Introduction
Co-infeksjon, infeksjon med flere samtidige infeksjoner, er normen i naturlige omgivelser. Co-infeksjon kan ha en stor innvirkning på sykdommen patologi og på den kliniske behandlingen av hver infeksjon. I sammenheng med ko-infeksjon, vaksine og legemiddel effekt, så vel som diagnostiske tester kan bli negativt påvirket (oversikt i 1). Imidlertid, til tross for sin betydning, de fleste av patogenet forskning vurderer bare én infeksjoner.
Malaria og HIV-1 (HIV) er ledende årsaker til sykelighet og dødelighet globalt. Områder av malaria og HIV endemicity dele en bred geografisk overlapp, sette millioner av mennesker i fare for co-infeksjon og dermed i fare for alvorligere klinisk sykdom 2-10. De to sykdommene negativt samhandle. Hos HIV-infiserte individer, høyere HIV-virusmengde og midlertidige reduksjoner i CD4 + T-celletall kan sees under en malariainfeksjon, mensmalariaparasitten byrder og risiko for klinisk og alvorlig malaria er høyere i co-infiserte individer 2,3,5,7,8,10. Mekanismer som HIV øker malaria alvorlighetsgrad er ikke fullt ut forstått og garanterer videre etterforskning.
Her beskriver vi en metode som malaria og HIV-infeksjon kan studeres in vitro. Konkret gir denne metoden for undersøkelse av malaria-spesifikke immunresponser i sammenheng med HIV-infeksjon. Vår protokollen beskriver en allsidig ko-kultur-system ved bruk av nylig isolerte perifere mononukleære blodceller (PBMC) isolert fra kronisk HIV-infiserte givere og in vitro dyrkede P. falciparum parasitized erytrocytter (PfRBC). Virkningen av HIV antiretroviral terapi på disse svarene kan også bli undersøkt ved hjelp prospektivt innsamlede PBMC fra HIV (+) givere før og etter behandling.
Vi har brukt dette systemet for å undersøke effekten av HIV-smittepå malaria-spesifikke medfødte immunresponser 11,12, og var i stand til å bestemme at malariaspesifikke IFNy og TNF responser er svekket i NK-celler, NKT celler, γδ T-celler fra HIV (+) givere før og etter HIV antiretroviral behandling . I tillegg var vi i stand til å bruke dette systemet for å fastslå at monocyttiske funksjoner er også svekket i HIV (+) givere, men gjenopprette post-HIV antiretroviral behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen krever rekruttering av givere for serum og RBC som skal brukes for parasitt kultur, og HIV (+) og friske givere for PBMC isolasjon. Institutional Review Boards må godkjenne alle studiene og alle givere må gi informert samtykke før blodprøvetaking.
FORSIKTIG: Arbeide med humane blodprøver og humane malariaparasitter krever forholdsregler. Alltid bære en frakk, hansker, og arbeid i en nivå 2 biosikkerhet kabinett. I tilfelle av utilsiktet perkutan eksponering for menneskelig malaria, rapportere til helse og sikkerhet for profylaktisk behandling. Ytterligere sikkerhets vurdering bør også være på plass for å jobbe med HIV (+) blod. Bruk en tilbake stengetid labfrakk. Double hanske (øverst hansken bør latex). Utføre all håndtering i et nivå 2 biosikkerhet kabinett. Ikke bruk glass eller skarpe gjenstander. Ikke bruk aspirator. Legg alle forurensede elementer i virox løsning eller blekemiddel i minst en time før du kasserer.Vask alle flater med virox og UV for en time etter bruk. Merk at hver institusjon vil ha sine egne spesifikke biosikkerhet regler som må følges. Rapportere alle utilsiktede eksponeringer mot HIV-infisert blod til helse og sikkerhet for evaluering og vurdering av mulige profylakse etter eksponering.
Merk: Ulike stammer av P. falciparum malaria parasitter finnes. ITG ble anvendt for disse forsøk, men forskjellige stammer kan anvendes. Gode instruksjoner om frysing og tining Plasmodium falciparum parasitter er tilgjengelig på MR4 nettstedet 13.
1. Å gjøre RPMI-A for malariaparasitten Culture
- Gjør RPMI-0 ved å blande 950 ml av DDH 2 O, en pakke av RPMI-1640-pulver, 6 g HEPES, 2 g natriumhydrogenkarbonat, og 1,35 mg hypoxantin.
- Tine varmeinaktivert humant serum fra to forskjellige givere. AB givere er best, men en hvilken som helst kan brukes hvis parasitter blir dyrket i O-røde blodceller (RBC). Invertere rør for å blande. Hvis serum inneholder partikler eller er tykk spinn ved 2000 rpm og deretter filtrere flytende delen ved hjelp av en 0,45 mikrometer filter enhet.
