Introduction
Co-infezione, infezione da infezioni multiple concomitanti, è la norma in ambienti naturali. Co-infezione può avere un grande impatto sulla patologia della malattia e sulla gestione clinica di ogni infezione. Nel contesto di co-infezione, il vaccino e l'efficacia dei farmaci, così come test diagnostico, può essere influenzato negativamente (rivisto in 1). Tuttavia, nonostante la sua importanza, la maggior parte delle ricerche patogeno ritiene infezioni solo singoli.
La malaria e HIV-1 (HIV) sono le principali cause di morbilità e mortalità a livello mondiale. Aree di malaria e l'HIV endemicità condividono una vasta sovrapposizione geografica, mettendo a milioni di persone a rischio di co-infezione e di conseguenza a rischio di più grave malattia clinica 2-10. Le due malattie interagiscono negativamente. Negli individui affetti da HIV, la carica virale HIV più alti e le diminuzioni temporanee CD4 + T-cellule può essere visto nel corso di una infezione della malaria, mentremalaria oneri parassita e il rischio di malaria clinica e grave sono più alti in co-infettati individui 2,3,5,7,8,10. I meccanismi attraverso i quali l'HIV aumenta la malaria gravità non sono pienamente compresi e meritano ulteriori indagini.
Qui si descrive un metodo con cui la malaria e la co-infezione HIV possono essere studiati in vitro. In particolare, questo metodo consente per l'esame delle risposte immunitarie specifiche per malaria nel contesto dell'infezione da HIV. Il nostro protocollo descrive un sistema versatile di co-coltura con cellule mononucleate del sangue periferico appena isolate (PBMC) isolati da donatori infetti cronicamente da HIV e in vitro colta P. falciparum parassitati eritrociti (PfRBC). L'impatto dell'HIV terapia antiretrovirale nelle risposte può essere esaminata usando PBMC prospetticamente raccolti da HIV (+) i donatori pre e post-terapia.
Abbiamo usato questo sistema per studiare l'impatto dell'infezione da HIVsulle risposte immunitarie innate specifiche malaria 11,12, e sono stati in grado di determinare che IFNγ e TNF risposte specifiche per malaria sono alterate nelle cellule NK, cellule NKT, γδ cellule T da HIV (+) i donatori pre e post-HIV terapia antiretrovirale . Inoltre, siamo stati in grado di utilizzare questo sistema per determinare che le funzioni monocitiche sono anche compromesse HIV (+) i donatori, ma recuperare post-HIV terapia antiretrovirale.
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Protocol
Questo protocollo richiede il reclutamento di donatori di siero e RBC da utilizzare per la cultura parassita, e l'HIV (+) e non infetti donatori per l'isolamento PBMC. Institutional Review Boards devono approvare tutti gli studi e tutti i donatori devono fornire il consenso informato prima di prelievo di sangue.
ATTENZIONE: Lavorare con campioni di sangue umano e dei parassiti della malaria umana richiede misure precauzionali. Indossare sempre un camice da laboratorio, guanti, e lavorare in un armadio di livello 2 biosicurezza. In caso di accidentale esposizione percutanea a malaria umana, riferire alla Salute e Sicurezza per il trattamento profilattico. Ulteriori considerazione la sicurezza dovrebbe essere messo in atto per lavorare con l'HIV (+) nel sangue. Indossare un camice da laboratorio chiusura posteriore. Doppio guanto (guanto superiore deve essere in lattice). Eseguire tutte manipolazione in un armadio di livello 2 biosicurezza. Non utilizzare vetro o oggetti appuntiti. Non utilizzare aspiratore. Metti i prodotti contaminati in soluzione virox o candeggina per un minimo di 1 ora prima dello smaltimento.Lavare tutte le superfici con virox e UV per 1 ora dopo l'uso. Si noti che ogni istituzione avrà i propri regolamenti di biosicurezza specifici che devono essere seguite. Segnala tutte le esposizioni accidentali al sangue con infezione da HIV di salute e sicurezza per la valutazione e la considerazione di eventuali profilassi post-esposizione.
Nota: I diversi ceppi di P. esistono parassiti della malaria falciparum. ITG è stato utilizzato per questi esperimenti, ma diversi ceppi può essere utilizzato. Eccellenti le istruzioni su di congelamento e scongelamento Plasmodium falciparum parassiti sono disponibili sul sito MR4 13.
