Introduction
Co-infecção, a infecção com múltiplas infecções simultâneas, é a norma em ambientes naturais. A co-infecção pode ter um impacto importante na patologia da doença e na gestão clínica de cada infecção. No contexto da co-infecção, vacina e a eficácia do fármaco, bem como os testes de diagnóstico, podem ser influenciadas negativamente (revisto em 1). No entanto, apesar da sua importância, a maioria das pesquisas patógeno considera infecções única individuais.
Malária e HIV-1 (HIV) são as principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Áreas de malária e HIV endemicidade compartilhar uma ampla sobreposição geográfica, colocando milhões de pessoas em risco de co-infecção e, conseqüentemente, em risco de doença clínica mais grave 2-10. As duas doenças interagir negativamente. Em indivíduos infectados pelo HIV, a carga viral mais elevados e diminuições temporárias em + contagem de células T CD4 pode ser visto durante uma infecção por malária, enquantoencargos parasita da malária e risco de malária clínica e grave são mais elevados em indivíduos co-infectados 2,3,5,7,8,10. Os mecanismos pelos quais o HIV aumenta a gravidade da malária não são totalmente compreendidas e garante uma investigação mais aprofundada.
Aqui, descrevemos um método pelo qual a malária e a co-infecção com HIV pode ser estudado in vitro. Mais especificamente, este método permite a análise das respostas imunes específicas para a malária no contexto da infecção pelo HIV. Nosso protocolo descreve um sistema versátil de co-cultura utilizando células mononucleares do sangue periférico isoladas recentemente (PBMC) isoladas a partir de dadores cronicamente infectadas pelo VIH e cultivados in vitro P. falciparum parasitados eritrócitos (PfRBC). O impacto da terapia anti-retroviral HIV sobre estas respostas também podem ser examinados usando PBMCs prospectivamente coletados de VIH (+) doadores pré e pós-tratamento.
Temos utilizado este sistema para investigar o impacto da infecção pelo HIVna resposta imune inata específicas para a malária 11,12, e foram capazes de determinar que IFN-y e TNF respostas específicas para a malária são prejudicados nas células NK, células NKT, γδ células T de HIV (+) doadores pré e pós-terapia anti-retroviral HIV . Além disso, fomos capazes de utilizar este sistema para determinar que funções monoc�icas também são prejudicados em HIV (+) doadores, mas recuperar pós-HIV terapia anti-retroviral.
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Protocol
Este protocolo requer o recrutamento de dadores de soro e eritrócitos a ser utilizados para a cultura de parasita, e doadores de HIV (+) e não infectadas para o isolamento de PBMC. Conselhos de Revisão Institucional deve aprovar todos os estudos e todos os doadores devem dar seu consentimento informado antes da coleta de sangue.
CUIDADO: Trabalhando com amostras de sangue humano e parasitas da malária humana requer medidas cautelares. Use sempre uma bata de laboratório, luvas, e trabalhar em um nível 2 gabinete de Biossegurança. Em caso de exposição percutânea acidental a malária humana, denunciar a Saúde e Segurança para o tratamento profilático. Consideração adicionais de segurança também deve ser colocado em prática para trabalhar com HIV no sangue (+). Usar um jaleco fechamento de volta. Luva Duplo (top luva deve ser de látex). Execute todos tratando de nível 2 gabinete de Biossegurança. Não use nenhum vidro ou objetos pontiagudos. Não use aspirador. Coloque todos os itens contaminados em solução Virox ou água sanitária para um mínimo de 1 hora antes de deitar fora.Lave todas as superfícies com Virox e UV durante 1 hora após o uso. Note-se que cada instituição terão suas próprias normas de biossegurança específicas que precisam ser seguidas. Denunciar todas as exposições acidentais a sangue infectado pelo HIV para saúde e segurança para avaliação e análise de possíveis profilaxia pós-exposição.
Nota: Diferentes cepas de P. existem parasitas de malária falciparum. ITG foi utilizada para estas experiências, mas diferentes estirpes pode ser utilizada. Instruções excelentes no congelamento e descongelamento parasitas Plasmodium falciparum estão disponíveis no site do MR4 13.
1. Fazer RPMI-A para Parasita da malária Cultura
- Adicione RPMI-0 através da mistura de 950 ml de ddH2O, um pacote de pó de meio RPMI-1640, 6 g de HEPES, 2 g de bicarbonato de sódio, e 1,35 mg de hipoxantina.
- Descongelar calor inactivado soro humano de dois doadores diferentes. Dadores AB são melhor mas pode ser utilizado qualquer se parasitas são cultivadas em tipo óOs glóbulos vermelhos (RBC). Inverta os tubos para misturar. Se o soro contém partículas ou é giro grossa a 2.000 rpm e, em seguida, filtrar porção líquida usando uma unidade de filtro de 0,45 mm.
