Abstract
Membran receptor-ligand interaktioner medierar många cellulära funktioner. Bindande kinetik och nedströms signalering utlöses av dessa molekylära interaktioner sannolikt påverkas av den mekaniska miljö där bindning och signalering sker. En ny studie har visat att mekanisk kraft kan reglera antigenigenkänning genom och triggning av T-cellreceptorn (TCR). Detta har möjliggjorts genom en ny teknik vi utvecklat och benämnd fluorescens biomembran kraft sond (fBFP), som kombinerar enda molekyl kraft spektroskopi med fluorescensmikroskopi. Använda en ultramjuk människa röda blodkroppar som den känsliga kraftsensor, en höghastighetskamera och realtids imaging spårningsteknik, är ~ 1 PN (10 -12 N), ~ 3 nm fBFP och ~ 0,5 msek i kraft, spatial och temporal upplösning. Med fBFP, kan man exakt mäta enskilda receptor-ligandbindande kinetik enligt gällande lagstiftning och samtidigt bildbindnings utlöst intracellulär kalcium signalering på en enda levande cell. Denna nya teknik kan användas för att studera andra membranreceptor-ligand-interaktion och signalering i andra celler under mekanisk reglering.
Introduction
Cell-till-cell och cell-till-extracellulära matrix (ECM) vidhäftning medieras genom bindning mellan cellytereceptorer, ECM-proteiner och / eller lipider 1. Bindning tillåter celler att bilda funktionella strukturer 1, såväl som att känna igen, kommunicera, och reagera på miljön 1-3. Till skillnad från lösliga proteiner (t.ex. cytokiner och tillväxtfaktorer) som binder från ett tredimensionellt (3D) fluidumfas på cellytereceptorer, celladhesionsreceptorer bilda bindningar med sina ligander över en smal Junktional gap att överbrygga två motstående ytor som begränsar molekyl diffusion i en tvådimensionell (2D) gränssnitt 4-7. I motsats till 3D kinetik som vanligen mätas med traditionella bindningsanalyser (t.ex. ytplasmonresonans eller SPR), 2D kinetik måste kvantifieras med specialiserade tekniker såsom atomkraftsmikroskopi (AFM) 8-10, flödeskammare 11,12, mikropipett 13,14, optiskpincett 15 och biomembran kraft sond (BFP) 16-21.
Mer än bara ge fysisk koppling för cellulär sammanhållning, adhesionsmolekyler är en viktig del av maskinen signalering för cellen att kommunicera med sin omgivning. Det har funnits ett ökande intresse för att förstå hur ligandengagemanget av adhesionsmolekyler initierar intracellulär signalering och hur den initiala signalen transduceras inuti cellen. Intuitivt, egenskaper hos receptor-ligandbindning kan påverka de signaler det inducerar. Det är dock svårt att dissekera mekanistiska relationer mellan den extracellulära interaktion och intracellulära signaleringshändelser med traditionell ensemble av biokemiska analyser på grund av sina många begränsningar, till exempel, en dålig tidsupplösning och den fullständiga bristen på rumslig upplösning. Befintliga metoder som gör att både biofysiska (2D-receptor-ligandbindande kinetik) och biokemiska (signalering) synpunkter på levandeceller innefattar substrat av avstämbara styvhet 22 elastomer pelaren matriser 23 och flödeskammare / mikrofluidikanordningar införlivas med fluorescens kapacitet 24-26. Men avläsning av signalering och receptor-ligandbindning måste erhållas separat (oftast genom olika metoder), vilket gör det svårt att dissekera temporala och rumsliga relationer obligations egenskaper med signaleringshändelser.
Konventionell BFP är en ultra kraft spektroskopi med hög Spatiotemporal upplösning 17. Den använder en flexibel röda blodkroppar (RBC) som en kraftsensor, som möjliggör mätning av enda molekyl 2D kinetik, mekaniska egenskaper och konformationsförändringar 14,16,19-21,27-29. En fluorescerande avbildning baserad BFP (fBFP) korrelerar receptor-ligandbindande kinetik med bindnings utlöst cellsignalering vid enda molekyl skala. Med denna inställning, in situ cellsignalering aktiviteter i samband med ytan mekanismer ochcal stimulering observerades i T-celler 27. Den fBFP är mångsidig och kan användas för studier av cellvidhäftning och signalering medieras av andra molekyler i andra celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer riktlinjer och har godkänts av den mänskliga forskningsetisk kommitté Georgia Institute of Technology.
1. Human RBC Isolering, Biotinylation och Osmolaritet justering
Obs: Steg 1.1 bör utföras av en utbildad läkare eller sjuksköterska som en sjuksköterska, med en Institutional Review Board godkänt protokoll.
- Skaffa 8-10 il (en droppe) av blod från fingerstick och tillsätt till 1 ml av karbonat / bikarbonatbuffert (tabell 1 och 2). Vortexa försiktigt eller pipettera blandningen och centrifugera i 1 min vid 900 x g. Kassera supernatanten och tvätta en gång till.
- I en liten bägare väga 3,5-4 mg Biotin-PEG3500-NHS linkern (tabell 1). Lös den i karbonat / bikarbonat-buffert för att göra den slutliga koncentrationen 3 mg / ml.
- Blanda 171 pl karbonat / bikarbonatbuffert, 10 pl RBC pack och 1049 ilBiotin-PEG3500-NHS-linker-lösning och inkubera vid RT i 30 min. Tvätta RBC gång med karbonat / bikarbonatbuffert och sedan två gånger med N2-5% buffert (tabell 1 och 2).
- Under tiden placerar linkern flaska med lossade lock i en glas vakuumexsickator fylld med torkmedel i botten och vakuum under 5 minuter, och fyll exsickatorn med argon. Dra åt locket och ta flaskan ur. Täta flaskan med plastparaffinfilmen (tabell 1), placera det i en behållare fylld med torkmedel på botten och förvara i -20 ° C.
