Abstract
אינטראקציות קולט יגנד קרום לתווך רבים תפקודים תאיים. קינטיקה כריכה ואיתות במורד הזרם מופעלת על ידי אינטראקציות מולקולריות אלה צפויים מושפעות מהסביבה המכנית שבו מתקיים מחייב ואיתות. מחקר שנערך לאחרונה הוכיח כי כוח מכאני יכול לווסת הכרת אנטיגן על ידי ומפעילה של קולט T-cell (TCR). זה התאפשר על ידי טכנולוגיה חדשה שפיתחנו ובדיקת כוח biomembrane הקרינה termed (fBFP), המשלבת כוח ספקטרוסקופיה מולקולה בודדת עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שימוש בתאי דם אולטרה רך אנושיים אדומים כחיישן רגיש הכוח, טכניקות מעקב הדמיה מצלמה במהירות גבוהה וזמן אמת, fBFP הוא של ~ 1 PN (10 -12 N), ~ 3 ננומטר ו~ 0.5 msec ב כוח, רזולוציה מרחב ובזמן. עם fBFP, אפשר למדוד בדיוק קינטיקה יחידה קולט ליגנד מחייבת לפי תקנת כוח וקאל תאיים בו זמנית תמונה מופעלת מחייבתcium איתות על תא חי בודד. טכנולוגיה חדשה זו יכולה לשמש כדי לחקור את האינטראקציה אחרת קרום קולט ליגנד ואיתות בתאים אחרים לפי תקנה מכאנית.
Introduction
תא אל תא ותא אל תאית מטריצת הידבקות (ECM) מתווכת על ידי מחייב בין קולטני תא שטח, חלבוני ECM, ו / או שומנים 1. כריכה מאפשרת לתאים כדי ליצור מבנים פונקציונליים 1, כמו גם להכיר, לתקשר, ומגיבים לסביבה 1-3. בניגוד לחלבונים מסיסים (למשל, ציטוקינים וגורמי גדילה) לאגד שמשלושה ממדים (3D) בשלב נוזל על קולטני תא השטח, קולטני הידבקות התא ליצור קשרים עם ligands שלהם על פני פער junctional צר לגשר שני משטחים מנוגדים המגבילים מולקולרי דיפוזיה בממשק שני ממדים (2D) 4-7. בניגוד לקינטיקה 3D הנמדדים בדרך כלל על ידי מבחני מסורתיים מחייבים (לדוגמא, תהודת plasmon פני השטח או SPR), יש לי קינטיקה 2D ל לכמת עם טכניקות מיוחדות כגון מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) 8-10, תא זרימת 11,12, micropipette 13,14, אופטיפינצטה 15 ובדיקת כוח biomembrane (BFP) 16-21.
יותר מאשר רק לספק הצמדה פיזית ללכידות סלולריות, מולקולות הידבקות הן מרכיב עיקרי במכונות האיתות לתא כדי לתקשר עם סביבתו. יש כבר התעניינות גוברת בהבנה כיצד אירוסין יגנד של מולקולות הדבקה יוזם איתות וכיצד האות הראשונית transduced בתוך התא תאיים. באופן אינטואיטיבי, מאפיינים של קולט ליגנד מחייב יכול להשפיע על האותות שהיא גורמת. עם זאת, קשה לנתח יחסים מכניסטית בין האינטראקציה תאית ואירועי איתות תאיים באמצעות הרכב מסורתי של מבחני ביוכימיים בגלל המגבלות שלהם רבות, לדוגמא, רזולוציה של זמן עני וחוסר ברזולוציה מרחבית המלא. קיימים שיטות שתאפשרנה לשני (קולטן ליגנד 2D מחייב קינטיקה) biophysical ותצפיות ביוכימי (איתות) בשידור חיתאים כוללים מצעים של קשיחות מתכונן 22, מערכי עמוד אלסטומר 23 והתקני תא זרימה / microfluidic משולבים עם יכולת הקרינה 24-26. עם זאת, קריאות של איתות והקולט ליגנד המחייב יש לקבל בנפרד (לרוב על ידי שיטות שונות), ולכן קשה לנתח את יחסי זמן ומרחב של מאפייני קשר עם אירועי איתות.
BFP הקונבנציונלי הוא ספקטרוסקופיה כוח רגישה עם רזולוציה גבוהה spatiotemporal 17. היא משתמשת בתא גמיש דם אדום (RBC) כחיישן כוח, המאפשרת מדידה של קינטיקה מולקולה בודדת 2D, תכונות מכאניות ושינויי קונפורמציה 14,16,19-21,27-29. BFP מבוסס הדמיה ניאון (fBFP) קורלציה קינטיקה מחייבת קולט ליגנד עם איתות התא-מופעל מחייב בקנה מידת מולקולה בודדת. עם ההגדרה הזאת, בפעילויות איתות תא אתר בהקשר של mechani המשטחגירוי קאל נצפה בתאי T 27. FBFP הוא תכליתי ויכול לשמש למחקרים של הידבקות תא ואיתות בתיווכו של מולקולות אחרות בתאים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה כדלקמן הנחיות ואושר על ידי ועדת האתיקה של מחקר האנושי גאורגיה מכון טכנולוגי.
1. בידוד RBCs האדם, biotinylation וosmolarity התאמה
הערה: שלב 1.1 צריכה להתבצע על ידי איש מקצוע כגון אחות רפואית מיומן, עם מועצה לביקורת מוסדית אישרה פרוטוקול.
- להשיג 8-10 μl (טיפה אחת) של דם מאצבע זין ולהוסיף 1 מיליליטר של קרבונט / החיץ ביקרבונט (הטבלה 1 ו -2). בעדינות מערבולת או פיפטה התערובת ו צנטריפוגות 1 דקות ב 900 x גרם. בטל supernatant ולשטוף פעם נוספת.
- בכוס קטנה שוקל 3.5-4 מ"ג של מקשר יוטין-PEG3500-NHS (טבלת 1). לפזר אותו בקרבונט / החיץ ביקרבונט לעשות מ"ג / מיליליטר הריכוז הסופי 3.
- מערבבים 171 μl של קרבונט / חיץ ביקרבונט, 10 μl של חבילת RBC ו1,049 μl שלביוטין-PEG3500-NHS פתרון מקשר ולדגור על RT למשך 30 דקות. שטוף את RBC פעם אחת עם קרבונט / חיץ ביקרבונט ולאחר מכן פעמיים עם חיץ N2-5% (טבלת 1 ו -2).
- בינתיים, למקם את בקבוק מקשר עם כובע רופף בייבוש ואקום זכוכית מלא desiccants בתחתית והוואקום במשך 5 דקות, ולמלא את הייבוש עם ארגון. להדק את הכובע ולקחת את הבקבוק. לאטום את הבקבוק עם סרט פרפין פלסטיק (טבלת 1), למקם אותו לתוך מיכל המלא בdesiccants בתחתית והחנות ב-20 ° C.
