Abstract
Membran receptor-ligand-interaktioner medierer mange cellulære funktioner. Bindende kinetik og nedstrøms signalering udløses af disse molekylære interaktioner er sandsynligvis påvirkes af den mekaniske miljø, hvor binding og signalering finde sted. En nylig undersøgelse viste, at mekanisk kraft kan regulere antigen-genkendelse ved og udløsning af T-celle receptor (TCR). Dette blev muliggjort af en ny teknologi, vi udviklet og betegnet fluorescens biomembran force sonde (fBFP), som kombinerer enkelt molekyle force spektroskopi med fluorescens mikroskopi. Ved hjælp af en ultra-bløde menneskelige røde blodlegemer som følsomme force sensor, en high-speed kamera og real-time imaging sporing teknikker, den fBFP er ~ 1 pN (10 -12 N), ~ 3 nm og ~ 0,5 ms i kraft, rumlig og tidsmæssig opløsning. Med fBFP, kan man præcist måle enkelt receptor-ligand bindende kinetik under force regulering og samtidig billede binding-udløst intracellulær calcium signalering på en enkelt levende celle. Denne nye teknologi kan anvendes til at studere andre membran-receptor-ligand-interaktion og signalering i andre celler under mekanisk regulering.
Introduction
Celle-til-celle og celle-til-ekstracellulære matrix (ECM) adhæsion medieres af binding mellem celleoverfladereceptorer, ECM-proteiner og / eller lipider 1. Binding tillader celler at danne funktionelle strukturer 1, samt erkende, kommunikere og reagerer på miljøet 1-3. Modsætning opløselige proteiner (f.eks cytokiner og vækstfaktorer), der binder fra en tredimensional (3D) væskefase onto celleoverfladereceptorer, celleadhæsionsreceptorer danne bindinger med deres ligander på tværs af en smal forbindelsesepitop kløft at bygge bro to modstående overflader, der begrænser molekylære diffusion i en todimensionel (2D) grænseflade 4-7. I modsætning til 3D-kinetik, der almindeligvis måles på traditionel bindingsanalyser (f.eks overfladeplasmonresonans eller SPR), at 2D kinetik har kvantificeres med specialiserede teknikker såsom atomic force mikroskopi (AFM) 8-10, flow kammer 11,12, mikropipette 13,14, optiskpincet 15 og biomembran force probe (BFP) 16-21.
Mere end blot at give fysisk kobling til cellulær samhørighed, adhæsionsmolekyler er en vigtig del af signaleringen maskiner til cellen til at kommunikere med sine omgivelser. Der har været stigende interesse for at forstå, hvordan ligand-engagementet af adhæsionsmolekyler initierer intracellulær signalering og hvordan det første signal transduceres inde i cellen. Intuitivt egenskaber receptor-ligand-binding kan påvirke de signaler den fremkalder. Det er imidlertid vanskeligt at dissekere mekanistiske relationer mellem den ekstracellulære interaktion og intracellulære signalsystemer begivenheder ved hjælp af traditionel ensemble af biokemiske analyser på grund af deres mange begrænsninger, f.eks en dårlig tidsmæssig opløsning og den fuldstændige mangel på rumlig opløsning. Eksisterende metoder, der tillader både biofysiske (2D-receptor-ligand binding kinetik) og biokemiske (signalanlæg) bemærkninger om levendeceller omfatter substrater af justerbar stivhed 22, elastomer søjle arrays 23 og flow kammer / mikrofluidenheder indarbejdet med fluorescens kapacitet 24-26. , Udlæsninger af signalering og receptor-ligand binding har dog skal indhentes separat (oftest ved forskellige metoder), hvilket gør det vanskeligt at dissekere tidsmæssige og rumlige relationer obligations- karakteristika med signalering begivenheder.
Konventionel BFP er en ultrasensitiv kraft spektroskopi med høj opløsning Spatiotemporal 17. Det bruger en fleksibel røde blodlegemer (RBC) som en kraft sensor, hvilket muliggør måling af enkelt-molekyle 2D kinetik, mekaniske egenskaber og konformationelle ændringer 14,16,19-21,27-29. En fluorescerende billeddannelse baseret BFP (fBFP) korrelerer de receptor-ligand bindingskinetik med bindingen-udløste cellesignalering ved enkelt-molekyle skala. Med denne opsætning in situ cellesignalering aktiviteter i forbindelse med overfladen generelt mekaniskcal-stimulering blev observeret i T-celler 27. Den fBFP er alsidig og kan bruges til undersøgelser af celleadhæsion og signalering medieret af andre molekyler i andre celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger retningslinjerne fra og er blevet godkendt af den menneskelige videnskabsetisk komité af Georgia Institute of Technology.
1. Menneskelig RBC Isolation, Biotinylering og Osmolaritet Justering
Bemærk: Trin 1.1 skal udføres af en uddannet læge, såsom en sygeplejerske, med en Institutional Review Board godkendte protokol.
- Opnåelse 8-10 pi (én dråbe) af blod fra stik i fingeren, og der tilsættes til 1 ml af carbonat / bicarbonat-buffer (tabel 1 og 2). Blidt vortexes eller pipettere blandingen og centrifugeres i 1 min ved 900 x g. Supernatanten kasseres og vask en gang mere.
- I en lille bægerglas afvejes 3,5-4 mg Biotin-PEG3500-NHS linker (tabel 1). Opløs det i carbonat / bicarbonat-buffer for at gøre slutkoncentrationen 3 mg / ml.
- Bland 171 pi carbonat / bicarbonatbuffer, 10 pi RBC pack og 1049 piBiotin-PEG3500-NHS-linker-opløsning og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter. Vask RBC en gang med carbonat / bicarbonat-buffer og derefter to gange med N2-5% puffer (tabel 1 og 2).
- I mellemtiden placere linker flaske med løsnet hætte i et glas vakuumtørreskab fyldt med tørremidler i bunden og vakuum i 5 minutter, og fylde ekssikkator med argon. Spænd hætten og tage flasken ud. Forsegle flasken med plastik paraffin film (tabel 1), som anbringes i en beholder fyldt med tørremidler på bunden og opbevares i -20 ° C.