- Usando um filtro de 0,2 um aparelho de filtro 180 ml de meio RPMI-0, 20 ml de soro humano (10 ml de cada dador), e 0,5 ml de 10 mg / ml de gentamicina.
Nota: soro humano podem entupir o filtro, de modo mais do que uma unidade de filtro pode não ser necessária. - Rotular o frasco com o meio RPMI-A, a data, e a fonte de soro. Leve à geladeira até ser necessário. RPMI-A pode ficar turva quando refrigerado. Isso é normal, mas aumentando a nebulosidade é um sinal de contaminação.
Nota: o crescimento do parasita podem variar em diferentes soro dador. É uma boa idéia para testar todos os lotes de soro humano para o bom crescimento do parasita antes de usar.
2. Preparar as células vermelhas do sangue humano para Parasite Cultura
Nota: Os doadores de sangue devem ser do tipo O.
- Recolha 7-10 ml de sangue em ácido-cit(ACD) tubos de taxa de dextrose. Faça ID e data de colheita no rótulo do doador.
- Sangue armazenar a 4 ° C até serem necessárias. Use sangue para as culturas de parasitas dentro de 1 mês.
- Limpar o topo do tubo com etanol a 70%. Remova cuidadosamente rolha e descarte. Transferir sangue para um tubo de 15 ml. Rotação durante 3 min a 1000 x g. Remover o plasma por aspiração.
- Suspender RBC com igual volume de quente RPMI-0. Rotação durante 5 minutos a 1.000 x g. Remover o revestimento de Buffy por aspiração, ressuspender em 5 ml de meio RPMI-0 e repetir a lavagem mais 2 vezes.
- Remover o sobrenadante e adicionar suficiente RPMI-A para produzir uma mistura que é 50% em volume de RBC.
- Armazenar a 4 ° C até serem necessárias.
3. Manter a cultura dos parasitas
- Pré-quente RPMI-A a 37 o C.
- Coloque parasitas descongeladas (ver protocolo para o procedimento de descongelamento MR4) para um frasco T25 com 5 ml de meio RPMI-A e 75 ul de RBC lavados humano para um hematócrito de 3% ~.Nota: Hematócrito mede o volume de RBC em comparação com o volume total. Para calcular o hematócrito medir o volume de glóbulos vermelhos embalados e o volume total de meio de mais eritrócitos. Suponha que os parasitas descongelados contribuirá 75 ul de RBC. Pela adição de 150 ul de estoque de RBC (que é equivalente à adição de 75 ul de embalado RBC) para o balão tem um total de 150 pi de glóbulos vermelhos em 5 ml de meio, o que equivale a um hematócrito de 3% (150 ul / 5000 l x 100% = 3%).
- Gás do frasco durante 30 segundos com a mistura de gás parasita (1% O 2, 3% de CO 2, o balanço de N 2). Selar e colocar a garrafa de lado grande para baixo em 37 ° C uma incubadora para permitir a maior área de superfície para a troca de gás.
- Para alterar a forma e verificar se há parasitemia (precisa ser feito diariamente), mova cuidadosamente o frasco para não perturbar a camada de RBC. Usando uma pipeta Pasteur estéril unplugged desenhar fora do meio de cultura sem perturbar a camada de sangue.
- Para verificar parasitemia, retire uma amostra de 10 ul a partir da camada de sangue, coloque-o sobre uma lâmina de vidro e usando uma segunda lâmina de vidro criar um filme fino de sangue. Permitir slides para secar.
- Coloque 4 ml de RPMI fresco-A para o balão, misturar suavemente, gás durante 30 seg, e o lugar em incubadora a 37 ° C.
- Manchar o slide usando o kit de coloração Hema3 de acordo com o protocolo do fabricante.
- Para a coloração óptima, mergulho desliza na solução de fixação durante 10 seg, eu solução durante 10 seg, e solução II durante 30 seg. Enxágüe em água e deixar as lâminas secar.
- Calcule parasitemia através da contagem do número de PfRBC (manchado roxo escuro) versus o número total de RBC (rosa com detalhes). Contagem de um total de 300 células para assegurar a precisão.
- Quando os parasitas tenham atingido uma parasitémia de 5%, a expansão da cultura para um frasco T75, usando 40 ml de meio RPMI-A, e 500 uL de RBC.
4. Parasite Sincronização
Nota: No dia antes de tele experimentar, sincronizar a cultura parasita por tratamento com alanina. Somente parasitas estágio anel e não infectado RBC vai sobreviver a este tratamento. Sincronização Alanina lhe dará uma cultura pura trofozóito no dia seguinte que pode ser usado nas experiências de co-cultura. Certifique-se de começar com uma cultura parasita que contém a maioria dos parasitas estágio anel.