הערה: הצעדים שכרוכים בשימוש במקשר יוטין-PEG3500-NHS, כולל 1.2-1.4 (פרט לדגירה ולשטוף ב1.3), צריכה להתבצע מהר ככל האפשר. - לדלל nystatin לN2-5 חיץ% לעשות ריכוז סופי של 40 מיקרוגרם / מיליליטר. לערבב 5 μl של RBC biotinylated עם 71.4 μl של nystatin (טבלת 1) פתרון דגירה במשך שעה 1 ב0 ו# 176; ג. לשטוף פעמיים עם חיץ N2-5% וחנות עם N2-5 חיץ% BSA + 0.5% (טבלת 1) במקרר (4 מעלות צלזיוס).
2. זכוכית ביד Silanization
- ניקוי של פני שטח ביד
- שוקל 50 מ"ג של אבקת חרוזי זכוכית ומחדש להשעות אותם ב 500 μl מים DI.
- מערבבים 0.5 מיליליטר של 30% H 2 O 2 (טבלה 1) עם 9.5 מיליליטר של מים די בכוס 50 מיליליטר, ולאחר מכן להוסיף 2 מיליליטר של 4 OH NH מרוכז (טבלת 1) ולהביא את הפתרון הזה לדוד על צלחת חמה .
- הוסף את חרוזי זכוכית לפתרון הרתיחה וממשיך להרתיח במשך 5 דקות נוספות. מערבולת בעדינות את הפתרון כל דקות.
- לאחר הרתיחה, להעביר ~ 5 מיליליטר של השעיה חרוז חמה זה לתוך צינור 15 מיליליטר מיקרו צנטריפוגות ועליון עם מים RT DI. צנטריפוגה ב 3500 XG במשך 5 דקות, להסיר ולסלק supernatant.
- העבר 5 מיליליטר נוסף של השעיה חרוז חמה ולהוסיף לחרוזים שטפו, ראש עם יותר מים DI, מערבב היטב, וצנטריפוגות שוב. חזור על תהליך זה עד כ -50 מיליליטר המים DI משמש, אשר יהיו כולל של 4 עד 5 פעמים בכביסה.
- מעבירים את ההשעיה חרוז לתוך בקבוקון 1 מיליליטר. שטיפת חרוזים עם מתנול (טבלת 1) על ידי צנטריפוגה ב17,000 XG במשך 5 דקות במשך 3 פעמים, ולבסוף חוזר מחדש להשעות את החרוזים 1 מיליליטר של 100% מתנול.
- משטח חרוז Thiolation
- לצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר להוסיף 45.6 מיליליטר של מתנול, 0.4 מיליליטר של חומצה אצטית (טבלת 1), 1.85 מיליליטר של מים DI, 1.15 מיליליטר של 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) (טבלת 1) ו -1 מיליליטר חרוזים השעיה ערוכים 2.1, אז לדגור על RT עבור 3 שעות.
- לאחר התגובה, להסיר את כל המגיבים על ידי שטיפת פעם אחת עם מתנול הטרי, ומחדש להשעות את חרוזים לתוך 500 μl של מתנול. באופן שווה לחלק השעיה חרוז זכוכית מרוכזת זה לסט של 20 בקבוקוני זכוכית יבשים ונקיים עםפקקי הברגה. להתנדף ממתנול באמצעות סילון של ארגון יבש ולסובב לאט את הבקבוקונים כדי להפוך את השכבה דקה של חרוזים יבשים בצדדים של כל בקבוקון.
- מניחים את הבקבוקונים של חרוזים לתנור מחומם מראש ייבוש ב 120 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן להוציא ובמהירות למקם את הכובע (ים) באופן רופף על. מניחים את הבקבוקונים בייבוש ואקום זכוכית מלאים desiccants בתחתית וואקום הייבוש עם משאבת ואקום עד מקוררת.
- לטהר את הייבוש בשואב אבק עם ארגון יבש להביא הייבוש ללחץ האטמוספרי רגיל. הסר את מכסה תא ייבוש ומחדש במהירות להדק את הכובע (ים) על הבקבוקון. לאטום את צלוחיות עם סרט פרפין פלסטיק ולאחסן אותם בRT בתיבת אחסון חשוך ויבשה.
- על שימוש מיידי, לקחת בקבוקון אחד של חרוזים יבשים ולשטוף פעם עם חיץ פוספט (לוחות 1 ו -2), מחדש להשעות לתוך 50 μl של חיץ וחנות פוספט ב 4 מעלות צלזיוס. הכנת חרוז מרוכזת זה תיקרא לכ" חרוזים MPTMS "בשלבים הבאים.
הערה: עם אחסון נאות, חרוזים MPTMS יכולים להישאר פונקציונליים לעד שלושה חודשים.
3. חרוז Functionalization
- קוולנטית ציפוי חלבונים בחרוזים
- קח נפח מסוים (למשל, μl 2.5) של מניית החלבון ולערבב עם נפח שווה של קרבונט / חיץ ביקרבונט לעשות פתרון 1.
הערה: הנפח תלוי בריכוז המניות וצפיפות האתר הסופי הרצויה של החלבון על פני השטח חרוזים. - בכוס קטנה שוקל 2-3 מ"ג מקשר MAL-PEG3500-NHS (טבלת 1) ולפזר אותו עם קרבונט / חיץ ביקרבונט להגיע ריכוז סופי של .231 מ"ג / מיליליטר.
- לערבב 1 פתרון עם נפח שווה של פתרון מקשר מוכן ב3.1.2. דגירה את התערובת על RT למשך 30 דקות כדי להפוך את הפתרון 2.
- בינתיים, למקם את בקבוק מקשר עם כובע רופף בF ייבוש ואקום זכוכיתilled עם desiccants בתחתית והוואקום במשך 5 דקות, ולמלא את הייבוש עם ארגון. להדק את הכובע ולקחת את הבקבוק. לאטום את הבקבוק עם סרט פרפין פלסטיק, למקם אותו לתוך מיכל המלא בdesiccants בתחתית והחנות ב-20 ° C.
הערה: הצעדים שכרוכים בשימוש במקשר MAL-PEG3500-NHS, כולל 3.1.2-3.1.4 (פרט לדגירה ב3.1.3), צריך להיות מושלם מהר ככל האפשר. - לערבב 5 μl של חרוזים MPTMS עם פתרון 2 ולהוסיף למאגר פוספט (טבלה 1) כדי להפוך את נפח סופי של 250 μl.
- דגירה חרוזים הלילה בשעה RT, לשטוף 3 פעמים עם חיץ פוספט, ומחדש להשעות לשל חיץ וחנות פוספט 100 μl על 4 מעלות צלזיוס.
- קח נפח מסוים (למשל, μl 2.5) של מניית החלבון ולערבב עם נפח שווה של קרבונט / חיץ ביקרבונט לעשות פתרון 1.
- חלבון הכנת חרוזים / streptavidin (SA) מצופים
- עקוב פרוטוקול 3.1.1-3.1.4.
- לערבב 5 μl של חרוזים MPTMS עם פתרון 2 ו -5 μl של 4 מ"ג / מיליליטר streptavidin-Maleimide (SA-MAL) (טבלת 1פתרון) ולאחר מכן להוסיף למאגר פוספט לעשות נפח סופי של 250 μl.