1. Fare RPMI-A per Parassita della malaria Cultura
- Rendere RPMI-0 mescolando 950 ml di DDH 2 O, 1 pacchetto di polvere RPMI-1640, 6 g di HEPES, 2 g di bicarbonato di sodio e 1,35 mg di ipoxantina.
- Calore disgelo inattivato siero umano da due diversi donatori. Donatori AB sono i migliori, ma qualsiasi possono essere usati se i parassiti sono coltivate in tipo Oglobuli rossi (RBC). Capovolgere i tubi a mescolare. Se siero contiene particelle o è girare di spessore a 2.000 giri e poi filtrare parte liquida con una unità di 0,45 micron filtro.
- Utilizzando un filtro unità 0,2 micron filtro 180 ml di RPMI-0, 20 ml di siero umano (10 ml da ciascun donatore) e 0,5 ml di 10 mg / ml di gentamicina.
Nota: Siero umano può intasare il filtro in modo più di una unità di filtro può essere richiesto. - Etichettare la bottiglia con mezzo RPMI-A, la data e la fonte del siero. Mettete in frigorifero fino al momento. RPMI-A può diventare torbida in frigorifero. Questo è normale, ma con aumento della nuvolosità è un segno di contaminazione.
Nota: la crescita del parassita può variare nel siero del donatore diverso. E 'una buona idea per testare tutti i lotti di siero umano per la buona crescita del parassita prima di utilizzare.
2. Preparare le cellule umane rosso sangue per Parasite Cultura
Nota: i donatori di sangue devono essere di tipo O.
- Raccogliere 7-10 ml di sangue in acido-cit(ACD) tubi di tasso-destrosio. Scrivi ID e data di raccolta sull'etichetta del donatore.
- Sangue Conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso. Utilizzare il sangue per le culture di parassiti entro 1 mese.
- Pulire la parte superiore del tubo con etanolo al 70%. Rimuovere con cautela il tappo e scartare. Trasferire sangue in una provetta da 15 ml. Spin per 3 minuti a 1000 x g. Rimuovere il plasma mediante aspirazione.
- Sospendere RBC a parità di volume di caldo RPMI-0. Spin per 5 min a 1000 x g. Rimuovere il buffy coat per aspirazione, risospendere in 5 ml di RPMI-0 e ripetere il lavaggio altre 2 volte.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere abbastanza RPMI-A per produrre una miscela che è del 50% in volume RBC.
- Conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
3. Mantenere Culture Parasite
- Preriscaldare RPMI-A a 37 ° C.
- Posizionare parassiti scongelati (vedi protocollo MR4 per la procedura di scongelamento) in un pallone T25 con 5 ml di RPMI-A e 75 ml di RBC lavato umana per un ematocrito del ~ 3%.Nota: ematocrito misura il volume di RBC rispetto al volume totale. Per calcolare ematocrito misurare il volume di imballato RBC al volume totale del mezzo più RBC. Si supponga che i parassiti scongelati contribuiranno 75 ml di RBC. Aggiungendo 150 ml di RBC magazzino (che è equivalente ad aggiungere 75 ml di imballato RBC) al pallone c'è un totale di 150 ml di RBC in 5 ml di mezzo, che equivale ad un ematocrito del 3% (150 ml / 5.000 microlitri x 100% = 3%).
- GAS il pallone per 30 sec con miscela di gas parassita (1% O 2, 3% di CO 2, equilibrio N 2). Sigillare e posizionare il lato largo beuta giù a 37 o C incubatore da consentire un'ampia superficie di scambio di gas.
- Per cambiare il supporto e controllare parassitemia (deve essere fatto ogni giorno), spostare con cautela il pallone come per non disturbare lo strato di RBC. Utilizzando uno sterile scollegato pipetta Pasteur trarre fuori il terreno di coltura senza disturbare lo strato di sangue.
- Per controllare parasitemia, rimuovere un campione di 10 microlitri dallo strato di sangue, posizionarlo su un vetrino e con un secondo vetrino creano un film sottile di sangue. Lasciare asciugare diapositiva.
- Collocare 4 ml di fresco RPMI-A nel pallone, miscelare delicatamente, gas per 30 sec, e posto in incubatore a 37 ° C.
- Colorare il vetrino utilizzando il kit di colorazione Hema3 secondo il protocollo del produttore.
