Introduction
Co-infection, l'infection par de multiples infections simultanées, est la norme dans les milieux naturels. Co-infection peut avoir un impact majeur sur la pathologie de la maladie et sur la prise en charge clinique de chaque infection. Dans le cadre de la co-infection, le vaccin et l'efficacité des médicaments, ainsi que des tests de diagnostic, peut être eu une incidence négative (revue en 1). Cependant, malgré son importance, la majorité des recherches de l'agent pathogène considère seulement les infections simples.
Le paludisme et le VIH-1 (VIH) sont les principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. Les zones de paludisme endémique et VIH partagent un large chevauchement géographique, en mettant des millions de personnes à risque de co-infection et par conséquent un risque de maladie clinique plus sévère 2 - 10. Les deux maladies interagissent négativement. Chez les personnes infectées par le VIH, la hausse des charges virales de VIH et des diminutions temporaires de CD4 + lymphocytes T peut être vu lors d'une infection par le paludisme, tandis quepaludisme charges parasitaires et risque de paludisme clinique et grave sont plus élevés dans les individus co-infectés 2,3,5,7,8,10. Les mécanismes par lesquels le VIH augmente la gravité du paludisme ne sont pas entièrement comprises et justifient une enquête plus approfondie.
Nous décrivons ici une méthode par laquelle le paludisme et la co-infection VIH peut être étudiée in vitro. Plus précisément, cette méthode permet à l'examen des réponses immunitaires spécifiques contre le paludisme dans le contexte de l'infection à VIH. Notre protocole décrit un système polyvalent de co-culture en utilisant des cellules mononucléaires de sang périphérique fraîchement isolées (PBMC) isolées de donneurs infectés chroniquement par le VIH in vitro et en culture P. falciparum parasité érythrocytes (PfRBC). L'impact du traitement antirétroviral sur ces réponses peut également être examiné en utilisant PBMC recueillies de façon prospective du VIH (+) donateurs pré- et post-traitement.
Nous avons utilisé ce système pour étudier l'impact de l'infection à VIHsur les réponses immunitaires innées spécifiques au paludisme 11,12, et ont pu déterminer que IFN-y et TNF réponses spécifiques au paludisme sont altérées dans les cellules NK, les cellules NKT, yô cellules du VIH (+) donateurs pré- et post-traitement antirétroviral VIH T . En outre, nous avons été en mesure d'utiliser ce système pour déterminer que les fonctions monocytaires sont également affaiblies par le VIH (+) les bailleurs de fonds, mais récupérer post-VIH thérapie antirétrovirale.
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Protocol
Ce protocole exige le recrutement de donateurs pour le sérum et RBC à être utilisés pour la culture du parasite, et le VIH (+) et non infectés donateurs pour CMSP isolement. Institutional Review Board doivent approuver toutes les études et tous les donateurs doivent fournir un consentement éclairé avant le prélèvement de sang.
ATTENTION: Travailler avec des échantillons de sang humain et parasites du paludisme humain nécessite des mesures de précaution. Toujours porter une blouse, des gants, et le travail dans une armoire de biosécurité de niveau 2. En cas d'exposition percutanée accidentelle au paludisme humain, un rapport à la santé et la sécurité pour le traitement prophylactique. Facteur de sécurité supplémentaire devrait également être mis en place pour travailler avec (+) VIH dans le sang. Porter une blouse de laboratoire dos fermeture. Double gant (en haut gant doit être latex). Effectuer toutes les manipulations dans une armoire de biosécurité de niveau 2. Ne pas utiliser de verre ou des objets pointus. Ne pas utiliser l'aspirateur. Placez tous les objets contaminés dans une solution de Virox ou eau de Javel pour un minimum de 1 heure avant de les jeter.Lavez toutes les surfaces avec Virox et UV pendant 1 heure après leur utilisation. Notez que chaque institution auront leurs propres réglementations de biosécurité spécifiques qui doivent être suivies. Signaler toutes les expositions accidentelles au sang infecté par le VIH à la santé et la sécurité pour l'évaluation et l'examen de la prophylaxie post-exposition possibles.
Remarque: Différentes souches de P. parasites de la malaria falciparum existent. ITG a été utilisé pour ces expériences, mais différentes souches peut être utilisé. Excellentes instructions sur la congélation et la décongélation Plasmodium falciparum parasites sont disponibles sur le site MR4 13.