Anmärkning: Stegen som inbegriper användningen av biotin-PEG3500-NHS-linker, inklusive 1,2-1,4 (utom för inkubation och tvätta i 1,3), måste utföras så snabbt som möjligt. - Späd nystatin i N2-5% buffert för att göra en slutlig koncentration av 40 mikrogram / ml. Blanda 5 il biotinylerad RBC med 71,4 pl av nystatin (tabell 1) lösning och inkubera under 1 timme vid 0 &# 176; C. Tvätta två gånger med N2-5% buffert och förvara med N2-5% buffert + 0,5% BSA (tabell 1) i kylskåp (4 ° C).
2. Pärlor silanisering
- Rengöring av pärlytan
- Väg upp 50 mg glaspärlor pulver och återsuspendera dem i 500 | il avjoniserat vatten.
- Blanda 0,5 ml 30% H 2 O 2 (tabell 1) med 9,5 ml avjoniserat vatten i en 50 ml bägare, tillsätt sedan 2 ml koncentrerad NH4OH (tabell 1) och föra denna lösning till en panna på en varm platta .
- Tillsätt glaspärlor till den kokande lösningen och fortsätta att koka i ytterligare 5 minuter. Snurra försiktigt lösningen var min.
- Efter kokning, överföra ~ 5 ml av denna heta pärlsuspensionen i en 15 ml mikro-centrifugrör och fyll på med RT DI vatten. Centrifugera vid 3500 xg under 5 minuter, ta bort och kasta supernatanten.
- Överför ytterligare 5 ml varm pärlsuspension och lägga till de tvättade pärlorna, Fylla på mer avjoniserat vatten, blanda väl och centrifugera igen. Upprepa denna procedur tills ca 50 ml avjoniserat vatten används, vilket kommer att vara totalt 4 till 5 gånger av tvätt.
- Överför pärlsuspensionen in i en 1 ml flaska. Upprepa tvättning av pärlorna med metanol (tabell 1) genom centrifugering vid 17.000 xg under 5 min för tre gånger, och slutligen återsuspendera pärlorna i en ml 100% metanol.
- Pärlytan Tiolering
- Till en 50 ml centrifugrör till 45,6 ml metanol, 0,4 ml ättiksyra (tabell 1), 1,85 ml avjoniserat vatten, 1,15 ml 3-merkaptopropyltrimetoxisilan (MPTMS) (tabell 1) och 1 ml pärlor suspension framställd i 2,1, sedan inkubera vid RT i 3 h.
- Efter reaktionen avlägsna alla reaktanterna genom tvättning en gång med färsk metanol, och återsuspendera pärlorna i 500 | il metanol. Jämnt dela denna koncentrerade glaspärla suspensionen i en uppsättning av 20 torra och rena glasflaskor medskruvlock. Avdunsta metanolen genom användning av en stråle av torr argon och rotera långsamt flaskorna så att ett tunt skikt av torra pärlor på sidorna av varje flaska.
- Placera rören av pärlor i en förvärmd torkugn vid 120 ° C under 5 min och sedan ta ut och snabbt placera locket (er) löst på. Placera rören i en glas vakuumexsickator fylld med torkmedel i botten och vakuum exsickatorn med en vakuumpump tills den svalnat.
- Töm dammsugas exsickator med torr argon för att få exsickatorn till normalt lufttryck. Ta exsickatorn locket och snabbt dra åt locket (s) på flaskan. Täta flaskorna med plastparaffinfilmen och förvara dem vid rumstemperatur i en torr mörk förvaringsbox.
- Vid omedelbar användning, ta en flaska av torra pärlor och tvätta en gång med fosfatbuffert (tabell 1 och 2), återsuspendera i 50 pl fosfatbuffert och förvara vid 4 ° C. Denna koncentrerade pärla förberedelse kommer att hänvisas tillsom "MPTMS pärlor" i följande steg.
Obs: Med rätt förvaring, kan MPTMS pärlor förblir funktionell för upp till tre månader.
3. Pärla Funktionalisering
- Kovalent Beläggning Proteiner på pärlor
- Ta en viss volym (t.ex., 2,5 | il) av proteinet lager och blanda med lika stor volym karbonat / bikarbonat-buffert för att göra Lösning 1.
Obs! Volymen beror på stamkoncentration och den önskade slutliga platsen densiteten hos proteinet på kulor ytan. - I en liten bägare väger 2-3 mg MAL-PEG3500-NHS länk (tabell 1) och lös den med karbonat / bikarbonatbuffert för att nå en slutlig koncentration av 0,231 mg / ml.
- Blanda Lösning 1 med en lika stor volym av linkern lösningen framställd i 3.1.2. Inkubera blandningen vid RT under 30 min för att göra Lösning 2.
- Samtidigt placerar länkflaska med lossade lock i ett glas vakuumexsickator filled med torkmedel i botten och vakuum under 5 minuter, och fyll exsickatorn med argon. Dra åt locket och ta flaskan ur. Täta flaskan med plast paraffin film, placera den i en behållare fylld med torkmedel på botten och förvara i -20 ° C.
Anmärkning: Stegen som innefattar användning av MAL-PEG3500-NHS-linker, inklusive 3.1.2-3.1.4 (med undantag för inkubering i 3.1.3), måste genomföras så snabbt som möjligt. - Blanda 5 il MPTMS pärlor med Lösning 2 och tillsätt fosfatbuffert (tabell 1) för att göra en slutlig volym av 250 ul.
- Inkubera pärlorna över natten vid RT, tvätta tre gånger med fosfatbuffert, och återsuspendera i 100 | il fosfatbuffert och förvara vid 4 ° C.
- Ta en viss volym (t.ex., 2,5 | il) av proteinet lager och blanda med lika stor volym karbonat / bikarbonat-buffert för att göra Lösning 1.
- Framställning protein / streptavidin (SA) belagda pärlor
- Följ protokoll 3.1.1-3.1.4.
- Blanda 5 il MPTMS pärlor med Lösning 2 och 5 | il av 4 mg / ml streptavidin-maleimid (SA-MAL) (Tabell 1) Lösning och tillsätt sedan fosfatbuffert för att göra en slutvolym av 250 | il.
- Inkubera pärlorna över natten vid RT, tvätta tre gånger med fosfatbuffert och slutligen återsuspendera i 100 | il fosfatbuffert och förvara vid 4 ° C.