- Preparar a solução de alanina misturando 8,01 g de alanina (300 mM) e 0,365 g de Tris (10 mM) em 300 ml de ddH 2 O. Traga o pH a 7,4. Filtrar esterilizar utilizando uma unidade de filtro de 0,2 um.
- Alanina-solução quente para pré 37 o C.
- Girar a cultura parasita (5 min x 1.000 xg), e remova o meio.
- Ressuspender sedimento em 19 volumes de solução de alanina (1 ml RBC embalado para 19 ml de solução de alanina). Incubar durante 15 min à TA.
- Rotação 5 min x 1.000 x g. Aspirar o sobrenadante. Lavar em RPMI-0 uma vez. Aspirar o sobrenadante e ressuspender em meio RPMI-A e ajustar o hematócrito para ~ 3%. Gcomo balão e regresso a 37 o C.
Nota: Para as experiências de co-cultura é necessária uma parasitemia mínimo de 5% trophozoites, com 10% de parasitemia considerado ideal.
5. Parasite e RBC Preparação para Experimentos de co-cultura
- Usar uma proporção de 3 PfRBC por PBMC em experiências de co-cultura para induzir uma resposta inflamatória. Para calcular PfRBC total quantificar a parasitemia, fazendo um esfregaço de sangue fina, como descrito em 3.5, e o hematócrito através da contagem do número de glóbulos vermelhos por ml de cultura parasita usando um hemocitómetro.
Número de PfRBC =% de parasitemia de RBC x total / ml x ml de cultura. Por exemplo: 10 ml de cultura a 10 x 10 6 de RBC / ml e 10% de parasitemia é igual a 0,1 x 10 6 / ml x 10 ml = 10 x 10 6 PfRBC. - Girar a cultura parasita durante 5 min a 1000 xg (RT). Aspirar o meio, e ressuspender a 6 x 10 6 por ml em PfRBC RPMI-s + (500 ml de RPMI-1640 suplementado com L-glutamina e HEPES, 10% de calorFBS inactivado, 1,5 ml de gentamicina, 5 ml de 100 mM de piruvato de sódio, 5 mL de MEM 10 mM de aminoácidos não essenciais, 5 ml de 5 mM β-mercaptoetanol).
- Aqui sangue de controlo (RBC não infectado do mesmo doador utilizado para a manutenção da cultura parasita), calcular o hematócrito e ressuspender em meio RPMI-S + no mesmo número de glóbulos vermelhos por ml de cultura como o parasita.
6. Isolamento de sangue periférico humano as células mononucleares (PBMC)
- Recolha de sangue venoso em tubos de heparina de sódio (top verde) tanto do HIV (+) de doadores crônica e uma HIV (-) controle. Não utilizar EDTA como um anti-coagulante, como acção quelante do EDTA de cálcio afecta a função da célula. Em média, esperam que entre 5-10 x 10 6 PBMC por 10 ml de sangue. Para uma experiência típica recolher 30 ml de sangue de cada dador. O volume de sangue terão de ser ajustados de acordo com as exigências experimentais.
- O mais rapidamente possível e, definitivamente, dentro de uma hora de sangue a ser recolhidos,remover o sangue dos tubos e coloque em um tubo de plástico de 50 ml. Monócitos em particular será ativado e ficar com vidro, por isso é importante que as células se tubos de coleta de sangue de vidro são usados são removidos o mais rapidamente possível.
- Girar o sangue a 1000 xg durante 15 minutos e recolher o plasma (isto pode ser usado para outros estudos, se necessário - se não for este passo pode ser ignorado). Dilui-se o sangue em igual volume de DPBS frio.
- Coloque 15 ml de Ficoll RT em um tubo de 50 ml. Lentamente, usando uma pipeta de transferência de plástico estéril, a camada de solução / DPBS sangue sobre o Ficoll sem qualquer mistura. Um máximo de 25 ml de solução / DPBS sangue pode ser mergulhado sobre cada 15 ml de Ficoll.
- Girar os gradientes de 30 min à temperatura ambiente a 600 x g. Verifique se a configuração "não freio 'está ligado.
- Uma vez que as células tenham fiado, olhar para a interface entre as duas fases. Este é o lugar onde o PBMC são. Usando uma pipeta de plástico estéril de transferência de recolher o PBMC a partir da interface (vejaA Figura 1). Minimizar a contaminação por RBC.
- Coloque células coletadas em tubos de 50 ml, com não mais de 20 ml por tubo. Top tubo de até 50 ml com DPBS frio estéreis.
- Rodar as células durante 10 min a 4 ° C a 300 x g.
- Elimine o sobrenadante, ressuspender o sedimento em 5 ml de DPBS frio estéreis e reunir todas as células a partir do mesmo doador em um tubo. Encher a 50 ml com DPBS estéril, e repetir a passos de lavagem mais 2 vezes.