- דגירה חרוזים הלילה בשעה RT, לשטוף 3 פעמים עם חיץ פוספט, ולבסוף מחדש להשעות לשל חיץ וחנות פוספט 100 μl על 4 מעלות צלזיוס.
- ציפוי streptavidin על חרוזי זכוכית
- לערבב 5 μl של חרוזים MPTMS עם 5 μl של 4 מ"ג פתרון / מיליליטר SA ולהוסיף 140 μl של חיץ פוספט.
- דגירה חרוזים הלילה בשעה RT, לשטוף 3 פעמים עם חיץ פוספט, ומחדש להשעות לתוך 50 μl של חיץ וחנות פוספט ב 4 מעלות צלזיוס.
- ציפוי חרוזים SA מצופה עם חלבון Biotinylated
- לערבב 5 μl של חרוזים SA מצופים בחלבון (נפח בהתאם לצפיפות הציפוי הרצויה) ולהוסיף למאגר פוספט לעשות הנפח הסופי להיות 100 μl.
- דגירה את תערובת הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס או במשך 3 שעות ב RT, לשטוף 3 פעמים עם חיץ פוספט, ומחדש להשעות לתוך 50 ph μlosphate חיץ ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
4. תא הכנה
הערה: כדי לטהר את התאים, בצע את פרוטוקולי טיהור תא סטנדרטיים המתאימים לסוג של תאים בשימוש, למשל תאי T 27 או שורות תאים מסוימות 21,29.
- לניסויי fBFP, פעם ההשעיה התא מוכנה, להוסיף Fura2-AM (טבלת 1) מומס DMSO להשעית התא להגיע לריכוז סופי של 2 מיקרומטר, דגירה במשך 30 דקות ב RT ולאחר מכן לשטוף פעם אחת. שמור השעיה תא טעון fluorescently זה בחושך עד לשימוש.
5. הכנה לMicropipettes ולשכה סלולארי
- הכנת Micropipettes
- צינורות לחתוך נימי זכוכית ארוכות (טבלה 1) עם חותך זכוכית לחתיכות קצרות של כ 3 אינץ 'באורך. חתיכת הר אחד על חולץ micropipette (טבלת 1), לחץ על "משוך" אבלטון, כך שאמצע הנימים יהיה מחומם על ידי המכונה והנימים תהיה משך בשני הקצוות כדי להפוך את שתי נימים עם טיפים חדים (micropipettes גלם).
הערה: על ידי ביצוע הנחיות המוצר, המורפולוגיה הרצויה של פיפטה הגלם יש 6-8 להתחדד מ"מ ו.1-.5 מיקרומטר קצה. - הר פיפטה גלם על בעל פיפטה של פורג micropipette (טבלת 1). חום כדי להמס את כדור הזכוכית בכבשן. הכנס את הקצה של פיפטה הגלם בתוך כדור הזכוכית. להתקרר כדור הזכוכית ולמשוך את פיפטה הגלם לשבור אותו מבחוץ ולהשאיר טיפ שלה בתוך המרחב. חזור על תהליך זה עד פתח הקצה הרצוי מתקבל.
הערה: דוגמאות לקוטר פנימי קצה micropipette: 2.0-2.4 מיקרומטר לRBC, ~ 1.5 מיקרומטר לחרוז, ~ 2-4 מיקרומטר לתא T ו-7 מיקרומטר לתא hybridoma.
- צינורות לחתוך נימי זכוכית ארוכות (טבלה 1) עם חותך זכוכית לחתיכות קצרות של כ 3 אינץ 'באורך. חתיכת הר אחד על חולץ micropipette (טבלת 1), לחץ על "משוך" אבלטון, כך שאמצע הנימים יהיה מחומם על ידי המכונה והנימים תהיה משך בשני הקצוות כדי להפוך את שתי נימים עם טיפים חדים (micropipettes גלם).
- בניית הלשכה סלולארי
הערה: תא התא בנוי על הבסיס של מטורף-ביתבעל דואר קאמרי, אשר מורכב משני חלקים של ריבועי מתכת (נחושת / אלומיניום) וידית המקשרת אותם יחד (1D איור). - לחתוך coverslip x 22 מ"מ x 0.2 מ"מ 40 מ"מ באמצעות חותך זכוכית לשני חלקי 40 מ"מ x 11 מ"מ x 0.2 מ"מ (coverslip 1 ו -2). coverslip דבק 1 על ידי גריז לצד העליון של בעל התא באופן שבו מגשר בין שני ריבועי המתכת, ובאופן דומה coverslip דבק 2 לצד התחתון, אשר יהווה תא תא מקביל coverslip (1D איור).
- השתמש פיפטה להזריק 200 μl של חיץ ניסיוני בין שני coverslips. ודא החיץ מייחס לשני coverslips. בעדינות לסובב ולנער את התא כדי לאפשר לחיץ לגעת בשני הקצוות של החדר.
- להזריק בזהירות שמן מינרלים לשני הצדדים של חדר איגוף אזור החיץ הניסיוני ובכך חתם את החיץ מהאוויר הפתוח. הזרק השעיות של חרוזים בדיקה (לדוגמא, חרוזים מצופים pMHC), תאי דם אדומים ומטרות(לדוגמא, תאי T) באזורים העליונים, אמצעי ותחתונים של אזור חיץ בהתאמה.
6. ניסוי BFP
תמונת סקירה של מערכת חומרת fBFP הרכבה fBFP (): איור 1.. ציור סכמטי של מערכת חומרת fBFP (B). המערכת הכפולה-פקה "DC2" (כתום) על שהמצלמה במהירות גבוהה (הכחולה) ומצלמה הקרינה (לבן) היו רכובים (C). הבמה מיקרוסקופ שמתאים את עצמו תא ניסוי ושלוש מערכות המניפולציה micropipette (ד '). (E ו- F) micrographs של הגדרת BFP בתא ניסוי. (R הנמוך (E) Micropipettes הרכבה מראה פיפטה הבדיקה (משמאל), פיפטה היעד (ימנית עליון) ופיפטה עוזרight). מיקום חרוז (F) Probe. חרוז בדיקה היה שהופעל על ידי פיפטה עוזר ומחובר לשיא RBC ליצירת בדיקה כוח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- הפעל מיקרוסקופ (טבלת 1) ומקור אור. מניחים את החדר לבמה מיקרוסקופ העיקרי (איור 1 א, ד).
- התקן את כל שלושת micropipettes של BFP (1D איור משמאל:. בדיקה, כדי לתפוס RBC, מימין: יעד, כדי לתפוס את תא או חרוז, ימין למטה: עוזר, כדי לתפוס את חרוז).
- השתמש מיקרו הזרקה (טבלה 1) למילוי micropipette עם חיץ ניסיוני. קח את בעל פיפטה (טבלת 1) ולהחזיק אותו במקום נמוך יותר כדי לאפשר לטפטוף מים מהקצה. במהירות להכניס את micropipette לתוך קצה בעל ולוודא שאין בועות אוויר נכנס micropipetteבמהלך ההכנסה. הדק את בורג בעל.