- Ved hjelp av en 0,2 pm filter-enhet filter 180 ml RPMI-0, 20 ml humant serum (10 ml fra hver donor), og 0,5 ml av 10 mg / ml gentamycin.
Merk: Humant serum kan tette til filteret slik at mer enn én filterenhet, kan være nødvendig. - Merke medium flaske med RPMI-A, dato, og kilden til serum. Kjøle inntil nødvendig. RPMI-A kan slå skyet når nedkjølt. Dette er normalt, men økende skydekke er et tegn på forurensning.
Merk: Parasite vekst kan variere i ulike donor serum. Det er en god idé å teste alle humane serum batcher for god parasitt vekst før bruk.
2. Å Menneskelig røde blodlegemer for Parasite Culture
Merk: Blodgivere skal være type O.
- Samle 7-10 ml blod inn i syre-citrente-dextrose (ACD) rør. Skriv donor-ID og innsamlingsdatoen på etiketten.
- Oppbevares blod ved 4 o C inntil nødvendig. Bruk blod for parasitten kulturer innen 1 måned.
- Tørk av toppen av røret med 70% etanol. Fjern forsiktig propp og kast. Overføre blod inn i en 15 ml tube. Spinn i 3 minutter ved 1000 x g. Fjern plasma ved aspirasjon.
- Suspen RBC med likt volum varm RPMI-0. Spin i 5 min ved 1000 x g. Fjern fibrinlagområdet ved aspirasjon, resuspender i 5 ml RPMI-0 og gjenta vaske 2 flere ganger.
- Fjern supernatanten og tilsett tilstrekkelig RPMI-A for å fremstille en blanding som er 50% RBC etter volum.
- Oppbevar ved 4 o C inntil nødvendig.
3. Opprettholde Parasitt kulturer
- Pre-varm RPMI-A til 37 o C.
- Plasser tinte parasitter (se MR4 protokoll for tining prosedyre) i en T25-kolbe med 5 ml RPMI-A og 75 pl av humane vaskede RBC for en hematokritt på ~ 3%.Merk: Hematokrit måler volumet av RBC i forhold til totalt volum. For å beregne hematokrit måle volumet av pakkede RBC til det totale volum av medium pluss RBC. Anta at de tinte parasitter vil bidra 75 ul av RBC. Ved å tilsette 150 ul av RBC lager (som er ekvivalent med tilsetning av 75 ul av sammenpakket RBC) til kolben er det totalt 150 pl av RBC i 5 ml medium, noe som tilsvarer til en hematokrit på 3% (150 ul / 5000 ul x 100% = 3%).
- Gass i kolben i 30 sek med parasitt gassblandingen (1% O 2, 3% CO2, balanse N2). Forsegl og plassere kolben bredsiden ned i en 37 ° C inkubator som for å tillate størst areal for gassutveksling.
- For å endre medium og sjekk for parasitemia (må gjøres daglig), forsiktig bevege kolben som å ikke forstyrre RBC lag. Ved hjelp av en steril Pasteur-pipette koblet trekke av kulturmediet uten å forstyrre blodlaget.
- For å sjekke parasitemia, fjerne en 10 mL prøve fra blodet lag, legg det på en glassplate og bruke en annen glass lysbilde create et tynt blod film. Tillat lysbilde tørke.
- Plasser 4 ml friskt RPMI-A i kolben, forsiktig blanding, gass i 30 sekunder, og plasser i inkubator ved 37 ° C.
- Flekk lysbildet bruker Hema3 farging kit i henhold til produsentens protokoll.
- For optimal farging, glir dip i fikseringsoppløsningen i 10 sek, løsning I i 10 sek, og oppløsningen II i 30 sek. Skyll i vann og la lysbilder til tørk.
- Beregn parasitemia ved å telle antall PfRBC (farget mørk purpur) mot det totale antall RBC (farget rosa). Teller totalt 300 celler for å sikre nøyaktighet.
- Når parasitter har nådd en parasitemia på 5%, utvides kulturen til en T75-kolbe, ved hjelp av 40 ml RPMI-A, og 500 ul av RBC.
4. Parasite Synkronisering
Merk: Dagen før than eksperimentere, synkron parasitten kultur ved å behandle med alanin. Bare ring scene parasitter og infisert RBC vil overleve denne behandlingen. Alanin synkroniseringen vil gi en ren kultur trophozoite neste dag som kan brukes i eksperimentene ko-kultur. Sørg for å starte med en parasitt kultur som inneholder et flertall av ring scenen parasitter.
- Forbered alanin løsning ved å blande 8,01 g av alanin (300 mM) og 0,365 g av Tris (10 mM) i 300 ml DDH 2 O. Bringe pH til 7,4. Filter sterilisere ved hjelp av en 0,2 mikrometer filter enhet.