- Ressuspender as células em 10 ml de RPMI + S-forma.
- Remove-se uma alíquota de 20 ul e misturar-se com 20 ul de azul de tripano. Pipeta 10 ul em um hemocitómetro e contar as células vivas (células que não têm tido até o corante azul - todas as células azuis são mortos). Usar um hemocitómetro para calcular o número de células numa solução como se segue.
Nota: um hemocitómetro tem uma grelha de dimensões especificadas de modo a que a área coberta pelas linhas é conhecido.- Verifique se o hemocitómetro está limpo. Coloque a lamela sobre a countiárea ng. Carga de 10 ul de solução de células colocando a ponta da pipeta num dos poços em forma de V. A área sob a lamela irá preencher, por acção capilar.
- Coloque a hemocitómetro carregado sob um microscópio. A grade completa do hemocitómetro contém 9 quadrados de 1 mm 2 cada. Contagem de todas as células dentro de cada quadrado grande. Se muitas células estão presentes, diluir a solução mais e recontagem.
- Calcular a concentração de células como se segue: Total de células / ml = (número total de células contadas / # de quadrados) x factor de diluição x 10.000 células / ml, por exemplo, (500 células / 5 quadrados) factor de diluição x de 20 x 10.000 células / ml = 20 X 10 6 células totais.
- Ajuste meio a uma concentração final de 10 x 10 6 por ml (meio RPMI-S + forma).
7. Malária / Co-infecção HIV Cultura
- Placa 100 ul de PBMC isoladas e 400 ul de meio RPMI-S + médio para uma placa de 24 poços (1 x 10 6 PBMC por cavidade). Garantirque os poços são criados em triplicado: 3 poços para não infectado RBC, 3 poços com PfRBC, 3 poços com meio, e 3 poços com PMA / ionomicina. Isto é tanto para o HIV (+) e HIV (-) da amostra.
- Para o PfRBC poços, coloque 3 x 10 6 PfRBC em cada um dos poços (500 ul da cultura parasita preparadas de 5,2).
- Para não infectado RBC poços, 500 ul de colocar a cultura não infectada RBC preparado em 5,3 em cada um dos poços.
- Para poços médias, colocar 500 ul de meio RPMI-S + no meio de cada um dos poços.
- Para PMA / ionomicina poços, preparar a solução com PMA / ionomicina (2,5 pg / ml, 250 pg / ml, respectivamente). Coloque 500 ul desta solução em cada poço.
Nota: como estimuladores potentes da secreção de citoquinas de células T, PMA e ionomicina são utilizados como um controlo positivo para assegurar células são funcionais. - Colocar a placa a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2.
- Opcional: usar excesso de células para análise fenotípica por citometria de fluxo ou armazene em um RNUma solução de estabilização para a futura análise da expressão de mRNA.
8. Detecção das Respostas Imunes Malária
Nota: Realizar experimentos de co-cultura por até quatro dias. Nenhuma mudança de meio é necessário durante este tempo. O ponto de tempo óptimo dependerá do tipo de célula de interesse e a pergunta. Uma incubação de 12-48 horas é o ideal para as respostas monoc�icas para PfRBCs, enquanto que as respostas dos linfócitos foram melhor observados em 72-96 horas. Os pontos de tempo terá de ser optimizada com base na pergunta experimental. Períodos mais curtos (2-4 h) poderá ser usado se interação entre intacta PfRBC e PBMC é de interesse.
- Placa de rotação a 300 xg durante 3 minutos para as células de pelotas. Recolha de 700 ul de sobrenadante de cultura de cada poço.
- Gire sobrenadante a 1.000 xg por 5 min para desembaraçadas de quaisquer detritos.
- Aliquota foi afastada sobrenadante conforme necessário, etiqueta, e congelamento abaixo dos -20 ° C até à análise dos factores secretados é para ser Performou.
- Analisar as respostas de citocinas / quimiocinas por ELISA ou por matriz do grânulo (seguir os protocolos sugeridos pelo fabricante).
- Recolher as células que permanecem na placa numa solução que estabiliza o ARN e utilizar para a análise de expressão de ARNm de a-PCR quantitativo em tempo real 14-16.
9. intracelular citometria de fluxo para Respostas Ccytokine específico de células utilizando PBMC co-cultivadas com P. falciparum Infected RBC
Observação: Como mencionado acima, o comprimento de co-cultura irá depender do tipo de células de interesse. Se estiver interessado em respostas monoc�icas para PfRBC um período de incubação mais curto é necessário. Vezes será mais longo para as respostas dos linfócitos inatas γδ células T, células NK, células NKT), e ainda mais para células T CD4 e CD8. Optimization será necessária.
- 6-8 h antes de adicionar 1 ul de análise de 1.000x brefeldina A a todos os poços. Retorne a placa a 37 ° C incubadora. Após 6-8 h incubção, colocar a placa em gelo durante 15 min.