- Per la colorazione ottimale, dip scorre nella soluzione di fissaggio per 10 sec, soluzione che per 10 sec, e la soluzione II per 30 sec. Risciacquare con acqua e lasciare scivoli ad asciugare.
- Calcola parassitemia contando il numero di PfRBC (macchiato viola scuro) rispetto al numero totale di RBC (rosa macchiata). Contare un totale di 300 cellule per garantire la precisione.
- Quando parassiti hanno raggiunto un parassitemia di 5%, espandere la cultura in un pallone T75, utilizzando 40 ml di RPMI-A, e 500 ml di RBC.
4. Parasite Sincronizzazione
Nota: Il giorno prima tegli sperimentare, sincronizzare la cultura parassita trattando con alanina. Solo parassiti fase anello e non infetti RBC sopravvivranno questo trattamento. Sincronizzazione alanina vi darà una coltura pura trofozoite il giorno dopo che può essere utilizzato negli esperimenti di co-coltura. Assicurati di iniziare con una cultura parassita che contiene la maggior parte dei parassiti fase anello.
- Preparare la soluzione alanina miscelando 8,01 g di alanina (300 mM) e 0,365 g di Tris (10 mM) in 300 ml di DDH 2 O. Portare il pH a 7,4. Filtro sterilizzare utilizzando una unità di 0,2 micron filtro.
- Soluzione alanina Preriscaldare a 37 ° C.
- Spin giù la cultura parassita (5 min x 1.000 xg), e rimuovere il mezzo.
- Risospendere pellet in 19 volumi di soluzione alanina (1 ml imballati RBC a 19 ml di soluzione alanina). Incubare per 15 minuti a RT.
- Spin 5 min x 1.000 x g. Aspirare il surnatante. Lavare in RPMI-0 una volta. Aspirare il surnatante e risospendere in RPMI-A e regolare ematocrito a ~ 3%. Solcome pallone e ritorno a 37 ° C.
Nota: Per gli esperimenti di co-coltura è necessario un minimo di parassitemia 5% trofozoiti, con il 10% parassitemia considerato ottimale.
5. Parasite e RBC preparazione per esperimenti di co-coltura
- Utilizzare un rapporto di 3 PfRBC per PBMC in esperimenti di co-coltura per indurre una risposta infiammatoria. Per calcolare totale PfRBC, quantificare parassitemia facendo una sottile striscio di sangue come descritto al punto 3.5, ed ematocrito contando il numero di RBC per ml di cultura parassita con un emocitometro.
Numero di PfRBC =% parassitemia x totale RBC / ml x ml di cultura. Ad esempio: 10 ml di coltura a 10 x 10 6 RBC / ml e 10% parassitemia è pari a 0,1 x 10 6 / ml x 10 ml = 10 x 10 6 PfRBC. - Spin cultura parassita per 5 minuti a 1000 xg (RT). Aspirare media, e risospendere alle 6 x 10 6 PfRBC per ml in RPMI-S + (500 ml RPMI-1640 integrati con L-glutammina e HEPES, il 10% di caloreFBS inattivato, 1,5 ml gentamicina, 5 ml di 100 mM sodio piruvato, 5 ml di 10 mM MEM aminoacidi non essenziali, 5 ml di 5 mM β-mercaptoetanolo).
- Prendere sangue di controllo (non infetto RBC dallo stesso donatore utilizzato per mantenere la cultura parassita), calcolare ematocrito e risospendere in RPMI-S + allo stesso numero di RBC per ml come la cultura parassita.
6. Isolamento di cellule mononucleari di sangue periferico umano (PBMC)
- Raccogliere il sangue venoso in tubi di eparina sodica (top verde) sia da un virus HIV (+) del donatore cronica e uno di HIV (-) di controllo. Non usare EDTA come un anti-coagulante come azione chelante del calcio EDTA colpisce la funzione delle cellule. In media si aspettano tra 5-10 x 10 6 PBMC per 10 ml di sangue. Per un tipico esperimento raccogliere 30 ml di sangue da ogni donatore. Il volume di sangue dovrà essere regolata a seconda delle esigenze sperimentali.
- Nel più breve tempo possibile e sicuramente entro un'ora di sangue che viene raccolto,rimuovere il sangue dai tubi e posto in un tubo di plastica da 50 ml. I monociti, in particolare, saranno attivati e bastone al vetro, quindi è importante che le cellule, se vengono utilizzati tubi di raccolta del sangue vetro vengono rimossi il più rapidamente possibile.