Bemærk: De trin, der indebærer anvendelse af Biotin-PEG3500-NHS-linker, herunder 1,2-1,4 (bortset fra inkubation og vask i 1.3), skal udføres så hurtigt som muligt. - Fortynd nystatin i N2-5% buffer til at lave en endelig koncentration på 40 pg / ml. Bland 5 pi biotinyleret RBC med 71,4 pi nystatin (tabel 1) opløsning og inkuberes i 1 time ved 0 &# 176; C. Vaskes to gange med N2-5% puffer og opbevares med N2-5% puffer + 0,5% BSA (tabel 1) i køleskab (4 ° C).
2. Glas Bead silanisering
- Rensning af perleoverfladen
- 50 mg af glasperler pulver og vejer re-suspendere dem i 500 pi destilleret vand.
- Bland 0,5 ml 30% H 2 O 2 (tabel 1) med 9,5 ml Dl-vand i et 50 ml bægerglas, hvorefter der tilsættes 2 ml koncentreret NH4OH (tabel 1) og bringe denne opløsning til en kedel på en varm plade .
- Tilføj glasperlerne til kogende opløsning og fortsætte med at koge i yderligere 5 min. Vend forsigtigt løsningen hver min.
- Efter kogning, overføre ~ 5 ml denne varme perlesuspension af i en 15 ml mikro-centrifugerør og top op med RT DI vand. Centrifugeres ved 3.500 xg i 5 min, fjerne og kassere supernatanten.
- Overføre yderligere 5 ml varm perlesuspensionen og føje til de vaskede perler, Top op med mere DI vand, bland godt, og centrifugeres igen. Gentag denne fremgangsmåde, indtil ca. 50 ml DI vand anvendes, som vil være i alt 4 til 5 ganges vask.
- Overfør perlen suspension i en 1 ml hætteglas. Gentag vask af perlerne med methanol (tabel 1) ved centrifugering ved 17.000 x g i 5 min til 3 gange, og endelig genopslæmmes perler i 1 ml 100% methanol.
- Bead Surface Thiolering
- Til en 50 ml centrifugeglas tilsættes 45,6 ml methanol, 0,4 ml eddikesyre (tabel 1), 1,85 ml DI-vand, 1,15 ml 3-mercaptopropyltrimethoxysilan (MPTMS) (tabel 1) og 1 ml perler suspension fremstillet i 2,1, derefter inkuberes ved stuetemperatur i 3 timer.
- Efter reaktionen fjerne alle reaktanterne ved vask en gang med frisk methanol, og re-suspendere perlerne i 500 pi methanol. Denne koncentrerede glaskugle suspension Jævnt opdele i et sæt af 20 rene og tørre hætteglas medskruelåg. Afdampes methanolen ved hjælp af en stråle af tør argon og langsomt rotere hætteglassene, således at et tyndt lag af tørre perler på siderne af hvert hætteglas.
- Placer hætteglas med perler i en forvarmet tørreovn ved 120 ° C i 5 minutter og derefter tage ud og hurtigt placere hætten (r) løst på. Placer hætteglassene i et glas vakuumekssikkator fyldt med tørremidler i bunden og støvsuge ekssikkator med en vakuumpumpe indtil afkølet.
- Rense støvsuges ekssikkator med tør argon at bringe ekssikkator til normal atmosfærisk tryk. Fjern ekssikkator låget og hurtigt spænd dækslet (e) på hætteglasset. Forsegl hætteglas med plastic paraffin film og gemme dem ved RT i et tørt mørkt opbevaringsboks.
- Ved umiddelbar brug, tage et hætteglas af tørre perler og vask en gang med phosphatbuffer (tabel 1 og 2), re-suspendere i 50 pi phosphatbuffer og opbevares ved 4 ° C. Denne koncentrerede bead præparat vil blive henvist tilsom "MPTMS perler" i de følgende trin.
Bemærk: Med korrekt opbevaring, kunne MPTMS perler forbliver funktionel i op til tre måneder.
3. Bead Funktionalisering
- Covalent Belægning Proteiner på perler
- Tage et vist volumen (f.eks 2,5 ul) af proteinet materiel og blandes med samme volumen carbonat / bicarbonat-buffer for at gøre Løsning 1.
Bemærk: volumen afhænger af koncentration af stamopløsning og den ønskede endelige tæthed af proteinet på perler overflade. - I en lille bæger vejer 2-3 mg MAL-PEG3500-NHS linker (tabel 1) og opløs det med carbonat / bicarbonatbuffer for at nå en endelig koncentration på 0,231 mg / ml.
- Bland Løsning 1 med et tilsvarende volumen af linkeren opløsning fremstillet i 3.1.2. Inkuber blandingen ved stuetemperatur i 30 minutter for at gøre Løsning 2.
- I mellemtiden placere linker flaske med løsnet hætte i et glas vakuumekssikkator filled med tørremidler i bunden og vakuum i 5 minutter, og fylde ekssikkator med argon. Spænd hætten og tage flasken ud. Forsegle flasken med plastik paraffin film, læg det i en beholder fyldt med tørremidler på bunden og butik i -20 ° C.
Bemærk: De trin, der indebærer anvendelse af MAL-PEG3500-NHS-linker, herunder 3.1.2-3.1.4 (bortset fra inkubation i 3.1.3), skal ske så hurtigt som muligt. - Bland 5 pi MPTMS perler med Løsning 2 og tilsæt phosphatbuffer (tabel 1) for at foretage en endelig volumen på 250 pi.
- Inkuber perlerne natten over ved stuetemperatur, vaskes 3 gange med phosphatbuffer, og re-suspendere i 100 pi phosphat-buffer og opbevares ved 4 ° C.
- Tage et vist volumen (f.eks 2,5 ul) af proteinet materiel og blandes med samme volumen carbonat / bicarbonat-buffer for at gøre Løsning 1.
- Forberedelse protein / Streptavidin (SA) Coated Perler
- Følg protokol 3.1.1-3.1.4.
- Bland 5 pi MPTMS perler med Løsning 2 og 5 pi 4 mg / ml streptavidin-maleimid (SA-MAL) (tabel 1) Opløsning og derefter tilføje phosphatbuffer at foretage en endelig volumen på 250 pi.