- Remover as células dos poços utilizando pipetagem vigorosa e colocá-los em tubos microcentifuge rotulados. Raspar pode ser necessária para remover os monócitos.
- Células de centrifugação durante 5 min a 1000 x g. Remover sobrenadantes. Ressuspender as células em 500 ul de tampão de citometria de fluxo (1x DPBS, 2% de FBS inactivado pelo calor, azida de sódio a 0,02%).
- As células se dividem de forma que cada amostra tem: um tubo para a coloração de anticorpo completo (240 uL), e um tubo para a coloração de um menos fluorescente (FMO) anticorpo de controlo (240 ul). Piscina um pequena quantidade de cada amostra (20 ul) para o fluxo de citometria de controlo não corado (isto irá ser utilizado na criação do citómetro de fluxo).
- As células de centrifugação durante 5 min a 500 x g. Remover sobrenadantes.
- Incubar as células com CD16 não conjugado anti-humano / CD32 (5 ug / ml) em 50 ul de tampão de citometria de fluxo durante 15 min a 4 ° C para bloquear os receptores Fc.
- Adicionar 1 ml de tampão de citometria de fluxo para cada tubo. Spin cells para 5 min a 500 x g. Remover sobrenadantes.
- Ressuspender as células em 50 ul de tampão de citometria de fluxo com uma concentração pré-titulada de anticorpos fluoróforos para marcadores de superfície de células desejada. Pré-mistura de solução de anticorpo suficiente para todas as amostras a serem corados. Incubar as células a 4 ° C por 20 min. Proteger da light.Note: Montante de cada anticorpo terá de ser otimizado. Rotineiramente manchar para CD56, CD3, γδ, CD4, CD8, CD14. Volumes ajustadas para estes anticorpos estão apresentados na Tabela 1.
- Adicionar 1 ml de tampão de citometria de fluxo para cada tubo. As células de centrifugação durante 5 min a 500 x g. Remover sobrenadantes.
- Adicionar 100 ul de solução Cytofix / Cytoperm a cada tubo. Incubar as células durante 20 minutos a 4 o C. Proteger da luz.
- Adicionar 1 ml de tampão de Perm / lavagem (10x concentrado fornecido como - diluir a 1x usando ddH2O) a cada tubo. As células de centrifugação durante 5 min a 500 x g. Remover sobrenadantes.
- Adiciona-se 100 μl de perm / tampão de lavagem de controle FMO tubos de coloração de anticorpos e misture para voltar a suspender as células.
- Adicionar 100 ul de tampão de Perm / lavagem com uma concentração pré-titulada de anticorpos fluoróforos aos marcadores intracelulares desejados (isto é, citocinas / quimiocinas) para tubos de coloração de anticorpo completas.
Nota: A quantidade de cada anticorpo terá de ser optimizada. Rotineiramente manchar com anti-TNF e anti-IFNy anticorpos. Volumes ajustadas para estes anticorpos estão apresentados na Tabela 1. - Incubar todos os tubos durante 30 minutos a 4 o C. Proteger da luz.
- Adicionar 1 ml de tampão de Perm / Wash a cada tubo. As células de centrifugação durante 5 min a 500 x g. Remover sobrenadantes.
- Ressuspender as células em 300 ul citometria de fluxo tampão com 1% de paraformaldeído. Vamos sentar-se para um mínimo de 15 minutos para neutralizar o HIV.
- Prepare anticorpos única amostras coradas usando esferas de compensação, a ser utilizado para compensação instituído no citômetro de fluxo. O tipo de compensaçãogrânulos dependerá dos anticorpos utilizados (isto é., Ig anti-murganho, anti-rato / Ig de hamster). Grânulos vórtice. Adicionar uma gota de grânulos por anticorpo. Adicionar a mesma quantidade de anticorpo que o utilizado para a coloração. Adicionar 200 ul de tampão de citometria de fluxo. Estes são agora pronto para o uso. Não há necessidade de lavar as contas.
- Adquirir amostras num citómetro de fluxo o mais rápido possível e dentro de 24 h para obter os melhores resultados. Corantes Tandem são suscetíveis a dissociação com o armazenamento, por isso recomendamos aquisição imediata, se possível.
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Representative Results
Os gráficos apresentam os níveis de produção de IFN-y a partir de células NKT (Figura 2), usando CD56 + CD3 + γδ- portas para obtenção de uma população de células NKT (dados não mostrados). As células foram cultivadas durante 72 horas antes da coloração. Depois de coradas, 100.000 células CD3 + foram adquiridos no citómetro de fluxo para obter grandes populações suficientes de NK, células NKT e γδ (células de interesse). Um mínimo de 5.600 células NKT são exibidas em cada gráfico. A produção de TNF é obtido da mesma forma (dados não apresentados). Os gráficos demonstram claramente que a produção de IFNy em células é inferior a partir de HIV (+), em comparação com indivíduos HIV (-) indivíduos expostos a PfRBC.
