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Immunology and Infection

एक Published: October 6, 2015 doi: 10.3791/52969
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, University of Calgary, 2Toronto General Research Institute, University Health Network

Introduction

सह-संक्रमण, कई समवर्ती संक्रमण के साथ संक्रमण, प्राकृतिक वातावरण में आदर्श है। सह-संक्रमण रोग विकृति पर और प्रत्येक संक्रमण के नैदानिक ​​प्रबंधन पर एक बड़ा प्रभाव हो सकता है। सह-संक्रमण, टीका और दवा प्रभावकारिता, साथ ही नैदानिक ​​परीक्षण के संदर्भ में, नकारात्मक असर हो सकता है (1 में समीक्षा)। हालांकि, इसके महत्व के बावजूद, रोगज़नक़ अनुसंधान के बहुमत केवल एकल में संक्रमण समझता है।

मलेरिया और एचआईवी -1 (एचआईवी) विश्व स्तर पर रुग्णता और मृत्यु दर के कारणों का नेतृत्व कर रहे हैं। 10 - मलेरिया और एचआईवी स्थानिकता क्षेत्रों सह-संक्रमण के खतरे में लोगों के लाखों लोगों की डाल रहा है और इसके परिणामस्वरूप अधिक गंभीर नैदानिक ​​रोग 2 के लिए खतरे में, एक व्यापक भौगोलिक ओवरलैप साझा करें। दो रोगों नकारात्मक बातचीत। एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों, उच्च एचआईवी वायरल लोड और सीडी 4+ टी कोशिकाओं की गिनती में अस्थायी कम हो जाती है में है, जबकि एक मलेरिया संक्रमण के दौरान देखा जा सकता हैमलेरिया परजीवी बोझ और नैदानिक ​​और गंभीर मलेरिया के जोखिम को सह-संक्रमित व्यक्तियों 2,3,5,7,8,10 में अधिक है। एचआईवी मलेरिया की गंभीरता बढ़ जाती है जिसके द्वारा तंत्र को पूरी तरह समझ में आ रहा है और आगे की जांच का वारंट नहीं कर रहे हैं।

यहाँ हम इन विट्रो में अध्ययन किया जा सकता है, जो मलेरिया और एचआईवी सह-संक्रमण से एक विधि का वर्णन है। विशेष रूप से, इस विधि एचआईवी संक्रमण के संदर्भ में मलेरिया-विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की परीक्षा के लिए अनुमति देता है। हमारी प्रोटोकॉल सुसंस्कृत पी चिरकाल एचआईवी संक्रमित दाताओं से और इन विट्रो में पृथक हौसले से पृथक परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear का उपयोग कर एक बहुमुखी सह संस्कृति प्रणाली (PBMCs) का वर्णन फाल्सीपेरम एरिथ्रोसाइट्स (PfRBC) parasitized। इन प्रतिक्रियाओं पर एचआईवी एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी का प्रभाव भी एचआईवी (+) दाताओं से पहले और बाद चिकित्सा से भावी एकत्र PBMCs का उपयोग कर जांच की जा सकती है।

हम एचआईवी संक्रमण के प्रभाव की जांच करने के लिए इस प्रणाली का इस्तेमाल किया हैमलेरिया-विशिष्ट सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर 11,12, और एन.के. कोशिकाओं में प्रभावित कर रहे हैं कि मलेरिया-विशिष्ट IFNγ और टीएनएफ प्रतिक्रियाओं का निर्धारण करने में सक्षम थे, एचआईवी (+) दाताओं से पहले और बाद एचआईवी एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी से NKT कोशिकाओं, γδ टी कोशिकाओं । इसके अतिरिक्त, हम monocytic कार्य भी एचआईवी (+) दाताओं में प्रभावित कर रहे हैं कि निर्धारित करते हैं, लेकिन बाद के एचआईवी एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी ठीक करने के लिए इस प्रणाली का उपयोग करने में सक्षम थे।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल परजीवी संस्कृति के लिए प्रयोग की जाने वाली सीरम और आरबीसी के लिए दानदाताओं की भर्ती की आवश्यकता है, और PBMC अलगाव के लिए एचआईवी (+) और असंक्रमित दाताओं। संस्थागत समीक्षा बोर्ड सभी अध्ययनों को स्वीकार करना चाहिए और सभी दानदाताओं खून आकर्षित करने के पूर्व सूचित सहमति प्रदान करनी चाहिए।

चेतावनी: मानव रक्त के नमूने लिए और मानव मलेरिया परजीवी के साथ कार्य करना एहतियाती उपायों की आवश्यकता है। हमेशा के लिए एक स्तर 2 जैव सुरक्षा कैबिनेट में एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, और काम पहनते हैं। मानव मलेरिया के लिए आकस्मिक पर्क्यूटेनियस जोखिम की स्थिति में, रोगनिरोधी उपचार के लिए स्वास्थ्य और सुरक्षा के लिए रिपोर्ट। अतिरिक्त सुरक्षा पर विचार भी एचआईवी (+) रक्त के साथ काम करने के लिए जगह में रखा जाना चाहिए। एक वापस बंद करने प्रयोगशाला कोट पहनें। (शीर्ष दस्ताने लेटेक्स किया जाना चाहिए) डबल दस्ताना। एक स्तर 2 जैव सुरक्षा कैबिनेट में सब से निपटने के प्रदर्शन करना। किसी भी कांच या तेज वस्तुओं का प्रयोग न करें। वातशोषक का प्रयोग न करें। Discarding करने से पहले 1 घंटा की एक न्यूनतम के लिए virox समाधान या ब्लीच में सब दूषित वस्तुओं रखें।उपयोग के बाद 1 घंटे के लिए virox और यूवी के साथ सभी सतहों को धो लें। प्रत्येक संस्था पालन करने की आवश्यकता है कि अपनी विशिष्ट जैव सुरक्षा नियमों होगा कि ध्यान दें। मूल्यांकन और संभव के बाद जोखिम प्रोफिलैक्सिस के विचार के लिए स्वास्थ्य और सुरक्षा के लिए एचआईवी संक्रमित रक्त के लिए सभी आकस्मिक जोखिमों की रिपोर्ट।

