Abstract
झिल्ली रिसेप्टर ligand बातचीत कई सेलुलर कार्यों मध्यस्थता। बंधन कैनेटीक्स और इन आणविक मुलाकातों से चालू होने वाले बहाव के संकेत दे संभावना यांत्रिक वातावरण में जो बाध्यकारी और संकेत जगह ले से प्रभावित हैं। एक ताजा अध्ययन में यांत्रिक बल द्वारा प्रतिजन मान्यता को विनियमित करने और टी सेल रिसेप्टर (TCR) के ट्रिगर कर सकते हैं कि प्रदर्शन किया। इस प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी को जोड़ती है जो एक नया हम विकसित प्रौद्योगिकी और करार दिया प्रतिदीप्ति biomembrane बल जांच (fBFP), के द्वारा ही संभव बनाया गया था। संवेदनशील बल सेंसर के रूप में एक उच्च गति कैमरा और वास्तविक समय इमेजिंग तकनीक पर नज़र रखने के लिए एक अति नरम मानव लाल रक्त कोशिका का प्रयोग, fBFP ~ 1 पी.एन. (10 -12 एन), ~ 3 एनएम की है और ~ 0.5 मिसे में बल, स्थानिक और लौकिक संकल्प। FBFP के साथ, एक ठीक बल विनियमन के तहत एक रिसेप्टर ligand के बंधन कैनेटीक्स और साथ ही छवि ट्रिगर बंधन इंट्रासेल्युलर कैलोरी उपाय कर सकते हैंcium एक भी जीवित कोशिका पर संकेत। इस नई तकनीक यांत्रिक विनियमन के तहत अन्य कोशिकाओं में अन्य झिल्ली रिसेप्टर ligand के संपर्क और संकेतन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
सेल के लिए सेल और सेल के लिए बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) आसंजन कोशिका की सतह रिसेप्टर्स, ईसीएम प्रोटीन, और / या लिपिड 1 के बीच बंधन से मध्यस्थता है। बंधन कोशिकाओं कार्यात्मक संरचनाओं 1 फार्म, साथ ही पहचान है, संवाद, और पर्यावरण 1-3 करने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमति देता है। घुलनशील प्रोटीन (जैसे, साइटोकिन्स और वृद्धि कारकों) एक तीन आयामी (3 डी) से है कि बाँध कोशिका की सतह रिसेप्टर्स पर तरल पदार्थ चरण के विपरीत, कोशिका आसंजन रिसेप्टर्स आणविक विवश है कि दो विरोधी सतहों को पाटने के लिए एक संकीर्ण junctional अंतराल में उनके ligands के साथ बांड फार्म एक दो आयामी (2 डी) इंटरफेस 4-7 में प्रसार। आमतौर पर पारंपरिक बंधन assays के (जैसे, सतह plasmon अनुनाद या एसपीआर) द्वारा मापा जाता है कि 3 डी कैनेटीक्स के विपरीत, कक्ष 11,12 प्रवाह, इस तरह के परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) 8-10 के रूप में विशेष तकनीक के साथ मात्रा निर्धारित किया जा करने के लिए 2 डी कैनेटीक्स है micropipette 13,14, ऑप्टिकलचिमटी 15 और biomembrane बल जांच (BFP) 16-21।