- Pre-varm alanine løsning til 37 o C.
- Spinne ned parasitten kultur (5 min x 1000 x g), og fjern medium.
- Resuspender pellet i 19 volumer av alanin-løsning (1 ml sammenpakket RBC til 19 ml oppløsning alanin). Inkuber i 15 min ved RT.
- Spin 5 min x 1000 x g. Aspirer supernatant. Vask i RPMI-0 en gang. Aspirer supernatanten og resuspender i RPMI-A og justere hematokritt til ~ 3%. Gsom kolbe og tilbake til 37 o C.
Merk: For co-kultur eksperimenter minimum parasitemia av 5% trophozoites er nødvendig, med 10% parasitemia anses optimal.
5. Parasite og RBC Forberedelse for Co-kultur Eksperimenter
- Bruker et forhold på 3 PfRBC pr PBMC i ko-kultur eksperimenter for å indusere en inflammatorisk respons. For å beregne total PfRBC, kvantifisere parasitemia ved å lage en tynn blodutstryk som beskrevet i 3.5, og hematokrit ved å telle antall RBC pr ml kultur ved hjelp av en parasitt hemocytometer.
Antall PfRBC =% parasitemia x totale RBC / ml x ml kultur. For eksempel: 10 ml av kulturen ved 10 x 10 6 RBC / ml og 10% parasittemi er lik 0,1 x 10 6 / ml x 10 ml = 10 x 10 6 PfRBC. - Spin parasitten kultur i 5 min ved 1000 xg (RT). Aspirer medium, og resuspender på 6 x 10 6 PfRBC pr ml i RPMI-S + (500 ml RPMI-1640 supplert med L-glutamin og HEPES, 10% varmeinaktivert FBS, 1,5 ml gentamicin, 5 ml 100 mM natriumpyruvat, 5 ml av 10 mM MEM ikke-essensielle aminosyrer, 5 ml 5 mM β-merkaptoetanol).
- Ta kontroll blod (uinfisert RBC fra den samme donor som brukes for opprettholdelse av parasitten kultur), beregne hematokritt og resuspendert i RPMI-S + i samme antall RBC per ml som parasitten kulturen.
6. Isolering av human perifere mononukleære blodceller (PBMC)
- Samle venøs blod i natrium heparin rør (grønn topp) fra både en kronisk HIV (+) donor og en HIV (-) kontroll. Bruk ikke EDTA som en antikoagulerende som EDTA kalsium gelaterende handling påvirker cellefunksjonen. I gjennomsnitt forventer mellom 5-10 x 10 6 PBMC per 10 ml blod. For et typisk forsøk samler 30 ml blod fra hver donor. Det blodvolumet som må bli justert i henhold til de eksperimentelle krav.
- Så raskt som mulig, og definitivt innen en time av blod som blir samlet inn,fjerne blod fra rørene og plass i en plast 50 ml tube. Monocytter i særdeleshet vil bli aktivert og holde seg til glass, så det er viktig at hvis glass blodoppsamlingsrør brukes cellene fjernes så raskt som mulig.
- Spin blodet ved 1000 xg i 15 min, og samle plasma (dette kan brukes for andre undersøkelser hvis nødvendig - hvis ikke dette trinnet kan bli utelatt). Fortynn blodet i like stort volum kaldt DPBS.
- Plasser 15 ml RT Ficoll i et 50 ml rør. Langsomt, ved hjelp av en steril pipette overføring av plast, lag blod / DPBS oppløsning over Ficoll uten blanding. Maksimalt 25 ml blod / DPBS oppløsning kan legges lagvis over hverandre 15 ml Ficoll.
- Spinn gradienter i 30 min ved RT på 600 x g. Forsikre deg om at "ingen brems" innstillingen er på.
- Når cellene er spunnet, se for grenseflaten mellom de to fasene. Dette er hvor PBMC-er. Ved hjelp av en steril plast overføringspipetten samle PBMC fra grensesnittet (seFigur 1). Minimer forurensning av RBC.
- Plasser oppsamlede celler i 50 ml rør, med ikke mer enn 20 ml per rør. Top tube opp til 50 ml med sterile kalde DPBS.
- Spinn-celler i 10 minutter ved 4 ° C ved 300 x g.
- Kast supernatant, resuspender pellet i 5 ml sterile kalde DPBS og basseng alle celler fra samme donor inn i en tube. Topp opp til 50 ml med sterile DPBS, og gjenta vaske trinn 2 flere ganger.
- Resuspender cellene i 10 ml RPMI-medium + S.
- Fjerne en 20 ul alikvot og bland med 20 ul av trypanblått. Pipetter 10 mL i en hemocytometer og telle levende celler (celler som ikke har tatt opp den blå fargestoff - alle blå cellene er døde). Bruke et hemocytometer for å beregne celletallet i en løsning som følger.