नोट: पी के विभिन्न प्रकारों फाल्सीपेरम मलेरिया परजीवी मौजूद हैं। ITG इन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया था, लेकिन विभिन्न प्रकारों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ठंड और विगलन प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम परजीवी पर उत्कृष्ट निर्देश MR4 वेबसाइट 13 पर उपलब्ध हैं।

1. मलेरिया परजीवी संस्कृति के लिए RPMI-ए बनाना

  1. DDH 2 हे की 950 मिलीलीटर, RPMI 1640 पाउडर के 1 पैकेट, HEPES की 6 ग्राम, सोडियम बाइकार्बोनेट के 2 जी, और hypoxanthine की 1.35 मिलीग्राम के मिश्रण से RPMI -0 बनाओ।
  2. पिघलना गर्मी से दो अलग अलग दाताओं से मानव सीरम निष्क्रिय। परजीवी हे प्रकार में बड़े हो रहे हैं, तो एबी दाताओं सबसे अच्छा है लेकिन कोई भी इस्तेमाल किया जा सकता हैलाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी)। मिश्रण करने के लिए नलियों उलटें। सीरम बात कण होते हैं या मोटी स्पिन 2,000 आरपीएम पर है और तो एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर इकाई का उपयोग तरल भाग फिल्टर।
  3. 0.2 माइक्रोन फिल्टर यूनिट फिल्टर RPMI-0 से 180 मिलीलीटर, मानव सीरम (प्रत्येक दाता से 10 मिलीलीटर) के 20 मिलीलीटर, और / एमएल gentamycin 10 मिलीग्राम के 0.5 मिलीलीटर का उपयोग करना।
    नोट: एक से अधिक फिल्टर यूनिट की आवश्यकता हो सकती है ताकि मानव सीरम फिल्टर रोकना कर सकते हैं।
  4. RPMI-ए के साथ मध्यम बोतल, दिनांक, और सीरम के स्रोत के लेबल। आवश्यक सर्द तक। जब प्रशीतित RPMI-एक बादल बदल सकते हैं। यह सामान्य है, लेकिन बढ़ती बादल संदूषण का एक संकेत है।
    नोट: परजीवी विकास अलग दाता सीरम में भिन्न हो सकते हैं। यह प्रयोग करने से पहले अच्छा परजीवी के विकास के लिए सभी मानव सीरम बैचों का परीक्षण करने के लिए एक अच्छा विचार है।

परजीवी संस्कृति के लिए 2. तैयारी मानव लाल रक्त कोशिकाओं

नोट: रक्त दाताओं ओ प्रकार होना चाहिए

  1. एसिड-सीआईटी में रक्त के 7-10 मिलीलीटर लीजिएदर-डेक्सट्रोज (एसीडी) ट्यूबों। दाता के आईडी और लेबल पर वसूली की तारीख लिखें।
  2. 4 हे सेल्सियस पर स्टोर रक्त की जरूरत तक। 1 महीने के भीतर परजीवी संस्कृतियों के लिए रक्त का प्रयोग करें।
  3. 70% इथेनॉल के साथ ट्यूब के ऊपर साफ कर लें। ध्यान डाट हटाने और त्यागें। एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में रक्त स्थानांतरण। 1000 x जी पर 3 मिनट के लिए स्पिन। आकांक्षा द्वारा प्लाज्मा निकालें।
  4. गर्म RPMI-0 की बराबर मात्रा के साथ आरबीसी निलंबित। 1000 x जी पर 5 मिनट के लिए स्पिन। RPMI-0 से 5 मिलीलीटर में, आकांक्षा द्वारा resuspend बफी कोट हटाने और धोने दो बार दोहराएँ।
  5. तैरनेवाला निकालें और मात्रा से 50% आरबीसी है कि एक मिश्रण का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त RPMI-ए जोड़ें।
  6. जरूरत तक 4 ओ सी पर स्टोर।

3. परजीवी संस्कृतियों को बनाए रखने

  1. पूर्व गर्म RPMI-ए को 37 ओ सी
  2. RPMI-ए का 5 मिलीलीटर और ~ 3% की एक hematocrit के लिए धोया मानव आरबीसी के 75 μl के साथ एक T25 फ्लास्क में thawed परजीवी (विगलन प्रक्रिया के लिए MR4 प्रोटोकॉल देखें) रखें।नोट: Hematocrit कुल मात्रा की तुलना में आरबीसी की मात्रा के उपाय। गणना करने के लिए hematocrit मध्यम प्लस आरबीसी की कुल मात्रा के लिए पैक आरबीसी की मात्रा को मापने। Thawed परजीवी आरबीसी के 75 μl योगदान देगा, मान लें। 3% की एक हेमाटोक्रिट (150 μl / 5,000 के बराबर होती है जो मध्यम के 5 मिलीलीटर में आरबीसी के 150 μl की कुल वहाँ है, फ्लास्क (पैक्ड आरबीसी के 75 μl जोड़ने के बराबर है) आरबीसी शेयर के 150 μl जोड़कर μl) 100% = 3% एक्स।
  3. परजीवी गैस मिश्रण (1% ओ 2, 3% सीओ 2, संतुलन एन 2) के साथ 30 सेकंड के लिए कुप्पी गैस। सील और गैस विनिमय के लिए सबसे बड़ी सतह क्षेत्र के लिए अनुमति देने के लिए के रूप में एक 37 ओ सी इनक्यूबेटर में नीचे कुप्पी व्यापक पक्ष जगह है।
  4. आरबीसी परत को परेशान नहीं करने के लिए माध्यम के रूप में बदलने के लिए और पेरासाइटिमिया (दैनिक किया जाना चाहिए) के लिए जाँच करने के लिए, ध्यान से कुप्पी चलते हैं। एक बाँझ अनप्लग पाश्चर विंदुक का प्रयोग रक्त परत परेशान बिना संस्कृति के माध्यम से दूर आकर्षित।
  5. देहात की जांच करने के लिएrasitemia, रक्त परत से एक 10 μl नमूना हटाने के लिए एक गिलास स्लाइड पर जगह और एक पतली रक्त फिल्म एक दूसरे गिलास स्लाइड बनाने का उपयोग कर। स्लाइड सूखे की अनुमति दें।
  6. धीरे, फ्लास्क में ताजा RPMI-ए के 4 मिलीलीटर की जगह 30 सेकंड के लिए, गैस मिश्रण है, और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह।
  7. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार Hema3 धुंधला किट का उपयोग कर स्लाइड दाग।
    1. इष्टतम धुंधला के लिए, डुबकी 10 सेकंड, मैं 10 सेकंड के लिए समाधान है, और 30 सेकंड के लिए समाधान द्वितीय के लिए फिक्सिंग समाधान में स्लाइड। पानी में कुल्ला और सूखी करने के लिए स्लाइड छोड़ दें।
  8. PfRBC की संख्या की गणना के द्वारा पेरासाइटिमिया की गणना आरबीसी (दाग गुलाबी) की कुल संख्या बनाम (गहरे बैंगनी दाग)। सटीकता सुनिश्चित करने के लिए 300 कोशिकाओं की कुल गिनती।
  9. परजीवी 5% की पेरासाइटिमिया तक पहुँच चुके हैं, RPMI-ए का 40 मिलीलीटर, और आरबीसी के 500 μl का उपयोग कर, एक T75 फ्लास्क में संस्कृति का विस्तार।