- הר כל בעל פיפטה על מיקרו-מניפולטור המקביל שלה. לדחוף את micropipette לקראת קאמרי כך שהעצות שלהם להיכנס לאזור החיץ קאמרי. להתאים את המיקום של micropipette ולמצוא אותם תחת מיקרוסקופ שדה ראייה.
- לנוע שלב קאמרי בעל כדי למצוא את המושבות של שלושה אלמנטים (RBCs, מטרות וחרוזי בדיקה) אחד על אחד. להתאים את המיקום של micropipette המקביל על ידי סיבוב הכפתורים של מניפולטורים לתת טיפ של תא אחד / חרוז גישת micropipette. לשאוב את התא / חרוז על ידי התאמת הלחץ בתוך micropipette המקביל. כל שלושה micropipettes יהיה ללכוד האלמנטים המקביל שלהם.
- לנוע שלב קאמרי בעל למצוא שטח פתוח הרחק מהמושבות של האלמנטים שהוחדרו בי הניסוי יבוצע. לעבור את המצב החזותי מיקרוסקופ כדי להמחיש את התמונה על compתכנית uter על מסך המחשב. להעביר את כל שלושת אלמנטים על הטיפים פיפטה לתוך שדה הראייה של התכנית.
- יישר את חרוז הבדיקה וRBC, ולתמרן את חרוז הבדיקה לשיא של RBC בזהירות, בקצרה לפגוע חרוז על RBC ועדינות לחזור. התאם את הלחץ של micropipette עוזר לפוצץ בעדינות חרוז משם, כך שהוא יישאר דבוק על RBC השיא (איור 1F). להתרחק micropipette העוזר וליישר את היעד וחרוז בדיקה (איור 2 א).
איור 2:. תכנית BFP ומחזור הבדיקה שלה () וידאו-מיקרוסקופ מתאר בדיקה כוח (משמאל) ויעד תא T (מימין) להישאף על ידי החללית שלהם בהתאמה pipettes.The הנייחת כוח מורכב של RBC נפוח ומצורף חרוז נושאות יגנד. קולט נושאותT-cell (יעד) הוא רכוב על piezotranslator מיושר הפוך לבדיקה. ההחזר על ההשקעה מצויינים בירוק. גשש הקצה מסומן בקו כחול. הכנס מתאר את יגנד (pMHC, צד חרוז) וקולט (TCR, צד T-cell) זוג על שני המשטחים המנוגדים באזור המסומן בכתום. פרופיל עוצמת קצה חרוז ב( א) (ב). אזור ROI ב-direction x הוא להתוות כx -axis (במספר הפיקסלים) ועוצמת האור (בערך סולם אפור) בממוצע על ידי binning 30 פיקסלים לאורך -direction y. (ג) הסטייה של RBC ואת עמדתו של חרוז והיעד (T-cell) במחזור בדיקה של assay כוח המהדק. קווים מקווקווים האנכיים ואופקיים לציין את מיקום אפס הכוח של קודקוד RBC וכמובן הזמן, בהתאמה. גשש קו קצה עיוות RBC מוצג בכחול בכל לוח. אותו עדיין פחות צעדים שאומצו בתדירות הידבקותassay (שחסר את הצעדים של "מהדק" ו- "לנתק") וassay תנודות תרמית (שחסר את הצעד של "לנתק").
- בתכנית, בחלון שדה הראייה להשתמש בכלים בתכנית כדי למדוד את רדיוס בהתאמה של micropipette הבדיקה (עמ 'R), RBC (R 0), שטח המגע העגול בין RBC וחרוז בדיקה (ג R) , המאפשר ההערכה של קבוע הקפיץ של RBC (k) על ידי המשוואה הבאה 17,30,
כאשר p Δ הוא לחץ השאיפה בקצה פיפטה הבדיקה.
הערה: נובע מהחוק של הוק שהכח המחייב, F, ניתן לכמת על ידי המוצר של קבוע קפיץ ועקירה של חרוז הבדיקה (ד), כלומר, F = ד (איור 2 ג). - הזן את קבוע קפיץ RBC הרצוי לתכנית (עיין סעיף פרוטוקול 6.6. קבוע הקפיץ מוגדר בדרך כלל ברמה של 0.25 או 0.3 PN / ננומטר עבור assay assay תדירות כוח המהדק וההידבקות וPN 0.1 / ננומטר עבור assay התנודות התרמי) , שיחזור לחץ שאיפה נדרשת ביחידה של סנטימטר של מים. התאם את הגובה של מיכל המים שמקשר לפיפטה של החללית עד שיגיע ללחץ aspirating הנדרש.
- צייר קו אופקי על פני שיא RBC, אשר יניב עקומה בחלון הסמוך המציין את הבהירות (ערך סולם אפור) של כל פיקסל לאורך הקו הזה. גרור את קו הסף להיות כבמחצית העומק של העקומה (איור 2 א, ב).
הערה: נקודת המינימום על עקומת הבהירות מתחת לקו הסף מציינת את המיקום של גבול חרוז, ובכך מינימום מקומי רק אחת מותר. אם שניים או מינימום מקומי יותר נמצאים בהווה, זהמציין את התמונה היא לא אופטימלית (כנראה עקב היותו מחוץ לפוקוס התמונה, או יישור לקוי בין חרוז הבדיקה וRBC). - בחר את המצב הרצוי ניסוי: assay תנודות תרמיות, assay תדירות הידבקות או assay כוח מהדק. הגדר את הפרמטרים כרצויים (למשל, = שניות כוח הפגיעה = 15 PN, שיעור טעינה = 1,000 / s PN, זמן מגע 1, מהדק כוח = 20 PN (עבור assay מהדק כוח), וכו ').
- לחץ על "התחל", המאפשר לתכנית להעביר את פיפטה היעד ולנסוע ליעד ובמתוך קשר עם החללית (ראה סעיף נציג תוצאות לפרטים נוספים). איסוף הנתונים יבוצע במקביל, אשר מתעד את המיקום של חרוז הבדיקה בזמן אמת. לעצור את התכנית על ידי לחיצה על הכפתור "הניסוי עצור", בו בזמן חלון יקפוץ החוצה כדי לאפשר לשמור את הנתונים שנרכשו.
7. הקרינה BFP ניסוי (fBFP)
- כדי להשתמש בfluoreפונקצית סצנה של מערכת BFP, להפעיל את מקור אור העירור (טבלת 1) והמצלמה הקרינה (טבלת 1), אשר נשלטים על ידי תכנית נפרדת (טבלה 1). בתכנית, בחר את הפרמטרים להדמית הקרינה, כוללים רווח, חשיפה, ערוצי עירור (במקרה זה, 340 ננומטר ו 380 ננומטר אור), וכו '. בצע את כל ההכנות בפרוטוקול ניסוי BFP, כולל יישור הבדיקה והיעד, אשר יאפשר להדמיה של תמונת הניאון חי תא המטרה נרגשת 340 ננומטר או 380 ננומטר עירור אור.