- Spin il sangue a 1.000 xg per 15 minuti e raccogliere il plasma (questo può essere usato per altri studi, se necessario - se non questo passaggio può essere saltato). Diluire il sangue in volume uguale di DPBS fredda.
- Mettere 15 ml di Ficoll RT in una provetta da 50 ml. Lentamente, con una pipetta di trasferimento sterile in plastica, strato della soluzione / DPBS sangue sul Ficoll senza alcuna miscelazione. Un massimo di 25 ml di soluzione / DPBS sangue può essere sovrapposto su ogni 15 ml di Ficoll.
- Spin i gradienti per 30 minuti a RT a 600 x g. Assicurarsi che l'impostazione 'no freno' è acceso.
- Una volta che le cellule hanno filato, cercare l'interfaccia tra le due fasi. Questo è dove il PBMC sono. Utilizzando uno sterile trasferimento pipetta di plastica raccogliere le PBMC dall'interfaccia (vediFigura 1). Ridurre al minimo la contaminazione da RBC.
- Posizionare cellule raccolte in provette da 50 ml, con non più di 20 ml per provetta. Superiore del tubo fino a 50 ml con DPBS freddo sterile.
- Spin le cellule per 10 min a 4 ° C a 300 x g.
- Gettare il surnatante, risospendere pellet in 5 ml sterili DPBS freddi e riunire tutte le cellule dello stesso donatore in un tubo. Top fino a 50 ml con DPBS sterile, e ripetere il lavaggio passaggi altre 2 volte.
- Risospendere le cellule in 10 ml di RPMI-S + media.
- Rimuovere un'aliquota da 20 ml e mescolare con 20 ml di trypan blu. Pipettare 10 ml in un emocitometro e contare le cellule viventi (cellule che non hanno preso il colorante blu - tutte le cellule blu sono morti). Utilizzare un emocitometro per calcolare il numero di cellule in una soluzione come segue.
Nota: Un emocitometro ha una griglia di dimensioni specificate in modo che l'area coperta dalle linee è nota.- Assicurarsi che il dell'emocitometro sia pulito. Posizionare il vetrino sul countizona ng. Carico 10 ml di soluzione di cellule posizionando la punta della pipetta in uno dei pozzetti a V. L'area sotto la coprioggetto riempirà per capillarità.
- Posizionare il emocitometro caricata al microscopio. La griglia completa del dell'emocitometro contiene 9 piazze di 1 mm 2 ciascuno. Contare tutte le cellule all'interno di ogni grande piazza. Se troppe cellule sono presenti, diluire la soluzione ulteriormente e da raccontare.
- Calcolare la concentrazione cellulare come segue: cellule totali / ml = (cellule totali contate / # di quadrati) x Fattore di diluizione x 10.000 cellule / ml, ad esempio, (500 cellule / 5 quadrati) x fattore di diluizione di 20 x 10.000 cellule / ml = 20 x 10 6 cellule totali.
- Regolare medio una concentrazione finale di 10 x 10 6 per ml (RPMI-S + medio).
7. Malaria / HIV co-infezione Cultura
- Piatto 100 ml di PBMC isolate e 400 ml di RPMI-S + mezzo ad un 24-pozzetti (1 x 10 6 PBMC per pozzetto). Garantireche i pozzi sono installati in triplice copia: 3 pozzi per non infetti RBC, 3 pozzi con PfRBC, 3 pozzi di media e 3 pozzi con PMA / Ionomicina. Questo è sia per l'HIV (+) e HIV (-) del campione.
- Per la PfRBC pozzi, posizionare 3 x 10 6 PfRBC in ciascun pozzetto (500 microlitri della cultura parassita preparati in 5.2).
- Per non infetti RBC pozzi, mettere 500 ml di cultura RBC non infetti preparato in 5.3 in ciascuno dei pozzetti.
- Per pozzi medie, mettere 500 ml di RPMI-S + medie ciascuno dei pozzetti.
- Per PMA / Ionomicina pozzi, preparare la soluzione PMA / Ionomicina (2,5 pg / ml, 250 pg / ml). Mettere 500 ml di questa soluzione in ciascun pozzetto.
Nota: come potenti stimolatori della secrezione di citochine delle cellule T, PMA e Ionomicina sono utilizzati come controllo positivo al fine di garantire le cellule sono funzionali. - Posizionare la piastra a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%.