केवल सेलुलर सामंजस्य के लिए शारीरिक संबंध उपलब्ध कराने से भी ज्यादा, आसंजन अणुओं अपने परिवेश के साथ बातचीत करने के लिए सेल के लिए संकेत मशीनरी के एक प्रमुख घटक हैं। आसंजन अणुओं की लिगेंड सगाई इंट्रासेल्युलर संकेतन और कैसे प्रारंभिक संकेत सेल के अंदर transduced है शुरू की कैसे समझ में बढ़ती रुचि रही है। Intuitively, रिसेप्टर ligand के गुण यह लाती संकेतों को प्रभावित कर सकता बाध्यकारी। हालांकि, यह क्योंकि जैसे उनके कई सीमाएं हैं, एक गरीब अस्थायी समाधान और स्थानिक संकल्प के पूर्ण अभाव की जैव रासायनिक assays के पारंपरिक पहनावा का उपयोग कर कोशिकी बातचीत और intracellular संकेतन घटनाओं के बीच यंत्रवत रिश्तों को काटना मुश्किल है। Live पर दोनों जैवभौतिक (कैनेटीक्स बाध्यकारी 2D रिसेप्टर ligand) की अनुमति देने के तरीकों कि और जैव रासायनिक (संकेत) टिप्पणियों मौजूदाकोशिकाओं प्रतिदीप्ति क्षमता 24-26 के साथ शामिल ट्यून करने योग्य कठोरता 22 के substrates के, 23 इलास्टोमेर स्तंभ सरणियों और प्रवाह कक्ष / microfluidic उपकरणों में शामिल हैं। हालांकि, सिगनल और बाध्यकारी रिसेप्टर ligand के readouts यह मुश्किल संकेत घटनाओं के साथ बंधन विशेषताओं के अस्थायी और स्थानिक संबंधों काटना, जिससे (विभिन्न तरीकों से सबसे अधिक बार) अलग से प्राप्त किया जाना है।
परम्परागत BFP उच्च spatiotemporal संकल्प 17 के साथ एक ultrasensitive बल स्पेक्ट्रोस्कोपी है। यह एकल अणु 2 डी कैनेटीक्स, यांत्रिक गुणों और गठनात्मक परिवर्तन 14,16,19-21,27-29 की माप को सक्षम करने, एक बल सेंसर के रूप में एक लचीला लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) का उपयोग करता है। एक फ्लोरोसेंट इमेजिंग आधारित BFP (fBFP) एकल अणु पैमाने पर बाध्यकारी ट्रिगर कोशिका संकेतन के साथ रिसेप्टर ligand के बंधन कैनेटीक्स संबद्ध करता है। सतह mechani के संदर्भ में सीटू कोशिका संकेतन गतिविधियों में इस सेटअप के साथसीएएल उत्तेजना टी कोशिकाओं 27 में मनाया गया। fBFP बहुमुखी है और अन्य कोशिकाओं में अन्य अणुओं द्वारा मध्यस्थता सेल आसंजन और संकेतन के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
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Protocol
इस प्रोटोकॉल के दिशा निर्देशों के बाद और जॉर्जिया प्रौद्योगिकी संस्थान के मानव अनुसंधान नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है।
1. मानव लाल रक्त कोशिकाओं अलगाव, Biotinylation और परासारिता समायोजन
नोट: एक संस्थागत समीक्षा बोर्ड प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी साथ 1.1 कदम, एक प्रशिक्षित चिकित्सा पेशेवर के रूप में एक नर्स द्वारा किया जाना चाहिए।
- उंगली चुभन से खून की 8-10 μl (एक बूंद) प्राप्त करें और कार्बोनेट / बाइकार्बोनेट बफर के 1 मिलीलीटर में जोड़ें (तालिका 1 और 2)। धीरे जी भंवर या 900 एक्स पर 1 मिनट के लिए मिश्रण और सेंट्रीफ्यूज विंदुक। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और एक बार फिर धो लें।
- एक छोटे से बीकर में बायोटिन PEG3500 एनएचएस लिंकर (तालिका 1) का 3.5-4 मिलीग्राम वजन। अंतिम एकाग्रता 3 मिलीग्राम / एमएल बनाने के लिए कार्बोनेट / बाइकार्बोनेट बफर में इसे भंग।