- Inkuber perlerne natten over ved stuetemperatur, vaskes 3 gange med phosphatbuffer, og endelig re-suspendere i 100 pi phosphat-buffer og opbevares ved 4 ° C.
- Belægning Streptavidin onto Glasperler
- Bland 5 pi MPTMS perler med 5 pi af 4 mg / ml SA-opløsning, og der tilsættes 140 pi phosphatbuffer.
- Inkuber perlerne natten over ved stuetemperatur, vaskes 3 gange med phosphatbuffer, og re-suspendere i 50 pi phosphatbuffer og opbevares ved 4 ° C.
- Belægning af SA Belagt Perler med en Biotinylated Protein
- Bland 5 pi SA-overtrukne perler med proteinet (volumen afhængigt af den ønskede belægning densitet) og tilsæt phosphatbuffer at foretage den endelige volumen til at være 100 pi.
- Inkuber blandingen natten over ved 4 ° C eller i 3 timer ved stuetemperatur, vaskes 3 gange med phosphatbuffer, og re-suspendere i 50 pi phosphate buffer og opbevares ved 4 ° C.
4. Cell Fremstilling
Bemærk: For at oprense celler, følger standardprocedurer celle oprensningsprotokoller svarende til den type celler i anvendelse, for eksempel T-celler 27 eller visse cellelinier 21,29.
- For fBFP eksperimenter, når cellen suspension fremstilles, tilsættes fura2-AM (Tabel 1) opløst i DMSO til cellesuspensionen for at nå en slutkoncentration på 2 uM, inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur og derefter vaske én gang. Dette fluorescens indlæst cellesuspension holde mørke indtil brug.
5. Forberedelse til Mikropipetter og en Cell Chamber
- Forberedelse Mikropipetter
- Skåret lange kapillære glasrør (tabel 1) med et glas cutter i korte stykker af omkring 3 inches i længden. Mount et stykke på mikropipette aftrækker (tabel 1), klik på "Pull", menton, således at midten af kapillarrøret vil blive opvarmet af maskinen, og kapillarrøret vil blive trukket på de to ender for at lave to kapillærer med skarpe spidser (rå Mikropipetter).
Bemærk: Ved at følge produktets retningslinje, den ønskede morfologi rå pipette har 6-8 mm taper og 0,1-0,5 um spids. - Montere en rå pipette onto pipette indehaveren af mikropipetten smedje (tabel 1). Varme til at smelte glas kugle på smedje. Sæt spidsen af rå pipette inde i glas kugle. Køl ned i glasset kugle og træk den rå pipette til at bryde det udefra og lade spidsen inde i kuglen. Gentag denne procedure, indtil den ønskede spids åbning opnås.
Note: Eksempler på en mikropipettespids indre diameter: 2,0-2,4 um for en RBC, ~ 1,5 um for en vulst, ~ 2-4 um for en T-celle og -7 um for en hybridomcelle.
- Skåret lange kapillære glasrør (tabel 1) med et glas cutter i korte stykker af omkring 3 inches i længden. Mount et stykke på mikropipette aftrækker (tabel 1), klik på "Pull", menton, således at midten af kapillarrøret vil blive opvarmet af maskinen, og kapillarrøret vil blive trukket på de to ender for at lave to kapillærer med skarpe spidser (rå Mikropipetter).
- Opbygning af en Cell Chamber
Bemærk: cellen kammeret er bygget på grundlag af et hjem-made kammer holder, som består af to stykker metal kvadrater (kobber / aluminium) og et håndtag, der forbinder dem sammen (figur 1D). - Skær en 40 mm x 22 mm x 0,2 mm dækglas under anvendelse af et glas cutter i to 40 mm x 11 mm x 0,2 mm stykker (dækglas 1 og 2). Lim dækglasset 1 af fedt på oversiden af holderen kammeret på den måde, at det danner bro de to metal firkanter, og ligeledes lim dækglas 2 til den nederste side, som vil danne et parallelt dækglas celle kammer (figur 1D).
- Brug en pipette til at injicere 200 pi eksperimentel buffer i mellem de to dækglas. Sørg for, at bufferen tillægger begge dækglas. Forsigtigt rotere og ryste kammeret til at lade bufferen røre begge ender af kammeret.
- Omhyggeligt injicere mineralsk olie i begge sider af kammeret flankerer eksperimentelle stødpudezone derved forsegle bufferen fra det fri. Injicere suspensioner af probe perler (f.eks pMHC-overtrukne perler), RBC'er og mål(for eksempel T-celler) i de øverste, mellemste og nederste regioner af bufferzonen hhv.
6. BFP eksperiment
Figur 1: fBFP samling (A) En oversigt billede af fBFP hardwaresystem.. (B) En skematisk tegning af fBFP hardwaresystem. (C) Den dobbelte-cam system "DC2" (orange), hvorpå højhastighedstog kamera (blå) og en fluorescens kamera (hvid) blev monteret. (D) mikroskopbordet der tilpasser et eksperiment kammer og tre mikropipette manipulation systemer. (E og F) mikrografier af BFP indstilling i en eksperimentel kammer. (E) Mikropipetter samling viser sonden pipette (til venstre), target pipette (øverst til højre) og hjælper-pipette (lavere røjre). (F) Probe bead placering. En sonde perle blev manipuleret af en hjælper pipette og fastgjort til en RBC apex til at danne en kraft sonde. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Tænd mikroskop (tabel 1) og lyskilden. Placer kammeret på de vigtigste mikroskopbordet (figur 1A, D).
- Installere alle tre mikropipetter af BFP (figur 1D venstre:. Sonde, at få fat i en RBC, højre: target, at få fat i en celle eller perle, nederst til højre: hjælper, at få fat i en perle).
- Brug en mikro-injektor (tabel 1) for at efterfylde en mikropipette med eksperimentel puffer. Tag pipetten holder (tabel 1) og hold den på et lavere sted at lade vand dryp fra spidsen. Indsæt hurtigt mikropipetten i holderen spids og sørg luftbobler kommer ind i mikropipetteunder indføringen. Spænd skrue.
- Montere hver pipette holderen på dens tilsvarende mikro-manipulator. Skub mikropipette mod kammeret, således at deres spidser ind i kammeret bufferområde. Justere placeringen af mikropipetten og finde dem under mikroskop synsfelt.