1. Faire RPMI-A pour Parasite du paludisme Culture
- Ajouter RPMI-0 en mélangeant 950 ml d'ddH 2 O, 1 paquet de poudre RPMI-1640, 6 g d'HEPES, 2 g de bicarbonate de sodium et 1,35 mg d'hypoxanthine.
- La chaleur Thaw inactivé sérum humain provenant de deux donneurs différents. AB donateurs sont mieux, mais tout peut être utilisé si les parasites sont cultivés dans de type Oles globules rouges (RBC). Inversez tubes pour mélanger. Si le sérum contient des particules ou est épaisse rotation à 2000 tpm, puis filtrer partie liquide en utilisant une unité de 0,45 um filtre.
- L'utilisation d'un filtre de 0,2 pm de l'unité de filtre 180 ml de RPMI-0, 20 ml de sérum humain (10 ml de chaque donneur) et 0,5 ml de 10 mg / ml de gentamycine.
Remarque: le sérum humain peut obstruer le filtre de façon plus d'une unité de filtrage peut être nécessaire. - Marquer la bouteille moyenne avec RPMI-A, la date et la source du sérum. Réfrigérer jusqu'au moment requis. RPMI-A peut devenir trouble lorsque réfrigéré. Ceci est normal, mais augmentation de la nébulosité est un signe de contamination.
Note: La croissance Parasite peut varier dans le sérum de donneur différent. Il est une bonne idée de tester tous les lots de sérum humain pour une bonne croissance du parasite avant d'utiliser.
2. Préparation des globules rouges du sang humain pour Parasite Culture
Note: Les donneurs de sang doivent être de type O.
- Recueillir 7-10 ml de sang en acide cit-(ACD) tubes de taux-dextrose. Donnez votre ID et la date de la collecte sur l'étiquette du donateur.
- Le sang de magasin à 4 o C jusqu'à ce que nécessaire. Utilisez le sang pour les cultures de parasites délai de 1 mois.
- Nettoyez le dessus du tube avec 70% d'éthanol. Retirez délicatement le bouchon et le jeter. Transférer le sang dans un tube de 15 ml. Spin 3 min à 1000 x g. Retirer plasma par aspiration.
- Suspendre RBC avec un volume égal d'eau tiède RPMI-0. Spin pendant 5 min à 1000 x g. Retirer la couche leucocytaire par aspiration, remettre en suspension dans 5 ml de RPMI-0 et répéter le lavage 2 fois plus.
- Eliminer le surnageant et ajouter suffisamment RPMI-A pour produire un mélange qui est de 50% en volume de RBC.
- Conserver à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
3. Maintenir Cultures Parasite
- Préchauffer RPMI-A à 37 o C.
- Placer parasites décongelées (voir protocole MR4 traité selon la procédure de décongélation) dans une fiole T25 avec 5 ml de RPMI-A et de 75 ul de RBC humain lavé pour un hématocrite de ~ 3%.Remarque: hématocrite mesure le volume des globules rouges par rapport au volume total. Pour calculer l'hématocrite mesurer le volume de culot globulaire au volume total de milieu plus RBC. Supposons que les parasites décongelés contribueront 75 pi de RBC. En ajoutant 150 pi de RBC stock (ce qui est équivalent à l'ajout de 75 pi de culot globulaire) dans le ballon, il ya un total de 150 pi de RBC dans 5 ml de milieu, ce qui équivaut à un hématocrite de 3% (150 pl / 5000 pi x 100% = 3%).
- Gaz, le flacon pendant 30 secondes avec mélange de gaz parasite (1% de O 2, CO 3 2%, l'équilibre de N 2). Sceller et placer le côté large du flacon vers le bas dans un incubateur 37 ° C pour permettre à la plus grande aire de surface pour l'échange de gaz.
- Pour changer le moyen et vérifier la parasitémie (qui doit être fait tous les jours), déplacer le ballon avec précaution pour ne pas perturber la couche de RBC. En utilisant une pipette Pasteur stérile débranché soutirer le milieu de culture sans déranger la couche de sang.
- Pour vérifier parasitemia, supprimer un échantillon de 10 pi de la couche de sang, le placer sur une lame de verre et en utilisant une deuxième lame de verre créer un frottis sanguin. Laisser lame sécher.
- Placez 4 ml de RPMI frais-A dans le flacon, mélanger délicatement, de gaz pendant 30 secondes, et le lieu dans un incubateur à 37 ° C.
- Colorer la lame en utilisant le kit de coloration Hema3 selon le protocole du fabricant.