- Beläggning Streptavidin på glaspärlor
- Blanda 5 il MPTMS pärlor med 5 pl av 4 mg / ml SA-lösning och tillsätt 140 | il fosfatbuffert.
- Inkubera pärlorna över natten vid RT, tvätta tre gånger med fosfatbuffert, och återsuspendera i 50 | il fosfatbuffert och förvara vid 4 ° C.
- Beläggning SA Coated Pärlor med en biotinylerad Protein
- Blanda 5 il SA belagda pärlor med proteinet (volym beroende på den önskade beläggningsdensitet) och tillsätt fosfatbuffert för att göra den slutliga volymen till vara 100 | j, l.
- Inkubera blandningen över natten vid 4 ° C eller under 3 timmar vid rumstemperatur, tvätta 3 gånger med fosfatbuffert, och återsuspendera i 50 | il phosphate buffert och förvaras vid 4 ° C.
4. Cellberedning
Obs! För att rena cellerna följa standardcellreningsprotokoll som motsvarar den typ av celler som används, till exempel T-celler 27 eller vissa cellinjer 21,29.
- För fBFP experiment, när cellsuspension framställes, till fura2-AM (tabell 1) upplöst i DMSO till cellsuspensionen för att nå en slutlig koncentration av 2 | iM, inkubera i 30 min vid RT och sedan tvätta en gång. Spara denna fluorescens laddas cellsuspensionen i mörkret fram till användning.
5. Förberedelser inför Mikro och en cellkammare
- Framställning Mikropipetter
- Klipp lång kapillär glasrör (tabell 1) med en glasskärare i korta bitar av cirka 3 inches i längd. Montera en bit på mikropipett avdragare (tabell 1), klicka på "Pull" menton, så att mitten av kapillären kommer att värmas upp av maskinen och kapillären att dras på de två ändarna för att göra två kapillärer med skarpa spetsar (råa mikropipetter).
Obs: Genom att följa produkten riktlinje, den önskade morfologin av rå pipetten har 6-8 mm avsmalning och 0,1-0,5 um spets. - Montera en rå pipett på pipetten innehavaren av mikropipett forge (tabell 1). Värm för att smälta glaskula på ässjan. In spetsen på den råa pipetten inuti glaskula. Kyl ner glaskula och dra rå pipetten för att bryta det från utsidan och lämnar sin spets inuti sfären. Upprepa denna procedur tills den önskade spetsöppningen erhålls.
Obs: Exempel på en mikropipett spets innerdiameter: 2,0-2,4 pm för en RBC, ~ 1,5 pm för en pärla, ~ 2-4 pm för en T-cell och -7 pm för en hybridomcell.
- Klipp lång kapillär glasrör (tabell 1) med en glasskärare i korta bitar av cirka 3 inches i längd. Montera en bit på mikropipett avdragare (tabell 1), klicka på "Pull" menton, så att mitten av kapillären kommer att värmas upp av maskinen och kapillären att dras på de två ändarna för att göra två kapillärer med skarpa spetsar (råa mikropipetter).
- Att bygga en cellkammare
Anm: cellkammaren är byggd på basis av en hem-made kammarhållare, som består av två bitar av metall rutor (koppar / aluminium) och ett handtag som kopplar ihop dem (Figur 1D). - Skär en 40 mm x 22 mm x 0,2 mm täckglas med användning av en glasskäraren i två 40 mm x 11 mm x 0,2 mm bitar (täckglas 1 och 2). Lim täckglas 1 med fett på sidan av kammaren hållaren på det sätt som den överbryggar de två metall fyrkanter, och på liknande sätt limma täckglas 2 till bottensidan, som kommer att bilda en parallell-täckcellkammare (figur 1D).
- Använd en pipett för att injicera 200 pl experimentella buffert mellan de två täck. Se till att bufferten fäster båda täck. Rotera försiktigt och skaka i kammaren för att låta bufferten röra båda ändar av kammaren.
- Försiktigt injicera mineralolja i båda sidor av kammaren som flankerar den experimentella buffertzonen och därigenom tätar buffert från det fria. Injicera suspensioner av sondpärlor (t.ex. pMHC-belagda pärlor), RBC och mål(till exempel T-celler) i de övre, mellersta och nedre regionerna i buffertzonen respektive.
6. BFP experimentet
Figur 1: fBFP enheten (A) En översiktsbild av maskinvarusystem fBFP.. (B) En schematisk ritning av maskinvarusystem fBFP. (C) Den dubbla kamerasystemet "DC2" (orange) på vilken höghastighetskamera (blå) och en fluorescens kamera (vit) monterades. (D) Den mikroskop scenen som anpassar ett experiment kammare och tre mikropipett manipulation system. (E och F) mikrofotografier av inställningen BFP i en experimentell kammare. (E) Mikro församling visar sond pipett (vänster), mål pipett (uppe till höger) och hjälpare pipett (lägre right). (F) Probe pärla placering. En sond pärla manipulerades av en hjälpare pipett och fäst vid en RBC spets för att bilda en kraft sond. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Slå på mikroskopet (tabell 1) och ljuskällan. Placera kammaren på huvudmikroskopsteget (figur 1 A, D).
- Installera alla tre mikropipetter av BFP (Figur 1D vänster:. Sonden, för att ta en RBC, höger: mål, att ta en cell eller pärla, nedre högra: hjälpare, att ta en kula).
- Använd en mikro-injektor (tabell 1) för att återfylla en mikropipett med experimentell buffert. Ta av pipetten hållaren (tabell 1) och håll den på en lägre plats så att vatten droppar från spetsen. Snabbt sätta mikropipett i hållaren spets och se till att ingen luftbubbla kommer in mikropipettunder införingen. Dra åt hållarens skruv.
- Montera varje pipett hållare på dess motsvarande mikro manipulator. Skjut mikropipett mot kammaren så att deras spetsar in i kammaren buffertarean. Justera positionen för mikropipett och hitta dem under mikroskop synfält.