- Flyt rundt indehaveren kammer scenen for at finde de kolonier af tre elementer (RBC'erne, målene og sonden perler) en efter en. Justere placeringen af den tilsvarende mikropipette ved at dreje på håndtagene på de manipulatorer at lade spidsen af mikropipette tilgang en celle / perle. Aspirere cellen / perle ved at justere trykket inde i tilsvarende mikropipette. Alle tre mikropipetter vil fange deres tilsvarende elementer.
- Flyt rundt indehaveren kammer scenen for at finde en åben plads væk fra kolonier af de injicerede elementer, hvor forsøget skal udføres. Skift mikroskopet visuelle tilstand for at visualisere billedet på compputer program på computerskærmen. Flyt alle tre elementer på pipettespidser i programmet felt vision.
- Juster sonden vulst og RBC, og omhyggeligt manøvrere sonden vulst til spidsen af RBC, kortvarigt ramme vulsten på RBC og forsigtigt trukket tilbage. Justere trykket af hjælper-mikropipetten til forsigtigt blæse perlen væk, så det vil stå limet på RBC apex (figur 1F). Gå væk hjælperen mikropipetten og tilpasse målet og sonde perle (figur 2A).
Figur 2:. BFP ordningen og dens prøvecyklus (A) Video-mikrograf skildrer en kraft sonde (til venstre) og et mål T-celle (højre) indsugning af deres respektive pipettes.The stationære kraft sonde består af en opsvulmet RBC og en vedhæftet ligand-bærende vulst. Den receptor-bærendeT-celle (mål) er monteret på en piezotranslator rettet modsat sonden. ROI er angivet med grønt. Kanten tracker er angivet i en blå linie. Indsatsen viser ligand (pMHC, perle side) og (TCR, T-celle side) par på de to modstående flader i området markeret med orange. (B) Intensiteten profil af vulsten kant i (A). ROI-regionen i x -retning plottes som x aksen (i pixel nummer) og lysintensiteten (i grå skalaværdi) i gennemsnit ved binning 30 pixels langs y -retning. (C) Den afbøjning af RBC og positionen af perlen og målet (T-celle) i en testcyklus force clamp-assay. De lodrette og vandrette stiplede linjer angiver nul-force position af RBC spids og tidsforløbet hhv. Linjen kant tracker af RBC deformation er vist med blåt i hvert panel. De samme endnu færre trin vedtages i vedhæftning frekvensassay (som mangler trinnene "klemme" og "dissociere") og termisk udsving assay (som mangler trinnet "dissociere").
- På programmet i synsfeltet vinduet bruge værktøjerne i programmet til at måle den respektive radier af sonden mikropipetten (Rp), RBC (R 0), det cirkulære kontaktområde mellem RBC og sonde vulst (Rc) , som tillader estimeringen af fjederkonstanten af RBC (k) ved den følgende ligning 17,30,
hvor Δ p er trykket ved aspiration probe pipettespids.
Bemærk: Det fremgår af Hookes lov at bindingen kraft, F, kan kvantificeres ved produktet af fjederkonstant og forskydning af sonden vulst (d), dvs., F = d (Figur 2C). - Indtast den ønskede RBC fjederkonstant i programmet (Se protokollen afsnit 6.6. Fjederkonstanten typisk sat til 0,25 eller 0,3 pN / nm for den kraft klemme assay og vedhæftning frekvens analyse og 0,1 pN / nm til termiske udsving assay) , hvilket vil returnere en krævet aspiration tryk i enheden centimeter vand. Justere højden af vandtanken, links til sondens pipette, indtil den ønskede opsugning tryk er nået.
- Tegn en vandret linie gennem RBC spids, hvilket vil give en kurve i den tilstødende vindue angiver lysstyrken (gråskala værdi) af hver pixel langs denne linje. Træk tærsklen linje at være på omkring halvdelen af dybden af kurven (figur 2A, B).
Bemærk: Den mindste punkt på lysstyrken kurven under tærskelværdien linje angiver placeringen af perlen grænse, således kun en lokal minimum er tilladt. Hvis to eller flere lokale minima i øjeblikket, er detangiver, at billedet ikke er optimal (sandsynligvis på grund af det billede er ude af fokus, eller en dårlig tilpasning mellem sonden perle og RBC). - Vælg den ønskede eksperiment mode: termisk udsving assay, vedhæftning frekvens analyse eller force clamp assay. Indstil parametrene som ønsket (f.eks impingement kraft = 15 PN, lastning hastighed = 1.000 PN / s, kontakttid = 1 sek, lukkekraft = 20 pN (til kraft klemme assay), etc).
- Klikke på "Start", som gør det muligt for programmet at flytte målet pipette og drive målet i og ud af kontakt med proben (se Repræsentative resultater sektionen for detaljer). Dataindsamling vil blive udført parallelt, som registrerer positionen af sonden perle i realtid. Stoppe programmet ved at klikke på knappen "Stop eksperiment", på hvilket tidspunkt et vindue vil poppe ud for at tillade at gemme de indsamlede data.
7. Fluorescens BFP (fBFP) eksperiment
- Hvis du vil bruge fluorescence funktion af BFP-systemet, tænde excitationslyskilden (tabel 1), og fluorescensen kamera (tabel 1), som kontrolleres af et særskilt program (tabel 1). På programmet, skal du vælge parametrene for fluorescens billeddannelse, herunder gevinst, eksponering, excitation kanaler (i dette tilfælde, 340 nm og 380 nm lys), osv. Følg alle præparater i BFP eksperimentet protokollen, herunder justering af sonden og målet, hvilket vil give mulighed for visualisering af målcellen levende fluorescerende billede ophidset af 340 nm eller 380 nm excitation lys.
- Brug sektionering redskab til groft sektionen område, hvor cellen vil bo under hele optagelsen periode.