- השתמש בכלי חתך בערך סעיף התחום שבו התא יישאר במהלך כל תקופת ההקלטה.
הערה: בשל השימוש של מחזור גישת מגע-נסיגה, התא יהיה לנוע קדימה ואחורה שוב ושוב, ובכך האזור מחולק הוא הרבה יותר גדול מהתא עצמו. - לחץ על "שיא" כדי לאפשר 340 ננומטרד 380 ננומטר אור לרגש לסירוגין הצבע תאיים הקרינה (Fura2), וזוג מתאים תמונות הקרינה יירשם לסירוגין אחת לשנייה. במקביל לחץ על "התחל" בתכנית להתחיל את ניסוי BFP לאינטראקציה מולקולרית ניתוח והניסוי ההדמיה הקרינה לעקוב אחר איתות סידן תוך תאי. המערכת תפיק קובץ נתונים גולמי לקולטן ליגנד המחייב (ראה איור 6 א להלן) וסדרה של תמונות ניאון בפורמט .tiff לאותות סידן.
ניתוח נתונים 8.
- ניתוח נתונים BFP
- ניתוח נתונים עבור assay תדירות הידבקות
- רצף לבדוק אות של כל מחזור "כוח לעומת זמן" ופשוט להקליט שמחזורים להכיל אירוע הידבקות ואילו לא, ולסכם להניב תדירות הידבקות ממוצעת.
- לאסוף כוח הקרע של כל אירוע הידבקות, שהוא ערך השיא של הכוח באופן ליניארי ramped לפני קשר קרע. לאחר איסוף כמות מספקת של כוחות הקרע במגוון של שיעורי רמפה, לגזור את חלוקת כוח קרע בכל שיעור רמפה שממנו הכוח תלוי מחוץ לשיעור של ניתוק קולט יגנד נגזר באמצעות ניתוח ספקטרוסקופיה כוח דינמי 18,31.
- ניתוח נתונים עבור assay תנודות תרמית
- רצף לבדוק את אות שלב ההידוק של כל מחזור, שסביר להניח מכיל אירועי אג"ח עמותה וניתוק מרובים. השתמש ברמת שלב הידוק תרמית התנודות (סטיית התקן הממוצעת של מרווח הזזה של 70 נקודות זמן רציפות של עמדת חרוז) ב" הכוח לעומת זמן "אות כמדריך להבחין אירועי אג"ח עמותה וניתוק, מאז קשר היווצרות מתאימה לירידה בתנודתיות התרמית.
- לייעד את המרווח מהאג"ח מיידי של דיסוציאציה (כאשר יסתנודות mal קורות חיים לרמה נורמלית) למיידיים של היווצרות הקשר הבאה כזמן המתנה, ולייעד את משך הקשר מהקשר שלה לניתוק כקשר לכל החיים, ששניהם שנאספו במהלך בדיקת נתונים. לחשב את זמן ההמתנה הממוצע וממוצע קשר לכל החיים, שבהתאמה משקפת את הגומלין של שיעור ובכי חוץ-שיעור מתחת לאפס-כוח 16,30.
- ניתוח נתונים עבור assay כוח המהדק
- פרמטרים תיעוד של כל אירועי החיים כוללים כוח הממוצע ואג"ח חיים עם מספר הרצף, כמו גם את זמן ההתחלה וזמן הסיום, אשר יאפשר אחד לצייר עקומת חיים מצטברת (למשל, איור 6 ג, עקומה צהובה).
- לאסוף כמות מספקת של אירועי חיים תחת מגוון של כוחות. קבוצתם לפחי כוח שונים, אשר תפיק חיים ממוצע בכל סל כוח, ולגמרי להניב "חיים ממוצע לעומת. עקומת כוח "(איור 4).
- ניתוח נתונים עבור assay תדירות הידבקות
- ניתוח ההדמיה נתוני הקרינה סידן
- התאם את עוצמת הסף עד תמונות הקרינה להראות קווי המתאר ברורים של התא בשני ערוצי 340 ננומטר ו 380 ננומטר ללא רעשי רקע (איור 5 א ', ב'). לאחר מכן תסקור את מסגרת אות Ca 2 + תאית על ידי מסגרת עם מציין את רמת האינטנסיביות (איור 6) פסאודו-צבע, אשר נגזר על בסיס יחס העצמה של 340 ננומטר / 380 ננומטר, כדי ליצור "עוצמת Ca 2 + מנורמלת לעומת . עקומת זמן "(איור 6 ג). השתמש בתמונות הקרינה פסאודו-צבע כדי לייצר סרט המציג את רמת הקרינה שנייה על ידי שני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טכניקת BFP הייתה חלוץ ידי המעבדה אוונס בשינה 1995 17. כלי picoforce זה כבר נעשה שימוש נרחב כדי למדוד אינטראקציות של חלבונים משותקים על משטחים, כדי לנתח את קינטיקה דו-ממדית של מולקולות הדבקת אינטראקציה עם ligands 16,19,20, 30, למדוד גמישות מולקולרית 21,29, וכדי לקבוע קונפורמציה החלבון משתנה 21. לfBFP, סט נוסף של מכשירים הקשורים לעלית הקרינה עם מערכת התוכנה המתאימה (טבלת 1) מתווסף (איור 1 א - ג).
מערכת fBFP מורכבת ממערכת תוכנת מערכת חומרה (רכיבים אופטיים, מכאניים וחשמליים) ו( טבלה 1 ואיור 1 א ', ב'). מיקרוסקופ הפוך (איור 1 א, באמצע) עם רכיבים אופטיים המאפשרים בהיר שדה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי עלית עושה את הגוף העיקרי שלמערכת fBFP, על ששלב הניסוי ומניפולטורים פיפטה הם רכובים. בקר מקור הקרינה אור (איור 1 א, פינה השמאלית עליונה) משמש כדי לספק אורות עירור לסירוגין. מערכת הכפולה-פקה "DC2" מפצלת את האור לשני ומעבירה אותם למצלמה במהירות גבוהה (כחולה) ומצלמה הקרינה (לבן) (איור 1 א, פינה השמאלית תחתונה). לשעבר אוסף את תמונת הבדיקה לקביעת מיקום ותמונות הקרינה נאספות האחרונות נפלטות מתא המטרה בשני אורכי גל. הניסוי הוא פיקוח ושליטה של שני מחשבים שמחשב המארח 1 (איור 1 א, פינה ימנית עליונה, ייחתך בתמונה בשל מגבלת שטח) מחובר לשתי המצלמה במהירות גבוהה והמצלמה הקרינה והוא אחראי על ביצוע ניסוי ורכישת נתונים, ומארח מחשב 2 מחוברת למצלמה הניטור ואחראית על הצגת תצוגה מלאה של התנסות BFPment (איור 1 א ', ב').