- Opzionale: utilizzare le cellule in eccesso per l'analisi fenotipica citometria a flusso o conservare in un RNUna soluzione per la futura stabilizzazione analisi di espressione dell'mRNA.
8. Individuazione di malaria immunitarie Risposte
Nota: eseguire esperimenti di co-coltura per tutto il tempo 4 giorni. Non è richiesta alcuna variazione media durante questo periodo. Il punto di tempo ottimale dipenderà dal tipo di cellula di interesse e la domanda posta. Un'incubazione di 12-48 ore è ottimale per le risposte monocitiche a PfRBCs, mentre le risposte linfocitarie sono state meglio osservati a 72-96 ore. I punti di tempo dovranno essere ottimizzato in questione sperimentale. Periodi più brevi (2-4 hr) possono essere utilizzati se l'interazione tra intatto PfRBC e PBMC è di interesse.
- Piastra Spin a 300 xg per 3 minuti a cellule pellet. Raccogliere 700 ml di cultura surnatante da ogni pozzetto.
- Spin surnatante a 1000 xg per 5 minuti a libera da detriti.
- Aliquota schiarì surnatante, se necessario, l'etichetta, e congelare a -20 ° C fino al momento dell'analisi dei fattori secreti è essere perfoconfermate.
- Analizzare le risposte di citochine / chemochine mediante ELISA o matrice tallone (seguire i protocolli proposti del produttore).
- Raccogliere celle rimanenti nella piastra in una soluzione stabilizzante RNA e utilizzare per l'analisi quantitativa dell'espressione di mRNA mediante real-time PCR 14-16.
9. intracellulare Citometria a flusso per specifiche cellule Ccytokine risposte utilizzando PBMC co-coltura con P. falciparum infetti RBC
Nota: Come menzionato sopra la lunghezza di co-coltura dipenderà dal tipo cellulare di interesse. Se interessati nelle risposte monocitiche per PfRBC un periodo di incubazione più breve è necessario. Tempi saranno più lunghi per le risposte innate linfociti γδ cellule T, cellule NK, cellule NKT), e più ancora per le cellule CD4 e CD8 T. Sarà richiesto di ottimizzazione.
- 6-8 ore prima dell'analisi aggiungere 1 ml di 1,000x brefeldina A per tutti i pozzetti. Riportare la piastra a 37 ° C incubatore. Dopo 6-8 ore incubzione, piastra posto in ghiaccio per 15 minuti.
- Rimuovere le cellule dai pozzetti con pipettaggio vigoroso e metterli nelle provette microcentifuge etichettati. Raschiare può essere richiesto per rimuovere monociti.
- Cellule Spin per 5 min a 1000 x g. Rimuovere surnatanti. Risospendere le cellule in 500 microlitri citometria a flusso tampone (1x DPBS, 2% di calore inattivato FBS, 0,02% di sodio azide).
- Le cellule si dividono in modo che ogni campione ha: un tubo per la colorazione anticorpi completo (240 ml), e un tubo per la colorazione fluorescente meno uno (FMO) anticorpo di controllo (240 ml). Pool una piccola quantità di ciascun campione (20 microlitri) per il flusso unstained citometria controllo (questo sarà usato nella creazione del citometro a flusso).
- Spin cellule per 5 min a 500 x g. Rimuovere surnatanti.
- Incubare le cellule con CD16 coniugato anti-umano / CD32 (5 mg / ml) in 50 microlitri citometria di flusso buffer per 15 min a 4 ° C per bloccare i recettori Fc.
- Aggiungere 1 ml di citometria a flusso buffer per ogni provetta. Spin ceLLS per 5 min a 500 x g. Rimuovere surnatanti.
- Risospendere le cellule in 50 ml di citometria a flusso tampone con una concentrazione pretitolata di anticorpi fluoroforo coniugati a marcatori di superficie delle cellule desiderate. Soluzione di anticorpi sufficiente pre-mix per tutti i campioni da colorare. Incubare le cellule a 4 ° C per 20 min. Proteggere da light.Note: Importo di ciascun anticorpo dovrà essere ottimizzato. Noi abitualmente macchia per CD56, CD3, γδ, CD4, CD8, CD14. Volumi titolati per questi anticorpi sono riportati in Tabella 1.
- Aggiungere 1 ml di citometria a flusso buffer per ogni provetta. Spin cellule per 5 min a 500 x g. Rimuovere surnatanti.