- Pour la coloration optimale, Tremper les lames dans la solution de fixation pendant 10 secondes, la solution I pendant 10 sec, et la solution II pendant 30 sec. Rincer à l'eau et laissez sécher diapositives.
- Calculer la parasitémie en comptant le nombre de PfRBC (teinté violet foncé) par rapport au nombre total de RBC (de rose teinté). Comptez un total de 300 cellules pour assurer l'exactitude.
- Lorsque parasites ont atteint une parasitémie de 5%, accroître la culture dans un flacon T75, en utilisant 40 ml de RPMI-A, et 500 ul de RBC.
4. Parasite Synchronisation
Remarque: Le jour avant til expérimenter, de synchroniser la culture du parasite par traitement avec l'alanine. Les parasites au stade anneau seulement et non infecté RBC survivent à ce traitement. La synchronisation d'Alanine vous donnera une culture trophozoïte le lendemain pur qui peut être utilisé dans les expériences de co-culture. Assurez-vous de commencer par une culture de parasites qui contient la majorité des parasites au stade anneau.
- Préparer une solution d'alanine en mélangeant 8,01 g d'alanine (300 mM) et 0,365 g de Tris (10 mM) dans 300 ml d'ddH 2 O. Apportez pH à 7,4. Stériliser par filtration en utilisant une unité de filtre de 0,2 um.
- Préchauffer la solution de l'alanine à 37 o C.
- Isoler la culture du parasite (5 min x 1 000 x g), et éliminer le milieu.
- Remettre en suspension le culot dans 19 volumes d'une solution d'alanine (1 ml emballés RBC 19 ml de solution alanine). Incuber pendant 15 min à température ambiante.
- Spin 5 min x 1000 x g. Aspirer surnageant. Laver dans du RPMI-0 fois. Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans RPMI-A et ajuster hématocrite à ~ 3%. gcomme ballon et retour à 37 o C.
Remarque: Pour les expériences de co-culture une parasitémie minimum de 5% trophozoïtes est nécessaire, avec 10% de parasitémie considéré comme optimal.
5. Parasite et RBC Préparation pour les expériences de co-culture
- Utiliser un ratio de 3 PfRBC par PBMC dans des expériences de co-culture pour induire une réponse inflammatoire. Pour calculer le total PfRBC, de quantifier la parasitémie en faisant un frottis mince de sang comme décrit dans 3.5, et de l'hématocrite en comptant le nombre de RBC par ml de culture de parasites en utilisant un hémocytomètre.
Nombre de PfRBC =% de parasitémie x Total de RBC / ml x ml de culture. Par exemple: 10 ml de culture à 10 x 10 6 RBC / ml et 10% de parasitémie est égale à 0,1 x 10 6 / ml x 10 ml = 10 x 10 6 PfRBC. - Faites tourner la culture de parasites pendant 5 min à 1000 xg (RT). Aspirer le milieu et remettre en suspension à 6 x 10 6 par ml PfRBC dans du RPMI-S + (500 ml de RPMI-1640 additionné de L-glutamine et HEPES, 10% de la chaleurFBS inactivé, 1,5 ml de gentamicine, 5 ml de pyruvate de sodium 100 mM, 5 ml de 10 mM MEM acides aminés non essentiels, 5 ml de 5 mM de β-mercaptoéthanol).
- Prenez sang témoin (non infectés RBC provenant du même donneur utilisé pour le maintien de la culture de parasites), calculer l'hématocrite et de remettre en suspension dans RPMI-S + au même nombre de RBC par ml que la culture de parasites.
6. Isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC)
- Prélever le sang veineux dans des tubes d'héparine de sodium (en haut vert) à la fois du VIH (+) donneur chronique et un VIH (-) contrôle. Ne pas utiliser de l'EDTA comme anticoagulant chélatant le calcium en tant que l'action de l'EDTA affecte la fonction cellulaire. En moyenne, attendre entre 5-10 x 10 6 PBMC par 10 ml de sang. Pour une expérience typique de recueillir 30 ml de sang de chaque donneur. Le volume de sang devra être ajustée en fonction des exigences expérimentales.
- Aussi rapidement que possible et certainement moins d'une heure de sang sont recueillis,retirer le sang dans les tubes et les placer dans un tube de 50 ml en plastique. Monocytes en particulier seront activés et collent au verre, il est donc important que les cellules si les tubes de collecte de sang de verre sont utilisés sont retirés le plus rapidement possible.