4. परजीवी तुल्यकालन

नोट: टी से पहले दिनवह प्रयोग एलनाइन साथ इलाज से परजीवी संस्कृति सिंक्रनाइज़। केवल अंगूठी चरण परजीवी और असंक्रमित आरबीसी इस इलाज से बच जाएगा। एलनाइन तुल्यकालन एक शुद्ध trophozoite संस्कृति आप सह संस्कृति प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है कि अगले दिन दे देंगे। अंगूठी चरण परजीवियों का बहुमत होता है कि एक परजीवी संस्कृति के साथ शुरू करने के लिए सुनिश्चित करें।

  1. एलनाइन की 8.01 ग्राम (300 मिमी) और DDH 2 ओ की 300 मिलीलीटर में Tris (10 मिमी) के 0.365 ग्राम मिश्रण से एलनाइन समाधान तैयार 7.4 पीएच को लाओ। फ़िल्टर 0.2 माइक्रोन फिल्टर इकाई का उपयोग कर बाँझ।
  2. पूर्व गर्म एलनाइन समाधान के लिए 37 ओ सी
  3. परजीवी संस्कृति (5 मिनट x 1000 XG) नीचे, स्पिन और मध्यम निकालें।
  4. एलनाइन समाधान के 19 खंडों में resuspend गोली (1 मिलीलीटर 19 मिलीलीटर एलनाइन समाधान आरबीसी पैक)। आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. स्पिन 5 मिनट x 1000 x जी। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला। RPMI -0 एक बार में धो लें। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और resuspend RPMI-ए में और ~ 3% हेमाटोक्रिट समायोजित। जी37 ओ सी को फ्लास्क और वापसी के रूप में
    नोट: सह संस्कृति प्रयोगों के लिए 5% ट्रोफोजोइट्स की एक न्यूनतम पेरासाइटिमिया इष्टतम माना 10% पेरासाइटिमिया के साथ की जरूरत है।

सह-संस्कृति प्रयोगों के लिए 5. परजीवी और आरबीसी तैयारी

  1. एक भड़काऊ प्रतिक्रिया प्रेरित करने के लिए सह संस्कृति प्रयोगों में PBMC प्रति 3 PfRBC के अनुपात का प्रयोग करें। कुल PfRBC की गणना करने के लिए, 3.5 में वर्णित है, और hematocrit एक hemocytometer का उपयोग परजीवी संस्कृति के एमएल प्रति आरबीसी की संख्या की गणना के द्वारा के रूप में एक पतली रक्त स्मीयर बनाकर पेरासाइटिमिया यों।
    PfRBC =% पेरासाइटिमिया की संख्या संस्कृति की कुल आरबीसी / एमएल एक्स मिलीलीटर x। उदाहरण के लिए: 10 x 10 6 आरबीसी / एमएल और 10% पेरासाइटिमिया पर संस्कृति के 10 मिलीलीटर 0.1 एक्स 10 6 मिलीग्राम / एक्स 10 मिलीलीटर = 10 एक्स 10 6 PfRBC के बराबर है।
  2. 1000 XG (आरटी) पर 5 मिनट के लिए परजीवी संस्कृति स्पिन। RPMI-एस + में मिलीलीटर प्रति 6 एक्स 10 6 PfRBC (500 मिलीलीटर RPMI 1640 में महाप्राण माध्यम है, और resuspend एल glutamine और HEPES, 10% गर्मी के साथ पूरकनिष्क्रिय FBS, 1.5 मिलीग्राम जेंटामाइसिन, 5 100 मिमी सोडियम पाइरूवेट की मिलीलीटर, 10 मिमी सदस्य गैर आवश्यक अमीनो एसिड के 5 मिलीलीटर, 5 मिमी β-mercaptoethanol के 5 एमएल)।
  3. परजीवी संस्कृति के रूप में प्रति मिलीलीटर आरबीसी की एक ही नंबर पर RPMI-एस + में hematocrit और resuspend की गणना, (परजीवी संस्कृति को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया वही दाता से असंक्रमित आरबीसी) नियंत्रण रक्त ले लो।

मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear 6. अलगाव (PBMC)

