstider af YDEAASYIQSK var konsistente (A). . Derudover konsistensen af ​​den observerede elueringstiden af ​​hvert peptid hele LC-SRM analyser blev bestemt. De elueringstider af YDEAASYIQSK spændte over et interval på ~ 40 sek, hvilket var i overensstemmelse med præcisionen af ​​LC-SRM instrument, der blev brugt (værdierer toppens spids tid +/- den fulde bredde i halv-max, og også den fulde bredde ved basis af toppen) (B). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5:. Kvantitativ LC-SRM af G i2 Overgangsstykkerne kromatogrammer af den biologiske prøve peptid (A) og den indre peptid standard (B) havde konsistente relative overgangsintensiteter, og blev summeret (C) (afbildet er "R2" analyse for YDEAASYIQSK anvendelse af 10 fmol indre peptid standard). De lette og tunge elueringsprofiler var konsistente (C), og forholdet af arealet under disse kurver blev anvendt som et mål for den light / svær peptid overflod. En anden G i2 intern peptid standard (IAQSDYIPTQQDVLR) blev anvendt til kvantitativ LC-SRM parallelt, og de ​​resulterende G i2 overflod værdier var konsistent på tværs af både de biologiske gentagelser seks, og de ​​to mål peptider (samlet, n = 12 og CV = 8,38 %) (D). Klik her for at se en større version af dette tal.

<td> 68467
UniProt Tiltrædelse Målprotein Mål Peptid Overflod (fmol / ug) Overflod (kopier / celle, normaliseret) CV
P08659 Luciferase (UV ved 280 nm) 23,824 n / a n / a
P08659 Luciferase VVDLDTGK 24,103 n / a 7%
P08659 Luciferase VVPFFEAK 24,717 n / a 4%
P60710 Actin cytoplasmatisk 1 IWHHTFYNELR 760,448 61762598 3%
P16858 GAPDH LISWYDNEYGYSNR 357,803 28906524 14%
P06151 Lactatdehydrogenase LLIVSNPVDILTYVAWK 129,623 10633145 30%
P99024 Tubulin β 5 ALTVPELTQQVFDAK 78,765 6398971 3%
P20152 Vimentin SLYSSSPGGAYVTR 121,100 9807488 10%
P60766 Cdc42 DDPSTIEK 86,647 6957317 27%
P60766 Cdc42 QKPITPETAEK 26,475 2153669 6%
Q8C3J5 DOCK2 ETLYETIIGYFDK 1,459 118.539 15%
Q8C3J5 DOCK2 ISSSPTHSLYVFVR 1,795 143.440 33%
Q8BPU7 ELMO1 ALTTKPSSLDQFK 2,302 186.754 7%
Q8BPU7 ELMO1 SAIDISILQR 1,244 99.728 25%
Q8BGM0 FGR GAYSLSIR 1,099 89.473 17%
Q8BGM0 FGR WTAPEAALFGR 0,319 24.766 6%
P27601 Ga 13 GIHEYDFEIK 0,843 15%
P27601 Ga 13 VFLQYLPAIR 1.295 106.176 23%
P08752 Ga (i) 2 IAQSDYIPTQQDVLR 10.900 885.701 2%
P08752 Ga (i) 2 YDEAASYIQSK 9,774 790.616 9%
Q9DC51 Ga (k) EYQLNDSASYYLNDLDR 6,574 537.862 15%
Q9DC51 Ga (k) ISQTNYIPTQQDVLR 3,504 285.784 10%
P62874 Gβ 1 AGVLAGHDNR 17,078 1385578 4%
Q9CXP8 Gγ 10 DALLLGVPAGSNPFR 2,167 179.178 36% P63213 Gγ 2 EDPLLTPVPASENPFR 3,284 266.360 8%
Q80SZ7 Gγ 5 VSQAAADLK 6,087 493.512 6%
P08103 HCK GPVYVPDPTSSSK 1.143 93.044 12%
P08103 HCK IIEDNEYTAR 0,944 77.147 19%
P43406 Integrin α V AGTQLLAGLR 0,276 22.264 32%
P43406 Integrin α V SHQWFGASVR 0,443 34.235 5%
P25911 LYN VIEDNEYTAR 1,461 119.377 13%
Q5SW28 PI3K lovgivningsmæssige 5 AGFPGILDTASPGK 0,301 24.331 11%
Q8K3B3 PI3K lovgivningsmæssige α LYEEYTR 0,472 38.592 16%
Q8K3B3 PI3K lovgivningsmæssige α TWNVGSSNR 0,524 42.697 12%
Q8K3B3 PI3K lovgivningsmæssige α VLSEIFSPVLFR 0.440 35.902 20%