- Flytta runt kammarhållaren scenen för att hitta de kolonier av tre element (RBC, målen och sondpärlor) en efter en. Justera positionen för motsvarande mikropipett genom att vrida rattarna på manipulatorerna att låta spetsen på mikropipett tillvägagångssätt en cell / pärla. Aspirera cellen / vulsten genom att justera trycket inuti den motsvarande mikropipett. Alla tre mikropipetter kommer att fånga deras motsvarande element.
- Flytta runt kammarhållaren scenen för att hitta en öppen plats från kolonierna av de injicerade elementen där experimentet kommer att utföras. Växla mikroskop visuellt läge att visualisera bilden på computer programmet på datorskärmen. Flytta alla tre element på pipettspetsar i programmets synfältet.
- Rikta in sond pärla och RBC, och försiktigt manövrera sonden pärla till toppen av RBC, kort träffa strängen på RBC och försiktigt dra tillbaka. Justera trycket på hjälpare mikropipett att försiktigt blåsa pärlan bort, så att det kommer att lämnas limmas på RBC spetsen (figur 1F). Flytta bort hjälpare mikropipett och rikta in målet och sondpärla (Figur 2A).
Figur 2:. BFP systemet och dess testcykeln (A) Video-mikroskop visar en kraft sond (vänster) och ett mål T-cell (höger) sugs av deras respektive pipettes.The stationär kraft sond består av en svullen RBC och en bifogad ligand bärande vulst. Den receptorbärandeT-cell (mål) är monterad vid en piezotranslator inriktad motsatt sonden. ROI indikeras i grönt. Kant tracker visas i en blå linje. Insatsen visar liganden (pMHC, pärla sidan) och receptor (TCR, T-cellssidan) par på de två motstående ytor i området markerat i orange. (B) intensitetsprofilen av vulsten kant i (A). ROI-regionen i x-riktningen plottas som x-axel (i antal pixlar) och ljusintensiteten (i gråskalevärdet) genomsnitt av binning 30 pixlarna utefter y-riktningen. (C) Avböjningen av RBC och läget hos vulsten och målet (T-cell) i en provcykel av force clamp-analys. De vertikala och horisontella streckade linjerna anger noll-kraft position RBC spets och tidsförloppet, respektive. Linjen kant tracker av RBC deformation visas i blått i varje panel. Samma ännu färre steg antas i vidhäftning frekvensanalysen (som saknar stegen i "klämma" och "separera") och termisk fluktuation analys (som saknar steget "ta avstånd").
- På programmet i synfältet fönstret använda verktygen i programmet för att mäta respektive radier av sonden mikropipett (Rp), RBC (R 0), den cirkulära kontaktytan mellan RBC och sondpärla (R c) , som tillåter en uppskattning av fjäderkonstanten hos RBC (k) med följande ekvation 17,30,
där Δ p är aspirations trycket vid sond pipettspetsen.
Obs: Det framgår av Hookes lag att bindningskraften, F, kan kvantifieras genom produkten av fjäderkonstanten och förskjutning av sonden vulst (d), dvs F = d (Figur 2C). - Ange önskad RBC fjäderkonstanten i programmet (Se protokoll avsnitt 6.6. Fjäderkonstanten är typiskt satt till 0,25 eller 0,3 pN / nm för frekvensanalys kraftkläm analysen och vidhäftning och 0,1 pN / nm för den termiska fluktuationer analys) , som återkommer ett erforderligt aspiration tryck i enheten centimeter vatten. Justera höjden på vattentank som länkar till sondens pipetten tills önskat aspire trycket har uppnåtts.
- Rita en horisontell linje över RBC spetsen, som kommer att ge en kurva i den intilliggande fönster anger ljusstyrka (gråskalevärdet) för varje pixel längs denna linje. Dra tröskellinjen att vara på omkring halva djupet av kurvan (figur 2A, B).
Obs: Den minsta punkt på ljuskurvan under tröskellinjen indikerar läget för pärla gränsen, alltså bara en lokalt minimum är tillåtet. Om två eller flera lokala minima är för närvarande detanger att bilden inte är optimal (troligen på grund av att bilden är ur fokus, eller en dålig anpassning mellan sonden pärla och RBC). - Välj önskad experiment läge: termisk fluktuation analys vidhäftning frekvensanalys eller kraft klämma analys. Ställ in parametrar som önskas (t.ex. anslagskraft = 15 PN, lastning hastighet = 1.000 pn / s, kontakttid = 1 sekund, klämkraft = 20 PN (för kraft klämma test), etc).
- Klicka på "Start", vilket gör att programmet för att flytta målet pipett och driva målet i och ut ur kontakt med sonden (se Representativa resultat för detaljer). Datainsamling kommer att utföras parallellt, som registrerar positionen av sonden pärla i realtid. Stoppa programmet genom att klicka på knappen "Stopp experiment", vid vilken tidpunkt ett fönster kommer att dyka upp för att göra det möjligt att spara insamlade data.
7. Fluorescens BFP (fBFP) experimentet
- Om du vill använda fluorescence funktion av BFP-systemet, slå på exciteringsljuskällan (tabell 1) och fluorescens kameran (tabell 1), vilka styrs av ett separat program (tabell 1). På programmet, välj parametrarna för fluorescens avbildning, inklusive vinst, exponering, exciteringskanaler (i detta fall, 340 nm och 380 nm ljus), osv. Följ alla förberedelser i BFP experimentet protokollet, inklusive rikta proben och målet, vilket kommer att möjliggöra visualisering av målcellen levande fluorescerande bild upphetsad av 340 nm eller 380 nm excitationsljus.
- Använd sektioneverktyget att grovt avsnittet det område inom vilket cellen kommer att stanna under hela registreringsperioden.
OBS: På grund av användningen av metoden-kontakt-indragningscykel, kommer cellen att vara framåt och bakåt upprepade gånger, alltså sektione området är mycket större än själva cellen. - Klicka på "Record" för att tillåta 340 nm end 380 nm ljus för att omväxlande excitera intracellulära fluorescens färgämne (fura2), och ett par av motsvarande fluorescensbilder kommer att växelvis registreras ungefär en gång per sekund. Samtidigt klicka på "Start" i programmet för att börja BFP experimentet för analys molekylär interaktion och fluorescens avbildning experiment för att övervaka intracellulär kalciumsignalering. Systemet kommer att producera en rådatafil för receptor-ligand-bindning (se figur 6A nedan) och en serie av fluorescerande bilder i .tiff format för kalciumsignaler.