Merk: En hemocytometer har et rutenett av spesifiserte dimensjoner, slik at området som dekkes av linjene er kjent.- Kontroller at hemocytometer er ren. Plasser dekkglass over counting området. Belastning 10 ul celleløsning ved å plassere pipettespissen inn i en av de V-formede brønner. Arealet under dekk vil fylles ved kapillarvirkning.
- Plasser lastet hemocytometer under et mikroskop. Den fulle rutenett av hemocytometer inneholder 9 ruter på 1 mm 2 hver. Telle alle cellene i hver store plassen. Hvis for mange celler er til stede, fortynne løsningen videre og opptelling.
- Beregn cellekonsentrasjon som følger: Totalt antall celler / ml = (totale celler tellet / # av firkanter) x fortynningsfaktor x 10.000 celler / ml, for eksempel, (500 celler / 5 kvadrater) x fortynningsfaktor av 20 x 10.000 celler / ml = 20 x 10 6 celler totalt.
- Juster medium til en sluttkonsentrasjon på 10 x 10 6 per ml (RPMI-medium + S).
7. Malaria / HIV Samtidig infeksjon Culture
- Plate 100 pl isolerte PBMC og 400 ul av RPMI-S + medium til en 24-brønns plate (1 x 10 6 PBMC per brønn). Sikreat brønnene er satt opp i tre eksemplarer: 3 brønner for infisert RBC, 3 brønner med PfRBC, 3 brønner med medium, og 3 brønner med PMA / Ionomycin. Dette er både for HIV (+) og HIV (-) prøve.
- For PfRBC brønner, plasserer 3 x 10 6 PfRBC i hver av brønnene (500 ul av parasitt kultur fremstilt i 5,2).
- For uinfiserte RBC brønner, å plassere 500 pl av uinfiserte RBC kulturen fremstilt på 5,3 i hver av brønnene.
- For middels brønner, å plassere 500 pl av RPMI-medium + S i hver av brønnene.
- For PMA / Ionomycin brønner, forberede PMA / Ionomycin løsning (2,5 pg / ml, 250 pg / ml). Plasser 500 ul av denne løsning i hver brønn.
Merk: Som potente stimulatorer av T-celle-cytokin sekresjon, PMA og Ionomycin blir brukt som en positiv kontroll for å sikre at cellene er funksjonelle. - Sett platen ved 37 o C i en 5% CO 2 inkubator.
- Valgfritt: Bruk overflødige celler for fenotypeanalyser ved hjelp av flowcytometri eller lagre i en RNEn stabilisering løsning for fremtiden mRNA uttrykk analyse.
8. Påvisning av Malaria immunrespons
Merk: Utfør co-kultur eksperimenter så lenge som fire dager. Ingen medium endring er nødvendig i løpet av denne tiden. Den optimale tidspunkt vil avhenge av celletype av interesse, og spørsmålet stilt. Inkubasjon i 12-48 timer er optimalt for monocyttiske svar på PfRBCs, mens lymfocyttresponser ble best observert på 72-96 timer. De tidspunkter må optimaliseres basert på eksperimentelle spørsmålet. Kortere tidsrom (2-4 time) kan anvendes om interaksjonen mellom intakt PfRBC og PBMC-er av interesse.
- Spin plate ved 300 xg i 3 minutter for å pelletere cellene. Samle 700 ul kultursupernatant fra hver brønn.
- Spin supernatanten ved 1000 xg i 5 min til klar av eventuelle rester.
- Aliquot fjernet supernatanten etter behov, etikett, og fryse ved under -20 ° C inntil analyse av utskilt faktorer er å være perfoRMED.
- Analyser cytokin / chemokin responser ved ELISA eller ved perle array (følg produsentens foreslåtte protokoller).
- Samle celler som er igjen i platen inn i en RNA-stabiliserende oppløsning, og anvende mRNA-ekspresjon ved hjelp av kvantitativ analyse for real-time PCR 14-16.
9. Intracellulær flowcytometrisystemer for Cell-spesifikke Ccytokine Responses Bruke PBMC Co-dyrket med P. falciparum Infected RBC
Merk: Som nevnt ovenfor lengden av ko-kultur vil avhenge av celletype av interesse. Hvis interessert i monocyttiske svar på PfRBC en kortere inkubasjonstid er nødvendig. Ganger blir lengre for medfødte lymfocyttresponser γδ T-celler, NK-celler, NKT celler), og lengre fortsatt for CD4 og CD8 T-celler. Optimalisering vil være nødvendig.
- 6-8 timer før analyse tilsett 1 pl av 1,000x Brefeldin A til alle brønnene. Returnere platen til 37 o C inkubator. Etter 6-8 timers incubasjon, sted plate på is i 15 min.