  1. (-) नियंत्रण एक पुरानी एचआईवी (+) दाता और एक एचआईवी दोनों से सोडियम हेपरिन ट्यूबों में शिरापरक रक्त (हरी ऊपर) लीजिए। EDTA के कैल्शियम chelating कार्रवाई सेल समारोह को प्रभावित करता है के रूप में एक विरोधी कौयगुलांट के रूप में EDTA का प्रयोग न करें। औसत पर रक्त के 10 मिलीलीटर प्रति 6 10 एक्स 5-10 के बीच PBMC की उम्मीद है। एक ठेठ प्रयोग के लिए प्रत्येक दाता से रक्त का 30 मिलीलीटर लीजिए। रक्त की मात्रा प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार समायोजित करने की आवश्यकता होगी।
  2. जल्दी से जल्दी और निश्चित रूप से रक्त के एक घंटे के भीतर एकत्र की जा रही है, के रूपएक प्लास्टिक की 50 मिलीलीटर ट्यूब में ट्यूब और जगह से खून निकाल दें। विशेष रूप से monocytes सक्रिय और कांच से चिपके रहते हैं, तो यह कांच रक्त संग्रह ट्यूबों का इस्तेमाल कर रहे हैं तो कोशिकाओं के रूप में जल्दी संभव के रूप में हटा रहे हैं कि महत्वपूर्ण है किया जाएगा।
  3. 15 मिनट के लिए 1,000 XG पर खून स्पिन और प्लाज्मा इकट्ठा (- नहीं इस कदम को छोड़ दिया हो सकता है अगर यह आवश्यक है, तो अन्य अध्ययनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है)। ठंड DPBS के बराबर मात्रा में खून पतला।
  4. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में आर टी Ficoll के 15 मिलीलीटर रखें। धीरे-धीरे एक बाँझ प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग, किसी भी मिश्रण बिना Ficoll से अधिक रक्त / DPBS समाधान परत। रक्त / DPBS के समाधान के 25 मिलीलीटर की एक अधिकतम Ficoll के प्रत्येक 15 मिलीलीटर पर स्तरित जा सकता है।
  5. 600 x जी पर आरटी पर 30 मिनट के लिए ढ़ाल स्पिन। 'कोई ब्रेक' स्थापित करने पर है सुनिश्चित करें।
  6. कोशिकाओं घूमती है एक बार, दो चरणों के बीच इंटरफेस के लिए देखो। PBMC हैं जहां यह है। इंटरफ़ेस से PBMC इकट्ठा एक बाँझ प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग (देखेंचित्रा 1)। आरबीसी द्वारा प्रदूषण को कम।
  7. ट्यूब प्रति कोई 20 से अधिक मिलीलीटर के साथ, 50 मिलीलीटर ट्यूब में एकत्र कोशिकाओं रखें। बाँझ ठंड DPBS के साथ 50 मिलीलीटर तक शीर्ष ट्यूब।
  8. 300 x जी पर 4 ओ सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं स्पिन।
  9. 5 मिलीलीटर बाँझ ठंड DPBS में सतह पर तैरनेवाला, resuspend गोली त्यागें और एक ट्यूब में एक ही दाता से सभी कोशिकाओं पूल। बाँझ DPBS के साथ 50 मिलीलीटर तक ऊपर, और धोने के 2 गुना अधिक चरणों को दोहराएँ।
  10. 10 मिलीलीटर RPMI-एस + माध्यम में Resuspend कोशिकाओं।
  11. एक 20 μl विभाज्य निकालें और trypan नीले रंग के 20 μl के साथ मिश्रण। पिपेट 10 एक रुधिरकोशिकामापी में μl और जीवित कोशिकाओं (नीले रंग की डाई तक नहीं लिया है कि कोशिकाओं - सभी नीले कोशिकाओं मर चुके हैं) गिनती। इस प्रकार के रूप में एक समाधान सेल संख्या की गणना करने के लिए एक रुधिरकोशिकामापी का प्रयोग करें।
    नोट: एक रुधिरकोशिकामापी लाइनों द्वारा कवर क्षेत्र में जाना जाता है, इसलिए है कि निर्दिष्ट आयामों का एक ग्रिड है।
    1. रुधिरकोशिकामापी साफ है सुनिश्चित करें। Counti खत्म coverslip रखेंएनजी क्षेत्र। लोड वी के आकार कुओं में से एक में पिपेट टिप रखकर सेल समाधान के 10 μl। coverslip के तहत क्षेत्र केशिका क्रिया से भर जाएगा।
    2. एक खुर्दबीन के नीचे भरी हुई रुधिरकोशिकामापी रखें। रुधिरकोशिकामापी से भरा ग्रिड 1 2 मिमी प्रत्येक की 9 चौकों शामिल हैं। प्रत्येक बड़े वर्ग के भीतर सभी कोशिकाओं की गणना। भी कई कोशिकाओं मौजूद हैं, तो आगे समाधान और ब्योरा पतला।
    3. इस प्रकार के रूप में सेल एकाग्रता की गणना: कुल कोशिकाओं / एमएल (= चौकों की कुल कोशिकाओं की गिनती / #) एक्स कमजोर पड़ने कारक x 10,000 कोशिकाओं / एमएल, 20 एक्स 10,000 कोशिकाओं / एमएल = 20 के जैसे, (500 कोशिकाओं / 5) वर्ग एक्स कमजोर पड़ने कारक एक्स 10 6 कोशिकाओं कुल।
  12. मिलीलीटर प्रति 10 x 10 6 (RPMI-एस + माध्यम) के अंतिम एकाग्रता के लिए मध्यम समायोजित करें।

7. मलेरिया / एचआईवी सह-संक्रमण संस्कृति

  1. प्लेट पृथक PBMCs के 100 μl और एक 24 अच्छी तरह से थाली (अच्छी तरह से प्रति 1 एक्स 10 6 PBMC) को RPMI-एस + माध्यम के 400 μl। सुनिश्चित करेंकुओं तीन प्रतियों में स्थापित कर रहे हैं कि: असंक्रमित आरबीसी के लिए 3 कुओं, PfRBC साथ 3 कुओं, मध्यम के साथ 3 कुओं, और पीएमए / Ionomycin के साथ 3 कुओं। (-) नमूना यह दोनों के लिए एचआईवी (+) और एचआईवी है।
  2. PfRBC कुओं के लिए, कुओं (5.2 में तैयार परजीवी संस्कृति के 500 μl) में से प्रत्येक में 3 एक्स 10 6 PfRBC जगह है।
  3. असंक्रमित आरबीसी कुओं के लिए, कुओं में से प्रत्येक में 5.3 में तैयार असंक्रमित आरबीसी संस्कृति के 500 μl जगह है।
  4. मध्यम कुओं के लिए, कुओं में से प्रत्येक में RPMI-एस + माध्यम के 500 μl जगह है।
  5. पीएमए / Ionomycin कुओं के लिए, (/ क्रमशः मिलीलीटर 2.5 स्नातकोत्तर / एमएल, 250 पीजी) पीएमए / Ionomycin समाधान तैयार है। प्रत्येक कुएं में इस समाधान के 500 μl रखें।
    नोट: टी सेल साइटोकाइन स्राव की प्रबल stimulators, पीएमए और Ionomycin कोशिकाओं कार्य कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं।
  6. एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 ओ सी में जगह की थाली।
  7. वैकल्पिक: एक आर.एन. में प्रवाह cytometry या दुकान का उपयोग प्ररूपी विश्लेषण के लिए अतिरिक्त कोशिकाओं का उपयोगभविष्य mRNA अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए एक स्थिरीकरण समाधान।