Q5U3K7 PI3K lovgivningsmæssige β DTPDGTFLVR 0,188 15.262 30%
Q5U3K7 PI3K lovgivningsmæssige β IAEIHESR 0,282 22.561 13%
Q0VGQ5 PI3K α LINLTDILK 0,102 8494 38%
Q8CI98 PI3K δ HEVQEHFPEALAR 0,178 14.566 22%
Q8CI98 PI3K δ ITEEEQLQLR 0,481 38.709 24%
Q9ES52 PIP3 5-phosphatase 1 IVVLAKPEHENR 0,486 39.194 19%
Q9ES52 PIP3 5-phosphatase 1 LSQLTSLLSSIEDK 2.056 167.123 7%
Q69ZK0 PIP3-afhængig Rac GEF 1 DSVLSYTSVR 0,647 52.712 32%
Q69ZK0 PIP3-afhængig Rac GEF 1 NQLLLALLK 0,354 27.425 5%
Q9CQE5 RGS 10 ASSQVNVEGQSR 2.460 199.782 4%
Q9CQE5 RGS 10 WASSLENLLEDPEGVQR 20,647 206.005 11%
Q9CX84 RGS 19 AEANQHVVDEK 0,495 39.753 21%
Q9CX84 RGS 19 LIYEDYVSILSPK 0,846 68.481 22%
B9EKC3 Rho GAP 5 DGLAQELANEIR 0,448 34.653 10%
Q99PT1 Rho GDI 1 SIQEIQELDK 3,156 267.063 16%
Q99PT1 Rho GDI 1 VAVSADPNVPNVIVTR 37,077 3006168 5%
Q61599 Rho GDI 2 LNYKPPPQK 37,975 3086596 3%
Q61599 Rho GDI 2 YVQHTYR 21,436 1711908 47%
Q61210 Rho GEF 1 FDGAEGSWFQK 2,149 176.139 47%
Q61210 Rho GEF 1 SGLELEPEEPPGWR 2,911 236.483 8%
Q9QUI0 RhoA QVELALWDTAGQEDYDR 43.500 3532438 8%
P70336 ROCK2 GAFGEVQLVR 0,527 42.800 23%
P70336 ROCK2 IYESIEEAK 1.011 83.794 33%
P70336 ROCK2 LEGWLSLPVR 0,573 48.259 22%
Q8R0X7 S1P lyase 1 AGYPLEKPFDFR 1,787 147.043 27%
Q8R0X7 S1P lyase 1 TPEIVAPESAHAAFDK 3,562 291.791 18%

Tabel 1: Kvantitative LC-SRM af RAW 264.7 celleproteiner Femogtredive RAW 264.7 celle proteiner blev kvantificeret ved hjælp otteoghalvtreds interne peptid standarder og seks biologiske gentagelser.. Fem af målproteiner blev housekeeping proteiner (actin, GAPDH, lactat dehydrogenase, tubulin, og vimentin) og blev kvantificeret for at muliggøre normalisering over biologiske prøver (trin 1.1). Desuden blev en intern proteinstandard spiked-ind i hver celle lysat og kvantificeres ved LC-SRM (4,765 pmol ildflue-luciferase per 200 ug prøve; 98% rent ved SDS-PAGE; kvantificeret spektrofotometrisk ved 280 nm; Trin 4.11). CV-værdier blev beregnet på tværs af de biologiske replikater seks hjælp af globalt normaliserede overflod værdier (bortset luciferase, Step 5.15).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Absolut protein kvantificering er afgørende for en meget bred vifte af biomedicinske applikationer såsom biomarkør validering og signaltransduktionsvej modellering. For nylig har målrettede proteomics ved hjælp af LC-SRM nydt godt af forbedringer til talrige teknologier, herunder peptid standard forberedelse, HPLC, QQQ-MS og LC-SRM dataanalyse. Følgelig er det blevet et stærkt alternativ til immunoassays. Immunassays kan være ekstremt følsomme og høj kapacitet, men at udvikle en robust immunoassay kan være ekstremt udfordrende, fordi immunassays kan være sårbare over for krydsreaktivitet og / eller interferens, uforenelige med celle / vævs lysis / homogeniseringsmetoder, og / eller uegnede til multipleksing 5,8. For eksempel, den mest omfattende test for krydsreaktivitet er at udføre immunassay med anvendelse af prøver, der stammer fra gen-knockouts, som kan være udfordrende at forberede.