- Fjerne celler fra brønnene ved hjelp av kraftig pipettering og plassere dem i merkede microcentifuge rør. Skraping kan være nødvendig å fjerne monocytter.
- Spinn-celler i 5 min ved 1000 x g. Fjern Supernatantene. Resuspender celler i 500 ul flowcytometri buffer (1x DPBS, 2% varmeinaktivert FBS, 0,02% natriumazid).
- Fordel cellene opp slik at hver prøve har: en tube for hel antistoff-farging (240 ul), og en slange for fluorescerende minus en (FMO) kontrollantistoff farging (240 ul). Basseng en liten mengde av hver prøve (20 ul) for de ufargede flowcytometri kontroll (dette vil bli brukt til å sette opp flowcytometer).
- Spinn-celler i 5 min ved 500 x g. Fjern Supernatantene.
- Inkuber cellene med ikke-konjugert anti-human CD16 / CD32 (5 ug / ml) i 50 ul flowcytometri-buffer i 15 minutter ved 4 ° C for å blokkere Fc-reseptorer.
- Tilsett 1 ml av flowcytometri buffer til hvert rør. Spin cells i 5 min ved 500 x g. Fjern Supernatantene.
- Resuspender celler i 50 pl av flowcytometri buffer med en på forhånd titrert konsentrasjon av fluoroforen-konjugerte antistoffer til ønsket celleoverflatemarkører. Forblanding nok antistoff-løsning for alle prøver å være farget. Inkuber cellene ved 4 ° C i 20 min. Beskytt mot light.Note: Mengde hvert antistoff må optimaliseres. Vi rutinemessig beis for CD56, CD3, γδ, CD4, CD8, CD14. Titrerte volumer for disse antistoffene er vist i tabell 1.
- Tilsett 1 ml av flowcytometri buffer til hvert rør. Spinn-celler i 5 min ved 500 x g. Fjern Supernatantene.
- Tilsett 100 ul av cytofix / cytoperm løsning til hvert rør. Inkuber cellene i 20 minutter ved 4 o C. Beskytt mot lys.
- Tilsett 1 ml perm / vaskebuffer (gitt som 10x konsentrat - fortynne til 1x hjelp DDH 2 O) til hvert rør. Spinn-celler i 5 min ved 500 x g. Fjern Supernatantene.
- Tilsett 100 μl perm / vask buffer til FMO kontroll antistoffarging rør og bland til resuspender celler.
- Tilsett 100 ul av perm / vaskebuffer med en på forhånd titrert konsentrasjon av fluoroforen-konjugerte antistoffer til ønsket intracellulære markører (dvs. cytokiner / kjemokiner) til komp antistoffarging rør.
Note: Mengde hvert antistoff vil måtte bli optimalisert. Vi rutinemessig flekken med anti-TNF og anti-IFNy antistoffer. Titrerte volumer for disse antistoffene er vist i tabell 1. - Inkuber alle rør i 30 minutter ved 4 o C. Beskytt mot lys.
- Tilsett 1 ml Perm / vaskebuffer til hvert rør. Spinn-celler i 5 min ved 500 x g. Fjern Supernatantene.
- Resuspender celler i 300 mL flowcytometri buffer med 1% paraformaldehyde. La sitte i minimum 15 min for å nøytralisere HIV.
- Forbered enkelt antistoff farget prøver ved hjelp av kompensasjons perler, som skal brukes for erstatning er satt opp på strømningscytometer. Den type kompensasjonperler vil avhenge av de antistoffer som brukes (f.eks., anti-mus-Ig, anti-rotte / hamster lg). Vortex perler. Tilsett en dråpe perler per antistoff. Legg like mengder av antistoff som anvendes for farging. Tilsett 200 ul av flowcytometri buffer. Disse er nå klar til bruk. Det er ikke nødvendig å vaske perlene.
- Erverve prøvene på en strømningscytometer så snart som mulig og innen 24 timer for best resultat. Tandem fargestoffer er utsatt for dissosiasjon med lagringsplass så anbefaler vi umiddelbar oppkjøpet hvis mulig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Grafene viser nivåer av IFNy-produksjon fra NKT-celler (figur 2), ved hjelp av CD56 + CD3 + γδ- porter for å oppnå den NKT-celler populasjon (data ikke vist). Cellene ble dyrket i 72 timer før farging. Når farget, 100.000 CD3 + celler ble kjøpt på flowcytometeret for å få store nok populasjoner av NK, NKT og γδ celler (celler av interesse). Et minimum på 5600 NKT-celler er vist på hver graf. TNF-produksjon er oppnådd på samme måte (data ikke vist). Grafene viser tydelig at IFNy produksjonen er lavere i celler fra HIV (+) personer sammenlignet med HIV (-) individer utsatt for PfRBC.