8. जांच मलेरिया प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के

नोट: के रूप में लंबे समय के रूप में 4 दिनों के लिए सह संस्कृति प्रयोगों प्रदर्शन करना। कोई मध्यम परिवर्तन इस समय के दौरान आवश्यक है। इष्टतम समय बिंदु ब्याज की सेल प्रकार और पूछा सवाल पर निर्भर करेगा। लिम्फोसाइट प्रतिक्रियाओं सबसे अच्छा 72-96 घंटा में मनाया गया, जबकि 12-48 घंटे की एक ऊष्मायन, PfRBCs को monocytic प्रतिक्रिया के लिए इष्टतम है। समय अंक प्रयोगात्मक प्रश्न के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी। बरकरार PfRBC और PBMCs के बीच बातचीत के लिए ब्याज की है, तो छोटी अवधि (2-4 घंटे) का इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. गोली कोशिकाओं के लिए 3 मिनट के लिए 300 XG पर स्पिन थाली। प्रत्येक अच्छी तरह से संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के 700 μl लीजिए।
  2. किसी भी मलबे के स्पष्ट करने के लिए 5 मिनट के लिए 1000 XG पर सतह पर तैरनेवाला स्पिन।
  3. अशेष नीचे में की जरूरत है, लेबल, और फ्रीज के रूप में सतह पर तैरनेवाला को मंजूरी दे दी -20 डिग्री सेल्सियस स्रावी कारकों का विश्लेषण perfo हो रहा है जब तकrmed।
  4. एलिसा द्वारा या मनका सरणी (निर्माता का सुझाव दिया प्रोटोकॉल का पालन) द्वारा साइटोकाइन / केमोकाइन प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करें।
  5. एक शाही सेना को स्थिर समाधान में थाली में शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर 14-16 से mRNA अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए उपयोग।

का उपयोग करते हुए सेल विशिष्ट Ccytokine प्रतिक्रियाएँ 9. Intracellular फ्लो PBMC पी के साथ सह सुसंस्कृत फाल्सीपेरम संक्रमित आरबीसी

नोट: ब्याज की सेल प्रकार पर निर्भर करेगा सह संस्कृति की लंबाई ऊपर उल्लेख किया है। एक छोटी ऊष्मायन अवधि PfRBC को monocytic प्रतिक्रियाओं में रुचि रखते हैं, तो जरूरी है। जन्मजात लिम्फोसाइट प्रतिक्रियाओं CD4 और CD8 टी कोशिकाओं के लिए अभी भी लंबे समय तक टी कोशिकाओं, एन.के. कोशिकाओं, NKT कोशिकाओं) γδ, और के लिए बार अब हो जाएगा। अनुकूलन की आवश्यकता होगी।