Denne protokol beskriver mål Peptide udvælgelse, LC-SRM assay udvikling, kvalitativ og kvantitativ LC-SRM, og LC-SRM dataanalyse. Det blev brugt til at måle absolutte overflod af 36 kemotaksis pathway proteiner i RAW 264.7 celler 56, men dens anvendelighed strækker sig langt ud over denne specifikke anvendelse. Selv om det var designet til at kvantificere proteiner inden cellepellets, kunne det blive justeret til analyse af andre biologiske prøver (f.eks Biofluids) og andre SRM mål (f.eks phosphopeptider). For eksempel ændrer homogenisering og / eller protein fordøjelse protokol kan markant forbedre solubiliseringen, denaturering, alkylering, fordøjelsen, og kvantificering af særligt vanskelige målproteiner (f.eks membran proteiner), eller kan gøre det muligt analyse af særligt udfordrende prøver (f.eks prøver indeholder <100 pg protein masse).

Den indledende udvælgelse af target-peptider er kritisk, men kan være tidskrævende. For hundreds af målproteiner, kunne en ad hoc score anvendes for hvert kriterium, og de ​​foreløbige mål peptider kan rangeret baseret på summen af de scoringer, som det er sket tidligere 56. Alternativt kan denne analyse automatiseres ved hjælp PeptidePicker, en web-grænseflade, der forenkler målpeptid valg 30 (http://mrmpeptidepicker.proteincentre.com/).

Efter target peptider er blevet udvalgt og LC-SRM assays er blevet udviklet, er det afgørende, at kvalitative LC-SRM assays for de biologiske prøver udføres, fordi selv en højt proteotypic og quantotypic peptid ikke vil kunne detekteres, hvis proteinet udtrykkes ved niveauer under tærsklen af ​​instrumentet, eller hvis baggrunden interferens er særlig problematisk. En anden dimension af adskillelse (f.eks stærk kationbytter HPLC, high-pH-omvendt fase-HPLC, og gel-elektroforese) kan øge proteomisk dybde, men vil krævebetydeligt mere instrument tid og dataanalyse. Alternativt kan en strategi berigelse (f.eks peptid- og protein-niveau immunoenrichment og celle fraktionering) forbedre proteomisk dybde, og immunodepletion af stærkt rigelige proteiner kan anvendes til at reducere interferens ved co-eluerende analytter.

LC-SRM på ~ snesevis af prøver til ~ hundreder eller tusinder af ~ overgange kræver typisk omfattende instrument tid. Selv om det ikke blev brugt til denne undersøgelse, LC-SRM planlægning (måling overgange under præ-specificerede eluering tidsvinduer) gør det muligt at analysere flere overgange pr løb. Også planlægning reducerer SRM arbejdscyklus under relativt ledige perioder af LC gradient, og dette kan resultere i forbedret peptid identifikation og kvantificering. Planlægning kræver imidlertid, at peptidet elueringstid være trygt bestemt ud fra en kvalitativ LC-SRM analyse. Subtile ændringer til prøveforberedelse, LC-MS instrument,eller LC-MS metode kan forårsage planlægning at beskære eller endda helt glip target peptider. For eksempel blev den biologiske prøve YDEAASYIQSK elueringsprofiler lidt forskudt i forhold til dem af ekstern peptid standard (figur 4B), muligvis på grund af matrixeffekter.