A citometria de fluxo análise é muito subjetivo. Por isso, é essencial ter todos os controles apropriados para cada experimento (veja a Figura 2). Os níveis de fundo são calculados com base nas amostras de FMO, o que permite uma verdadeira representação da coloração de citocinas.As células estimuladas com PMA / ionomicina foram utilizadas como um controlo positivo (dados não mostrados). PMA e ionomicina são fortes estimuladores da produção de citocina da célula T. Uma falta de produção de IFN-y nestas amostras seria mais provável indicar um problema com o protocolo de coloração. No entanto, outras variáveis, como a viabilidade celular ou reagentes inativos também podem estar em falta.
Figura 1. Representação de Ficoll pós gradiente rotação demonstrando a posição do PBMC.
Figura 2. IFN γ produção por células assassinas T Natural. Os diagramas de fluxo foram obtidos por gating em CD56 + CD3 + γδ- células (mínimo de 5.600 eventos). Produção de IFN-y é detectável no HIV (-) de uma amostra com estimuladaP. falciparum glóbulos vermelhos infectados. Esta resposta de citocinas não aparente no contexto de uma infecção crônica do HIV é. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nosso protocolo foi optimizado, a fim de estudar mais realisticamente co-infecção com HIV-malária in vitro. Em primeiro lugar, os glóbulos vermelhos humanos frescos e soro são necessários para a cultura parasita da malária. Isso é vital para obter uma população saudável de parasitas da malária. Os lisados de parasitas não pode ser substituído por parasitas vivos como a produção de citoquinas é muito mais rápida e intensa quando se utiliza vivo P. RBC infectados falciparum (PfRBC) 17,18. Além disso, a activação de tipos de células, como as células NK, requer PfRBCs inteiros, e não funciona eficientemente com os lisados de parasitas. Isto pode ser devido à necessidade de contacto directo entre o PfRBC e a de leucócitos ou pode ser devido à natureza instável dos ligandos derivados de parasitas que interagem com receptores de superfície celular 18. Culturas Malária PfRBC também deve ser bem sincronizados (Protocolo 4) antes da experiência. PfRBCs sincronizados melhorar a reprodutibilidade dos dados experimentais. Embora este protocolo desecretários uso de fase trofozóito PfRBC para co-cultura, isto pode facilmente ser modificado para o estudo de fase anel PfRBC.
Leucócitos humanos podem ser infectados artificialmente com o HIV, e este método tem sido utilizado em estudos de investigação do HIV-malária co-infecção de 20. No entanto, isto não modelar a desregulação imune que resulta de infecção crónica pelo HIV. Neste sistema de co-cultura usamos CMSPs isolados a partir de participantes humanos que estão cronicamente infectados com HIV-1. Quando forem necessárias participantes para um estudo, é importante selecionar com cuidado essa população. Os critérios de inclusão e exclusão são vitais para garantir a variabilidade mínima e máxima reprodutibilidade. Os nossos critérios incluíram uma definição clara de infecção crônica pelo HIV (HIV-infectados por> 1 ano, com CD4 + de células T declínio da contagem de> 50 células / mm3 / ano) e à exclusão de qualquer pessoa com uma infecção concomitante. Isto assegurou que os resultados obtidos podem ser atribuídas assimlely para o efeito da infecção crónica pelo HIV, e não outra infecção. Além disso, uma vez que estavam interessados em respostas imunitárias inatas à malária foram excluídos os doadores que tiveram infecção anterior malária.
Controles não infectados pelo HIV também são utilizados para cada doador de HIV (+), em todos os pontos de tempo de amostragem, para permitir a normalização dos dados. Deve ser feita uma tentativa para combinar controles ao seu respectivo doador HIV (+) durante pelo menos idade, mas de preferência, também o sexo (embora em nosso estudo anterior 12 não observamos uma diferença significativa em subpopulações de células ou respostas de citocinas entre feminino e masculino HIV participantes não infectadas). Se a amostragem prospectivo está previsto manter o mesmo controle não infectados pelo HIV para cada ponto de tempo de amostragem é benéfico. As respostas podem variar de experiência para experiência devido a vários fatores, incluindo a saúde dos PfRBCs, o seu grau de sincronização, o nível de parasitemia e estágio de maturidade de PfRBCs, e nível de hematócrito. Cuidadodevem ser tomadas para manter como muitos destes consistente entre experimentos. Normalizando a um controlo não infectados pelo HIV permite alguma contabilidade para essas variáveis.
Usando células frescas é fundamental para evitar resultados artificiais. Amostras de congelamento e descongelamento pode ter um impacto significativo na viabilidade das células 21,22, produção de citocinas e 23-26 fenotípica marcadores da superfície da célula 27.