8. Data Analysis
- BFP Data Analysis
- Dataanalys för vidhäftning frekvensanalys
- Sekventiellt inspektera varje cykel är "kraft som funktion av tiden" signal och helt enkelt spela in vilka cykler innehåller en vidhäftnings händelse och som inte gör det, och sammanfatta för att ge en genomsnittlig vidhäftning frekvens.
- Samla bristning andet av varje vidhäftnings händelse, somär toppvärdet av linjärt sluttande kraft innan obligations brott. Efter uppsamling av en tillräcklig mängd av brottstyrkorna i ett intervall av ramphastigheter, härleda brottkraftfördelning vid varje ramphastighet från vilket kraften beroende av-hastighet av receptor-ligand-dissociation är härledd med användning av dynamisk kraft-spektroskopi-analys 18,31.
- Dataanalys för termisk fluktuationer analys
- Sekventiellt inspektera kläm fassignal av varje cykel, vilka sannolikt innehåller multipla bindnings associations- och dissociations händelser. Använd kläm fas termisk fluktuation nivå (den genomsnittliga standardavvikelsen för en glidande intervall på 70 sekventiella punkter tid av pärlan läge) i "kraft som funktion av tiden" signal som en guide för att skilja de obligations associations- och dissociation händelser, eftersom en obligation bildning motsvarar en minskning i den termiska fluktuationer.
- Utse intervallet från det ögonblick då obligations dissociation (när finsMal fluktuation återgår till normal nivå) till tidpunkten för nästa bindning som väntetid, och utse varaktighet obligationen från dess anslutning till dissociation som obligations livstid, som båda samlats in under inspektionen uppgifter. Beräkna den genomsnittliga väntetiden och den genomsnittliga obligations livstid, som respektive speglar det reciproka värdet av den ränta och off-rate under noll-kraft 16,30.
- Dataanalys för kraft klämma analys
- Rekord Parametrarna för alla livstid händelser inklusive den genomsnittliga kraft och obligations livslängd med sekvensnumret samt starttid och sluttid, vilket gör att man rita en kumulativ livstids kurva (till exempel figur 6C, gul kurva).
- Samla en tillräcklig mängd livstid händelser under ett intervall av krafter. Gruppera dem i olika kraftpapperskorgar, som kommer att producera en genomsnittlig livslängd på varje kraft bin, och helt och hållet ge en "genomsnittlig livslängd vs. kraft "kurvan (Figur 4).
- Dataanalys för vidhäftning frekvensanalys
- Kalcium fluorescens Imaging Data Analysis
- Justera tröskelintensiteten tills fluorescens bilder visar en tydlig kontur för cellen i både 340 nm och 380 nm kanaler utan bakgrundsbrus (figur 5A, B). Sedan igenom den intracellulära Ca2 + signal ram för ram med en pseudo-färg som indikerar intensitetsnivån (Figur 6B), som är beräknad på det intensitetsförhållande av 340 nm / 380 nm, för att generera den "normaliserade Ca2 + intensiteten mot . tid "kurvan (figur 6C). Använd pseudo-färg fluorescens bilder för att producera en film som visar fluorescensnivån sekund för sekund.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den BFP-teknik var uppfunnen av Evans laboratorium i 1995 17. Denna picoforce verktyg har i stor utsträckning använts för att mäta interaktioner mellan proteiner immobiliserade på ytor, för att analysera tvådimensionella kinetiken för adhesionsmolekyler interagera med deras ligander 16,19,20, 30, för att mäta molekyl elasticitet 21,29, och för att bestämma proteinkonformationsförändringar 21. För en fBFP, en extra uppsättning av epi-fluorescens-relaterade enheter med den motsvarande programvarusystem (tabell 1) tillsätts (Figur 1A - C).
Den fBFP systemet består av en maskinvarusystem (optiska, mekaniska och elektriska komponenter) och ett programvarusystem (Tabell 1 och Figur 1A, B). Ett inverterat mikroskop (Figur 1A, mitten) med optiska komponenter som gör det möjligt ljusfält och epi-fluorescensmikroskopi utgör huvuddelen avden fBFP systemet, på vilken experimentet steget och pipett manipulatorer är monterade. En fluorescens ljuskälla controller (Figur 1A, övre vänstra hörnet) används för att leverera alternerande exciteringsljus. En dubbel-CAM-system "DC2" delar upp ljuset i två och överför dem till en höghastighetskamera (blå) och en fluorescens kamera (vit) (Figur 1A, nedre vänstra hörnet). Den förstnämnda samlar sond bilden för positionsbestämning och senare samlar in fluorescens bilder som avges från målcellen vid två våglängder. Experimentet övervakas och kontrolleras av två datorer som värdpersondatorn 1 (Figur 1A, övre högra hörnet, beskärs i bilden på grund av geografiskt begränsade) är ansluten till både höghastighetskamera och fluorescens kameran och är ansvarig för utförandet experiment och datainsamling, och värdpersondatorn 2 är förbunden med övervakningskameran och ansvarig för att presentera en fullständig bild av BFP erfaning (Figur 1A, B).
Under ett experiment använder experimentalist tre mikropipetter att greppa och manipulera celler och mikrosfärer respektive (Figur 1E, F). En typisk bild av en BFP experimentet består av en kraft sond, som är monterad genom att fästa en sond pärla på spetsen av ett aspirerat RBC, och en målcell / vulst (Figur 2A). En region av intresse (ROI), som innehåller kantområdet av vulsten på RBC spetsen, spåras av en snabb hastighet kamera (2000 fps) för att övervaka deformationen av RBC i realtid. Den spårade förskjutningen av vulsten kan sedan användas för att beräkna den externa kraft som utövas på den kraft sond (se anmärkningen i protokollet avsnitt 6.6), eftersom fjäderkonstanten hos BFP (figur 2A, B).