Sammenfattende er en trin-for-trin-protokol præsenteret for udvikling og anvendelse af LC-SRM for absolut protein kvantificering. Absolut kvantificering af proteiner ved LC-SRM er allerede blevet påvist at være reproducerbar mellem laboratorier 16,19. Proteomik teknologier, herunder prøveforberedelse (fx automatisering), væskekromatografi, massespektrometri og dataanalyse, bliver bedre hurtigt, og gør det muligt for LC-SRM til at blive praktiske til storstilet forskning og kliniske anvendelser. Den specificitet, sensitivitet, nøjagtighed, reproducerbart og high-throughput kvantitative LC-SRM gør det til et stærkt værktøj til grundforskning og biomedicin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (ACN), LC-MS grade Fisher A955-1
BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit Fisher 23235
Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1 mm BioSpec Products 11079101z
Bestatin hydrochloride Sigma B8385-10MG
Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine) Lonza 12-614F
Cell culture EDTA, 500 mM, pH8 Gibco 15575
Cell culture fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11550
Cell culture L-glutamine Sigma G8540-25G
Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 Gibco 10010-049
Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v Lonza 17-942E
Cellometer Auto T4 cell counter Nexcelom Bioscience Cellometer Auto T4
Cellometer Auto T4 disposable counting chambers Nexcelom Bioscience CHT4-SD100-014
Dithiothreitol (DTT) Sigma D5545-5G
Formic acid, LC-MS grade, ampules Fisher A117-10X1AMP
Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1 mm deep Marienfeld-Superior 0640030
HEPES, 1 M, pH 7.2 Mediatech 25-060-CI
Hydrochloric acid, 37% w/w VWR BDH3028-2.5LG
Iodoacetamide Sigma I1149-5G
Laser Based Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-2000
LC coated silica capillary, 50 µm id Polymicro Technologies 1068150017
LC vial, autosampler, 12 mm x 32 mm polypropylene SUN SRI 200-268
LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone SUN SRI 500-061
Luciferase, from Photinus pyralis Sigma L9506-1MG
Pepstatin A EMD Millipore 516481-25MG
pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0) EMD Chemicals 9586-1
PhosStop phosphatase inhibitor cocktail Roche 04906837001
RapiGest SF Waters 186001861
Sep-Pak SPE, C18 1 ml 100 mg cartridge Waters WAT023590
Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position Waters WAT200609
Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb Fisher 03-448-25
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher S318-500
SpeedVac vacuum concentrator Fisher SPD111V
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade Fisher A116-50
Trypsin, sequencing grade, modified Promega V5113
Tube decapper for Micronic tubes USA Scientific 1765-4000
Tubes, 2 ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile Sarstedt 72.694.006
Urea Sigma U0631-500g
Water, LC-MS grade Fisher W6-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annu Rev Biochem. 80, 273-299 (2011).
  2. Zhang, Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R. 3rd Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics. Chem Rev. 113, 2343-2394 (2013).
  3. Boja, E. S., Rodriguez, H. Mass spectrometry-based targeted quantitative proteomics: achieving sensitive and reproducible detection of proteins. Proteomics. 12, 1093-1110 (2012).
  4. Gillette, M. A., Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nat Methods. 10, 28-34 (2013).
  5. Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions. Nat Methods. 9, 555-566 (2012).
  6. Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. Proteomics. , (2015).
  7. Wild, D. The immunoassay handbook : theory and applications of ligand binding ELISA., and related techniques. , 4th edn, Elsevier. (2013).
  8. Sturgeon, C. M., Viljoen, A. Analytical error and interference in immunoassay: minimizing risk. Ann Clin Biochem. 48, 418-432 (2011).
  9. Adrait, A., et al. Development of a Protein Standard Absolute Quantification (PSAQ) assay for the quantification of Staphylococcus aureus enterotoxin A in serum. J Proteomics. 75, 3041-3049 (2012).
  10. Lin, D., Alborn, W. E., Slebos, R. J., Liebler, D. C. Comparison of protein immunoprecipitation-multiple reaction monitoring with ELISA for assay of biomarker candidates in plasma. J Proteome Res. 12, 5996-6003 (2013).