Flowcytometri analyse er svært subjektiv. Det er derfor viktig å ha alle de nødvendige kontroller for hvert forsøk (se figur 2). Bakgrunnsnivåene er beregnet ved hjelp av FMO prøvene, noe som gir et sant bilde av cytokin farging.Celler stimulert med PMA / Ionomycin ble anvendt som en positiv kontroll (data ikke vist). PMA og Ionomycin er sterke stimulatorer av T-celle cytokinproduksjon. Mangel på IFNy-produksjon i disse prøvene ville mest sannsynlig indikerer et problem med fargings protokollen. Imidlertid kan andre variabler som for eksempel celle levedyktighet eller inaktive reagenser også være feil.
Figur 1. Visning av Ficoll-gradient sentrifugering etter viser posisjonen av PBMC.
Figur 2. IFN γ produksjon av Natural Killer T-celler. Flytskjemaer ble oppnådd ved gating på CD56 + CD3 + γδ- celler (minimum 5.600 hendelser). IFNy-produksjon er detekterbar i HIV (-) prøve stimulert medP. falciparum infiserte røde blodceller. Dette cytokinrespons er ikke lenger synlig i sammenheng med en kronisk HIV-infeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår protokoll har blitt optimalisert for å mest mulig realistisk studere HIV-malaria-infeksjon in vitro. Først blir friske humane RBC-er og serum som kreves for malariaparasitten kultur. Dette er viktig for å oppnå en sunn befolkning på malariaparasitter. Parasitt lysatene kan ikke erstattes av levende parasitter som cytokinproduksjon er mye raskere og mer intens når du bruker levende P. falciparum smittet RBC (PfRBC) 17,18. I tillegg, aktivering av celletyper som NK-celler, krever hele PfRBCs, og virker ikke effektivt med parasitt lysater. Dette kan være på grunn av behovet for direkte kontakt mellom PfRBC og leukocytter, eller kan være på grunn av den ustabile natur av parasitt-avledede ligander som vekselvirker med reseptorer på celleoverflaten 18. Malaria PfRBC kulturer må også være godt synkronisert (protokoll 4) forut for eksperimentet. Synkroniserte PfRBCs forbedre reproduserbarheten av de eksperimentelle data. Selv om denne protokollen deskriftlærde bruk av trophozoite scenen PfRBC for co-kultur, kan det lett bli endret for studiet av ringen scenen PfRBC.
Humane leukocytter kan være kunstig smittet med hiv, og denne metoden har vært brukt i studier av malaria-HIV-infeksjon forskning 20. Men dette betyr ikke modell immun dysregulation at resultatene fra kronisk HIV-infeksjon. I denne ko-kultursystem bruker vi PBMC isolert fra humane deltakere som er kronisk infisert med HIV-1. Når deltakerne er nødvendig for en studie, er det viktig å velge nøye denne populasjonen. Inklusjons- og eksklusjonskriterier er avgjørende for å sikre minimum variabilitet og maksimal reproduserbarhet. Våre kriterier inkluderte en klar definisjon av kronisk HIV-infeksjon (HIV-smittet for> ett år, med CD4 + T-celletall nedgang på> 50 celler / mm 3 / år) og utelukkelse av alle med en samtidig infeksjon. Dette sikret at de oppnådde resultater kunne tilskrives såLELY til effekten av kronisk HIV-infeksjon, og ikke en infeksjon. I tillegg, siden vi var interessert i medfødte immunresponser mot malaria vi ekskludert givere som hadde forrige malaria-smitte.
HIV-ikke-infiserte kontroller blir også brukt for hver HIV (+) donor, ved hvert prøvetakingstidspunkt punkt, for å tillate data normalisering. Bør gjøres et forsøk på å matche kontrollene til sine respektive HIV (+) donor i minst alder, men helst også sex (selv i vår forrige undersøkelse 12 vi ikke observere en betydelig forskjell i celle undergrupper eller cytokin respons mellom kvinnelig og mannlig HIV uinfiserte deltakere). Hvis potensielle prøvetaking er planlagt å opprettholde den samme HIV-infisert kontroll for hver prøvetaking tidspunkt er gunstig. Responser kan variere fra eksperiment til eksperiment på grunn av flere faktorer, inkludert helsen til PfRBCs, deres grad av synkronisering, parasittemi nivå og fasen av modenhet PfRBCs, og hematokrit nivå. Caremå tas for å beholde så mange av disse konsekvent mellom eksperimenter. Normalisering til en HIV-infisert kontroll åpner for noen regnskap for disse variablene.
Bruker friske celler er viktig å unngå kunstige resultater. Frysing og tining prøver kan ha en betydelig innvirkning på celleviabilitet 21,22, markører cytokinproduksjon 23-26 og celleoverflaten fenotypiske 27.