Adhesion frekvensanalys, termisk fluktuation analys och kraft klämma analys är de tre vanligen använda experimentella lägen på en BFP systemet. Genom annonsväljer någon av dessa tre lägen, är en BFP experiment som består av upprepade testcykler som utförs sekventiellt.
I vidhäftningsfrekvensanalys, närmar sig målet och i kontakt med sondsträng vid en given kontakttid (exempelvis en sekund) och dras direkt tillbaka till den ursprungliga positionen och påbörja nästa cykel. Ett vidhäftnings händelse reflekteras av en dragkraft signalen under indragningsfasen. Detta tillvägagångssätt-kontakt-indragnings cykel upprepas 50 gånger under minst tre mål-sondparen för att beräkna ett medelvärde SEM för vidhäftning frekvens, Pa.
Termisk fluktuationer analys används för livstidsmätningar under noll-kraft. I varje cykel, efter att röra sonden vulsten, är målet dras tillbaka till noll-kraft position och klämmas fast i kontakt med vulsten utan antingen kompression eller spänning under 20 sek, och sedan återgår till den ursprungliga positionen för att påbörja nästa cykel. Bond förening / dissociation under noll kraftmanifesteras som en plötslig minskning / ökning av termiska fluktuationer i pärlan 16,30.
Force klämma analys används för livstidsmätningar enligt krafter. En önskad klämkraft (exempelvis 20 PN) är satt före experimentet. Målet drivs upprepade gånger för att kontakta sonden vulsten för en given kontakttid (exempelvis en sekund) för att tillåta bildning av ett receptor / ligand-bindning (Figur 2C, Paneler 2 och 3) och sedan dra tillbaka (Figur 2C, panel 4 ). Om ingen bindning bildas, reflekteras av någon dragkraft signal på RBC, eller om obligations brister innan de når den förinställda klämkraft, kommer målet att återgå till ursprungsläget och starta nästa cykel. I de bindande händelser som överlever den returgående fasen, är målet hölls på klämkraften med en motsvarande förlängning av RBC genom d tills obligations dissocierar (Figur 2C, Paneler 5 och 6), och sedan återvänder till den ursprungliga positjon att påbörja nästa cykel (Figur 2C, fält 7). Livstid definieras som tidsintervallet mellan det ögonblick då den kraft nått önskad nivå tidpunkten för obligations dissociation 20.
För alla dessa tre BFP experimentella lägen bör experimentalist kunna se strategi-inkräktar-kontakt-retract- (klämma -) (dissociate-) retur testning cykel (Figur 2C), som kommer att upprepas för flera gånger 16,20 , 21.
Data som samlats in från varje experimentell sätt BFP kan analyseras på olika sätt att få fram önskat resultat. Den genomsnittliga livslängden Kurvan är en representativt resultat från kraftkläm analysen (Figur 4). Det återspeglar de ömsesidiga off-hastigheter av receptor-ligand-dissociation under krafter. Termisk fluktuationer analysen möjliggör karakterisering av 2D på hastighet och off-hastigheten för en receptor-ligandpar under noll-kraft 16; medan vidhäftnings frekvuency analys gör 2D på hastighet, off-rate och affinitet under noll-kraft 13.
Tillägget av fluorescensen bildfunktion möjliggör för övervakning av intracellulära Ca2 + nivå av en enda cell, vilket används som avläsning av cellsignalering i detta system. Om du vill använda den här funktionen under ett fBFP experiment måste man förladda cellerna med en Ca2 + indikator. När det gäller fura2-AM är den fluorescerande färgämne ades fluorescens bilder av samma cell under 340 nm och 380 nm excitation kanaler registreras växelvis i försöket och inspekterades par-by-pair i analysen. En tröskelintensitet tilldelades till varje kanals fluorescerande bild för att avlägsna bakgrundsbrus och erkänna cellkonturen (fig 5). Jämförelse av varje par av de fluorescensbilder möjliggör beräkning av den intracellulära Ca 2 + nivå. Tydliga fluorescerande bilder av cellen enligt både 340 nmoch 380 nm exciteringskanaler är nödvändiga för noggrann mätning av Ca2 + nivån (fig 5A, B), medan dåliga bilder med icke försumbar bakgrundsbrus kommer att resultera i snedvridna resultat och bör undvikas (figur 5C).
Genom att införa styr mekaniska stimuleringar på cellen och spela cell Ca2 + nivå samtidigt ger fBFP en kraftfull enda molekyl verktyg för att studera mekano-transduktion på en levande cell. Det är värt att notera att plattformen beskrivs här är ganska mångsidig; i princip kan man utforma ett stort antal sätt att applicera kraft till cellen för att passa speciella ändamål och samtidigt övervaka olika signaleringshändelser av intresse. De kraftberoende kinetiska detaljer analyseras sedan i samband med den valda signal avläsning för att extrahera egenskaper hos kraftreglerade receptor-ligand kinetik, den inducerade signaleringen, och deras förhållande. I exemplet TCR signaling, en agonist specifika TCR-pMHC fångst obligation upptäcktes först och sedan dess relevans för T-cell Ca2 + flöde undersöktes 27. Strategin var att ta det högsta värdet av Ca2 + flöde som signalerings avläsning att söka sitt bästa prediktor mellan olika kinetiska parametrar, inklusive antalet sammanväxningar, kraft amplitud bindningen, den genomsnittliga livslängden, den längsta livslängden och den kumulativa livslängd sekventiellt bildade bindningar. Visas i figur 6 är ett exempel på samtidig inspelade individuell bindningsperiod (där en klämkraft av 10 pN användes) av en T-cell och deras ackumulering tillsammans med motsvarande Ca2 + signalkurvan. I detta fall fyra livstids händelser har inträffat före den tidpunkt då Ca2 + nivå började höja vid 55 sek, ackumulera en summa av 10-sekunders obligations livstid. Denna nivå av livstid ansamling utlöste en Ca2 + signal med en topp på normaliserad fura2 förhållandeav 1,8 som inträffade vid 65 sek. En systematisk matematisk analys av sådana uppgifter som samlats in från många enskilda celler avslöjade att det bästa korrelat av Ca2 + signalering styrka livstid samlade i 1: a minut upprepade TCR-pMHC interaktioner (se Referens 27 för tekniska detaljer).