  11. Weiss, F., et al. Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research. Biochim Biophys Acta. 1844, 927-932 (2014).
  12. Yassine, H., et al. Mass spectrometric immunoassay and MRM as targeted MS-based quantitative approaches in biomarker development: potential applications to cardiovascular disease and diabetes. Proteomics Clin Appl. 7, 528-540 (2013).
  13. Zhao, L., et al. Quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry. J Vis Exp. , (2011).
  14. Becker, J. O., Hoofnagle, A. N. Replacing immunoassays with tryptic digestion-peptide immunoaffinity enrichment and LC-MS/MS. 4, 281-290 (2012).
  15. Wasinger, V. C., Zeng, M., Yau, Y. Current status and advances in quantitative proteomic mass spectrometry. Int J Proteomics. 2013, 180605 (2013).
  16. Abbatiello, S. E., et al. Large-scale inter-laboratory study to develop, analytically validate and apply highly multiplexed, quantitative peptide assays to measure cancer-relevant proteins in plasma. Mol Cell Proteomics. , (2015).
  17. Rodriguez-Suarez, E., Whetton, A. D. The application of quantification techniques in proteomics for biomedical research. Mass Spectrom Rev. 32, 1-26 (2013).
  18. Wehr, A. Y., Hwang, W. T., Blair, I. A., Yu, K. H. Relative quantification of serum proteins from pancreatic ductal adenocarcinoma patients by stable isotope dilution liquid chromatography-mass spectrometry. J Proteome Res. 11, 1749-1758 (2012).
  19. Kennedy, J. J., et al. Demonstrating the feasibility of large-scale development of standardized assays to quantify human proteins. Nat Methods. 11, 149-155 (2014).
  20. Jensen, K. J., Shelton, P. T., Pedersen, S. L. Peptide synthesis and applications. , 2nd edn, Humana Press Springer. (2013).
  21. Pratt, J. M., et al. Multiplexed absolute quantification for proteomics using concatenated signature peptides encoded by QconCAT genes. Nat Protoc. 1, 1029-1043 (2006).
  22. Brun, V., et al. Isotope-labeled protein standards: toward absolute quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 2139-2149 (2007).
  23. Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. , U.S. Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/ucm/groups/fdagov-public/@fdagov-drugs-gen/documents/document/ucm070107.pdf (2001).
  24. Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. , U.S. Food and Drug Administration; Revision 1 (draft). Available from: http://www.fda.gov/ucm/groups/fdagov-public/@fdagov-drugs-gen/documents/document/ucm368107.pdf (2013).
  25. Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Mol Cell Proteomics. 13, 907-917 (2014).
  26. Ori, A., Andres-Pons, A., Beck, M. The use of targeted proteomics to determine the stoichiometry of large macromolecular assemblies. Methods Cell Biol. 122, 117-146 (2014).
  27. Rosen, O., Feldberg, L., Gura, S., Zichel, R. A new peptide substrate for enhanced botulinum neurotoxin type B detection by endopeptidase-liquid chromatography-tandem mass spectrometry/multiple reaction monitoring assay. Anal Biochem. , (2015).
  28. Feng, Y., et al. Global analysis of protein structural changes in complex proteomes. Nat Biotechnol. 32, 1036-1044 (2014).
  29. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
  30. Mohammed, Y., et al. PeptidePicker: a scientific workflow with web interface for selecting appropriate peptides for targeted proteomics experiments. J Proteomics. 106, 151-161 (2014).
  31. Rodriguez, J., Gupta, N., Smith, R. D., Pevzner, P. A. Does trypsin cut before proline. J Proteome Res. 7, 300-305 (2008).
  32. Min, X. J., Butler, G., Storms, R., Tsang, A. OrfPredictor: predicting protein-coding regions in EST-derived sequences. Nucleic Acids Res. 33, W677-W680 (2005).
  33. Lam, H., et al. Building consensus spectral libraries for peptide identification in proteomics. Nat Methods. 5, 873-875 (2008).
  34. Craig, R., Cortens, J. P., Beavis, R. C. Open source system for analyzing, validating, and storing protein identification data. J Proteome Res. 3, 1234-1242 (2004).