Se os monócitos são de particular interesse, é importante que o vidro não é utilizada ao longo do protocolo. Os monócitos aderir ao vidro e muitos outros materiais plásticos 28. Nós usamos pipetas de polipropileno de plástico, pipetas de transferência, e tubos em toda a minimizar a adesão de monócitos e remoção definitiva de nossas populações de células estudo.
Ao configurar o ensaio de citometria de fluxo, qualquer combinação de anticorpos podem ser usados dependendo das células de interesse. Estamos particularmente interessados na produção de IFN e TNFa partir de células NK, as células NKT e as células T γδ. Este definido nosso painel de anticorpos. No entanto, se utilizando uma combinação diferente, é importante optimizar as quantidades de anticorpo para cada painel. Isso é vital para evitar dados errados. Além disso, para evitar a variabilidade e garantir a validade, FMOs são necessários para avaliar os níveis de citocinas fundo para cada condição (RBC, PfRBC, médio e PMA / ionomicina) e da população participante (HIV (-) e HIV (+), Figura 2). Medição da produção de citoquina intracelular in vitro geralmente resulta em elevados níveis de fundo, especialmente quando as células foram cultivadas antes da coloração. Uma vez que as condições de cultura de afectar os níveis de fundo, apropriados QOM assegurar o conhecimento do nível de fundo para cada amostra. Nosso suprimento de células foi limitado, portanto, nós projetamos nossos FMOs para conter todas as manchas superficiais, mas sem manchas intracelulares. Isto permite a comparação dos níveis de fundo específico de citocinas em todos os diferentes tipos de células estudados.Nós também correu uma única mancha por experimento para cada um dos marcadores de superfície para confirmar os seus níveis de fundo.
O protocolo descrito é um versátil, que pode ser usado para examinar respostas dentro de horas ou dias, dependendo das células de interesse. Para a produção de citocina induzida por PfRBC óptima a partir de linfócitos inatos, nós medimos a citometria de fluxo de saída, após 2 ou 3 dias. Ao olhar para monócitos, pontos de tempo anteriores (1 ou 2 dias) são recomendados. Este sistema permite vários tipos de células e respostas celulares a ser distinguido por citometria de fluxo, as respostas secretoras de ser medidos em sobrenadantes celulares e perfis de expressão para ser avaliada em RNA extraído. Além disso, a utilização de anticorpos para bloquear os receptores específicos ou neutralizar as citocinas podem ser utilizadas neste sistema para dissecar ainda mais os mecanismos. Temos utilizado com sucesso IL-18 bloqueio do receptor para implicar IL-18 receptor de IFN-y nas respostas induzidas por PfRBC 12. Este sistema representa um realistaMétodo IC através do qual a avaliar uma série de respostas imunes inatas a malária no contexto da infecção pelo HIV.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alanine | Sigma | A7377 | |
| antibodies (see other table) | |||
| BD Cytofix/Cytoperm with BD GolgiPlug | BD | 555028 | includes brefeldin A, cytofix/cytoperm buffer and perm/wash buffer |
| BD Vacutainer ACD Solution A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer Sodium Heparin | BD | 17-1440-02 | |
| DPBS (no calcium, no magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | heat inactivate before use |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| gentamycin (10 mg/ml) | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 Staining Set | Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| Ionomycin | Sigma | I3909 | |
| MEM non-essential amino acids (10 mM) | Gibco | 11140 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| RPMI-1640 powder | Life-Technologies | 31800-022 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine and HEPES | Thermo Scientific | SH30255.01 | |
| sodium bicarbonate (powder, cell culture) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360 | |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T6066 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| Trypan Blue (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843, 552845 | depends on antibodies used |
| Parasite Gas Mixture | By special order | 3% CO2, 1% O2, balance N2 | |
| Equipment | |||
| 0.2 μm filter unit | |||
| Glass slides | |||
| T25 flasks | |||
| T75 flasks | |||
| 50 ml tubes | |||
| 24 well culture plates | |||
| unplugged Pasteur pipettes | |||
| plugged Pasteur pipettes | |||
| sterile transfer pipettes | |||
| hemocytometer | |||
| flow cytometer (3 laser) | |||
| Antibodies used for flow cytometry | |||
| Anti-TNF | eBiosciences | 551487 | FITC (fluorophore) 2 μl |
| Anti-IFNγ | Biolegend | 506507 | PE (fluorophore) 20 μl |
| Anti-CD8 | Biolegend | 300914 | PE-Cy7 (fluorophore) 1 μl |
| Anti-CD14 | Biolegend; BD Biosciences | 325624; 551487 | Biotin (fluorophore) 0.5 μl Streptavin PE-TR (fluorophore) 0.1 μl |
| Anti-CD56 | Biolegend | 318322 | PerCP/Cy5.5 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-γδ | Biolegend | 331212 | APC (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD3 | Biolegend | 300426 | APC-Cy7 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD4 | Biolegend | 317424 | Pacific Blue (fluorophore) 1 μl |
References
- Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large. Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).