- Spin le sang à 1000 g pendant 15 minutes et recueillir le plasma (ce qui peut être utilisé pour d'autres études si nécessaire - sinon cette étape peut être sautée). Diluer le sang dans un volume égal de DPBS froid.
- Placer 15 ml de Ficoll RT dans un tube de 50 ml. Lentement, en utilisant un transfert en plastique pipette stérile, la couche la solution / DPBS de sang sur le Ficoll sans mélange. Un maximum de 25 ml de solution de sang / DPBS peut être posés au-dessus de chacune 15 ml de Ficoll.
- Faites tourner les gradients pendant 30 min à température ambiante à 600 x g. Assurez-vous que le paramètre «sans frein» sur.
- Une fois que les cellules ont filé, regardez pour l'interface entre les deux phases. Ceci est où le CMSP sont. En utilisant une pipette de transfert en plastique stérile recueillir les PBMC de l'interface (voirFigure 1). Minimiser la contamination par RBC.
- Placer les cellules recueillies dans des tubes de 50 ml, avec pas plus de 20 ml par tube. Le tube supérieur jusqu'à 50 ml avec du DPBS froid stériles.
- Faites tourner les cellules pendant 10 min à 4 o C à 300 x g.
- Rejeter le surnageant, remettre le culot dans 5 ml DPBS froid stériles et mettre en commun toutes les cellules d'un même donneur dans un tube. Haut up à 50 ml avec DPBS stériles, et répétez les étapes du lavage 2 fois plus.
- Resuspendre les cellules dans 10 ml de RPMI-S + milieu.
- Retirer une aliquote de 20 pi et mélanger avec 20 pi de bleu trypan. Pipette 10 ul dans un hémocytomètre et compter les cellules vivantes (cellules qui ne sont pas prises le colorant bleu - toutes les cellules bleues sont morts). Utiliser un hémocytomètre pour calculer le nombre de cellules dans une solution de la façon suivante.
Remarque: un hémocytomètre a une grille de dimensions spécifiées de telle sorte que la zone couverte par les lignes est connue.- Assurez-vous que l'hémocytomètre est propre. Placer la lamelle couvre-objet sur la Countizone ng. Charge 10 pi de solution de cellules en plaçant la pointe de la pipette dans l'un des puits en forme de V. L'aire sous la lamelle va remplir par capillarité.
- Placez le chargé hémocytomètre sous un microscope. La grille complète de l'hémocytomètre contient 9 carrés de 1 mm 2 chacune. Comptez toutes les cellules au sein de chaque grand carré. Si trop de cellules sont présentes, diluer la solution encore et recomptage.
- Calculer la concentration cellulaire de la façon suivante: les cellules totales / ml = (nombre total de cellules comptées / # de carrés) x facteur de dilution x 10000 cellules / ml, par exemple, (500 cellules / 5 carrés) x facteur de dilution de 20 x 10000 cellules / ml = 20 x 10 6 cellules au total.
- Ajuster milieu à une concentration finale de 10 x 10 6 par ml (RPMI-S + milieu).
7. Paludisme / Co-infection par le VIH Culture
- Plaque 100 pi de CMSP isolées et 400 pi de RPMI-S + support à une plaque de 24 puits (1 x 10 6 PBMC par puits). Assurerque les puits sont mis en place en trois exemplaires: 3 puits pour non infecté RBC, 3 puits avec PfRBC, 3 puits avec du milieu, et 3 puits avec PMA / ionomycine. Ceci est à la fois pour le VIH (+) et le VIH (-) de l'échantillon.
- Pour la PfRBC puits, placer 3 x 10 6 PfRBC dans chacun des puits (500 ul de la culture de parasite préparés 5,2).
- Pour les puits non infectés RBC, placer 500 ul de la culture non infectée RBC préparé en 5.3 dans chacun des puits.
- Pour les moyennes des puits, 500 ul de placer RPMI-S + milieu dans chacun des puits.
- Pour PMA / ionomycine puits, préparer la solution de PMA / ionomycine (2,5 pg / ml, 250 pg / ml respectivement). Placez 500 pi de cette solution dans chaque puits.
Remarque: Comme stimulateurs puissants de cytokine des cellules T sécrétion, PMA et ionomycine sont utilisés comme témoin positif pour assurer les cellules sont fonctionnels. - Placer la plaque à 37 o C dans un incubateur à CO 2 de 5%.