Figur 3: Exempel tids kraft rådata kurvor för en no-vidhäftning händelse (A), en sönderslitningskraften händelse (B) och en livstid händelse (C). Olika faser av cykeln och motsvarande kurvsegmenten är respektive markerade i varje panel. Den kraft (y-axeln) härrör från att spåra den ändring av sondpärla, såsom visas i fig 2C. (A) nr vidhäftning: tryck (negativ) kraft i kontaktfasen retur to noll vid indragning. (B) En bristning kraft händelse: en drag (positiv) kraft drar via receptor-ligand bindning till förlänga RBC, som spräcker under den returgående fasen. (C) En livstid händelse: obligationen kvarstår tills klämkraften har uppnåtts och dissocierar därefter. Varaktigheten av livstid händelse indikeras. Den sönderslitningskraften händelse (B) och i början av livstid händelse (C) är markerade med en asterisk.
Figur 4:. "Medellivslängd vs. kraft" kurvan för OT1 T-cell som interagerar med sin agonist OVA (grön) och antagonist G4 (blå) är den poolade data grupperas i olika kraftpapperskorgar, och medelvärdet ± SEM av obligations livstid är avsattes mot kraft.
Figur 5:. Representant Ca2 + bilder upphetsad vid två våglängder (A, B) Rätt bildigenkänning av en T-cell (markerade med rött) i 340 nm (A) och 380 nm (B) kanalerna baserade på punkt-till- led säkerhetskontroll med en korrekt tilldelade intensitetströskel. (C) Oförmåga att känna igen den fluorescensbild av en T-cell (markerade med rött) i 340 nm excitation kanal, på grund av dålig fura2 lastning.
Figur 6: lagring av de "intracellulär Ca2 + nivå (relativ fura2 ratio) mot tiden" och "kumulativa livstid mot tiden" kurvor av en OT1 T-cell, genererad genom att upprepade gånger peka på T-cellen med en OVA-belagda pärlor över 300 sekunder. (A) En kraftkurva som visar en sekvens av icke-vidhäftning, sönderslitningskraften, och livslängds händelser som genereras av upprepade kontakter över tid. (B) Epi-fluorescens pseudo-färgbilder av intracellulära Ca2 + signaler i T-cellen vid olika tidpunkter. Den normaliserade Ca2 + Nivån anges av pseudo-färgskalan till höger. (C) överlagring av de signalkurvan (röd) Ca2 + och den kumulativa livstidskurvan (gul) i samma tidsförlopp. Ca2 + kurva plottades baserat på Ca 2 + avbildning. En Ca2 + flöde betecknas av en kraftig ökning av den normaliserade fura2 förhållandet. Den tid då Ca2 + når toppen indikeras med en streckad linje. Tillslagstiden för varje livstid händelse markeras på den kumulativa livstidskurvan (fast triangel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En framgångsrik fBFP experiment innebär några kritiska synpunkter. Först för kraftberäkning vara tillförlitliga, mikropipett, RBC, och sonden pärla bör anpassas så nära till koaxial som möjligt. Projektionen av RBC inuti pipetten bör vara ca en sond pipett diameter, så att friktionen mellan RBC och pipetten är försumbar. För en typisk mänsklig RBC, är den optimala pipetten diametern 2,0-2,4 fim, vilket ger en bästa passning i ekvation 1 17,30. För det andra, för att säkerställa mätningar i kraft klämma analys och termisk fluktuation analys är mest för enkelbindningar, en vidhäftningsfrekvens på mindre än 20% har upprätthållas 10,13,30. Här bör ospecifika sammanväxningar kontrolleras noggrant (vanligtvis <5% av tillräcklig blockering med BSA). Dessutom bör uppgifter samlas in endast från vidhäftnings händelser med en enda kraft droppe - kännetecknet på en enda molekyl beteende (analogt med ett enda steg försvinnandeav fluorescens i enda molekyl FRET). Tredje, lastning koncentrationen av fluorescens färgämnet bör optimeras på varje enskilt fall för att uppnå bästa bildkvalitet. För det fjärde måste toxiciteten av färgämne lastning till T-cell eller andra celler av intresse som skall undersökas noggrant innan varje experiment. Exempelvis kan bindningsaffiniteten för receptor-ligand-interaktioner vid färgämnes lastning behöver mätas och jämfördes med den utan färgämne lastning. Om bindningsaffiniteten är förändras dramatiskt på grund av färgämnes lastning, har en annan färg eller en annan lastkoncentrationer som skall beaktas. För det femte är terminalt biotin-märkta proteiner föredrog att tillåta bekväm, specifik och stark koppling som bevarar proteinets nativa orientering.
En stor styrka hos fBFP är att den utför en enkelbindning analys på en enda cell. Trots den låga genomströmningen, avslöjar en enda obligation analys ofta viktiga funktioner som är otillgängliga med konventionella ensemble migthods. Till exempel, genom att undersöka livslängden fördelningen vid varje kraft bin, kan man korrelera olika bindningsegenskaper med proteinkonformationstillstånd, som ger insikt om hur kraften reglerar proteinkonformationsändringar 20,32. Den BFP kan också användas för att mäta molekyl styvhet från förskjutningsuppgifter kraft och piezo-översättare av indragningsfasen, som kan användas för att undersöka proteinkonforma dynamik 20,21.