- Aggiungere 100 ml di soluzione di cytofix / Cytoperm ad ogni provetta. Incubare le cellule per 20 min a 4 ° C. Proteggere dalla luce.
- Aggiungere 1 ml di tampone perm / lavaggio (fornito come concentrato 10x - portare a 1x con DDH 2 O) ad ogni provetta. Spin cellule per 5 min a 500 x g. Rimuovere surnatanti.
- Aggiungere 100 μl di perm / lavaggio in tubi anticorpo colorazione controllo FMO e mescolare per risospendere le cellule.
- Aggiungere 100 ml di tampone perm / lavaggio con una concentrazione pretitolata degli anticorpi coniugati a fluoroforo marcatori intracellulari desiderati (ad esempio, citochine / chemiochine) a tubi pieni di anticorpi colorazione.
Nota: Quantità di ciascun anticorpo dovrà essere ottimizzata. Noi abitualmente macchia con anti-TNF e anticorpi anti-IFNγ. Volumi titolati per questi anticorpi sono riportati in Tabella 1. - Incubare tutte le provette per 30 min a 4 ° C. Proteggere dalla luce.
- Aggiungere 1 ml di tampone Perm / Wash ad ogni provetta. Spin cellule per 5 min a 500 x g. Rimuovere surnatanti.
- Risospendere le cellule in 300 microlitri citometria a flusso tampone con 1% paraformaldeide. Lasciate riposare per un minimo di 15 minuti per neutralizzare l'HIV.
- Preparare anticorpi singolo campioni colorati utilizzando sfere di compensazione, da utilizzare per la compensazione allestita sul citofluorimetro. Il tipo di compensazioneperline dipenderanno anticorpi usati (es., anti-topo Ig anti-topo / criceto Ig). Perline Vortex. Aggiungere una goccia di perle per anticorpi. Aggiungere la stessa quantità di anticorpi usati per la colorazione. Aggiungere 200 ml di citometria a flusso buffer. Questi sono ora pronti per l'uso. Non c'è bisogno di lavare le perline.
- Acquisire campioni su un citometro a flusso il più presto possibile e comunque entro 24 ore per ottenere risultati ottimali. Coloranti tandem sono suscettibili di dissociazione con stoccaggio quindi si consiglia di acquisizione immediata, se possibile.
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Representative Results
I grafici rappresentano i livelli di produzione IFNγ da cellule NKT (figura 2), utilizzando CD56 + CD3 + γδ- cancelli avere la popolazione di cellule NKT (dati non mostrati). Le cellule sono state coltivate per 72 ore prima della colorazione. Una volta macchiati, 100.000 cellule CD3 + sono state acquistate sul citofluorimetro di ottenere abbastanza grandi popolazioni di NK, NKT e cellule γδ (cellule di interesse). Un minimo di 5.600 cellule NKT sono visualizzate su ogni grafico. Produzione di TNF è ottenuta nello stesso modo (dati non mostrati). I grafici dimostrano chiaramente che la produzione di IFNγ è più bassa nelle cellule da HIV (+) individui rispetto all'HIV (-) individui esposti a PfRBC.
Citometria a flusso analisi è molto soggettivo. E 'quindi essenziale avere tutti i comandi appropriati per ciascun esperimento (vedere Figura 2). Livelli di fondo sono calcolate utilizzando i campioni di FMO, che permette per una rappresentazione fedele della colorazione citochine.Cellule stimolate con PMA / Ionomicina sono stati utilizzati come controllo positivo (dati non mostrati). PMA e Ionomicina sono forti stimolatori della produzione di citochine delle cellule T. La mancanza di produzione di IFNγ in questi campioni sarebbe più probabile indica un problema con il protocollo di colorazione. Tuttavia, altre variabili come la vitalità cellulare o reagenti inattivi possono anche essere in difetto.
Figura 1. Rappresentazione di Ficoll gradiente post scissione che dimostra la posizione del PBMC.