במהלך ניסוי, בניסויים משתמשים בשלושה micropipettes לתפוס ולטפל תאים וmicrospheres בהתאמה (איור 1E, F). תמונה אופיינית של ניסוי BFP מורכב מבדיקת כוח, שהורכבה על ידי הצמדת חרוז בדיקה על השיא של RBC aspirated, ותא המטרה / חרוז (איור 2 א). אזור של עניין (ROI), המכיל את אזור קצה חרוז בשיא RBC, הוא איתר על ידי מצלמה מהירה במהירות (2,000 תמונות בשניה) כדי לפקח על העיוות של RBC בזמן אמת. עקירת המעקב של חרוז לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לחשב את הכוח החיצוני המופעל על הבדיקה הכוח (ראה ההערה בסעיף 6.6 לפרוטוקול), קבל את קבוע הקפיץ של BFP (איור 2 א, ב).
assay הידבקות התדירות, assay תנודות תרמית, וassay כוח מהדק שלושה מצבים ניסיוניים נפוצים במערכת BFP. על ידי מודעהבוחר אחד משלושת מצבים אלה, ניסוי BFP מורכב ממחזורי בדיקות חוזרים ונשנים שבוצעו ברצף.
בassay תדירות הדבקה, היעד מתקרב ואנשי קשר חרוז הבדיקה בזמן מגע נתון (לדוגמא, סעיף 1) וחזר ישירות בחזרה למיקום המקורי ולהתחיל את המחזור הבא. אירוע הידבקות בא לידי ביטוי על ידי אות כוח מתיחה בשלב ההכחשה. מחזור גישת מגע-נסיגה זו חוזר 50 פעמים לפחות 3 זוגות היעד-חללית לחשב SEM ממוצע של תדירות הדבקה, P.
assay תנודות תרמית משמש למדידות חיים תחת אפס כוח. בכל מחזור, לאחר הנגיעה חרוז הבדיקה, היעד הוא חזר למצב אפס הכוח והדק במגע עם חרוז בלי או דחיסה או מתח במשך 20 שניות, ולאחר מכן חוזר למצב המקורי כדי להתחיל את המחזור הבא. עמותה בונד / ניתוק תחת אפס כוח היאבא לידי ביטוי כירידה / עלייה פתאומית בתנודות התרמיות של חרוז 16,30.
assay מהדק כוח משמש למדידות חיים תחת כוחות. כוח רצוי הידוק (לדוגמא, 20 PN) מוגדר לפני הניסוי. היעד הוא מונע שוב ושוב ליצור קשר עם חרוז הבדיקה במשך זמן קשר נתון (לדוגמא, 1 שניות) כדי לאפשר את היווצרותו של קשר קולטן / יגנד (איור 2 ג, פנלים 2 ו -3) ולאחר מכן לחזור בי (איור 2 ג, לוח 4 ). אם אין קשר נוצר, בא לידי ביטוי בשום אות כוח מתיחה על RBC, או אם נקרע הקשר לפני שהגיע כוח ההידוק מראש, היעד יחזור למצב המקורי ולהתחיל את המחזור הבא. באירועים המחייבים ששרדו את שלב ההכחשה, היעד מוחזק בכוח ההידוק עם התארכות מקביל RBC על ידי ד עד מנתק הקשר (איור 2 ג, פנלים 5 ו -6), ולאחר מכן חוזר למעמידים המקורייון להתחיל את המחזור הבא (איור 2 ג, 7 לוח). כל החיים מוגדר כפרק הזמן מהרגע שבו הכוח הגיע לרמה הרצויה למיידי של אג"ח דיסוציאציה 20.
לכל שלושת מצבים ניסיוניים אלה BFP, בניסויים צריכים להיות מסוגלים לראות את גישת impinge-הקשר-retract- (מהדק -) (dissociate-) מחזור בדיקות תמורה (איור 2 ג), שיחזור על עצמו מספר פעמים ל16,20 , 21.
נתונים שנאספו מכל מצב ניסיוני של BFP יכולים להיות מנותחים בדרכים שונות כדי להפיק תוצאות רצויות. עקומת החיים הממוצעת היא תוצאת נציג אחד מassay כוח המהדק (איור 4). הוא משקף את הגומלין מחוץ לשיעורים של ניתוק קולט יגנד תחת כוחות. assay תנודות התרמי מאפשר האפיון של 2D על-שיעור ומחוץ לשיעור של זוג רצפטור ליגנד תחת אפס כוח 16; בעוד תדר הידבקותassay uency הופך 2D על-שיעור, תחת מחוץ לשער וזיקה אפס כוח 13.
התוספת של פונקצית ההדמיה הקרינה מאפשרת לניטור Ca 2 + הרמה תאית של תא בודד, המשמש כקריאת הנתונים של איתות תא במערכת זו. כדי להשתמש בפונקציה זו בניסוי fBFP, צריך לטעון מראש את התאים עם מחוון Ca 2 +. במקרה של Fura2-AM להיות צבע הניאון, תמונות הקרינה של אותו התא מתחת 340 ננומטר ו -380 ערוצי עירור ננומטר נרשמו לסירוגין בניסוי ובדקו זוג אחר זוג בניתוח. סף עוצמת הוטל על תמונת הניאון של כל ערוץ להסרת רעשי רקע ולהכיר את קווי המתאר התא (איור 5). השוואה של כל זוג תמונות הקרינה מאפשרת החישוב של תאית 2 + Ca רמה. תמונות ניאון ברורות של התא תחת שני ננומטר 340ו -380 ערוצי עירור ננומטר נחוצים למדידה מדויקת של רמת Ca 2 + (איור 5 א ', ב'), ואילו תמונות עניות עם רעשי רקע שאינו זניחים יגרמו תוצאות מוטות ויש להימנע (איור 5 ג).
על ידי הצגת גירויים מכאניים לשליטה על תא התא ושיא Ca 2 + רמה בו זמנית, fBFP מספק כלי מולקולה בודדת חזק ללמוד mechano-התמרה בתא חי. ראוי לציין כי, הפלטפורמה שתוארה כאן היא די צדדי; בעיקרון, אפשר לתכנן דרכים רבות של הפעלת כוח לתא כדי שיתאים למטרות מסוימות ובמקביל ניטור אירועי איתות שונים של עניין. הפרטים הקינטית הכוח תלוי לאחר מכן ניתחו בהקשר של את הודעת האיתות בחרה לחלץ מאפיינים של קינטיקה מוסדר כוח קולט ליגנד, האיתות המושרית, והמתאם שלהם. בדוגמא של sig TCRnaling, אג"ח לתפוס אגוניסט הספציפי TCR-pMHC התגלה לראשונה ולאחר מכן את הרלוונטיות שלה לתא T שטף Ca 2 + נחקרו 27. האסטרטגיה הייתה לקחת את ערך השיא של שטף Ca 2 + כאת הודעת האיתות לחפש המנבא הטוב ביותר שלה בין פרמטרים הקינטית שונים, לרבות מספר ההידבקויות, משרעת הכוח המחייב, החיים הממוצע, חיים הארוכים ומצטבר חיים של איגודים ברצף שנוצר. שמוצגת באיור 6 הוא דוגמא לחי אג"ח בודד נרשמו בו זמנית (שבו כוח clamping של 10 PN יושם) של T-cell והצטברותם יחד עם עקומת אות Ca 2 + המקבילה. במקרה זה, ארבעה אירועי חיים התרחשו לפני הזמן שבו Ca 2 + רמה החלה להעלות ב 55 שניות, צבירת סכום של 10 שניות קשר לכל החיים. רמה זו של הצטברות חיים מופעלת אות Ca 2 + עם שיא של יחס Fura2 המנורמלשל 1.8 שהתרחשו ב 65 שניות. ניתוח מתמטי שיטתי של נתונים כגון שנאספו מהרבה תאים בודדים גילה כי לתאם הטוב ביותר של Ca 2 + איתות כוח הוא הצטבר חיים בדקה -1 באינטראקציות TCR-pMHC חזרו (ראה הפניה 27 לפרטים טכניים).