Många metoder har utvecklats för att studera receptorförmedlad cellvidhäftning och signalering. Receptor-ligand bindande kinetik mäts i allmänhet med rekombinanta proteiner i fullständig isolering från den cellulära miljön. En sådan praxis är potentiellt problematiskt. Till exempel har det nyligen visat sig att in situ kinetik uppmätta på levande celler drastiskt skiljer sig från den som uppmättes med användning av motsvarande rekombinanta proteiner 14, avslöjar nya insikter av receptorn & #8217; s cellfunktioner. Inte bara är fBFP kapabel att kvantifiera receptor-ligand kinetik in situ, men ännu viktigare, kan det också samtidigt spela in bindningen-inducerad cellsignalering. Som visats för TCR 27, den rika information bindningsegenskaper och cellsignalering som erhållits med hjälp av fBFP ger en oöverträffad möjlighet för att analysera sina förbindelser och förstå de molekylära mekanismerna för mekano-transduktion. Det är troligt att fBFP hittar fler tillämpningar inom andra viktiga receptor-ligand system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | N2-5% buffer preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | N2-5% buffer preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | N2-5% buffer preparation |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | N2-5% buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Bead functionalization |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Nystatin | Sigma-Aldrich | N6261 | RBC osmolarity adjustment |
| Ammonium Hydroxide (NH4OH) | Sigma-Aldrich | A-6899 | Glass bead silanization |
| Methanol | BDH | 67-56-1 | Glass bead silanization |
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | J. T. Barker | Jan-86 | Glass bead silanization |
| Acetic Acid (Glacial) | Sigma-Aldrich | ARK2183 | Glass bead silanization |
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology | 9002 | Glass bead functionalization |
| Streptavidin−Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Fura2-AM | Life Technologies | F-1201 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | BD LSR II | Density quantification |
| Capillary Tube 0.7-1.0 mm x 30 inches | Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette making |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | sutter instrument | P-97 | Micropipette making |
| Pipette microforce | Narishige | MF-900 | Micropipette making |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
| Micro-injector | World Precision Instruments | MF34G-5 | Chamber assembly |
| 1 ml syringe | BD | 309602 | chamber assembly |
| Micropipette holder | Narishige | HI-7 | Chamber assembly |
| Home-designed mechanical parts and adaptors fabrications using CNC machining. | Biophysics Instrument | All parts are customized according to the CAD designs. | BFP system |
| Microscope (TiE inverted) | Nikon | MEA53100 | BFP system |
| Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg) | Nikon | MRH00401 | BFP system |
| Camera, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, mono | Graftek Imaging | 02-2020C | BFP system |
| Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADC | Graftek Imaging | 02-2185A | BFP system |
| Manual submicron probehead with high resolution remote control | Karl Suss | PH400 | BFP system |
| Anti-vibration table (5’ x 3’) | TMC | 77049089 | BFP system |
| 3D manual translational stage | Newport | 462-XYZ-M | |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2012 SP5 | BFP system |
| LabVIEW software | National Instruments | Version 2009 | BFP system, BFP program |
| 3D piezo translational stage | Physik Instrumente | M-105.3P | BFP system |
| Linear piezo accuator | Physik Instrumente | P-753.1CD | BFP system |
| Micromanager software | Version 1.4 | fBFP system, fluorescence imaging program | |
| Dual Cam (DC-2) | Photometrics | 77054724 | fBFP system |
| Dual Cam emission filter (T565LPXR) | Photometrics | 77054725 | fBFP system |
| Fluorescence Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600-10B | fBFP system |
| Plastic paraffin film (Parafilm) | Bemis Company, Inc | PM996 | bottle sealing |
| Carbonate/bicarbonate buffer (pH 8.5) | 8.4 g/L sodium carbonate (Na2CO3), 10.6 g/L sodium bicarbonate (NaHCO3) | ||
| Phosphate buffer (pH 6.5-6.8) | 27.6 g/L NaPhosphate monobasic (NaH2PO4 • H2O), 28.4 g/L Anhy. NaPhosphate dibasic (Na2HPO4) | ||
| N2-5% buffer (pH 7.2) | 20.77 g/L potassium chloride (KCl), 2.38 g/L sodium chloride (NaCl), 0.13 g/L potassium phosphate monobasic (KH2PO4), 0.71 g/L anhy. sodium phosphate dibasic (Na2HPO4), 9.70 g/L sucrose |
References
- Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins. Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
- Dado, D., Sagi, M., Levenberg, S., Zemel, A. Mechanical control of stem cell differentiation. Regenerative medicine. 7, 101-116 (2012).
- Edwards, L. J., Zarnitsyna, V. I., Hood, J. D., Evavold, B. D., Zhu, C. Insights into T cell recognition of antigen: significance of two-dimensional kinetic parameters. Frontiers in immunology. 3, 86 (2012).
- Zhu, C., Jiang, N., Huang, J., Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D. Insights from in situ analysis of TCR-pMHC recognition: response of an interaction network. Immunological reviews. 251, 49-64 (2013).
- Huang, J., Meyer, C., Zhu, C. T. T cell antigen recognition at the cell membrane. Molecular immunology. 52, 155-164 (2012).
- Zarnitsyna, V., Zhu, C. T. T cell triggering: insights from 2D kinetics analysis of molecular interactions. Physical biology. 9, 045005 (2012).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).
- Marshall, B. T., et al. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423, 190-193 (2003).
- Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).
- Yago, T., et al. Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear. The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).
- Yago, T., et al. Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF. The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).
- Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).
- Huang, J., et al. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 (2010).
- Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).
- Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical. 68, 2580-2587 (1995).
- Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).
- Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib. Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).
- Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).
- Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells. The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophysical journal. 102, L5-L7 (2012).
- Bashour, K. T., et al. CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2241-2246 (2014).
- Nesbitt, W. S., et al. Distinct glycoprotein Ib/V/IX and integrin alpha IIbbeta 3-dependent calcium signals cooperatively regulate platelet adhesion under flow. The Journal of biological chemistry. 277, 2965-2972 (2002).
- Mazzucato, M., Pradella, P., Cozzi, M. R., De Marco, L., Ruggeri, Z. M. Sequential cytoplasmic calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by the glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor. Blood. 100, 2793-2800 (2002).
- Lefort, C. T., Ley, K. Neutrophil arrest by LFA-1 activation. Frontiers in immunology. 3, 157 (2012).
- Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling. Cell. 157, 357-368 (2014).
- Lou, J., et al. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. The Journal of cell biology. 174, 1107-1117 (2006).
- Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature communications. 5, 4886 (2014).
- Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).
- Marshall, B. T., Sarangapani, K. K., Lou, J., McEver, R. P., Zhu, C. Force history dependence of receptor-ligand dissociation. Biophysical. 88, 1458-1466 (2005).
- Xiang, X., et al. Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin. PloS one. 6, e27946 (2011).