- कार्बोनेट / बाइकार्बोनेट बफर के 171 μl, आरबीसी पैक के 10 μl और 1049 μl मिक्सबायोटिन PEG3500 एनएचएस लिंकर समाधान और 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। कार्बोनेट / बाइकार्बोनेट बफर के साथ एक बार आरबीसी धो लें और फिर दो बार N2-5% बफर (तालिका 1 और 2) के साथ।
- इस बीच, 5 मिनट के लिए नीचे और शून्य में desiccants से भरा एक गिलास निर्वात desiccator में ढीला टोपी के साथ लिंकर बोतल जगह है, और आर्गन साथ desiccator भरें। टोपी कसो और बोतल से बाहर ले। प्लास्टिक आयल फिल्म (तालिका 1) के साथ बोतल सील, -20 डिग्री सेल्सियस नीचे और दुकान पर desiccants से भरा एक कंटेनर में रखें।
नोट: 1.2-1.4 सहित बायोटिन PEG3500 एनएचएस लिंकर के इस्तेमाल को शामिल कदम है कि, (ऊष्मायन के लिए छोड़कर और 1.3 में धो), के रूप में संभव के रूप में तेजी से प्रदर्शन करने की आवश्यकता है। - 40 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए N2-5% बफर में Nystatin पतला। Nystatin के 71.4 μl (तालिका 1) समाधान के साथ biotinylated आरबीसी के 5 μl मिक्स और 0 पर 1 घंटे के लिए सेते और# 176; सी। फ्रिज में + 0.5% बीएसए N2-5% बफर (तालिका 1) (4 डिग्री सेल्सियस) के साथ N2-5% बफर और दुकान के साथ दो बार धोएं।
2. ग्लास मनका Silanization
- मनका सतह की सफाई
- कांच के मोती पाउडर और 50 मिलीग्राम वजन डि पानी के 500 μl में उन्हें फिर से निलंबित।
- एक 50 मिलीलीटर बीकर में डि पानी के 9.5 मिलीलीटर के साथ 0.5 मिलीलीटर 30% एच 2 ओ 2 (तालिका 1) का मिश्रण है, तो ध्यान केंद्रित किया एनएच 4 ओह (तालिका 1) के 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए और एक गर्म थाली पर एक बॉयलर के लिए इस समाधान लाना ।
- उबलते समाधान करने के लिए कांच के मोती जोड़ें और एक और 5 मिनट के लिए फोड़ा करने के लिए जारी है। धीरे समाधान हर मिनट ज़ुल्फ़।
- उबलते के बाद, आर टी डि पानी के साथ एक 15 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब और टॉप-अप में ~ इस गर्म मनका निलंबन के 5 मिलीलीटर हस्तांतरण। 5 मिनट के लिए 3500 XG पर अपकेंद्रित्र हटाने और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
- धोया मोतियों के लिए गर्म मनका निलंबन की एक और 5 मिलीलीटर स्थानांतरण और जोड़, फिर से, और डि पानी के साथ शीर्ष मिश्रण अच्छी तरह से, और अपकेंद्रित्र। डि पानी के बारे में 50 मिलीलीटर प्रयोग किया जाता है जब तक धोने के 4 से 5 बार की कुल किया जाएगा, जो इस प्रक्रिया को दोहराएँ।
- 1 मिलीलीटर शीशी में मनका निलंबन स्थानांतरण। अंत में 3 बार के लिए 5 मिनट के लिए 17,000 XG पर centrifugation द्वारा मेथनॉल (तालिका 1) के साथ मोती धोने, और दोहराने 100% मेथनॉल के 1 मिलीलीटर में मोतियों से निलंबित कर रहे हैं।
- मनका भूतल Thiolation
- एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब, निलंबन 2.1 में तैयार 1.15 मिलीग्राम 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) (1 टेबल) और 1 मिलीलीटर मोतियों की एसिटिक एसिड के मेथनॉल के 45.6 मिलीलीटर, 0.4 मिलीग्राम (तालिका 1), डि पानी की 1.85 मिलीग्राम, जोड़ तो 3 घंटे के लिए आरटी पर सेते हैं।