איור 3: זמן כוח למופת עקומות הנתונים הגולמיים של אירוע לא-הידבקות (), אירוע כוח הקרע (B) ואירוע לכל החיים (C). שלבים שונים של המחזור ומגזרי העקומה המתאימה מסומנים בהתאמה בכל לוח. הכוח (ציר y-) נגזר ממעקב שינוי עמדתו של חרוז הבדיקה, כפי שמוצג באיור 2 ג. אין הידבקות (): הדחיסה הכוח (שלילי) בt חוזר שלב קשר o אפס על הכחשה. כוח מתיחה (חיובי) מושך באמצעות האג"ח לרצפטור ליגנד להאריך RBC, שנקרע בשלב ההכחשה: אירוע כוח הקרע (B). (ג) אירוע לכל החיים: הקשר נמשך עד שיגיע לכוח ההידוק וdissociates לאחר מכן. משך אירוע החיים מצויינים. אירוע כוח הקרע (ב ') ובתחילתו של האירוע בחיים (C) מודגשים על ידי כוכבית.
איור 4:. "חיים ממוצע לעומת כוח" עקומה של הארכת הזמן 1 T-cell אינטראקציה עם אגוניסט OVA (ירוק) וG4 אנטגוניסט (כחול) נתונים נקוו מקובצות בפחי כוח שונים, וממוצע ± SEM של חיים אג"ח זמם לעומת כוח.
= "תמיד"> 
איור 5:. נציג Ca 2 + תמונות נרגשות בשני אורכי גל (A, B) זיהוי תמונה נכון של T-cell (מצויינים באדום) ב340 ננומטר () ו -380 ננומטר (B) ערוצים המבוססים על נקודה-ל- להצביע באמצעות הקרנת סף עוצמה שהוקצה כראוי. חוסר יכולת (ג) להכיר בתמונת הקרינה של תאי T (מצויינים באדום) בערוץ עירור 340 ננומטר, עקב טעינת Fura2 עניה.
איור 6: גיבוב של "2 + Ca הרמה תאית (יחס יחסי Fura2) לעומת זמן" ואת "החיים מצטברים לעומת זמן" עקומות של T-cell הארכת זמן 1, ליצורד על ידי נגיעה בתא T שוב ושוב עם חרוז מצופה OVA מעל 300 שניות. () עקומת כוח מראה רצף של אי-הידבקות, כוח קרע, ואירועי חיים שנוצרו על ידי אנשי קשר חזרו לאורך זמן. (ב) תמונות Epi-הקרינה פסאודו-צבע של 2 + Ca אותות תאיים בתאי T בנקודות זמן שונים. Ca 2 + הרמה המנורמלת מצויינים על ידי בקנה מידה פסאודו-הצבע בצד הימין. (ג) גיבוב של עקומת Ca 2 + אות (אדום) והעקומה המצטברת חיים (הצהובה) באותו הזמן כמובן. עקומת Ca 2 + הייתה להתוות מבוססת על ההדמיה Ca 2 +. שטף Ca 2 + הוא סימל על ידי העלאה חדה ביחס Fura2 המנורמל. הזמן שבו Ca 2 + מגיע לשיא מצויינים על ידי קו מקווקו. זמן תחילתו של כל אירוע בחיים מסומן בעקומה המצטברת חיים (המשולש מוצק).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניסוי מוצלח fBFP כרוך כמה שיקולים קריטיים. ראשית, לחישוב הכוח להיות אמין, micropipette, RBC, וחרוז הבדיקה צריך להיות מיושר כקרוב לקואקסיאלי ככל האפשר. ההשלכה של RBC בתוך פיפטה צריכה להיות על אחד קוטר פיפטה הבדיקה כך שהחיכוך בין RBC ופיפטה הוא זניח. לRBC האנושי טיפוסי, קוטר פיפטה האופטימלי הוא 2.0-2.4 מיקרומטר, אשר מניב הטוב ביותר בכושר של משוואת 1 17,30. שנית, על מנת להבטיח מדידות בassay כוח המהדק וassay תנודות התרמית הן בעיקר לקשרים יחידים, תדירות הידבקות של מתחת 20% יש להישמר 10,13,30. כאן, הידבקויות שאינן ספציפיות צריכים להיות מבוקרות בקפידה (בדרך כלל <5% על ידי חסימה מספיק עם BSA). בנוסף, יש לאסוף רק מאירועי הידבקות בכוח-טיפה אחת נתונים - סימן היכר של התנהגות מולקולה בודדת (מקביל להיעלמות שלב יחידשל הקרינה במולקולה בודדת סריג). ריכוז של צבע הקרינה שלישי, טעינה צריך להיות מותאם על בסיס מקרה לפי מקרה כדי להשיג את איכות ההדמיה הטובה ביותר. רביעית, הרעילות של טעינת צבע לתאי T או תאים אחרים של עניין יש לבחון בזהירות לפני כל ניסוי. לדוגמא, הזיקה המחייבת של אינטראקציות קולט ליגנד על טעינת צבע צריכה להימדד ובהשוואה לכי ללא טעינת צבע. אם הזיקה המחייבת היא לשנות באופן דרמטי בשל לצבוע טעינה, צבע שונה או ריכוז טעינה שונה יש לשקול. חמישי, חלבוני סופני ביוטין מתוייגים הם העדיפו לאפשר צימוד נוח, ספציפי, וחזק ששומר על הנטייה הטבעית של החלבון.
כוח עיקרי של fBFP הוא שהוא מבצע יחיד-בונד assay בתא בודד. למרות התפוקה הנמוכה, חד-אג"ח ניתוח לעתים קרובות חושף תכונות חשובות אשר אינן נגישים על ידי אנסמבל הקונבנציונליthods. לדוגמא, על ידי בחינת התפלגות חיים בכל סל כוח, אפשר לתאם מאפייני מחייב שונים עם מדינות קונפורמציה חלבון, מתן תובנה על איך כוח מסדיר קונפורמציה החלבון משתנה 20,32. גם BFP ניתן להשתמש כדי למדוד נוקשות מולקולריות מנתוני הכוח ופייזו מתורגמן התזוזה של שלב ההכחשה, אשר יכול לשמש כדי לחקור דינמיקת קונפורמציה חלבון 20,21.