Figura 2. la produzione di IFN γ da parte delle cellule Natural Killer T. I diagrammi di flusso sono stati ottenuti su gating CD56 + CD3 + γδ- cellule (minimo di 5.600 eventi). Produzione di IFNγ è rilevabile nelle HIV (-) campione stimolato conP. falciparum infetta i globuli rossi. Questa risposta citochina non è più evidente nel contesto di una infezione cronica da HIV è. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il nostro protocollo è stato ottimizzato al fine di studiare più realisticamente la co-infezione HIV-malaria in vitro. In primo luogo, i globuli rossi umani freschi e siero sono necessari per la cultura parassita della malaria. Questo è fondamentale per ottenere una popolazione sana di parassiti della malaria. Lisati parassiti non possono essere sostituiti per i parassiti dal vivo come la produzione di citochine è molto più rapido e intenso quando si utilizza dal vivo P. falciparum infettato RBC (PfRBC) 17,18. Inoltre, l'attivazione di tipi di cellule, come le cellule NK, richiede PfRBCs interi, e non funziona in modo efficiente con lisati parassita. Ciò può essere dovuto alla necessità di un contatto diretto tra il PfRBC e leucociti o può essere dovuto alla natura instabile dei ligandi parassita derivato che interagiscono con i recettori della superficie cellulare 18. Culture Malaria PfRBC devono essere ben sincronizzati (protocollo 4) prima dell'esperimento. PfRBCs sincronizzati migliorano la riproducibilità dei dati sperimentali. Anche se questo protocollo describi l'uso di fase vegetativa PfRBC per co-coltura, che possono essere facilmente modificati per lo studio di fase anello PfRBC.
Leucociti umani possono essere artificialmente infettati da HIV, e questo metodo è stato utilizzato in studi di malaria-HIV co-infezione ricerca 20. Tuttavia, questo non modella il disregolazione immunitaria che deriva da infezione cronica da HIV. In questo sistema di co-coltura usiamo PBMC isolate da soggetti umani che sono cronicamente infettati con HIV-1. Quando i partecipanti sono necessarie per uno studio, è importante scegliere con attenzione questa popolazione. I criteri di inclusione ed esclusione sono di vitale importanza per garantire la variabilità minima e massima riproducibilità. I nostri criteri includevano una chiara definizione di infezione cronica da HIV (HIV-infetti per> 1 anno, con CD4 + T-cellule count declino di> 50 cellule / mm 3 / anno) e l'esclusione di chiunque con una infezione concomitante. Ciò ha garantito che i risultati ottenuti potrebbero essere attribuiti cosìlely all'effetto di infezione cronica da HIV, e non un'altra infezione. Inoltre, dal momento che eravamo interessati a risposte immunitarie innate di malaria sono stati esclusi i donatori che hanno avuto precedente infezione della malaria.
Controlli non infetti da HIV sono utilizzati anche per ogni HIV (+) del donatore, in ogni punto del tempo di campionamento, per consentire la normalizzazione dei dati. Un tentativo dovrebbe essere fatto per abbinare i controlli ai rispettivi donatori di HIV (+) per almeno età, ma preferibilmente anche il sesso (anche se nel nostro precedente studio di 12 non abbiamo osservato una differenza significativa nei sottogruppi di cellule o le risposte citochine tra femminile e maschile HIV partecipanti non infetti). Se prospettico campionamento è previsto mantenendo lo stesso controllo non infetti da HIV per ogni punto di tempo di campionamento è benefico. Le risposte possono variare da esperimento a esperimento a causa di molteplici fattori, tra cui la salute dei PfRBCs, il loro grado di sincronizzazione, livello di parassitemia e stadio di maturità di PfRBCs, e il livello di ematocrito. Curadevono essere prese per mantenere come molti di questi coerente tra esperimenti. Normalizzare ad un controllo non infetti da HIV consente una certa contabilità per queste variabili.
Utilizzando cellule fresche è fondamentale per evitare risultati artificiali. Campioni congelamento e scongelamento possono avere un impatto significativo sulla vitalità cellulare 21,22, la produzione di citochine 23-26 e fenotipica superficie cellulare marcatori 27.
Se monociti sono di particolare interesse, è importante che il vetro non viene utilizzato durante il protocollo. I monociti aderiscono al vetro e molti altri materiali plastici 28. Usiamo pipette in polipropilene di plastica, pipette, tubi e tutto per ridurre al minimo monociti aderenza e la rimozione definitiva da parte dei nostri popolazioni cellulari studio.