- French, N., et al. Increasing rates of malarial fever with deteriorating immune status in HIV-1-infected Ugandan adults. AIDS (London, England). 15 (7), 899-906 (2001).
- Hoffman, I. F., et al. The effect of Plasmodium falciparum malaria on HIV-1 RNA blood plasma concentration. AIDS (London, England). 13 (4), 487-494 (1999).
- Kamya, M. R., et al. Effect of HIV-1 infection on antimalarial treatment outcomes in Uganda: a population-based study. The Journal of infectious diseases. 193 (1), 9-15 (2006).
- Kublin, J. G., et al. Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study. Lancet. 365 (9455), 233-240 (2005).
- Mermin, J., et al. Effect of co-trimoxazole prophylaxis, antiretroviral therapy, and insecticide-treated bednets on the frequency of malaria in HIV-1-infected adults in Uganda: a prospective cohort study. Lancet. 367 (9518), 1256-1261 (2006).
- Patnaik, P., et al. Effects of HIV-1 serostatus, HIV-1 RNA concentration, and CD4 cell count on the incidence of malaria infection in a cohort of adults in rural Malawi. The Journal of infectious diseases. 192 (6), 984-991 (2005).
- Whitworth, J., et al. Effect of HIV-1 and increasing immunosuppression on malaria parasitaemia and clinical episodes in adults in rural Uganda: a cohort study. Lancet. 356 (9235), 1051-1056 (2000).
- Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha. The Journal of infectious diseases. 177 (2), 437-445 (1998).
- Francesconi, P., et al. HIV, malaria parasites, and acute febrile episodes in Ugandan adults: a case-control study. AIDS (London, England). 15 (18), 2445-2450 (2001).
- Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates Tim-3 expression on innate cells: combination antiretroviral therapy results in partial restoration. Journal of acquired immune deficiency syndromes. 63 (2), 161-167 (2013).
- Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates innate immunity to malaria despite combination antiretroviral therapy. AIDS (London, England). 27 (3), 325-335 (2013).
- Ljungstrom, I., et al. Methods in Malaria Research. , 4th edition, MR4/ATCC. Available from: http://www.mr4.org/Publications/MethodsinMalariaResearch.aspx (2013).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Universal SYBR green quantitative PCR protocol [Internet]. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html (2014).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-DDCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Hensmann, M., Kwiatkowski, D. Cellular basis of early cytokine response to Plasmodium falciparum. Infection and immunity. 69 (4), 2364-2371 (2001).
- Artavanis-Tsakonas, K., Riley, E. M. Innate immune response to malaria: rapid induction of IFN-gamma from human NK cells by live Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. J Immunol. 169 (6), 2956-2963 (2002).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. The Journal of parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
- Ludlow, L. E., et al. HIV-1 inhibits phagocytosis and inflammatory cytokine responses of human monocyte-derived macrophages to P. falciparum infected erythrocytes. PloS one. 7 (2), e32102 (2012).
- Weinberg, A., et al. Viability and functional activity of cryopreserved mononuclear cells. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (4), 714-716 (2000).
- Fowke, K. R., Behnke, J., Hanson, C., Shea, K., Cosentino, L. M. Apoptosis: a method for evaluating the cryopreservation of whole blood and peripheral blood mononuclear cells. Journal of immunological. 244 (1-2), 139-144 (2000).
- Jeurink, P. V., Vissers, Y. M., Rappard, B., Savelkoul, H. F. J. T cell responses in fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells: kinetics of cell viability, cellular subsets, proliferation, and cytokine production. Cryobiology. 57 (2), 91-103 (2008).
- Kvarnström, M., Jenmalm, M. C., Ekerfelt, C. Effect of cryopreservation on expression of Th1 and Th2 cytokines in blood mononuclear cells from patients with different cytokine profiles, analysed with three common assays: an overall decrease of interleukin-4. Cryobiology. 49 (2), 157-168 (2004).
- Venkataraman, M. Effects of cryopreservation of immune responses. XI. Heightened secretion of tumor necrosis factor-alpha by frozen human peripheral blood mononuclear cells. Cryobiology. 34 (3), 276-283 (1997).
- Venkataraman, M. Effects of cryopreservation on immune responses. X. Decrease in interleukin-12 production by frozen human peripheral blood mononuclear cells is mediated by the endogenously hypersecreted interleukin-10. Cryobiology. 33 (5), 581-588 (1996).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (3), 352-359 (2000).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. Journal of leukocyte biology. 56 (3), 236-240 (1994).