Dersom monocytter er av særlig interesse, er det viktig at glasset ikke brukes under protokollen. Monocytter holde glass og mange andre plast 28. Vi bruker polypropylen plastpipetter, overføre pipetter, og rør hele for å minimere monocytt- etterlevelse og ultimate fjerning fra våre studiecellepopulasjoner.
Når du setter opp flowcytometri analysen, kan brukes hvilken som helst kombinasjon av antistoffer avhengig av cellene av interesse. Vi var spesielt interessert i IFNy og TNF-produksjonfra NK-celler, NKT-celler og T-celler γδ. Dette definert vår antistoff panel. Bruker man derimot en annen kombinasjon, er det viktig å optimalisere mengdene av antistoff for hvert panel. Dette er viktig for å unngå feilaktige data. Også for å unngå variasjon og sikre gyldighet, er FMOs pålagt å vurdere bakgrunns cytokinnivåer for hver tilstand (RBC, PfRBC, medium, og PMA / Ionomycin) og deltaker befolkningen (HIV (-) og HIV (+), figur 2). Måling av in vitro intracellulær cytokinproduksjon vanligvis resulterer i høye bakgrunnsnivåer, spesielt når cellene er blitt dyrket før farging. Siden dyrkingsbetingelsene påvirke bakgrunnsnivå, passende FMOs sikre kjennskap til bakgrunnsnivået for hver prøve. Våre leveranser av celler var begrenset, derfor har vi laget våre FMOs å inneholde alle overflaten flekker, men ingen intracellulære flekker. Dette gjør det mulig for den spesifikke sammenligning av cytokin bakgrunnsnivå for alle de forskjellige celletypene som ble studert.Vi løp også en enkelt flekk for hvert forsøk for hvert av de overflatemarkører for å bekrefte deres bakgrunnsnivåer.
Protokollen er beskrevet er en allsidig en, som kan brukes til å undersøke responser i løpet av timer eller dager avhengig av celler av interesse. For optimal PfRBC-indusert cytokin produksjon fra medfødte lymfocytter, målte vi flowcytometri utgang etter 2 eller 3 dager. Når du ser på monocytter, er tidligere tidspunkter (1 eller 2 dager) anbefales. Dette systemet gjør det mulig for flere celletyper og celle responser å bli preget av flowcytometri, sekretoriske svar å bli målt i cellesupernatanter og uttrykkssjabloner profiler som skal vurderes i ekstrahert RNA. Videre, bruk av antistoffer som blokkerer spesifikke reseptorer eller nøytralisere cytokiner kan benyttes i dette systemet for ytterligere å dissekere mekanismer. Vi har med hell brukt IL-18 reseptorblokkade å implisere IL-18 reseptor i PfRBC-indusert IFNy svar 12. Dette systemet representerer en realistic metode for å bedømme en rekke medfødte immunresponser mot malaria i sammenheng med HIV-infeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alanine | Sigma | A7377 | |
| antibodies (see other table) | |||
| BD Cytofix/Cytoperm with BD GolgiPlug | BD | 555028 | includes brefeldin A, cytofix/cytoperm buffer and perm/wash buffer |
| BD Vacutainer ACD Solution A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer Sodium Heparin | BD | 17-1440-02 | |
| DPBS (no calcium, no magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | heat inactivate before use |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| gentamycin (10 mg/ml) | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 Staining Set | Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| Ionomycin | Sigma | I3909 | |
| MEM non-essential amino acids (10 mM) | Gibco | 11140 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| RPMI-1640 powder | Life-Technologies | 31800-022 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine and HEPES | Thermo Scientific | SH30255.01 | |
| sodium bicarbonate (powder, cell culture) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360 | |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T6066 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| Trypan Blue (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843, 552845 | depends on antibodies used |
| Parasite Gas Mixture | By special order | 3% CO2, 1% O2, balance N2 | |
| Equipment | |||
| 0.2 μm filter unit | |||
| Glass slides | |||
| T25 flasks | |||
| T75 flasks | |||
| 50 ml tubes | |||
| 24 well culture plates | |||
| unplugged Pasteur pipettes | |||
| plugged Pasteur pipettes | |||
| sterile transfer pipettes | |||
| hemocytometer | |||
| flow cytometer (3 laser) | |||
| Antibodies used for flow cytometry | |||
| Anti-TNF | eBiosciences | 551487 | FITC (fluorophore) 2 μl |
| Anti-IFNγ | Biolegend | 506507 | PE (fluorophore) 20 μl |
| Anti-CD8 | Biolegend | 300914 | PE-Cy7 (fluorophore) 1 μl |
| Anti-CD14 | Biolegend; BD Biosciences | 325624; 551487 | Biotin (fluorophore) 0.5 μl Streptavin PE-TR (fluorophore) 0.1 μl |
| Anti-CD56 | Biolegend | 318322 | PerCP/Cy5.5 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-γδ | Biolegend | 331212 | APC (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD3 | Biolegend | 300426 | APC-Cy7 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD4 | Biolegend | 317424 | Pacific Blue (fluorophore) 1 μl |
References
- Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large. Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).