Quando si imposta la citometria a flusso dosaggio, qualsiasi combinazione di anticorpi può essere utilizzato a seconda delle cellule di interesse. Eravamo particolarmente interessati a IFNγ e TNF produzionedalle cellule NK, cellule NKT e cellule T γδ. Questo definisce il nostro pannello di anticorpi. Tuttavia, se si utilizza una combinazione diversa, è importante per ottimizzare la quantità di anticorpi per ogni pannello. Ciò è di vitale importanza per evitare dati errati. Inoltre, per evitare la variabilità e accertare la validità, QOR sono necessari per valutare i livelli di citochine di fondo per ogni condizione (RBC, PfRBC, medio, e PMA / Ionomicina) e la popolazione partecipante (HIV (-) e l'HIV (+), figura 2). Misurare in vitro la produzione di citochine intracellulari di solito si traduce in alti livelli di fondo, soprattutto quando le cellule sono state coltivate prima della colorazione. Dal momento che le condizioni di coltura influenzano i livelli di fondo, QOR adeguate garantiscono la conoscenza del livello di fondo per ogni campione. La nostra fornitura di cellule era limitata, quindi abbiamo progettato i nostri QOR a contenere tutte le macchie superficiali, ma senza macchie intracellulari. Questo consente il raffronto specifico dei livelli di citochine su tutti i diversi tipi cellulari studiate.Abbiamo anche eseguito una sola macchia per esperimento per ciascuno dei marcatori di superficie per confermare i loro livelli di fondo.
Il protocollo descritto è una versatile, che può essere usato per esaminare le risposte entro ore o giorni a seconda delle cellule di interesse. Per ottimale la produzione di citochine PfRBC indotta dai linfociti innate, abbiamo misurato la citometria a flusso in uscita dopo 2 o 3 giorni. Se si guarda a monociti, si raccomanda punti di tempo prima (1 o 2 giorni). Questo sistema consente più tipi di cellule e le risposte delle cellule da distinguere mediante citometria di flusso, le risposte secretoria a essere misurati in surnatanti cellulari, e profili di espressione deve essere valutata in RNA estratto. Inoltre, l'uso di anticorpi per bloccare specifici recettori o neutralizzare citochine possono essere utilizzati in questo sistema per sezionare ulteriormente i meccanismi. Abbiamo utilizzato con successo l'IL-18 blocco del recettore di coinvolgere IL-18 recettore nelle risposte IFNγ PfRBC-indotta 12. Questo sistema rappresenta un realistaMetodo ic con cui valutare una serie di risposte immunitarie innate alla malaria nel contesto dell'infezione da HIV.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alanine | Sigma | A7377 | |
| antibodies (see other table) | |||
| BD Cytofix/Cytoperm with BD GolgiPlug | BD | 555028 | includes brefeldin A, cytofix/cytoperm buffer and perm/wash buffer |
| BD Vacutainer ACD Solution A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer Sodium Heparin | BD | 17-1440-02 | |
| DPBS (no calcium, no magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | heat inactivate before use |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| gentamycin (10 mg/ml) | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 Staining Set | Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| Ionomycin | Sigma | I3909 | |
| MEM non-essential amino acids (10 mM) | Gibco | 11140 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| RPMI-1640 powder | Life-Technologies | 31800-022 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine and HEPES | Thermo Scientific | SH30255.01 | |
| sodium bicarbonate (powder, cell culture) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360 | |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T6066 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| Trypan Blue (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843, 552845 | depends on antibodies used |
| Parasite Gas Mixture | By special order | 3% CO2, 1% O2, balance N2 | |
| Equipment | |||
| 0.2 μm filter unit | |||
| Glass slides | |||
| T25 flasks | |||
| T75 flasks | |||
| 50 ml tubes | |||
| 24 well culture plates | |||
| unplugged Pasteur pipettes | |||
| plugged Pasteur pipettes | |||
| sterile transfer pipettes | |||
| hemocytometer | |||
| flow cytometer (3 laser) | |||
| Antibodies used for flow cytometry | |||
| Anti-TNF | eBiosciences | 551487 | FITC (fluorophore) 2 μl |
| Anti-IFNγ | Biolegend | 506507 | PE (fluorophore) 20 μl |
| Anti-CD8 | Biolegend | 300914 | PE-Cy7 (fluorophore) 1 μl |
| Anti-CD14 | Biolegend; BD Biosciences | 325624; 551487 | Biotin (fluorophore) 0.5 μl Streptavin PE-TR (fluorophore) 0.1 μl |
| Anti-CD56 | Biolegend | 318322 | PerCP/Cy5.5 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-γδ | Biolegend | 331212 | APC (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD3 | Biolegend | 300426 | APC-Cy7 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD4 | Biolegend | 317424 | Pacific Blue (fluorophore) 1 μl |
References
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