  1. विश्लेषण करने से पहले 6-8 घंटा के सभी कुओं को 1,000x brefeldin ए की 1 μl जोड़ें। प्लेट 37 ओ सी इनक्यूबेटर पर लौटें। 6-8 घंटे incub के बादसमझना, 15 मिनट के लिए बर्फ पर जगह थाली।
  2. जोरदार pipetting का उपयोग कुओं से कोशिकाओं को हटाने और लेबल microcentifuge ट्यूबों में उन्हें जगह है। Scraping monocytes दूर करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
  3. 1000 x जी पर 5 मिनट के लिए स्पिन कोशिकाओं। Supernatants निकालें। 500 μl में Resuspend कोशिकाओं बफर प्रवाह cytometry (1x DPBS, 2% गर्मी निष्क्रिय FBS, 0.02% सोडियम azide)।
  4. फूट डालो कोशिकाओं को तो प्रत्येक नमूना है कि: पूर्ण एंटीबॉडी धुंधला (240 μl) के लिए एक ट्यूब, और फ्लोरोसेंट शून्य से एक (FMO) नियंत्रण एंटीबॉडी धुंधला (240 μl) के लिए एक ट्यूब। नियंत्रण cytometry बेदाग प्रवाह (इस प्रवाह को स्थापित करने में उपयोग किया जाएगा) के लिए प्रत्येक नमूना (20 μl) की एक छोटी राशि पूल।
  5. 500 x जी पर 5 मिनट के लिए स्पिन कोशिकाओं। Supernatants निकालें।
  6. एफसी रिसेप्टर्स ब्लॉक करने के लिए 4 ओ सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए बफर cytometry के 50 μl प्रवाह में विसंयुग्मित मानव विरोधी CD16 / CD32 (5 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ कोशिकाओं को सेते हैं।
  7. प्रत्येक ट्यूब बफर प्रवाह cytometry के 1 मिलीलीटर जोड़ें। स्पिन सीई500 x जी पर 5 मिनट के लिए LLS। Supernatants निकालें।
  8. प्रवाह के 50 μl में Resuspend कोशिकाओं cytometry वांछित कोशिका की सतह मार्करों के लिए fluorophore संयुग्मित एंटीबॉडी के एक पूर्व titrated एकाग्रता के साथ बफर। सभी नमूनों के लिए पूर्व मिश्रण पर्याप्त एंटीबॉडी समाधान दाग हो। 20 मिनट के लिए 4 ओ सी में कोशिकाओं को सेते हैं। Light.Note से सुरक्षित रखें: प्रत्येक एंटीबॉडी की राशि अनुकूलित किया जाना होगा। हम नियमित रूप से CD56, CD3, γδ, सीडी 4, सीडी 8, CD14 के लिए दाग। इन एंटीबॉडी के लिए titrated संस्करणों तालिका 1 में दिखाया गया है।
  9. प्रत्येक ट्यूब बफर प्रवाह cytometry के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 500 x जी पर 5 मिनट के लिए स्पिन कोशिकाओं। Supernatants निकालें।
  10. प्रत्येक ट्यूब cytofix / cytoperm समाधान के 100 μl जोड़ें। 4 ओ सी पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते लाइट से बचाएँ।
  11. पर्म / धोने बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें - प्रत्येक ट्यूब (10x ध्यान के रूप में प्रदान की जाती DDH 2 हे का उपयोग कर 1x करने के लिए पतला)। 500 x जी पर 5 मिनट के लिए स्पिन कोशिकाओं। Supernatants निकालें।
  12. 100 μ जोड़ेंपर्म के एल / एफएमओ नियंत्रण एंटीबॉडी धुंधला ट्यूबों के लिए बफर धोने और कोशिकाओं resuspend मिश्रण।
  13. पूर्ण एंटीबॉडी धुंधला ट्यूबों के लिए वांछित इंट्रासेल्युलर मार्कर (यानी, साइटोकिन्स / chemokines) को fluorophore संयुग्मित एंटीबॉडी के एक पूर्व titrated एकाग्रता के साथ पर्म / धोने बफर के 100 μl जोड़ें।
    नोट: प्रत्येक एंटीबॉडी की राशि अनुकूलित किया जाना होगा। हम नियमित रूप से विरोधी टीएनएफ और विरोधी IFNγ एंटीबॉडी के साथ दाग। इन एंटीबॉडी के लिए titrated संस्करणों तालिका 1 में दिखाया गया है।
  14. 4 ओ सी पर 30 मिनट के लिए सभी ट्यूबों को सेते लाइट से बचाएँ।
  15. प्रत्येक ट्यूब पेर्म / धो बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 500 x जी पर 5 मिनट के लिए स्पिन कोशिकाओं। Supernatants निकालें।
  16. 300 μl में Resuspend कोशिकाओं 1% paraformaldehyde के साथ बफर प्रवाह cytometry। एचआईवी बेअसर करने के लिए 15 मिनट की एक न्यूनतम के लिए बैठते हैं।
  17. प्रवाह पर स्थापित मुआवजे के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, मुआवजा मनकों का उपयोग कर एक एंटीबॉडी दाग ​​नमूने तैयार। मुआवजे के प्रकारमोतियों का इस्तेमाल किया एंटीबॉडी पर निर्भर करेगा (यानी।, विरोधी माउस पुलिस महानिरीक्षक, विरोधी चूहे / हैम्स्टर आईजी)। भंवर मोती। एंटीबॉडी प्रति मोतियों की एक बूंद जोड़ें। धुंधला के लिए इस्तेमाल के रूप में एंटीबॉडी के बराबर मात्रा में जोड़ें। बफर प्रवाह cytometry के 200 μl जोड़ें। ये अब इस्तेमाल के लिए तैयार हैं। मोती धोने की कोई जरूरत नहीं है।
  18. जितनी जल्दी हो सके कोशिकामापी और अच्छे परिणाम के लिए 24 घंटे के भीतर एक प्रवाह पर नमूने मोल। यदि संभव हो तो हम तत्काल अधिग्रहण की सिफारिश इसलिए मिलकर रंगों भंडारण के साथ हदबंदी करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं।

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Representative Results

रेखांकन NKT कोशिकाओं आबादी प्राप्त करने के लिए CD56 + CD3 + γδ- फाटकों का उपयोग, NKT कोशिकाओं से IFNγ उत्पादन (चित्रा 2) के स्तर को दर्शाती (डेटा) नहीं दिखाया। कोशिकाओं पूर्व धुंधला करने के लिए 72 घंटे के लिए सुसंस्कृत थे। एक बार 1,00,000 CD3 + कोशिकाओं कोशिकामापी एन.के., NKT और γδ कोशिकाओं (ब्याज की कोशिकाओं) की काफी बड़ी आबादी प्राप्त करने के लिए प्रवाह पर हासिल किया गया, दाग। 5,600 NKT कोशिकाओं की एक न्यूनतम प्रत्येक ग्राफ पर प्रदर्शित कर रहे हैं। टीएनएफ उत्पादन एक ही तरीके से प्राप्त किया जाता है (डेटा) नहीं दिखाया। (-) PfRBC को उजागर व्यक्तियों रेखांकन स्पष्ट रूप से IFNγ उत्पादन एचआईवी (+) एचआईवी की तुलना में व्यक्तियों से कोशिकाओं में कम है कि प्रदर्शित करता है।

प्रवाह cytometry विश्लेषण बहुत व्यक्तिपरक है। यह एक प्रयोग के लिए सभी उचित नियंत्रण करने के लिए इसलिए जरूरी है (देखें चित्र 2)। पृष्ठभूमि के स्तर साइटोकाइन धुंधला का सही प्रतिनिधित्व के लिए अनुमति देता है जो एफएमओ नमूने, उपयोग कर की गणना कर रहे हैं।पीएमए / Ionomycin साथ प्रेरित कोशिकाओं एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया (डेटा) नहीं दिखाया। पीएमए और Ionomycin टी सेल साइटोकाइन उत्पादन की मजबूत stimulators हैं। इन नमूनों में IFNγ उत्पादन की कमी सबसे अधिक संभावना धुंधला प्रोटोकॉल के साथ एक समस्या का संकेत मिलता है। हालांकि, इस तरह के सेल व्यवहार्यता या निष्क्रिय अभिकर्मकों के रूप में अन्य चर भी गलती हो सकती है।