- French, N., et al. Increasing rates of malarial fever with deteriorating immune status in HIV-1-infected Ugandan adults. AIDS (London, England). 15 (7), 899-906 (2001).
- Hoffman, I. F., et al. The effect of Plasmodium falciparum malaria on HIV-1 RNA blood plasma concentration. AIDS (London, England). 13 (4), 487-494 (1999).
- Kamya, M. R., et al. Effect of HIV-1 infection on antimalarial treatment outcomes in Uganda: a population-based study. The Journal of infectious diseases. 193 (1), 9-15 (2006).
- Kublin, J. G., et al. Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study. Lancet. 365 (9455), 233-240 (2005).
- Mermin, J., et al. Effect of co-trimoxazole prophylaxis, antiretroviral therapy, and insecticide-treated bednets on the frequency of malaria in HIV-1-infected adults in Uganda: a prospective cohort study. Lancet. 367 (9518), 1256-1261 (2006).
- Patnaik, P., et al. Effects of HIV-1 serostatus, HIV-1 RNA concentration, and CD4 cell count on the incidence of malaria infection in a cohort of adults in rural Malawi. The Journal of infectious diseases. 192 (6), 984-991 (2005).
- Whitworth, J., et al. Effect of HIV-1 and increasing immunosuppression on malaria parasitaemia and clinical episodes in adults in rural Uganda: a cohort study. Lancet. 356 (9235), 1051-1056 (2000).
- Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha. The Journal of infectious diseases. 177 (2), 437-445 (1998).
- Francesconi, P., et al. HIV, malaria parasites, and acute febrile episodes in Ugandan adults: a case-control study. AIDS (London, England). 15 (18), 2445-2450 (2001).
- Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates Tim-3 expression on innate cells: combination antiretroviral therapy results in partial restoration. Journal of acquired immune deficiency syndromes. 63 (2), 161-167 (2013).
- Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates innate immunity to malaria despite combination antiretroviral therapy. AIDS (London, England). 27 (3), 325-335 (2013).
- Ljungstrom, I., et al. Methods in Malaria Research. , 4th edition, MR4/ATCC. Available from: http://www.mr4.org/Publications/MethodsinMalariaResearch.aspx (2013).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Universal SYBR green quantitative PCR protocol [Internet]. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html (2014).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-DDCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Hensmann, M., Kwiatkowski, D. Cellular basis of early cytokine response to Plasmodium falciparum. Infection and immunity. 69 (4), 2364-2371 (2001).
- Artavanis-Tsakonas, K., Riley, E. M. Innate immune response to malaria: rapid induction of IFN-gamma from human NK cells by live Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. J Immunol. 169 (6), 2956-2963 (2002).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. The Journal of parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
- Ludlow, L. E., et al. HIV-1 inhibits phagocytosis and inflammatory cytokine responses of human monocyte-derived macrophages to P. falciparum infected erythrocytes. PloS one. 7 (2), e32102 (2012).
- Weinberg, A., et al. Viability and functional activity of cryopreserved mononuclear cells. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (4), 714-716 (2000).
- Fowke, K. R., Behnke, J., Hanson, C., Shea, K., Cosentino, L. M. Apoptosis: a method for evaluating the cryopreservation of whole blood and peripheral blood mononuclear cells. Journal of immunological. 244 (1-2), 139-144 (2000).
- Jeurink, P. V., Vissers, Y. M., Rappard, B., Savelkoul, H. F. J. T cell responses in fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells: kinetics of cell viability, cellular subsets, proliferation, and cytokine production. Cryobiology. 57 (2), 91-103 (2008).
- Kvarnström, M., Jenmalm, M. C., Ekerfelt, C. Effect of cryopreservation on expression of Th1 and Th2 cytokines in blood mononuclear cells from patients with different cytokine profiles, analysed with three common assays: an overall decrease of interleukin-4. Cryobiology. 49 (2), 157-168 (2004).
- Venkataraman, M. Effects of cryopreservation of immune responses. XI. Heightened secretion of tumor necrosis factor-alpha by frozen human peripheral blood mononuclear cells. Cryobiology. 34 (3), 276-283 (1997).
- Venkataraman, M. Effects of cryopreservation on immune responses. X. Decrease in interleukin-12 production by frozen human peripheral blood mononuclear cells is mediated by the endogenously hypersecreted interleukin-10. Cryobiology. 33 (5), 581-588 (1996).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (3), 352-359 (2000).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. Journal of leukocyte biology. 56 (3), 236-240 (1994).