Bemærk: På grund af brugen af den fremgangsmåde-contact-tilbagetrækning cyklus vil cellen være bevægelige frem og tilbage gentagne gange, således snit område er meget større end selve cellen. - Klik på "Record" for at tillade 340 nm end 380 nm lys til skiftevis at excitere den intracellulære fluorescens farvestof (fura2), og et par tilsvarende fluorescensbilleder bliver skiftevis registreres ca. en gang hvert sekund. Samtidig skal du klikke på "Start" i programmet for at starte BFP eksperimentet til analyse molekylære interaktion og fluorescens imaging eksperiment for at overvåge intracellulær calcium signalering. Systemet vil producere en rå datafil for receptor-ligand-binding (se figur 6A nedenfor), og en serie af fluorescerende billeder i .tiff format for calcium signaler.
8. Data Analysis
- BFP Dataanalyse
- Dataanalyse for vedhæftning frekvens assay
- Sekventielt inspicere hver cyklus er "force vs. tid" signal og blot registrere hvilke cykler indeholder en vedhæftning hændelse og hvilke der ikke gør, og opsummere at give en gennemsnitlig vedhæftning frekvens.
- Opsaml brud kraft af hver vedhæftning begivenhed, somer den maksimale værdi af den lineært skrå kraft inden bond brud. Efter indsamling af en tilstrækkelig mængde af ruptur kræfter i en række opvarmningstakter, udlede brud kraftfordeling ved hver rampe sats hvorfra kraft-afhængige off-rate af receptor-ligand dissociation afledes ved hjælp dynamisk kraft spektroskopianalyse 18,31.
- Dataanalyse for termisk udsving assay
- Sekventielt inspicere klemmende fasesignal af hver cyklus, som sandsynligvis indeholder flere binding association og dissociation begivenheder. Brug klemmende fase termiske udsving niveau (den gennemsnitlige standardafvigelse for en glidende interval på 70 sekventielle tidspunkter af perlen holdning) i "kraft vs. tid" signal som en guide til at skelne mellem binding association og dissociation begivenheder, eftersom en binding dannelse svarer til et fald i den termiske udsving.
- Udpeg intervallet fra det øjeblik af obligation dissociation (når thermal udsving genoptager til normale niveau) til det øjeblik af den næste bindingsdannelse som ventetid, og udpege varigheden af obligationen fra sin forening til dissociation som bond levetid, der begge indsamles under inspektionen data. Beregn den gennemsnitlige ventetid og gennemsnitlig bond levetid, hvilket henholdsvis afspejler den reciprokke af den sats, og at af off-rate under nul-force 16,30.
- Dataanalyse for force clamp assay
- Optag parametre alle levetid begivenheder, herunder den gennemsnitlige kraft og bond levetid med løbenummeret samt starttidspunkt og sluttidspunkt, som vil give en til at tegne en kumulativ levetid kurve (f.eks figur 6C, gul kurve).
- Saml en tilstrækkelig mængde levetid begivenheder under en række af kræfter. Gruppere dem i forskellige kraft skraldespande, som vil producere en gennemsnitlig levetid i hvert force bin, og tilsammen give en "gennemsnitlige levetid vs. kurve force "(figur 4).
- Dataanalyse for vedhæftning frekvens assay
- Calcium fluorescens Imaging Dataanalyse
- Justere tærsklen intensitet indtil fluorescensbilleder viser en klar kontur af cellen i både 340 nm og 380 nm kanaler uden baggrundsstøj (figur 5A, B). Derefter gennemgå den intracellulære Ca2 + signal ramme for ramme med en pseudo-farve, som indikerer intensitetsniveau (figur 6B), som er afledt ud fra intensiteten forholdet 340 nm / 380 nm, for at generere den "normaliserede Ca2 + intensitet vs . tid "kurve (figur 6C). Brug pseudo-farve fluorescensbilleder at producere en film, der viser fluorescensniveauet sekund for sekund.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BFP teknik blev udviklet af Evans laboratorium i 1995 17. Har Denne picoforce værktøj blevet ekstensivt anvendt til at måle interaktioner af proteiner immobiliseret på overflader, således at analysere todimensionale kinetik for adhæsionsmolekyler interagere med deres ligander 16,19,20, 30, for at måle molekylær elasticitet 21,29, og til at bestemme protein konformationsændringer 21. For en fBFP, et ekstra sæt epi-fluorescens-relaterede enheder med tilhørende softwaresystem (tabel 1) er tilføjet (Figur 1A - C).
Den fBFP systemet består af en hardware-system (optiske, mekaniske og elektriske komponenter) og et softwaresystem (tabel 1 og figur 1A, B). Et omvendt mikroskop (figur 1A, midten) med optiske komponenter muliggør lysfeltsbillede og epi-fluorescensmikroskopi udgør hoveddelen afDen fBFP systemet, hvorpå eksperimentet scenen og pipettespidser manipulatorer er monteret. En fluorescens lyskilde controller (figur 1A, øverste venstre hjørne) anvendes til at levere alternerende excitation lys. En dobbelt-cam system "DC2" opdeler lyset i to og sender dem til en højhastigheds-kamera (blå) og en fluorescens kamera (hvid) (figur 1A, nederst til venstre). Førstnævnte indsamler sonden billedet for positionsbestemmelse og sidstnævnte indsamler fluorescensbilleder udsendes fra målcellen ved to bølgelængder. Forsøget overvåges og styres af to computere, hvoraf Host PC 1 (figur 1A, øverste højre hjørne, beskåret i billedet på grund af plads begrænsning) er forbundet til både high-speed kamera og fluorescens kamera og er ansvarlig for eksperiment udførelse og dataopsamling, og Host PC 2 er forbundet med overvågning kamera og ansvarlig for at præsentere en fuld visning af BFP erfaling (figur 1A, B).
Under et eksperiment, den experimentalist bruger tre mikropipetter at gribe og manipulere celler og mikrosfærer (figur 1E, F). En typisk billede af en BFP eksperiment består af en kraft probe, som er samlet ved at fastgøre en sonde perle på spidsen af en indsugningsmonitor RBC, og en målcelle / vulst (figur 2A). En region af interesse (ROI), som indeholder kantområdet af perlen på RBC apex, spores ved en hurtig hastighed kamera (2.000 fps) for at overvåge deformation af RBC i realtid. Den sporede forskydning af vulsten kan derefter anvendes til at beregne den ydre kraft, der udøves på den kraft probe (se note i protokollen afsnit 6.6), da fjederkonstanten af BFP (figur 2A, B).