- En option: utiliser des cellules en excès pour l'analyse phénotypique par cytométrie en flux ou entreposer dans un RNUne solution de stabilisation à l'avenir analyse de l'expression de l'ARNm.
8. Détection des réponses immunitaires contre le paludisme
Remarque: Effectuez des expériences de co-culture aussi longtemps que 4 jours. Aucun changement moyen est nécessaire pendant cette période. Le moment optimal dépendra du type de cellule d'intérêt et la question posée. Une incubation de 12-48 heures est optimal pour les réponses monocytiques à PfRBCs, tandis que les réponses des lymphocytes ont été mieux observé à 72-96 h. Les points de temps devront être optimisé basé sur la question expérimentale. Des périodes plus courtes (2-4 hr) peuvent être utilisés si l'interaction entre intacte PfRBC et CMSP est d'intérêt.
- Plaque de Spin à 300 g pendant 3 min au culot de cellules. Recueillir 700 pi de surnageant de culture de chaque puits.
- Spin surnageant à 1000 g pendant 5 min à claire de tous les débris.
- Aliquote effacé surnageant au besoin, l'étiquette, et le gel au-dessous de -20 ° C jusqu'à l'analyse des facteurs sécrétés est d'être performée.
- Analyser les réponses des cytokines / chimiokines par ELISA ou par réseau de billes (suivre les protocoles suggérés par le fabricant).
- Recueillir les cellules restantes dans la plaque dans une solution de stabilisation de l'ARN et à utiliser pour l'analyse de l'expression des ARNm par PCR 14 à 16 quantitative en temps réel.
9. intracellulaire de cytométrie en flux de réponses de Ccytokine spécifiques aux cellules utilisant PBMC co-cultivées avec P. falciparum Infected RBC
Remarque: Comme mentionné ci-dessus la longueur de la co-culture dépendra du type cellulaire d'intérêt. Si vous êtes intéressé dans les réponses à monocytiques PfRBC une période d'incubation plus courte est nécessaire. Fois sera plus longue pour les réponses des lymphocytes T innées yô cellules, les cellules NK, les cellules NKT), et plus encore pour les cellules T CD4 et CD8. Optimisation sera nécessaire.
- 6-8 heures avant l'analyse ajouter 1 pl de 1,000x brefeldine A à tous les puits. Retourner la plaque à 37 o C incubateur. Après 6-8 h Incubation, placez la plaque sur la glace pendant 15 min.
- Éliminer les cellules des puits en utilisant pipetage vigoureux et les placer dans des tubes de microcentifuge étiquetés. Grattage peut être nécessaire pour éliminer les monocytes.
- Spin cellules pendant 5 min à 1000 x g. Retirer surnageants. Resuspendre les cellules dans 500 pi cytométrie en flux tampon (1x DPBS, 2% de FBS inactivé à la chaleur, de l'azoture de sodium à 0,02%).
- Cellules de diviser afin que chaque échantillon a: un tube pour la coloration d'anticorps pleine (240 pi), et un tube de coloration fluorescente moins un (FMO) d'anticorps de contrôle (240 pi). En commun une petite quantité de chaque échantillon (20 pi) pour l'écoulement des souillures cytométrie de contrôle (ce qui sera utilisé dans la mise en place du cytomètre de flux).
- Spin cellules pendant 5 min à 500 x g. Retirer surnageants.
- Incuber les cellules avec CD16 non conjugué anti-humain / CD32 (5 ug / ml) dans 50 ul de cytométrie en flux de tampon pendant 15 min à 4 ° C pour bloquer les récepteurs Fc.
- Ajouter 1 ml de tampon de cytométrie de flux à chaque tube. Spin CElls pendant 5 min à 500 x g. Retirer surnageants.
- Resuspendre les cellules dans 50 ul de tampon de cytométrie flux avec une concentration pré-titré d'anticorps conjugué à un fluorophore à des marqueurs de surface de cellules désirées. Solution assez anticorps pré-mélange pour tous les échantillons à colorer. Incuber les cellules à 4 ° C pendant 20 min. Protéger de light.Note: Montant de chaque anticorps devra être optimisé. Nous régulièrement tache pour CD56, CD3, γδ, CD4, CD8, CD14. Volumes titrée pour ces anticorps sont présentés dans le tableau 1.
- Ajouter 1 ml de tampon de cytométrie de flux à chaque tube. Spin cellules pendant 5 min à 500 x g. Retirer surnageants.
- Ajouter 100 ul de solution Cytofix / Cytoperm de chaque tube. Incuber les cellules pendant 20 min à 4 ° C Protéger de la lumière.
- Ajouter 1 ml de tampon Perm / lavage (10x concentré comme prévu - diluer à 1x utilisant ddH 2 O) à chaque tube. Spin cellules pendant 5 min à 500 x g. Retirer surnageants.
- Ajouter 100 μl de Perm / tampon de lavage aux tubes anticorps de coloration de contrôle FMO et mélanger pour remettre en suspension les cellules.
- Ajouter 100 ul de tampon Perm / cycle de lavage avec une concentration pré-titré d'anticorps conjugué à un fluorophore de marqueurs intracellulaires souhaités (par exemple, des cytokines / chimiokines) à tubes pleins anticorps de coloration.
Remarque: Quantité de chaque anticorps devra être optimisée. Nous régulièrement tache avec des anti-IFN-y des anticorps anti-TNF et. Volumes titrée pour ces anticorps sont présentés dans le tableau 1. - Incuber tous les tubes pendant 30 minutes à 4 ° C Protéger de la lumière.
- Ajouter 1 ml de tampon Perm / Wash à chaque tube. Spin cellules pendant 5 min à 500 x g. Retirer surnageants.
- Resuspendre les cellules dans 300 ul de tampon cytométrie de flux avec 1% de paraformaldehyde. Laisser reposer pendant un minimum de 15 min pour neutraliser le VIH.
- Préparer anticorps à un seul échantillons colorés en utilisant des billes de rémunération, être utilisé pour la compensation mis en place sur le cytomètre de flux. Le type de compensationperles dépendront des anticorps utilisés (par exemple., Ig anti-souris, anti-rat / Ig de hamster). Perles de vortex. Ajouter une goutte de perles par anticorps. Ajouter des quantités égales de anticorps utilisés pour la coloration. Ajouter 200 pi de cytométrie en flux tampon. Ceux-ci sont maintenant prêts à l'emploi. Il n'y a pas besoin de laver les billes.
- Acquérir des échantillons sur un cytomètre de flux dès que possible et dans les 24 heures pour de meilleurs résultats. Tandem colorants sont sensibles à la dissociation avec le stockage de sorte que nous recommandons l'acquisition immédiate si possible.
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Representative Results
Les graphiques représentent les niveaux de la production d'IFNy par les cellules NKT (figure 2), en utilisant CD56 + CD3 + γδ- portes pour obtenir la population de cellules NKT (données non présentées). Les cellules ont été cultivées pendant 72 heures avant la coloration. Une fois colorées, 100.000 cellules CD3 + ont été acquis sur le cytomètre de flux pour obtenir une population suffisamment large de NK, NKT et les cellules yô (cellules d'intérêt). Un minimum de 5600 cellules NKT sont affichés sur chaque graphique. La production de TNF est obtenue de la même manière (données non présentées). Les graphiques montrent clairement que la production d'IFNy est plus faible dans les cellules du VIH (+) des individus par rapport au VIH (-) les individus exposés à PfRBC.
Cytométrie de flux est très subjective. Il est donc essentiel d'avoir tous les contrôles appropriés pour chaque expérience (voir la figure 2). Les niveaux de fond sont calculées en utilisant les échantillons FMO, qui permet une représentation fidèle de la coloration de cytokine.Les cellules stimulées par PMA / ionomycine ont été utilisés comme contrôle positif (données non présentées). PMA et ionomycine sont de puissants stimulateurs de la production de cytokines T de la cellule. L'absence de production d'IFNy dans ces échantillons serait très probablement indiquer un problème avec le protocole de coloration. Cependant, d'autres variables telles que la viabilité des cellules ou des réactifs inactifs peuvent également être en faute.
Figure 1. Représentation de gradient de Ficoll après essorage démontrant la position de la CMSP.
Figure 2. la production de l'IFN γ par les cellules tueuses naturelles T. Les diagrammes de flux ont été obtenus par le fenêtrage CD56 + CD3 + γδ- cellules (minimum de 5600 événements). La production d'IFNy est détectable dans le VIH (-) échantillon stimulé avecP. falciparum a infecté les cellules rouges du sang. Cette réponse de cytokine est plus apparente dans le contexte d'une infection chronique par le VIH. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Notre protocole a été optimisé afin d'étudier plus réaliste la co-infection VIH-de paludisme in vitro. Tout d'abord, les globules rouges humains frais et le sérum sont nécessaires pour la culture du parasite du paludisme. Ceci est essentiel pour obtenir une population saine des parasites du paludisme. Lysats parasite ne peut pas être remplacé par des parasites vivants que la production de cytokines est beaucoup plus rapide et intense lors de l'utilisation en direct P. falciparum infecté RBC (PfRBC) 17,18. De plus, l'activation de types cellulaires tels que les cellules NK, nécessite PfRBCs entiers, et ne fonctionne pas de façon efficace avec des lysats de parasites. Cela peut être dû à la nécessité d'un contact direct entre le PfRBC et les leucocytes ou peut être dû à la nature instable des ligands dérivés de parasites qui interagissent avec des récepteurs de surface cellulaire 18. Cultures paludisme PfRBC doivent également être bien synchronisés (Protocole 4) avant l'expérience. PfRBCs synchronisée améliorer la reproductibilité des données expérimentales. Bien que ce protocole describes l'utilisation de stade trophozoïte PfRBC pour la co-culture, il peut facilement être modifié pour l'étude de stade anneau PfRBC.
Leucocytes humains peuvent être infectés artificiellement avec le VIH, et cette méthode a été utilisée dans les études de recherche co-infection VIH-paludisme 20. Toutefois, cela ne modélise pas la dysrégulation immunitaire qui résulte de l'infection chronique par le VIH. Dans ce système de co-culture on utilise des PBMC isolées à partir de sujets humains qui sont chroniquement infectées par le VIH-1. Lorsque les participants sont nécessaires pour une étude, il est important de sélectionner avec soin cette population. Inclusion et d'exclusion critères sont essentiels pour assurer la variabilité minimum et maximum de reproductibilité. Nos critères inclus une définition claire de l'infection chronique par le VIH (VIH-infectée pour> 1 an, avec CD4 + T-cell baisse de comptage> 50 cellules / mm 3 / an) et l'exclusion de toute personne ayant une infection concomitante. Cette sorte que les résultats obtenus pourraient être attribués de façonLely à l'effet de l'infection chronique par le VIH, l'infection et pas un autre. En outre, étant donné que nous étions intéressés par les réponses immunitaires innées au paludisme, nous avons exclu les bailleurs de fonds qui avaient une infection du paludisme précédente.
Contrôles non-infectées sont également utilisés pour chaque VIH (+) donateur, à chaque point de temps d'échantillonnage, afin de permettre la normalisation des données. Une tentative devrait être faite pour correspondre à des contrôles de leur VIH (+) donneur respective pour au moins l'âge, mais de préférence également le sexe (bien que dans notre étude précédente 12 on n'a pas observé de différence significative dans les sous-ensembles de cellules ou des réponses de cytokines entre féminin et masculin VIH participants non infectés). Si échantillonnage prospectif est prévue, en conservant la même lutte contre le VIH-infecté pour chaque point de temps d'échantillonnage est bénéfique. Les réponses peuvent varier d'une expérience à raison de plusieurs facteurs, y compris la santé des PfRBCs, leur degré de synchronisation, le niveau de la parasitémie et le stade de maturité de PfRBCs, et le niveau d'hématocrite. Soinsdoivent être prises pour garder le plus grand nombre de ces cohérente entre les expériences. Normaliser à un contrôle de non-infectées permet une certaine comptabilité pour ces variables.
Utilisation de cellules fraîches est primordiale pour éviter des résultats artificiels. Des échantillons de gel et de dégel peuvent avoir un impact significatif sur la viabilité des cellules 21,22, la production de cytokines 23-26 et phénotypique de surface de la cellule 27 les marqueurs.
Si les monocytes sont d'un intérêt particulier, il est important que le verre n'a pas été utilisé au cours du protocole. Monocytes adhèrent au verre et à beaucoup d'autres plastiques 28. Nous utilisons des pipettes de polypropylène en plastique, des pipettes de transfert et à travers les tubes afin de minimiser l'adhérence des monocytes et le retrait ultime de nos populations cellulaires de l'étude.
Lors de la configuration de la cytométrie de flux dosage, une combinaison d'anticorps peut être utilisé selon les cellules d'intérêt. Nous étions particulièrement intéressés par IFN et TNF productionà partir de cellules NK, les cellules NKT et les cellules T yô. Ce défini notre panel d'anticorps. Cependant, si l'on utilise une combinaison différente, il est important d'optimiser les quantités d'anticorps pour chaque panneau. Ceci est essentiel pour éviter que des données erronées. Aussi, pour éviter la variabilité et assurer la validité, FMOs sont nécessaires pour évaluer les niveaux de cytokine de fond pour chaque condition (RBC, PfRBC, moyen et PMA / ionomycine) et la population des participants (VIH (-) et le VIH (+), Figure 2). Mesure de la production in vitro de cytokine intracellulaire se traduit généralement par des niveaux de fond élevés, en particulier lorsque les cellules ont été cultivées avant la coloration. Depuis les conditions de culture affectent les niveaux de fond, FMOs compétents de veiller à la connaissance du niveau de fond pour chaque échantillon. Notre offre de cellules était limité, donc nous avons conçu nos FMOs pour contenir toutes les taches de surface, mais pas de taches intracellulaires. Ceci permet pour la comparaison spécifique des niveaux de fond de cytokine sur tous les différents types de cellules étudiés.Nous avons également effectué une seule tache par expérience pour chacun des marqueurs de surface pour confirmer leurs niveaux de fond.
Le protocole décrit est un polyvalent, qui peut être utilisé pour examiner les réponses en quelques heures ou quelques jours selon les cellules d'intérêt. Pour optimiser la production de cytokines induite par PfRBC innées à partir de lymphocytes, nous avons mesuré par cytométrie de flux après la sortie 2 ou 3 jours. Lorsque l'on regarde les monocytes, des points de temps auparavant (1 ou 2 jours) sont recommandés. Ce système permet de multiples types cellulaires et les réponses des cellules à distinguer par cytométrie de flux, les réponses sécrétoires être mesurée dans les surnageants cellulaires et les profils d'expression doit être appréciée dans l'ARN extrait. En outre, l'utilisation d'anticorps pour bloquer ou neutraliser des récepteurs spécifiques des cytokines peuvent être utilisées dans ce système pour disséquer encore les mécanismes. Nous avons utilisé avec succès l'IL-18 blocage des récepteurs d'impliquer IL-18 récepteur dans PfRBC induites par IFN-y 12 réponses. Ce système représente un réalisteic méthode permettant d'évaluer un certain nombre de réponses immunitaires innées au paludisme dans le contexte de l'infection à VIH.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alanine | Sigma | A7377 | |
| antibodies (see other table) | |||
| BD Cytofix/Cytoperm with BD GolgiPlug | BD | 555028 | includes brefeldin A, cytofix/cytoperm buffer and perm/wash buffer |
| BD Vacutainer ACD Solution A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer Sodium Heparin | BD | 17-1440-02 | |
| DPBS (no calcium, no magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | heat inactivate before use |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| gentamycin (10 mg/ml) | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 Staining Set | Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| Ionomycin | Sigma | I3909 | |
| MEM non-essential amino acids (10 mM) | Gibco | 11140 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| RPMI-1640 powder | Life-Technologies | 31800-022 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine and HEPES | Thermo Scientific | SH30255.01 | |
| sodium bicarbonate (powder, cell culture) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360 | |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T6066 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| Trypan Blue (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843, 552845 | depends on antibodies used |
| Parasite Gas Mixture | By special order | 3% CO2, 1% O2, balance N2 | |
| Equipment | |||
| 0.2 μm filter unit | |||
| Glass slides | |||
| T25 flasks | |||
| T75 flasks | |||
| 50 ml tubes | |||
| 24 well culture plates | |||
| unplugged Pasteur pipettes | |||
| plugged Pasteur pipettes | |||
| sterile transfer pipettes | |||
| hemocytometer | |||
| flow cytometer (3 laser) | |||
| Antibodies used for flow cytometry | |||
| Anti-TNF | eBiosciences | 551487 | FITC (fluorophore) 2 μl |
| Anti-IFNγ | Biolegend | 506507 | PE (fluorophore) 20 μl |
| Anti-CD8 | Biolegend | 300914 | PE-Cy7 (fluorophore) 1 μl |
| Anti-CD14 | Biolegend; BD Biosciences | 325624; 551487 | Biotin (fluorophore) 0.5 μl Streptavin PE-TR (fluorophore) 0.1 μl |
| Anti-CD56 | Biolegend | 318322 | PerCP/Cy5.5 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-γδ | Biolegend | 331212 | APC (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD3 | Biolegend | 300426 | APC-Cy7 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD4 | Biolegend | 317424 | Pacific Blue (fluorophore) 1 μl |
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