- प्रतिक्रिया के बाद, ताजा मेथनॉल के साथ एक बार धोने से सभी अभिकारकों हटाने, और मेथनॉल के 500 μl में मोती फिर से निलंबित। समान रूप से 20 सूखी और साफ कांच की शीशियों का एक सेट के साथ में इस केंद्रित गिलास मनका निलंबन विभाजितपेंच के ढकन। शुष्क आर्गन के एक विमान का उपयोग करके मेथनॉल बंद लुप्त हो जाना और प्रत्येक शीशी के पक्षों पर शुष्क मोतियों की एक पतली परत बनाने के लिए इतनी के रूप में धीरे-धीरे शीशियों बारी बारी से।
- शिथिल पर टोपी (एस) जगह जल्दी से 5 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर एक पूर्व गर्म सुखाने ओवन में मोतियों की शीशियों प्लेस और फिर बाहर ले जाना और। तल में desiccants से भरा एक गिलास निर्वात desiccator में शीशियों रखें और ठंडा जब तक एक वैक्यूम पंप के साथ desiccator शून्य।
- सामान्य वायुमंडलीय दबाव के desiccator लाने के लिए सूखी आर्गन साथ vacuumed desiccator शुद्ध। शीशी पर टोपी (एस) को फिर से कसने जल्दी desiccator ढक्कन निकालें और। प्लास्टिक आयल फिल्म के साथ शीशियों को सील करने और एक सूखी अंधेरे भंडारण बॉक्स में आरटी पर उन्हें दुकान।
- तत्काल उपयोग करने पर, शुष्क मोतियों की एक शीशी ले और फॉस्फेट बफर (टेबल्स 1 और 2), 4 डिग्री सेल्सियस पर फॉस्फेट बफर और दुकान के 50 μl में फिर से निलंबित साथ एक बार धो लें। इस केंद्रित मनका तैयारी करने के लिए भेजा जाएगानिम्न चरणों में "MPTMS मोती" के रूप में।
नोट: उचित भंडारण के साथ, MPTMS मोती अप करने के लिए तीन महीने के लिए कार्यात्मक रह सकता है।
3. मनका functionalization
- Covalently मनकों पर प्रोटीन कोटिंग
- प्रोटीन स्टॉक की एक निश्चित मात्रा (उदाहरण के लिए, 2.5 μl) ले लो और 1 समाधान बनाने के लिए कार्बोनेट / बाइकार्बोनेट बफर के बराबर मात्रा के साथ मिश्रण।
नोट: मात्रा शेयर एकाग्रता और मोतियों की सतह पर प्रोटीन के वांछित अंतिम साइट घनत्व पर निर्भर करता है। - एक छोटे से बीकर में मल-PEG3500 एनएचएस लिंकर (तालिका 1) के 2-3 मिलीग्राम वजन और 0.231 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए कार्बोनेट / बाइकार्बोनेट बफर के साथ इसे भंग।
- 3.1.2 में तैयार लिंकर समाधान के एक बराबर मात्रा के साथ समाधान 1 मिलाएं। 2 समाधान बनाने के लिए 30 मिनट के लिए आरटी पर मिश्रण सेते हैं।
- इस बीच, एक गिलास निर्वात desiccator एफ में ढीला टोपी के साथ लिंकर बोतल जगह5 मिनट के लिए नीचे और शून्य में desiccants साथ illed, और आर्गन साथ desiccator भरें। टोपी कसो और बोतल से बाहर ले। , प्लास्टिक आयल फिल्म के साथ बोतल सील -20 डिग्री सेल्सियस नीचे और दुकान पर desiccants से भरा एक कंटेनर में रखें।