Vedhæftning frekvens assay termisk udsving assay og kraft clamp-assay er de tre almindeligt anvendte eksperimentelle tilstande på et BFP system. Ved annoncevælger en af disse tre tilstande, er en BFP eksperiment sammensat af gentagne test cyklusser, der udføres sekventielt.
I vedhæftning frekvens assay målet nærmer og kontakter proben vulst på et givet kontakttid (fx 1 sek) og trækker direkte tilbage til den oprindelige position og starte den næste cyklus. En vedhæftning begivenhed afspejles af en trækkraft signal under retraktionsfasen. Denne tilgang-kontakt-tilbagetrækning cyklus gentages 50 gange i mindst 3 target-probepar til at beregne en gennemsnitlig SEM af vedhæftning frekvens, P a.
Termisk udsving assay anvendes til levetidsmålinger under nul-kraft. I hver cyklus, efter berøring af sonden vulst, er målet trukket tilbage til nul-force position og fastspændt i berøring med vulsten uden hverken kompression eller spænding i 20 sekunder, og derefter vender tilbage til den oprindelige position for at starte den næste cyklus. Bond forening / dissociation under nul-force ermanifesteret som et pludseligt fald / stigning i de termiske fluktuationer i perlen 16,30.
Kraft klemme assay anvendes til levetid målinger under kræfter. En ønsket klemkraft (fx 20 PN) er indstillet før forsøget. Målet er drevet flere gange for at kontakte proben bead for en given kontakttid (fx 1 sek) for at tillade dannelse af et receptor / ligand-binding (figur 2C, Paneler 2 og 3) og derefter trække (figur 2C, Panel 4 ). Hvis der dannes ingen binding, hvilket afspejles på ingen trækkraft signal på RBC, eller hvis obligationslån brister før nå den forudindstillede fastspænding kraft, vil målet vende tilbage til den oprindelige position, og start den næste cyklus. I de bindende begivenheder, der overlever tilbagetrækning fase er målet afholdt på lukkekraft med en tilsvarende forlængelse af RBC ved d indtil obligations- dissocierer (Figur 2C, Paneler 5 og 6), og vender derefter tilbage til den oprindelige position at starte den næste cyklus (figur 2C, panel 7). Levetid er defineret som tidsintervallet fra det tidspunkt, hvor kraften nået det ønskede niveau til det øjeblik af obligation dissociation 20.
For alle disse tre BFP eksperimentelle tilstande, bør experimentalist kunne se tilgangen-griber ind-kontakt-retract- (klemme -) (dissociate-) tilbagevenden test cyklus (figur 2C), som vil blive gentaget til flere gange 16,20 , 21.
Data indsamlet fra hver eksperimentel form for BFP kunne analyseres på forskellige måder for at udlede de ønskede resultater. Den gennemsnitlige levetid kurve er en repræsentativt resultat fra force clamp-assay (figur 4). Det afspejler de gensidige off-rates for receptor-ligand dissociation under kræfter. Termisk udsving analysen muliggør en karakterisering af 2D on-rate og off-rate af en receptor-ligand-par under nul-force 16; mens vedhæftning frequency assay gør 2D on-sats, off-rate og affinitet under nul-force 13.
Tilføjelsesprogrammet af fluorescensen visualiseringsfunktion muliggør overvågning af intracellulær Ca2 + niveau af en enkelt celle, der anvendes som udlæsning af cellesignalering i dette system. For at bruge denne funktion under et fBFP eksperiment, er man nødt til at pre-indlæse celler med et Ca 2+ indikator. I tilfælde af fura2-AM er det fluorescerende farvestof, blev fluorescens billeder af den samme celle under 340 nm og 380 nm excitation kanaler registreres skiftevis i eksperimentet og inspiceret pair-by-par i analysen. En intensitet tærskel fik hver kanals fluorescerende billede for at fjerne baggrundsstøj og genkende cellen kontur (figur 5). Sammenligning af hvert par af de fluorescensafbildninger giver mulighed for beregning af den intracellulære Ca2 + niveau. Klare fluorescerende billeder af cellen under både 340 nmog 380 nm excitations- kanaler er nødvendige til nøjagtig måling af Ca2 + niveau (figur 5A, B), mens dårlige billeder med ikke uvæsentlige baggrundsstøj vil resultere i skæve resultater og bør undgås (figur 5C).
Ved at indføre styrbare mekaniske stimuleringer på cellen og optage celle-Ca2 + niveau samtidigt, den fBFP giver en kraftfuld enkelt molekyle værktøj til at studere mekanisk-transduktion på en levende celle. Det er værd at bemærke, at platformen er beskrevet her er ganske alsidig; i princippet kan man designe talrige måder at anvende kraft til cellen at passe til særlige formål, og samtidig overvågning af forskellige signalsystemer begivenheder af interesse. Kraft-afhængige kinetiske detaljer analyseres derefter i forbindelse med den valgte signalering udlæsning til at udtrække karakteristika kraft-regulerede receptor-ligand kinetik, den inducerede signalering og deres korrelation. I eksemplet i TCR SIGnaling blev en agonist-specifikke TCR-pMHC catch binding først opdaget og derefter dens relevans for T-celle-Ca2 + flux blev undersøgt 27. Strategien var at tage spidsværdien af Ca2 + flux som signaleringen udlæsning til at søge sin bedste forudsigelse mellem forskellige kinetiske parametre, herunder antallet af adhæsioner, kraftamplituden af bindingen, den gennemsnitlige levetid, den længste levetid og den kumulative levetid sekventielt dannede bindinger. Vist i figur 6 er et eksempel på samtidig konstateret individuel bond levetid (hvor en klemkraft på 10 pN blev anvendt), i en T-celle og deres akkumulering sammen med den tilsvarende Ca2 + signal kurve. I dette tilfælde forekom fire levetid begivenheder forud for det tidspunkt, hvor Ca2 + niveauer begyndte at hæve ved 55 sek, akkumulere en sum af 10-anden binding levetid. Dette niveau af livet akkumulering udløste en Ca2 + signal med et toppunkt på normaliseret fura2 forholdpå 1,8, der fandt sted ved 65 sek. En systematisk matematisk analyse af sådanne oplysninger er indsamlet fra mange individuelle celler viste, at den bedste korrelat for Ca 2+ signalering styrke er levetider kumulerede i 1. minut af gentagne TCR-pMHC interaktioner (se Referencer 27 for tekniske detaljer).
Figur 3: Eksemplarisk tid-force rå data kurver af en no-vedhæftning begivenhed (A), et brud force begivenhed (B) og en levetid begivenhed (C). Forskellige faser af cyklussen og de tilsvarende kurve segmenter er henholdsvis mærket i hvert panel. Den kraft (y- aksen) er afledt af spore positionsændring af sonden vulst, som vist i figur 2C. (A) nr vedhæftning: den komprimerende (negativ) kraft i kontakt fase returnerer to nul ved tilbagetrækning. (B) En brud force begivenhed: en trækstyrke (positiv) kraft trækker via receptor-ligand-binding til langstrakte RBC, som sprænger under retraktionsfasen. (C) En levetid begivenhed: obligationen varer indtil lukkekraft er nået, og dissocieres derefter. Varigheden af levetiden begivenheden markeres. Bruddet force begivenhed (B) og begyndelsen af levetid begivenhed (C) er fremhævet med en asterisk.
Figur 4:. "Gennemsnitlig levetid vs. kraft" kurve af OT1 T-celle interaktion med dens agonist OVA (grøn) og antagonist G4 (blå) er De samlede data grupperet i forskellige kraft skraldespande, og middelværdien ± SEM af obligations- levetider er afbildet versus kraft.
Figur 5:. Repræsentant Ca2 + billeder exciteret ved to bølgelængder (A, B) Korrekt billede genkendelse af en T-celle (angivet med rødt) i 340 nm (A) og 380 nm (B) kanaler baseret på punkt-til- pege screening ved anvendelse af en korrekt tildelt intensitet tærskel. (C) Manglende mulighed for at anerkende fluorescens billede af en T-celle (angivet med rødt) i 340 nm excitation kanal, på grund af dårlig fura2 belastning.
Figur 6: overlejring af de "intracellulær Ca2 + niveau (relativ fura2 ratio) vs. tid" og "kumulative levetid vs. tid" kurver af en OT1 T-celle, generered ved gentagne gange at trykke T-cellen med en OVA-overtrukne kugler over 300 sekunder. (A) En kraft kurve, der viser en sekvens af ikke-adhæsion, ruptur kraft, og levetid events genereret af gentagne kontakter over tid. (B) Epi-fluorescens pseudo-farvebilleder af intracellulær Ca2 + signaler i T-celle på forskellige tidspunkter. Den normaliserede Ca2 + niveau angives af pseudo-farve skalaen til højre. (C) overlejring af Ca2 + signal kurve (rød) og den kumulative levetid kurven (gul) på samme tidsforløb. Ca2 + kurve blev plottet baseret på Ca2 + billeddannelse. En Ca2 + flux indikeres med en skarp stigning i det normaliserede fura2 forhold. Den tid, hvor Ca2 + når toppen er angivet med en punkteret linie. Starten for hver levetid begivenhed er markeret på den kumulative levetid kurve (fast trekant).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En vellykket fBFP eksperiment medfører nogle kritiske overvejelser. Først for den kraft beregning for at være pålidelige, mikropipetten, RBC, og sonden perle bør tilpasses så tæt til koaksial som muligt. Projektionen af RBC inde pipetten skal være omkring én probe pipette diameter, således at friktionen mellem RBC og pipetten er ubetydelig. For en typisk human RBC, den optimale pipette diameter er 2,0-2,4 um, som giver en bedste tilpasning af ligning 1 17,30. For det andet at sikre målinger i kraft clamp assay og termisk udsving assay er for det meste for enkeltbindinger, en vedhæftning frekvens under 20% har opretholdes 10,13,30. Her, bør ikke-specifikke sammenvoksninger kontrolleres omhyggeligt (normalt <5% af tilstrækkelig blokering med BSA). Desuden bør indsamles data kun fra friktion begivenheder med et enkelt force-drop - kendetegnende for en enkelt-molekyle adfærd (analogt med et enkelt trin forsvindenaf fluorescens i single-molekyle FRET). Tredje, lastning koncentration af fluorescens farvestof bør optimeres fra sag til sag at opnå den bedste billedkvalitet. For det fjerde skal undersøges nøje, inden hvert forsøg toksicitet farvestof lastning til T-celle eller andre celler af interesse. F.eks bindingsaffiniteten af receptor-ligand-interaktioner ved farvestof lastning skal måles og sammenlignes med, at uden farvestof lastning. Hvis bindingsaffiniteten ændre sig drastisk på grund dye loading, en anden farvestof eller en anden belastning koncentrationen overvejes. For det femte er terminalt biotin-mærkede proteiner foretrukket at tillade nem, specifik og stærk kobling, der bevarer proteinets native orientering.
En styrke ved fBFP er, at den udfører en enkelt-binding assay på en enkelt celle. På trods af den lille produktion, single-bond analyse ofte afdækker vigtige funktioner, der er utilgængelige ved konventionel ensemble migthods. For eksempel ved at undersøge levetiden fordeling på hvert kraft bin, kan man korrelere forskellige bindingskarakteristika med protein konformationelle stater, der giver indsigt i, hvordan kraft regulerer protein konformationsændringer 20,32. BFP kan også anvendes til at måle molekylær stivhed fra data kraften og piezo-oversætter forskydning af retraktionsfasen, som kan anvendes til at undersøge protein konformationelle dynamik 20,21.