  35. Desiere, F., et al. The PeptideAtlas project. Nucleic Acids Res. 34, D655-D658 (2006).
  36. Vizcaino, J. A., et al. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, D1063-D1069 (2013).
  37. Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. J Immunol Methods. 267, 13-26 (2002).
  38. Ong, S. E., Kratchmarova, I., Mann, M. Properties of 13C-substituted arginine in stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). J Proteome Res. 2, 173-181 (2003).
  39. Mant, C. T., et al. HPLC analysis and purification of peptides. Methods Mol Biol. 386, 3-55 (2007).
  40. Alterman, M. A., Hunziker, P. Amino acid analysis : methods and protocols. , Humana Press. (2012).
  41. Maclean, B., et al. Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry. Anal Chem. 82, 10116-10124 (2010).
  42. Nesvizhskii, A. I. A survey of computational methods and error rate estimation procedures for peptide and protein identification in shotgun proteomics. J Proteomics. 73, 2092-2123 (2010).
  43. Tabb, D. L., Friedman, D. B., Ham, A. J. Verification of automated peptide identifications from proteomic tandem mass spectra. Nat Protoc. 1, 2213-2222 (2006).
  44. Freshney, R. I. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. , 6th edn, Wiley-Blackwell. (2010).
  45. Oberg, A. L., Vitek, O. Statistical design of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. J Proteome Res. 8, 2144-2156 (2009).
  46. Noble, J. E., Bailey, M. J. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 463, 73-95 (2009).
  47. Kiser, J. Z., Post, M., Wang, B., Miyagi, M. Streptomyces erythraeus trypsin for proteomics applications. J Proteome Res. 8, 1810-1817 (2009).
  48. Reiter, L., et al. mProphet: automated data processing and statistical validation for large-scale SRM experiments. Nat Methods. 8, 430-435 (2011).
  49. Abbatiello, S. E., Mani, D. R., Keshishian, H., Carr, S. A. Automated detection of inaccurate and imprecise transitions in peptide quantification by multiple reaction monitoring mass spectrometry. Clin Chem. 56, 291-305 (2010).
  50. Callister, S. J., et al. Normalization approaches for removing systematic biases associated with mass spectrometry and label-free proteomics. J Proteome Res. 5, 277-286 (2006).
  51. Karpievitch, Y. V., Dabney, A. R., Smith, R. D. Normalization and missing value imputation for label-free LC-MS analysis. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16. S5 (2012).
  52. Oh, S., Kang, D. D., Brock, G. N., Tseng, G. C. Biological impact of missing-value imputation on downstream analyses of gene expression profiles. Bioinformatics. 27, 78-86 (2011).
  53. Germain, R. N., Meier-Schellersheim, M., Nita-Lazar, A., Fraser, I. D. Systems biology in immunology: a computational modeling perspective. Annu Rev Immunol. 29, 527-585 (2011).
  54. Futran, A. S., Link, A. J., Seger, R., Shvartsman, S. Y. ERK as a model for systems biology of enzyme kinetics in cells. Curr Biol. 23, R972-R979 (2013).
  55. Krokhin, O. V. Sequence-specific retention calculator. Algorithm for peptide retention prediction in ion-pair RP-HPLC: application to 300- and 100-A pore size C18 sorbents. Anal Chem. 78, 7785-7795 (2006).
  56. Manes, N. P., Angermann, B. R., Koppenol-Raab, M., An, E., Sjoelund, V. H., Sun, J., Ishii, M., Germain, R. N., Meier-Schellersheim, M., Nita-Lazar, A. Targeted Proteomics-Driven Computational Modeling of Macrophage S1P Chemosensing. Mol Cell Proteomics. , Forthcoming.

Tags

Biokemi absolut kvantificering væskekromatografi massespektrometri udvalgt reaktion overvågning stabil isotop fortyndingsrække målrettede proteomics tripel kvadrupol
Valgt Reaktion Overvågning massespektrometri for Absolute Protein Kvantificering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manes, N. P., Mann, J. M.,… More

Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification. J. Vis. Exp. (102), e52959, doi:10.3791/52959 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter