Introduction
Co-infectie, infectie met meerdere gelijktijdige infecties, is de norm in de natuurlijke omgeving. Co-infectie kan een grote impact hebben op de ziekte pathologie en op de klinische behandeling van iedere infectie. In de context van co-infectie, vaccins en werkzaamheid van het geneesmiddel, alsmede diagnostische tests kunnen negatief beïnvloed (besproken in 1). Ondanks het belang, de meeste pathogeen onderzoek beschouwt eenmalig infecties.
Malaria en HIV-1 (HIV) zijn belangrijke oorzaken van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Gebieden van malaria en HIV endemiciteit delen een brede geografische overlap, waardoor miljoenen mensen het risico lopen van co-infectie en dus een risico op meer ernstige klinische ziekte 2-10. De twee ziekten negatief interageren. Bij HIV-geïnfecteerde individuen, hogere HIV virale lading en tijdelijke dalingen in CD4 + T-cel aantallen te zien tijdens een malaria infectie, terwijlmalariaparasiet lasten en risico's van de klinische en ernstige malaria zijn hoger in co-geïnfecteerde individuen 2,3,5,7,8,10. De mechanismen die HIV verhoogt malaria ernst worden niet volledig begrepen en garandeert verder onderzoek.
Hier beschrijven we een werkwijze waarmee malaria en HIV-infectie kan worden bestudeerd in vitro. Specifiek, maakt deze werkwijze voor de behandeling van malaria-specifieke immuunresponsen in de context van HIV-infectie. Onze protocol beschrijft een veelzijdige co-kweeksysteem met vers geïsoleerde perifere mononucleaire cellen (PBMCs) geïsoleerd uit chronisch HIV geïnfecteerde donoren en in vitro gekweekte P. falciparum geparasiteerde erytrocyten (PfRBC). Het effect van HIV antiretrovirale therapie volgende reacties kunnen worden onderzocht met behulp prospectief PBMC uit HIV (+) donors en na de behandeling.
We hebben dit systeem gebruikt om de impact van HIV-infectie te onderzoekenmalaria-specifieke aangeboren immuunrespons 11,12 en konden vaststellen dat malaria-specifieke IFNy en TNF responsen geremd in NK-cellen, NKT-cellen, γδ T-cellen van HIV (+) donoren pre- en post-HIV antiretrovirale therapie . Bovendien, waren we in staat om dit systeem te gebruiken om te bepalen dat monocytische functies ook worden aangetast bij HIV (+) donoren, maar herstellen na HIV antiretrovirale therapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol vereist de werving van donoren voor serum en RBC te worden gebruikt voor parasiet cultuur en HIV (+) en de niet-geïnfecteerde donoren PBMC isolatie. Institutional Review Boards moeten alle studies keuren en alle donoren moeten geïnformeerde toestemming voorafgaand aan de bloedafname te bieden.
LET OP: Het werken met menselijke bloedmonsters en menselijke malariaparasieten nodig voorzorgsmaatregelen. Draag altijd een laboratoriumjas, handschoenen, en werken in een level 2 bioveiligheid kast. In het geval van accidentele percutane blootstelling aan de menselijke malaria, rapporteren aan gezondheid en veiligheid voor de profylactische behandeling. Extra veiligheid overweging moet ook worden ingevoerd voor het werken met HIV (+) bloed. Draag een back sluiten laboratoriumjas. Dubbele handschoen (top handschoen moet worden latex). Voer alle hanteren in een level 2 bioveiligheid kast. Gebruik geen glas of scherpe voorwerpen gebruiken. Gebruik geen afzuiger. Plaats alle vervuilde items in virox oplossing of bleekmiddel voor een minimum van 1 uur voorafgaand aan het weggooien.Was alle oppervlakken met virox en UV 1 uur na gebruik. Merk op dat elke instelling een eigen specifieke bioveiligheid voorschriften die moeten worden gevolgd zal hebben. Meld alle accidentele blootstelling aan HIV-besmet bloed naar gezondheid en veiligheid voor de evaluatie en behandeling van eventuele post-exposure profylaxe.
Opmerking: Verschillende stammen van P. falciparum malariaparasieten bestaan. ITG werd gebruikt voor deze experimenten, maar andere stammen kunnen worden gebruikt. Uitstekende aanwijzingen voor het invriezen en ontdooien Plasmodium falciparum parasieten zijn beschikbaar op de website MR4 13.
1. Het maken van RPMI-A voor malariaparasiet Cultuur
- Voeg RPMI-0 door het mengen van 950 ml van DDH 2 O, 1 pakje RPMI-1640 poeder, 6 g HEPES, 2 g natriumbicarbonaat en 1,35 mg hypoxanthine.
- Dooi hitte geïnactiveerd humaan serum uit twee verschillende donoren. AB donoren best maar elk kan worden gebruikt als parasieten worden gekweekt in O-typerode bloedcellen (RBC). Omkeren buizen te mengen. Als serum bevat deeltjes of dik centrifugeren op 2000 tpm en vervolgens filteren vloeibare deel met behulp van een 0,45 pm filter.
- Met een 0,2 urn filtereenheid filter 180 ml RPMI-0, 20 ml humaan serum (10 ml van elke donor) en 0,5 ml van 10 mg / ml gentamycine.
Opmerking: menselijke serum kan het filter verstoppen zodat in een filtereenheid kan nodig. - Label het medium fles met RPMI-A, de datum, en de bron van het serum. Koelkast totdat vereist. RPMI-A kan blijken troebel is gekoeld. Dit is normaal, maar toenemende bewolking is een teken van besmetting.
Opmerking: Parasite groei kan variëren in verschillende donor serum. Het is een goed idee om alle menselijke serum batches voor een goede parasiet groei te testen alvorens het te gebruiken.
2. Voorbereiden Human Red Blood Cells voor Parasite Cultuur
Opmerking: Blood donoren moeten soort O.
- Verzamel 7-10 ml bloed in zuur-citrate-dextrose (ACD) buizen. Schrijf ID en de datum van de winning op het etiket van de donor.
- Store bloed bij 4 ° C totdat het nodig is. Gebruik bloed voor parasiet culturen binnen 1 maand.
- Veeg de bovenkant van de buis met 70% ethanol. Verwijder voorzichtig stop en gooi. Transfer bloed in een buis van 15 ml. Spin gedurende 3 min bij 1000 x g. Verwijder plasma door aspiratie.
- Schorten RBC met een gelijk volume van warme RPMI-0. Spin gedurende 5 min bij 1000 x g. Verwijder de buffy coat door aspiratie, hersuspenderen in 5 ml RPMI-0 en herhaal het wassen 2 keer.
- Verwijder het supernatant en voeg genoeg RPMI-A een mengsel dat 50% RBC volumeprocent produceren.
- Bewaren bij 4 ° C totdat het nodig is.
3. Handhaving van Parasite Cultures
- Pre-warm RPMI-A tot 37 o C.
- Plaats ontdooid parasieten (zie MR4 protocol ontdooien) in een T25 kolf met 5 ml van RPMI-A en 75 pl gewassen humane RBC voor een hematocrit van ~ 3%.Opmerking: Hematocriet meet het volume van RBC opzichte totale volume. Berekenen hematocriet meten van het volume van verpakte RBC tot het totale volume van medium met RBC. Neem aan dat de ontdooide parasieten dragen 75 pl RBC. Door toevoeging van 150 gl RBC voorraad (wat overeenkomt met het toevoegen van 75 ui verpakte RBC) aan de kolf er in totaal 150 ul van RBC in 5 ml medium, wat overeenkomt met een hematocriet van 3% (150 gl / 5000 pi x 100% = 3%).
- Gas de kolf gedurende 30 sec met parasieten gasmengsel (1% O2, 3% CO2, balans N2). Seal en plaats de kolf brede zijde in een 37 ° C incubator mogelijk te maken voor het grootste oppervlak voor gasuitwisseling.
- Om het medium te veranderen en te controleren op parasitemie (moet dagelijks worden gedaan), zorgvuldig verplaatsen de kolf als aan de RBC laag niet verstoren. Met behulp van een steriele unplugged Pasteur pipet te trekken uit het kweekmedium zonder verstoring van het bloed laag.
- Om pa controlerenrasitemia, verwijderen van een 10 ul monster van het bloed laag, leg het op een glasplaatje en het gebruik van een tweede glasplaatje creëren een dunne bloed film. Laat slide drogen.
- Plaats 4 ml vers RPMI-A in de kolf, meng, gas voor 30 sec, en de plaats in de incubator bij 37 ° C.
- Vlekken op de schuif met behulp van de hemA3 kleuring kit volgens protocol van de fabrikant.
- Voor een optimale kleuring, dip schuift bij de vaststelling oplossing voor 10 sec, oplossing die ik voor 10 sec, en oplossing II voor 30 sec. Afspoelen met water en laat dia's om te drogen.
- Bereken parasitemie door het tellen van het aantal PfRBC (gebrandschilderd donkerpaars) ten opzichte van het totale aantal RBC (gebrandschilderd roze). Telling in totaal 300 cellen nauwkeurigheid.
- Wanneer parasieten een parasitemie van 5% hebben bereikt, de uitbreiding van de cultuur in een T75 kolf met 40 ml RPMI-A, en 500 ul van RBC.
4. Parasite Synchronisatie
Opmerking: De dag voor thij experimenteren, de parasiet cultuur synchroniseren door behandeling met alanine. Alleen ring stadium parasieten en niet-geïnfecteerde RBC zal deze behandeling overleven. Alanine synchronisatie zal u een pure trophozoite cultuur de volgende dag, dat kan worden gebruikt in de co-cultuur experimenten geven. Zorg ervoor te beginnen met een parasiet cultuur die de meeste ring parasieten bevat.
- Bereid alanine oplossing door het mengen van 8,01 g alanine (300 mM) en 0,365 g Tris (10 mM) in 300 ml van DDH 2 O. Breng de pH tot 7,4. Filter gesteriliseerd met behulp van een 0,2 urn filtereenheid.
- Pre-warm alanine oplossing tot 37 o C.
- Spin down de parasiet cultuur (5 min x 1000 x g), en verwijder het medium.
- Resuspendeer pellet in 19 volumina alanine-oplossing (1 ml verpakt RBC aan 19 ml alanine oplossing). Incubeer gedurende 15 min bij kamertemperatuur.
- Spin 5 min x 1000 x g. Zuig supernatant. Was in RPMI-0 keer. Zuig supernatant en resuspendeer in RPMI-A en pas hematocriet tot ~ 3%. Gals kolf en terugkeer naar de 37 o C.
Opmerking: Voor co-cultuur experimenten minimaal parasitemie van 5% trofozoïeten nodig is, met 10% parasitemie beschouwd als optimaal.
5. Parasite en RBC Voorbereiding voor co-cultuur experimenten
- Met een verhouding van 3 PfRBC per PBMC in co-kweek-experimenten een ontstekingsreactie veroorzaken. Om totale PfRBC berekenen parasitemie gekwantificeerd door een dun bloeduitstrijkje zoals beschreven in 3,5 en hematocriet door telling van het aantal RBC per ml kweek parasiet behulp van een hemocytometer.
Aantal PfRBC =% parasitemie x totale RBC / ml x ml van de cultuur. Bijvoorbeeld: 10 ml kweken bij 10 x 10 6 RBC / ml en 10% parasitemie is gelijk aan 0,1 x 10 6 / ml x 10 ml = 10 x 10 6 PfRBC. - Draai de parasiet kweek gedurende 5 min bij 1000 xg (RT). Zuig medium en resuspendeer in 6 x 10 6 PfRBC per ml in RPMI-S + (500 ml RPMI-1640 aangevuld met L-glutamine en HEPES, 10% hittegeïnactiveerd FBS, 1,5 ml gentamycine, 5 ml van 100 mM natriumpyruvaat, 5 ml 10 mM MEM niet-essentiële aminozuren, 5 ml 5 mM β-mercaptoethanol).
- Neem controle bloed (geïnfecteerde RBC van dezelfde donor voor het onderhoud van de parasiet cultuur), berekenen hematocriet en hersuspenderen in RPMI-S + op hetzelfde aantal RBC per ml als parasiet cultuur.
6. Isolatie van humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC)
- Verzamel veneuze bloed in natrium heparine buisjes (groene top) van zowel een chronische HIV (+) donor en een HIV (-) controle. Laat EDTA als anti-coagulant calcium chelerende werking EDTA beïnvloedt celfunctie. Gemiddeld verwachten tussen de 5-10 x 10 6 PBMC per 10 ml bloed. Bij een kenmerkend experiment laat 30 ml bloed van elke donor. Het bloedvolume moet worden aangepast aan de experimentele eisen.
- Zo snel mogelijk en zeker binnen een uur van het bloed worden verzameld,het bloed van de buizen en plaats te verwijderen in een plastic 50 ml buis. Monocyten in het bijzonder geactiveerd en vasthouden aan glas, dus is het belangrijk dat als glazen bloedafnamebuisjes gebruikt cellen zo snel mogelijk worden verwijderd.
- Draai het bloed bij 1000 g gedurende 15 minuten en verzamel plasma (dit kan worden gebruikt voor andere studies indien nodig - als deze stap overgeslagen kan zijn). Verdun het bloed gelijk volume van koude DPBS.
- Plaats 15 ml Ficoll RT in een 50 ml buis. Langzaam, met een steriele plastic transferpipet, laag bloed / DPBS oplossing over de Ficoll zonder mengen. Een maximum van 25 ml bloed / DPBS oplossing kan worden gelaagd over elk 15 ml Ficoll.
- Draai de hellingen gedurende 30 min bij kamertemperatuur bij 600 x g. Zorg ervoor dat de instelling 'geen rem' op.
- Nadat de cellen gecentrifugeerd, zoeken naar het grensvlak tussen de twee fasen. Dit is waar de PBMC zijn. Met behulp van een steriele plastic transferpipet verzamelen van de PBMC van de interface (zieFiguur 1). Besmetting te minimaliseren door RBC.
- Plaats verzamelde cellen in 50 ml buizen met niet meer dan 20 ml per buis. Bovenbuis tot 50 ml met een steriele koud DPBS.
- Draai de cellen gedurende 10 min bij 4 ° C bij 300 x g.
- Gooi supernatant, resuspendeer pellet in 5 ml steriel koud DPBS en bundelen alle cellen van dezelfde donor in een buis. Top tot 50 ml met een steriele DPBS, en herhaal het wassen stappen 2 keer.
- Resuspendeer cellen in 10 ml RPMI-medium + S.
- Verwijderen 20 pi aliquot en mengen met 20 pi van trypan blue. Pipet 10 ul in een hemocytometer en tel de levende cellen (cellen die geen gebruik hebben gemaakt van de blauwe kleurstof - alle blauwe cellen zijn dood). Gebruik een hemocytometer om aantal cellen te berekenen in een oplossing als volgt.
Opmerking: Een haemocytometer heeft een raster van bepaalde afmetingen, zodat het gebied dat onder de lijnen bekend.- Zorg ervoor dat de hemocytometer schoon is. Plaats het dekglaasje over de counting omgeving. Belasting 10 pi celoplossing door het plaatsen van de pipetpunt in één van de V-vormige putjes. Het oppervlak onder het dekglaasje vult door capillaire werking.
- Plaats de geladen hemocytometer onder een microscoop. De volledige rooster van de hemocytometer bevat 9 vierkanten van 1 mm 2 per stuk. Tel alle cellen in elke grote plein. Als er te veel cellen aanwezig zijn, verdun de oplossing verder en hertelling.
- Bereken cel concentratie als volgt: Totaal aantal cellen / ml = (totaal cellen geteld / # vierkantjes) x verdunningsfactor x 10.000 cellen / ml, bijvoorbeeld (500 cellen / 5 vierkantjes) x verdunningsfactor van 20 x 10.000 cellen / ml = 20 x 10 6 cellen totaal.
- Stel medium tot een uiteindelijke concentratie van 10 x 10 6 per ml (RPMI-medium + S).
7. Malaria / HIV Co-infectie Cultuur
- Plaat 100 pl geïsoleerde PBMCs en 400 ul RPMI-medium + S een 24-putjes plaat (1 x 10 6 PBMC per putje). Verzekerendie putten worden opgezet in drievoud: 3 putten voor geïnfecteerde RBC, 3 putten met PfRBC, 3 putten met middelgrote en 3 waterputten met PMA / Ionomycine. Dit is zowel voor HIV (+) en HIV (-) monster.
- Voor de PfRBC putjes, plaats 3 x 10 6 PfRBC in elk van de putten (500 ui parasiet kweek bereid in 5,2).
- Voor geïnfecteerde RBC putjes plaats 500 pl van de geïnfecteerde RBC kweek bereid in 5,3 in elk van de putjes.
- Voor medium putjes plaats 500 pl RPMI + S-medium in elk van de putjes.
- Voor PMA / Ionomycine putten, bereiden PMA / Ionomycine oplossing (2,5 pg / ml, 250 pg / ml). Plaats 500 ul van deze oplossing in elk putje.
Opmerking: Als potente stimulatoren van T-cel cytokine secretie, PMA en lonomycine worden gebruikt als een positieve controle om te garanderen cellen functioneel. - Plaat staan bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
- Optioneel: gebruik teveel cellen voor fenotypische analyse met behulp van flowcytometrie of op te slaan in een RNEen stabilisatie oplossing voor toekomstige mRNA-expressie analyse.
8. Detectie van Malaria Immune Responses
Opmerking: Voer co-kweek-experimenten zolang 4 dagen. Nr medium verandering nodig in deze tijd. Het optimale tijdstip zal afhangen van het celtype van belang en de gestelde vraag. Een incubatie van 12-48 uur is optimaal voor monocytische reactie op PfRBCs, terwijl lymfocyt responsen werden best waargenomen bij 72-96 uur. De tijdstippen moeten worden geoptimaliseerd op basis van de wetenschappelijke vraag. Kortere periodes (2-4 uur) kan worden gebruikt als de interactie tussen intact PfRBC en PBMC is van belang.
- Spin plaat bij 300 xg gedurende 3 minuten tot pellet cellen. Verzamel 700 pi kweeksupernatant uit elk putje.
- Spin supernatant bij 1000 xg gedurende 5 minuten om vrij van vuil.
- Aliquot heldere supernatant indien nodig, label en bevriezen bij -20 ° C onder tot analyse van uitgescheiden factoren te zijn performed.
- Analyseer cytokine / chemokine reacties met ELISA of bead array (volg stelde protocollen van de fabrikant).
- Verzamel cellen die overblijven in de plaat in een RNA stabiliserende oplossing en benut voor mRNA expressie analyse door kwantitatieve real-time PCR 14-16.
9. Intracellulaire Flowcytometrie voor mobiele-specifieke Ccytokine Reacties Met behulp van PBMC co-gekweekt met P. falciparum geïnfecteerde RBC
Opmerking: Zoals de lengte van co-kweek genoemd zal afhangen van het celtype van belang. Indien geïnteresseerd in monocytische reactie op een kortere incubatieperiode PfRBC nodig. Duurt langer om aangeboren lymfocyt responsen γδ T-cellen, NK-cellen, NKT-cellen), en nog langer voor CD4 en CD8 T-cellen. Optimalisatie nodig zal zijn.
- 6-8 uur voorafgaand aan de analyse toe 1 pl 1000x Brefeldine A aan alle putjes. Zet de plaat tot 37 o C incubator. Na 6-8 uur incubatie, laat de plaat op ijs gedurende 15 min.
- Verwijder cellen van de putjes met behulp krachtig pipetteren en plaats ze in gelabelde microcentifuge buizen. Schrapen kan worden verplicht om monocyten te verwijderen.
- Spin cellen gedurende 5 min bij 1000 x g. Verwijderen supernatanten. Resuspendeer cellen in 500 pi van stromingscytometrie buffer (1x DPBS, 2% warmte geïnactiveerd FBS, 0,02% natriumazide).
- Verdeel cellen up zodat elk monster: een buis volledig antilichaamkleuring (240 ui), en één buis fluorescent min één (FMO) controle antilichaam kleuring (240 ui). Zwembad een kleine hoeveelheid van elk monster (20 ul) van de ongekleurde flowcytometrie control (deze wordt gebruikt bij het opzetten van de flowcytometer).
- Spin cellen gedurende 5 minuten bij 500 x g. Verwijderen supernatanten.
- Incubeer de cellen met geconjugeerde anti-humaan CD16 / CD32 (5 ug / ml) in 50 gl flowcytometrie buffer gedurende 15 min bij 4 ° C aan Fc-receptoren te blokkeren.
- Voeg 1 ml van flowcytometrie buffer aan elke buis. Spin cells gedurende 5 minuten bij 500 x g. Verwijderen supernatanten.
- Resuspendeer cellen in 50 ui buffer flowcytometrie met een vooraf bepaalde concentratie van fluorofoor-geconjugeerde antilichamen gewenste celoppervlak markers. Pre-mix genoeg antilichaam oplossing voor alle monsters te worden gekleurd. Incubeer de cellen bij 4 ° C gedurende 20 min. Beschermen tegen light.Note: Hoeveelheid elk antilichaam moeten worden geoptimaliseerd. We routinematig vlek voor CD56, CD3, γδ, CD4, CD8, CD14. Getitreerd hoeveelheden van deze antilichamen worden in tabel 1.
- Voeg 1 ml van flowcytometrie buffer aan elke buis. Spin cellen gedurende 5 minuten bij 500 x g. Verwijderen supernatanten.
- Voeg 100 ul van Cytofix / Cytoperm oplossing aan elke buis. Incubeer cellen gedurende 20 min bij 4 ° C. Bescherming tegen licht.
- Voeg 1 ml Perm / wasbuffer (10x geleverd als concentraat - verdunnen tot 1x behulp DDH 2 O) aan elke buis. Spin cellen gedurende 5 minuten bij 500 x g. Verwijderen supernatanten.
- Voeg 100 μl van perm / wassen buffer FMO controle antilichaam kleuring buizen en meng om cellen mengen.
- Voeg 100 ul van perm / wasbuffer met een vooraf bepaalde concentratie van fluorofoor-geconjugeerde antilichamen voor gewenste intracellulaire markers (bijv cytokines / chemokines) volledig antilichaamkleuring tubes.
Opmerking: Hoeveelheid elk antilichaam moeten worden geoptimaliseerd. We routinematig kleuren met anti-TNF en anti-IFNy-antilichamen. Getitreerd hoeveelheden van deze antilichamen worden in tabel 1. - Incubeer alle buizen gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Bescherming tegen licht.
- Voeg 1 ml Perm / Wash buffer aan elke buis. Spin cellen gedurende 5 minuten bij 500 x g. Verwijderen supernatanten.
- Resuspendeer cellen in 300 ul buffer flowcytometrie met 1% paraformaldehyde. Laat zitten voor een minimum van 15 minuten te neutraliseren HIV.
- Bereid enkel antilichaam gekleurd monsters met behulp van compensatie kralen, moet worden gebruikt voor compensatie ingesteld op de flowcytometer. De vorm van compensatieparels zal afhangen van de gebruikte antilichamen (bijv., anti-muizen-Ig, anti-rat / hamster Ig). Vortex kralen. Voeg een druppel kralen per antilichaam. Voeg gelijke hoeveelheden antilichaam zoals gebruikt voor kleuring. Voeg 200 ul van flowcytometrie buffer. Deze zijn nu klaar voor gebruik. Er is geen noodzaak om de parels te wassen.
- Verwerven monsters op een flowcytometer zo spoedig mogelijk en binnen 24 uur voor het beste resultaat. Tandem kleurstoffen zijn gevoelig voor dissociatie met berging dus we raden onmiddellijke overname, indien mogelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De grafieken tonen de niveaus van IFNy productie van NKT-cellen (figuur 2), via CD56 + CD3 + γδ- poorten van de NKT-cellen populatie te verkrijgen (data niet getoond). De cellen werden gedurende 72 uren voorafgaand aan kleuring. Eenmaal gekleurd, 100.000 CD3 + cellen werden verkregen op de flowcytometer om groot genoeg populaties van NK, NKT en γδ cellen (cellen van belang) te verkrijgen. Een minimum van 5600 NKT-cellen worden op elke grafiek. TNF-productie wordt verkregen op dezelfde wijze (gegevens niet getoond). De grafieken tonen duidelijk aan dat IFNy productie lager in cellen van HIV (+) individuen in vergelijking met HIV (-) individuen blootgesteld aan PfRBC.
Flowcytometrieanalyse is zeer subjectief. Daarom is het essentieel om de juiste controles voor elk experiment (zie figuur 2). Achtergrondniveaus worden berekend met de FMO monsters, die zorgt voor een getrouwe weergave van de cytokine kleuring.Cellen gestimuleerd met PMA / Ionomycine werden gebruikt als een positieve controle (gegevens niet getoond). PMA en Ionomycine sterke stimulatoren van T-cel cytokineproductie. Een tekort aan IFNy productie in deze monsters zou waarschijnlijk een probleem met de kleuringsprotocol geven. Echter, kunnen andere variabelen zoals de levensvatbaarheid van de cellen of inactief reagentia ook in gebreke is gebleven.
Figuur 1. Afbeelding van Ficoll gradiënt bericht draai het aantonen van de positie van de PBMCs.
Figuur 2. IFN γ productie door Natural Killer T-cellen. De stroomschema's werden verkregen door gating op CD56 + CD3 + γδ- cellen (minimaal 5600 events). IFNy productie is detecteerbaar in de HIV (-) monster gestimuleerd metP. falciparum geïnfecteerde rode bloedcellen. Dit cytokine reactie is niet meer zichtbaar in het kader van een chronische HIV-infectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ons protocol is geoptimaliseerd om zo realistisch studie HIV-malaria co-infectie in vitro. Eerst verse menselijke RBCs en serum zijn vereist voor malariaparasiet cultuur. Dit is essentieel voor een gezonde populatie van malariaparasieten verkrijgen. Parasiet lysaten kan niet worden vervangen voor levende parasieten als cytokine productie is veel sneller en intenser bij het gebruik van live-P. falciparum geïnfecteerde RBC (PfRBC) 17,18. Bovendien activeren van celtypen zoals NK-cellen, vereist geheel PfRBCs en niet efficiënt met parasieten lysaten. Dit kan te wijten zijn aan de noodzaak van direct contact tussen de PfRBC de leukocyten of kan vanwege de instabiliteit van de parasiet afgeleide liganden die interageren met celoppervlakreceptoren 18. Malaria PfRBC culturen dienen ook goed gesynchroniseerd (protocol 4) voorafgaand aan het experiment. Gesynchroniseerd PfRBCs betere reproduceerbaarheid van de experimentele data. Hoewel dit protocol deschriftgeleerden het gebruik van trophozoite podium PfRBC voor co-cultuur, kan het gemakkelijk worden aangepast voor de studie van de ring stadium PfRBC.
Menselijke leukocyten kan kunstmatig worden besmet met HIV, en deze methode is gebruikt in studies van malaria-HIV co-infectie onderzoek 20. Dit betekent echter niet het model van de immuun disregulatie als gevolg van chronische HIV-infectie. In deze co-cultuur systeem gebruiken we PBMCs geïsoleerd uit menselijke deelnemers die chronisch geïnfecteerd zijn met HIV-1. Wanneer deelnemers wel voor het onderzoek, is het belangrijk om zorgvuldig selecteren deze populatie. In- en uitsluiting criteria zijn van vitaal belang voor minimale variabiliteit en maximale reproduceerbaarheid te garanderen. De criteria inclusief een duidelijke definitie van chronische HIV infectie (HIV-geïnfecteerde gedurende> 1 jaar, met CD4 + T-celtelling afname van> 50 cellen / mm 3 / jaar) en de uitsluiting van iedereen met een gelijktijdige infectie. Hierdoor werd de verkregen resultaten dus kon worden toegeschrevenLely om het effect van chronische HIV-infectie, en niet een infectie. Bovendien, aangezien we geïnteresseerd waren in de aangeboren immuunrespons op malaria uitgesloten we donoren die vorige malaria-infectie had.
HIV-geïnfecteerde controles worden eveneens gebruikt voor elke HIV (+) donor op elk bemonsteringstijdstip, om voor gegevensnormalisatie. Een poging moet worden gedaan om de controles aan te passen aan hun respectieve HIV (+) donor minstens leeftijd, maar bij voorkeur ook seks (hoewel het in onze vorige studie 12 hebben we niet een significant verschil in cel subsets of cytokine reacties tussen vrouwelijke en mannelijke observeren HIV- geïnfecteerde deelnemers). Als aspirant-sampling is gepland behoud van dezelfde HIV-geïnfecteerde controle voor elke bemonstering tijdstip is gunstig. Antwoorden kunnen variëren van experiment tot experiment gevolg van meerdere factoren, waaronder de gezondheid van de PfRBCs, de mate van synchronisatie, parasitemie niveau en de rijpheid van PfRBCs en hematocrietwaarde. Zorgworden genomen om zoveel mogelijk van deze overeenstemming tussen experimenten houden. Normaliseren van een HIV-geïnfecteerde controle laat een zekere verwerking van deze variabelen.
Met verse cellen is van cruciaal belang om kunstmatige resultaten te vermijden. Invriezen en ontdooien monsters een significant effect op cellevensvatbaarheid 21,22 hebben cytokineproductie 23-26 en celoppervlak fenotypische markers 27.
Wanneer monocyten van bijzonder belang is het belangrijk dat het glas niet wordt gebruikt tijdens het protocol. Monocyten hechten aan glas en vele andere kunststoffen 28. We maken gebruik van polypropyleen plastic pipetten, overdracht pipetten en buizen gedurende de gehele monocyten hechting en uiteindelijke verwijdering te minimaliseren uit onze studie celpopulaties.
Bij het opzetten van de flowcytometrie-assay, kan elke combinatie van antilichamen worden gebruikt, afhankelijk van de cellen van belang. We waren vooral geïnteresseerd in IFNy en TNF-productievan NK-cellen, NKT-cellen en T-cellen γδ. Dit gedefinieerd onze antilichaam panel. Indien een andere combinatie, is het belangrijk om de hoeveelheid antilichaam optimaliseren voor elk paneel. Dit is essentieel om foutieve gegevens te voorkomen. Ook variabiliteit voorkomen en te zorgen geldigheid PWV moeten achtergrond cytokine niveaus bepalen voor elke voorwaarde (RBC, PfRBC, medium en PMA / lonomycine) en deelnemerspopulatie (HIV (-) en HIV (+), figuur 2). Meten in vitro intracellulaire cytokine productie resulteert meestal in hoge achtergrondniveaus, vooral wanneer cellen voorafgaand aan kleuring gekweekt. Aangezien de kweekomstandigheden beïnvloeden achtergrond niveaus passende PWV's zorgen voor de kennis van de achtergrond voor elk monster. Onze levering van cellen was beperkt, dus ontworpen we onze PWV om alle oppervlakte vlekken, maar geen intracellulaire vlekken bevatten. Dit maakt de vergelijking van specifieke cytokine achtergrondniveaus op alle verschillende celtypen onderzocht.We liepen ook één vlek per experiment voor elk van de oppervlaktemarkers hun achtergrondniveaus bevestigen.
De beschreven protocol is een veelzijdig is, die kan worden gebruikt om responsen binnen uren of dagen, afhankelijk van de cellen van belang. Voor een optimale PfRBC-geïnduceerde cytokine productie van aangeboren lymfocyten, gemeten we flowcytometrie uitgang na 2 of 3 dagen. Wanneer we kijken naar monocyten, zijn eerder tijdstippen (1 of 2 dagen) aanbevolen. Dit systeem maakt meerdere celtypes en celreacties te onderscheiden met stroomcytometrie, secretorische responsen te meten in cel supernatanten en expressieprofielen worden geëvalueerd geëxtraheerd RNA. Verder gebruik van antilichamen tegen specifieke receptoren blokkeren of neutraliseren cytokines kunnen worden gebruikt in dit systeem om mechanismen verder ontleden. We hebben met succes gebruik IL-18 receptor blokkade IL-18 receptor in PfRBC geïnduceerde IFNy reacties 12 impliceren. Dit systeem is een realistic methode om een aantal aangeboren immuunresponsen beoordelen in malaria in de context van HIV-infectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alanine | Sigma | A7377 | |
| antibodies (see other table) | |||
| BD Cytofix/Cytoperm with BD GolgiPlug | BD | 555028 | includes brefeldin A, cytofix/cytoperm buffer and perm/wash buffer |
| BD Vacutainer ACD Solution A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer Sodium Heparin | BD | 17-1440-02 | |
| DPBS (no calcium, no magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | heat inactivate before use |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| gentamycin (10 mg/ml) | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 Staining Set | Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| Ionomycin | Sigma | I3909 | |
| MEM non-essential amino acids (10 mM) | Gibco | 11140 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| RPMI-1640 powder | Life-Technologies | 31800-022 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine and HEPES | Thermo Scientific | SH30255.01 | |
| sodium bicarbonate (powder, cell culture) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360 | |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T6066 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| Trypan Blue (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843, 552845 | depends on antibodies used |
| Parasite Gas Mixture | By special order | 3% CO2, 1% O2, balance N2 | |
| Equipment | |||
| 0.2 μm filter unit | |||
| Glass slides | |||
| T25 flasks | |||
| T75 flasks | |||
| 50 ml tubes | |||
| 24 well culture plates | |||
| unplugged Pasteur pipettes | |||
| plugged Pasteur pipettes | |||
| sterile transfer pipettes | |||
| hemocytometer | |||
| flow cytometer (3 laser) | |||
| Antibodies used for flow cytometry | |||
| Anti-TNF | eBiosciences | 551487 | FITC (fluorophore) 2 μl |
| Anti-IFNγ | Biolegend | 506507 | PE (fluorophore) 20 μl |
| Anti-CD8 | Biolegend | 300914 | PE-Cy7 (fluorophore) 1 μl |
| Anti-CD14 | Biolegend; BD Biosciences | 325624; 551487 | Biotin (fluorophore) 0.5 μl Streptavin PE-TR (fluorophore) 0.1 μl |
| Anti-CD56 | Biolegend | 318322 | PerCP/Cy5.5 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-γδ | Biolegend | 331212 | APC (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD3 | Biolegend | 300426 | APC-Cy7 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD4 | Biolegend | 317424 | Pacific Blue (fluorophore) 1 μl |
References
- Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large. Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).
- French, N., et al. Increasing rates of malarial fever with deteriorating immune status in HIV-1-infected Ugandan adults. AIDS (London, England). 15 (7), 899-906 (2001).
- Hoffman, I. F., et al. The effect of Plasmodium falciparum malaria on HIV-1 RNA blood plasma concentration. AIDS (London, England). 13 (4), 487-494 (1999).
- Kamya, M. R., et al. Effect of HIV-1 infection on antimalarial treatment outcomes in Uganda: a population-based study. The Journal of infectious diseases. 193 (1), 9-15 (2006).
- Kublin, J. G., et al. Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study. Lancet. 365 (9455), 233-240 (2005).
- Mermin, J., et al. Effect of co-trimoxazole prophylaxis, antiretroviral therapy, and insecticide-treated bednets on the frequency of malaria in HIV-1-infected adults in Uganda: a prospective cohort study. Lancet. 367 (9518), 1256-1261 (2006).
- Patnaik, P., et al. Effects of HIV-1 serostatus, HIV-1 RNA concentration, and CD4 cell count on the incidence of malaria infection in a cohort of adults in rural Malawi. The Journal of infectious diseases. 192 (6), 984-991 (2005).
- Whitworth, J., et al. Effect of HIV-1 and increasing immunosuppression on malaria parasitaemia and clinical episodes in adults in rural Uganda: a cohort study. Lancet. 356 (9235), 1051-1056 (2000).
- Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha. The Journal of infectious diseases. 177 (2), 437-445 (1998).
- Francesconi, P., et al. HIV, malaria parasites, and acute febrile episodes in Ugandan adults: a case-control study. AIDS (London, England). 15 (18), 2445-2450 (2001).
- Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates Tim-3 expression on innate cells: combination antiretroviral therapy results in partial restoration. Journal of acquired immune deficiency syndromes. 63 (2), 161-167 (2013).
- Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates innate immunity to malaria despite combination antiretroviral therapy. AIDS (London, England). 27 (3), 325-335 (2013).
- Ljungstrom, I., et al. Methods in Malaria Research. , 4th edition, MR4/ATCC. Available from: http://www.mr4.org/Publications/MethodsinMalariaResearch.aspx (2013).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
- Universal SYBR green quantitative PCR protocol [Internet]. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html (2014).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-DDCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Hensmann, M., Kwiatkowski, D. Cellular basis of early cytokine response to Plasmodium falciparum. Infection and immunity. 69 (4), 2364-2371 (2001).
- Artavanis-Tsakonas, K., Riley, E. M. Innate immune response to malaria: rapid induction of IFN-gamma from human NK cells by live Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. J Immunol. 169 (6), 2956-2963 (2002).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. The Journal of parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
- Ludlow, L. E., et al. HIV-1 inhibits phagocytosis and inflammatory cytokine responses of human monocyte-derived macrophages to P. falciparum infected erythrocytes. PloS one. 7 (2), e32102 (2012).
- Weinberg, A., et al. Viability and functional activity of cryopreserved mononuclear cells. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (4), 714-716 (2000).
- Fowke, K. R., Behnke, J., Hanson, C., Shea, K., Cosentino, L. M. Apoptosis: a method for evaluating the cryopreservation of whole blood and peripheral blood mononuclear cells. Journal of immunological. 244 (1-2), 139-144 (2000).
- Jeurink, P. V., Vissers, Y. M., Rappard, B., Savelkoul, H. F. J. T cell responses in fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells: kinetics of cell viability, cellular subsets, proliferation, and cytokine production. Cryobiology. 57 (2), 91-103 (2008).
- Kvarnström, M., Jenmalm, M. C., Ekerfelt, C. Effect of cryopreservation on expression of Th1 and Th2 cytokines in blood mononuclear cells from patients with different cytokine profiles, analysed with three common assays: an overall decrease of interleukin-4. Cryobiology. 49 (2), 157-168 (2004).
- Venkataraman, M. Effects of cryopreservation of immune responses. XI. Heightened secretion of tumor necrosis factor-alpha by frozen human peripheral blood mononuclear cells. Cryobiology. 34 (3), 276-283 (1997).
- Venkataraman, M. Effects of cryopreservation on immune responses. X. Decrease in interleukin-12 production by frozen human peripheral blood mononuclear cells is mediated by the endogenously hypersecreted interleukin-10. Cryobiology. 33 (5), 581-588 (1996).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (3), 352-359 (2000).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. Journal of leukocyte biology. 56 (3), 236-240 (1994).