चित्र 1
PBMCs की स्थिति का प्रदर्शन Ficoll ढाल पद स्पिन की चित्रा 1. चित्रण।

चित्र 2
प्राकृतिक हत्यारा टी कोशिकाओं द्वारा चित्रा 2. IFN γ उत्पादन। प्रवाह चित्र CD56 + CD3 + γδ- कोशिकाओं (5,600 घटनाओं के न्यूनतम) पर gating द्वारा प्राप्त किया गया। (-) के साथ प्रेरित नमूना IFNγ उत्पादन एचआईवी में detectable हैपी फाल्सीपेरम लाल रक्त कोशिकाओं को संक्रमित। इस साइटोकाइन प्रतिक्रिया नहीं रह स्पष्ट एक जीर्ण एचआईवी संक्रमण के संदर्भ में है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हमारी प्रोटोकॉल सबसे वास्तविक इन विट्रो में एचआईवी-मलेरिया सह-संक्रमण का अध्ययन करने के क्रम में अनुकूलित किया गया है। सबसे पहले, ताजा मानव लाल रक्त कोशिकाओं और सीरम मलेरिया परजीवी संस्कृति के लिए आवश्यक हैं। यह मलेरिया परजीवी की एक स्वस्थ आबादी प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। लाइव पी का उपयोग करते समय साइटोकाइन उत्पादन बहुत अधिक तेजी से और तीव्र है के रूप में परजीवी lysates लाइव परजीवी के लिए प्रतिस्थापित नहीं किया जा सकता फाल्सीपेरम आरबीसी (PfRBC) 17,18 संक्रमित। इसके अलावा, एनके कोशिकाओं की तरह सेल प्रकार की सक्रियता, पूरे PfRBCs आवश्यकता है, और परजीवी lysates के साथ कुशलता से काम नहीं करता है। इस वजह से PfRBC और ल्युकोसैट के बीच सीधे संपर्क के लिए जरूरत के लिए हो सकता है या कोशिका की सतह रिसेप्टर्स 18 के साथ बातचीत कि परजीवी व्युत्पन्न ligands के अस्थिर प्रकृति के कारण हो सकता है। मलेरिया PfRBC संस्कृतियों भी अच्छी तरह से प्रयोग करने से पहले (प्रोटोकॉल 4) सिंक्रनाइज़ किया जाना चाहिए। सिंक्रनाइज़ PfRBCs प्रयोगात्मक डेटा के reproducibility में सुधार होगा। इस प्रोटोकॉल डे यद्यपितो शास्त्री सह संस्कृति के लिए trophozoite चरण PfRBC का उपयोग करते हैं, यह आसानी से अंगूठी चरण PfRBC के अध्ययन के लिए संशोधित किया जा सकता है।

मानव ल्यूकोसाइट्स कृत्रिम रूप से एचआईवी से संक्रमित हो सकता है, और इस विधि मलेरिया-एचआईवी के सह-संक्रमण अनुसंधान 20 के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इस जीर्ण एचआईवी संक्रमण का परिणाम है कि प्रतिरक्षा अनियंत्रण मॉडल नहीं है। इस प्रणाली सह संस्कृति में हम लंबे समय से एचआईवी -1 से संक्रमित हैं कि मानव प्रतिभागियों से अलग PBMCs का उपयोग करें। प्रतिभागियों को एक अध्ययन के लिए आवश्यक हैं, यह ध्यान से इस आबादी का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है। समावेशन और अपवर्जन मानदंड न्यूनतम परिवर्तनशीलता और अधिकतम reproducibility सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। हमारे मानदंडों पुरानी एचआईवी संक्रमण की स्पष्ट परिभाषा शामिल है और एक समवर्ती संक्रमण के साथ किसी के बहिष्कार (> 50 कोशिकाओं / 3 मिमी / वर्ष की सीडी 4+ टी कोशिकाओं की संख्या में गिरावट के साथ,> 1 वर्ष के लिए एचआईवी संक्रमित)। यह प्राप्त परिणामों इसलिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है कि यह सुनिश्चित कियापुरानी एचआईवी संक्रमण का प्रभाव है, और नहीं एक और संक्रमण के लिए Lely। हम मलेरिया को सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में रुचि रखते थे के बाद से ही, हम पिछले मलेरिया संक्रमण था कि दानदाताओं बाहर रखा गया है।

एचआईवी असंक्रमित नियंत्रण भी डेटा सामान्य बनाने के लिए अनुमति देने के लिए, हर नमूने समय बिंदु पर, प्रत्येक एचआईवी (+) दाता के लिए उपयोग किया जाता है। एक प्रयास कम से कम उम्र के लिए अपने संबंधित एचआईवी (+) दाता को नियंत्रण मैच के लिए किया जाना चाहिए, लेकिन अधिमानतः भी सेक्स (हालांकि हमारे पिछले अध्ययन के 12 में हम सेल सबसेट या महिला और पुरुष के बीच साइटोकाइन प्रतिक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण अंतर का पालन नहीं किया एचआईवी असंक्रमित प्रतिभागियों)। भावी नमूने प्रत्येक नमूने समय बिंदु के लिए एक ही एचआईवी असंक्रमित नियंत्रण बनाए रखने की योजना बनाई है तो फायदेमंद है। प्रतिक्रियायें PfRBCs के स्वास्थ्य, तुल्यकालन, पेरासाइटिमिया स्तर और PfRBCs की परिपक्वता के चरण के अपने डिग्री, और hematocrit स्तर सहित कई कारकों की वजह से प्रयोग करने के लिए प्रयोग से भिन्न हो सकते हैं। ध्यानप्रयोगों के बीच इन संगत के रूप में कई रखने के लिए लिया जाना चाहिए। एक एचआईवी असंक्रमित नियंत्रण को सामान्य बनाने के लिए इन चर के लिए कुछ लेखांकन के लिए अनुमति देता है।

ताजा कोशिकाओं का प्रयोग कृत्रिम परिणामों से बचने के लिए सर्वोपरि है। ठंड और विगलन नमूने सेल व्यवहार्यता 21,22 पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है, साइटोकाइन उत्पादन 23-26 और कोशिका की सतह प्ररूपी 27 मार्करों।

Monocytes विशेष रुचि के हैं, तो यह कांच प्रोटोकॉल के दौरान इस्तेमाल नहीं किया है कि महत्वपूर्ण है। Monocytes कांच और कई अन्य प्लास्टिक 28 का पालन करें। हम अपने अध्ययन सेल आबादी से एककेंद्रकश्वेतकोशिका पालन और अंतिम हटाने को कम से कम करने के लिए भर polypropylene प्लास्टिक pipettes, हस्तांतरण pipettes, और ट्यूब का उपयोग करें।