Der er udviklet mange metoder til at studere receptor-medieret celleadhæsion og signalering. Receptor-ligand bindingskinetik måles generelt med rekombinante proteiner i fuldstændig isolation fra det cellulære miljø. Sådan praksis er potentielt problematisk. For eksempel er det for nylig blevet vist, at in situ kinetik målt på levende celler drastisk forskellig fra den, der måles under anvendelse af de tilsvarende rekombinante proteiner 14, afslører hidtil ukendte indsigter af receptoren & #8217 s cellulære funktioner. Ikke kun er fBFP stand til at kvantificere receptor-ligand kinetik in situ, men endnu vigtigere, kan det også samtidigt optage bindingen-induceret cellesignalering. Som påvist for TCR 27, de rige oplysninger om bindende egenskaber og cellesignalering opnået ved brug fBFP giver en enestående mulighed for at analysere deres forbindelser og forstå de molekylære mekanismer i mekanisk-transduktion. Det er sandsynligt, at fBFP vil finde flere anvendelser i andre vigtige receptor-ligand systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | N2-5% buffer preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | N2-5% buffer preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | N2-5% buffer preparation |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | N2-5% buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Bead functionalization |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Nystatin | Sigma-Aldrich | N6261 | RBC osmolarity adjustment |
| Ammonium Hydroxide (NH4OH) | Sigma-Aldrich | A-6899 | Glass bead silanization |
| Methanol | BDH | 67-56-1 | Glass bead silanization |
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | J. T. Barker | Jan-86 | Glass bead silanization |
| Acetic Acid (Glacial) | Sigma-Aldrich | ARK2183 | Glass bead silanization |
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology | 9002 | Glass bead functionalization |
| Streptavidin−Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Fura2-AM | Life Technologies | F-1201 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | BD LSR II | Density quantification |
| Capillary Tube 0.7-1.0 mm x 30 inches | Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette making |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | sutter instrument | P-97 | Micropipette making |
| Pipette microforce | Narishige | MF-900 | Micropipette making |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
| Micro-injector | World Precision Instruments | MF34G-5 | Chamber assembly |
| 1 ml syringe | BD | 309602 | chamber assembly |
| Micropipette holder | Narishige | HI-7 | Chamber assembly |
| Home-designed mechanical parts and adaptors fabrications using CNC machining. | Biophysics Instrument | All parts are customized according to the CAD designs. | BFP system |
| Microscope (TiE inverted) | Nikon | MEA53100 | BFP system |
| Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg) | Nikon | MRH00401 | BFP system |
| Camera, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, mono | Graftek Imaging | 02-2020C | BFP system |
| Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADC | Graftek Imaging | 02-2185A | BFP system |
| Manual submicron probehead with high resolution remote control | Karl Suss | PH400 | BFP system |
| Anti-vibration table (5’ x 3’) | TMC | 77049089 | BFP system |
| 3D manual translational stage | Newport | 462-XYZ-M | |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2012 SP5 | BFP system |
| LabVIEW software | National Instruments | Version 2009 | BFP system, BFP program |
| 3D piezo translational stage | Physik Instrumente | M-105.3P | BFP system |
| Linear piezo accuator | Physik Instrumente | P-753.1CD | BFP system |
| Micromanager software | Version 1.4 | fBFP system, fluorescence imaging program | |
| Dual Cam (DC-2) | Photometrics | 77054724 | fBFP system |
| Dual Cam emission filter (T565LPXR) | Photometrics | 77054725 | fBFP system |
| Fluorescence Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600-10B | fBFP system |
| Plastic paraffin film (Parafilm) | Bemis Company, Inc | PM996 | bottle sealing |
| Carbonate/bicarbonate buffer (pH 8.5) | 8.4 g/L sodium carbonate (Na2CO3), 10.6 g/L sodium bicarbonate (NaHCO3) | ||
| Phosphate buffer (pH 6.5-6.8) | 27.6 g/L NaPhosphate monobasic (NaH2PO4 • H2O), 28.4 g/L Anhy. NaPhosphate dibasic (Na2HPO4) | ||
| N2-5% buffer (pH 7.2) | 20.77 g/L potassium chloride (KCl), 2.38 g/L sodium chloride (NaCl), 0.13 g/L potassium phosphate monobasic (KH2PO4), 0.71 g/L anhy. sodium phosphate dibasic (Na2HPO4), 9.70 g/L sucrose |
References
- Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins. Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
- Dado, D., Sagi, M., Levenberg, S., Zemel, A. Mechanical control of stem cell differentiation. Regenerative medicine. 7, 101-116 (2012).
- Edwards, L. J., Zarnitsyna, V. I., Hood, J. D., Evavold, B. D., Zhu, C. Insights into T cell recognition of antigen: significance of two-dimensional kinetic parameters. Frontiers in immunology. 3, 86 (2012).
- Zhu, C., Jiang, N., Huang, J., Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D. Insights from in situ analysis of TCR-pMHC recognition: response of an interaction network. Immunological reviews. 251, 49-64 (2013).
- Huang, J., Meyer, C., Zhu, C. T. T cell antigen recognition at the cell membrane. Molecular immunology. 52, 155-164 (2012).
- Zarnitsyna, V., Zhu, C. T. T cell triggering: insights from 2D kinetics analysis of molecular interactions. Physical biology. 9, 045005 (2012).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).
- Marshall, B. T., et al. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423, 190-193 (2003).
- Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).
- Yago, T., et al. Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear. The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).
- Yago, T., et al. Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF. The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).
- Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).
- Huang, J., et al. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 (2010).
- Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).
- Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical. 68, 2580-2587 (1995).
- Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).
- Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib. Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).
- Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).
- Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells. The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophysical journal. 102, L5-L7 (2012).
- Bashour, K. T., et al. CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2241-2246 (2014).
- Nesbitt, W. S., et al. Distinct glycoprotein Ib/V/IX and integrin alpha IIbbeta 3-dependent calcium signals cooperatively regulate platelet adhesion under flow. The Journal of biological chemistry. 277, 2965-2972 (2002).
- Mazzucato, M., Pradella, P., Cozzi, M. R., De Marco, L., Ruggeri, Z. M. Sequential cytoplasmic calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by the glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor. Blood. 100, 2793-2800 (2002).
- Lefort, C. T., Ley, K. Neutrophil arrest by LFA-1 activation. Frontiers in immunology. 3, 157 (2012).
- Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling. Cell. 157, 357-368 (2014).
- Lou, J., et al. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. The Journal of cell biology. 174, 1107-1117 (2006).
- Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature communications. 5, 4886 (2014).
- Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).
- Marshall, B. T., Sarangapani, K. K., Lou, J., McEver, R. P., Zhu, C. Force history dependence of receptor-ligand dissociation. Biophysical. 88, 1458-1466 (2005).
- Xiang, X., et al. Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin. PloS one. 6, e27946 (2011).