שיטות רבות פותחו ללמוד הידבקות תא קולטן בתיווך ואיתות. קינטיקה מחייבת קולטן ליגנד נמדדה בדרך כלל עם חלבונים רקומביננטי בבידוד מוחלט מהסביבה התאית. אימון כזה הוא פוטנציאל בעייתי. לדוגמא, זה לאחרונה הראה כי באתר קינטיקה נמדדה על תאי חיים באופן דרסטי שונה מזו שנמדדה באמצעות החלבונים רקומביננטי המתאימים 14, חושפים תובנות חדשות של קולט & #8217; של תפקודים תאיים. לא רק הוא fBFP מסוגל לכמת קינטיקה קולט ליגנד באתר, אבל יותר חשוב, זה גם יכול בו זמנית להקליט את איתות התא מושרה מחייבת. כפי שהודגם במשך 27 TCR, המידע העשיר של מאפיינים מחייבים ותא איתות שהושג באמצעות fBFP מספק הזדמנות חסרת תקדים לניתוח היחסים שלהם והבנת המנגנונים המולקולריים של mechano-התמרה. סביר להניח כי fBFP ימצא יותר יישומים במערכות קולט יגנד חשובים אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | N2-5% buffer preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | N2-5% buffer preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | N2-5% buffer preparation |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | N2-5% buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Bead functionalization |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Nystatin | Sigma-Aldrich | N6261 | RBC osmolarity adjustment |
| Ammonium Hydroxide (NH4OH) | Sigma-Aldrich | A-6899 | Glass bead silanization |
| Methanol | BDH | 67-56-1 | Glass bead silanization |
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | J. T. Barker | Jan-86 | Glass bead silanization |
| Acetic Acid (Glacial) | Sigma-Aldrich | ARK2183 | Glass bead silanization |
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology | 9002 | Glass bead functionalization |
| Streptavidin−Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Fura2-AM | Life Technologies | F-1201 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | BD LSR II | Density quantification |
| Capillary Tube 0.7-1.0 mm x 30 inches | Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette making |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | sutter instrument | P-97 | Micropipette making |
| Pipette microforce | Narishige | MF-900 | Micropipette making |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
| Micro-injector | World Precision Instruments | MF34G-5 | Chamber assembly |
| 1 ml syringe | BD | 309602 | chamber assembly |
| Micropipette holder | Narishige | HI-7 | Chamber assembly |
| Home-designed mechanical parts and adaptors fabrications using CNC machining. | Biophysics Instrument | All parts are customized according to the CAD designs. | BFP system |
| Microscope (TiE inverted) | Nikon | MEA53100 | BFP system |
| Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg) | Nikon | MRH00401 | BFP system |
| Camera, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, mono | Graftek Imaging | 02-2020C | BFP system |
| Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADC | Graftek Imaging | 02-2185A | BFP system |
| Manual submicron probehead with high resolution remote control | Karl Suss | PH400 | BFP system |
| Anti-vibration table (5’ x 3’) | TMC | 77049089 | BFP system |
| 3D manual translational stage | Newport | 462-XYZ-M | |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2012 SP5 | BFP system |
| LabVIEW software | National Instruments | Version 2009 | BFP system, BFP program |
| 3D piezo translational stage | Physik Instrumente | M-105.3P | BFP system |
| Linear piezo accuator | Physik Instrumente | P-753.1CD | BFP system |
| Micromanager software | Version 1.4 | fBFP system, fluorescence imaging program | |
| Dual Cam (DC-2) | Photometrics | 77054724 | fBFP system |
| Dual Cam emission filter (T565LPXR) | Photometrics | 77054725 | fBFP system |
| Fluorescence Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600-10B | fBFP system |
| Plastic paraffin film (Parafilm) | Bemis Company, Inc | PM996 | bottle sealing |
| Carbonate/bicarbonate buffer (pH 8.5) | 8.4 g/L sodium carbonate (Na2CO3), 10.6 g/L sodium bicarbonate (NaHCO3) | ||
| Phosphate buffer (pH 6.5-6.8) | 27.6 g/L NaPhosphate monobasic (NaH2PO4 • H2O), 28.4 g/L Anhy. NaPhosphate dibasic (Na2HPO4) | ||
| N2-5% buffer (pH 7.2) | 20.77 g/L potassium chloride (KCl), 2.38 g/L sodium chloride (NaCl), 0.13 g/L potassium phosphate monobasic (KH2PO4), 0.71 g/L anhy. sodium phosphate dibasic (Na2HPO4), 9.70 g/L sucrose |
References
- Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins. Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
- Dado, D., Sagi, M., Levenberg, S., Zemel, A. Mechanical control of stem cell differentiation. Regenerative medicine. 7, 101-116 (2012).
- Edwards, L. J., Zarnitsyna, V. I., Hood, J. D., Evavold, B. D., Zhu, C. Insights into T cell recognition of antigen: significance of two-dimensional kinetic parameters. Frontiers in immunology. 3, 86 (2012).
- Zhu, C., Jiang, N., Huang, J., Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D. Insights from in situ analysis of TCR-pMHC recognition: response of an interaction network. Immunological reviews. 251, 49-64 (2013).
- Huang, J., Meyer, C., Zhu, C. T. T cell antigen recognition at the cell membrane. Molecular immunology. 52, 155-164 (2012).
- Zarnitsyna, V., Zhu, C. T. T cell triggering: insights from 2D kinetics analysis of molecular interactions. Physical biology. 9, 045005 (2012).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).
- Marshall, B. T., et al. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423, 190-193 (2003).
- Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).
- Yago, T., et al. Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear. The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).
- Yago, T., et al. Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF. The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).
- Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).
- Huang, J., et al. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 (2010).
- Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).
- Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical. 68, 2580-2587 (1995).
- Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).
- Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib. Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).
- Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).
- Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells. The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophysical journal. 102, L5-L7 (2012).
- Bashour, K. T., et al. CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2241-2246 (2014).
- Nesbitt, W. S., et al. Distinct glycoprotein Ib/V/IX and integrin alpha IIbbeta 3-dependent calcium signals cooperatively regulate platelet adhesion under flow. The Journal of biological chemistry. 277, 2965-2972 (2002).
- Mazzucato, M., Pradella, P., Cozzi, M. R., De Marco, L., Ruggeri, Z. M. Sequential cytoplasmic calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by the glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor. Blood. 100, 2793-2800 (2002).
- Lefort, C. T., Ley, K. Neutrophil arrest by LFA-1 activation. Frontiers in immunology. 3, 157 (2012).
- Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling. Cell. 157, 357-368 (2014).
- Lou, J., et al. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. The Journal of cell biology. 174, 1107-1117 (2006).
- Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature communications. 5, 4886 (2014).
- Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).
- Marshall, B. T., Sarangapani, K. K., Lou, J., McEver, R. P., Zhu, C. Force history dependence of receptor-ligand dissociation. Biophysical. 88, 1458-1466 (2005).
- Xiang, X., et al. Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin. PloS one. 6, e27946 (2011).