परख प्रवाह cytometry की स्थापना, एंटीबॉडी के किसी भी संयोजन ब्याज की कोशिकाओं के आधार पर किया जा सकता है। हम IFNγ और टीएनएफ उत्पादन में विशेष रूप से रुचि रखते थेएन.के. कोशिकाओं, NKT कोशिकाओं और γδ टी कोशिकाओं से। यह हमारे एंटीबॉडी पैनल में परिभाषित किया। एक अलग संयोजन का उपयोग हालांकि, अगर यह प्रत्येक कक्ष के लिए एंटीबॉडी की मात्रा में अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह गलत डेटा से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। (-) और एचआईवी (+), चित्रा 2 एचआईवी () इसके अलावा, वैधता परिवर्तनशीलता से बचने और यह सुनिश्चित करने के लिए, FMOs हर हालत (आरबीसी, PfRBC, मध्यम, और पीएमए / Ionomycin) और प्रतिभागी आबादी के लिए पृष्ठभूमि साइटोकाइन के स्तर का आकलन करने के लिए आवश्यक हैं। इन विट्रो intracellular साइटोकाइन उत्पादन में मापने आमतौर पर कोशिकाओं धुंधला करने से पहले संवर्धित किया गया है, खासकर जब उच्च स्तर पृष्ठभूमि में यह परिणाम है। संस्कृति की स्थिति पृष्ठभूमि के स्तर को प्रभावित के बाद से, उचित FMOs प्रत्येक नमूना के लिए पृष्ठभूमि के स्तर का ज्ञान करता है। कोशिकाओं के हमारे आपूर्ति इसलिए हम सभी सतह दाग लेकिन कोई इंट्रासेल्युलर दाग को रोकने के लिए हमारे FMOs बनाया गया है, सीमित था। इस अध्ययन सभी विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं पर साइटोकाइन पृष्ठभूमि के स्तर के विशिष्ट तुलना के लिए अनुमति देता है।हम भी उनकी पृष्ठभूमि के स्तर पुष्टि करने के लिए सतह मार्कर से प्रत्येक के लिए प्रयोग के प्रति एक एकल दाग भाग गया।

वर्णित प्रोटोकॉल ब्याज की कोशिकाओं के आधार पर घंटों या दिनों के भीतर प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो एक बहुमुखी एक है। जन्मजात लिम्फोसाइट से इष्टतम PfRBC प्रेरित साइटोकाइन उत्पादन के लिए, हम 2 या 3 दिन के बाद उत्पादन प्रवाह cytometry मापा। Monocytes को देख, पहले के समय अंक (1 या 2 दिन) की सिफारिश कर रहे हैं। इस प्रणाली के निकाले शाही सेना में मूल्यांकन किया जा करने के लिए कई प्रकार की कोशिकाओं और सेल प्रतिक्रिया प्रवाह से प्रतिष्ठित किया जा रहा cytometry, स्रावी प्रतिक्रियाओं सेल supernatants में मापा जाना, और अभिव्यक्ति प्रोफाइल के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, एंटीबॉडी के उपयोग के विशिष्ट रिसेप्टर्स ब्लॉक या साइटोकिन्स आगे तंत्र काटना करने के लिए इस प्रणाली में उपयोग किया जा सकता बेअसर करने के लिए। हम सफलतापूर्वक PfRBC प्रेरित IFNγ प्रतिक्रियाएं 12 में आईएल 18 रिसेप्टर को फंसाने के लिए आईएल 18 रिसेप्टर नाकाबंदी का इस्तेमाल किया है। इस प्रणाली के एक यथार्थवादी प्रतिनिधित्वएचआईवी संक्रमण के संदर्भ में मलेरिया के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की संख्या का आकलन करने के लिए है जिसके द्वारा आईसी विधि।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
alanine Sigma A7377
antibodies (see other table)
BD Cytofix/Cytoperm with BD GolgiPlug BD 555028 includes brefeldin A, cytofix/cytoperm buffer and perm/wash buffer
BD Vacutainer ACD Solution A BD 364506
BD Vacutainer Sodium Heparin BD 17-1440-02
DPBS (no calcium, no magnesium) Corning 21-031-CV
Fetal Bovine Serum Sigma F1051 heat inactivate before use
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare 17-1440-02
gentamycin (10 mg/ml) Gibco 15710-064
Hema3 Staining Set Fisher 122-911
HEPES Fisher BP310-500
hypoxanthine Sigma H9636
Ionomycin Sigma I3909
MEM non-essential amino acids (10 mM) Gibco 11140
PMA Sigma P8139
RPMI-1640 powder Life-Technologies 31800-022
RPMI-1640 with L-glutamine and HEPES Thermo Scientific SH30255.01
sodium bicarbonate (powder, cell culture) Sigma S5761
Sodium Pyruvate (100 mM) Gibco 11360
Tris (Trizma base) Sigma T6066
Trizol Ambion 15596018
Trypan Blue (0.4%) Gibco 15250-061
BD CompBead BD 552843, 552845 depends on antibodies used
Parasite Gas Mixture By special order 3% CO2, 1% O2, balance N2
Equipment
0.2 μm filter unit
Glass slides
T25 flasks
T75 flasks
50 ml tubes
24 well culture plates
unplugged Pasteur pipettes
plugged Pasteur pipettes
sterile transfer pipettes
hemocytometer
flow cytometer (3 laser)
Antibodies used for flow cytometry
Anti-TNF eBiosciences 551487 FITC (fluorophore) 2 μl
Anti-IFNγ Biolegend 506507 PE (fluorophore) 20 μl
Anti-CD8 Biolegend 300914 PE-Cy7 (fluorophore) 1 μl
Anti-CD14 Biolegend; BD Biosciences 325624; 551487 Biotin (fluorophore) 0.5 μl Streptavin PE-TR (fluorophore) 0.1 μl
Anti-CD56 Biolegend 318322 PerCP/Cy5.5 (fluorophore) 5 μl
Anti-γδ Biolegend 331212 APC (fluorophore) 5 μl
Anti-CD3 Biolegend 300426 APC-Cy7 (fluorophore) 5 μl
Anti-CD4 Biolegend 317424 Pacific Blue (fluorophore) 1 μl

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 104 मलेरिया एचआईवी सेल संस्कृति cytometry साइटोकिन्स प्रवाह
एक<em&gt; इन विट्रो</em&gt; एचआईवी सह-संक्रमण के संदर्भ में मलेरिया के लिए इम्यून प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए मॉडल
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Finney, C., Serghides, L. An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection. J. Vis. Exp. (104), e52969, doi:10.3791/52969 (2015).

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