नोट: (3.1.3 में ऊष्मायन के लिए छोड़कर) 3.1.2-3.1.4 सहित मल PEG3500 एनएचएस लिंकर के इस्तेमाल को शामिल कदम है कि, जितनी जल्दी हो सके पूरा किया जा करने की जरूरत है। - 2 समाधान के साथ MPTMS मोतियों की 5 μl मिक्स और 250 μl के अंतिम मात्रा बनाने के लिए फॉस्फेट बफर (तालिका 1) जोड़ें।
- रात भर आरटी पर मोती सेते फॉस्फेट बफर के साथ 3 बार धोने, और 4 डिग्री सेल्सियस पर फॉस्फेट बफर और दुकान के 100 μl में फिर से निलंबित।
- प्रोटीन स्टॉक की एक निश्चित मात्रा (उदाहरण के लिए, 2.5 μl) ले लो और 1 समाधान बनाने के लिए कार्बोनेट / बाइकार्बोनेट बफर के बराबर मात्रा के साथ मिश्रण।
- की तैयारी प्रोटीन / Streptavidin (एसए) लिपटे मोतियों
- प्रोटोकॉल 3.1.1-3.1.4 का पालन करें।
- 2 समाधान के साथ MPTMS मोतियों की 5 μl और 4 मिलीग्राम / एमएल Streptavidin-Maleimide एसए (मल) (1 टेबल के 5 μl मिक्स) समाधान और फिर 250 μl के अंतिम मात्रा बनाने के लिए फॉस्फेट बफर जोड़ें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर फॉस्फेट बफर और दुकान के 100 μl में फिर से निलंबित अंत में, रात भर आरटी पर मोती सेते फॉस्फेट बफर के साथ 3 बार धो लें और।
- ग्लास मोती पर Streptavidin कोटिंग
- 4 मिलीग्राम / एमएल एसए समाधान के 5 μl साथ MPTMS मोतियों की 5 μl मिक्स और फॉस्फेट बफर के 140 μl जोड़ें।
- रात भर आरटी पर मोती सेते फॉस्फेट बफर के साथ 3 बार धोने, और 4 डिग्री सेल्सियस पर फॉस्फेट बफर और दुकान के 50 μl में फिर से निलंबित।
- एक biotinylated प्रोटीन के साथ एसए लिपटे मोतियों का लेप
- (मात्रा वांछित कोटिंग घनत्व पर निर्भर करता है) प्रोटीन के साथ एसए लिपटे मोतियों के 5 μl मिक्स और अंतिम मात्रा 100 μl होने के लिए बनाने के लिए फॉस्फेट बफर जोड़ें।
- रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर या आरटी पर 3 घंटे के लिए मिश्रण को सेते हैं फॉस्फेट बफर के साथ 3 बार धोने, और 50 μl पीएच में फिर से निलंबितosphate बफर और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
4. सेल तैयार
नोट: उदाहरण के लिए, टी कोशिकाओं को 27 या कुछ सेल लाइनों 21,29, कोशिकाओं को शुद्ध प्रयोग में कोशिकाओं के प्रकार के लिए इसी मानक सेल शुद्धि प्रोटोकॉल का पालन करें।
- FBFP प्रयोगों के लिए, सेल निलंबन तैयार किया जाता है, एक बार Fura2-एएम, 2 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं और फिर एक बार धोने के लिए सेल निलंबन में DMSO में भंग (तालिका 1) जोड़ें। अंधेरे में उपयोग करें जब तक इस fluorescently भरी हुई सेल निलंबन रखें।
5. Micropipettes के लिए तैयार करना और एक सेल चैंबर
- Micropipettes की तैयारी
- लंबाई में लगभग 3 इंच के छोटे टुकड़े में एक गिलास कटर के साथ कट लंबे केशिका ग्लास ट्यूब (1 टेबल)। Micropipette खींचने (तालिका 1), "पुल" पर क्लिक करें पर माउंट एक टुकड़ा है, लेकिनटन इतना है कि केशिका के बीच मशीन द्वारा गर्म हो जाएगा और केशिका तेज सुझावों (कच्चे micropipettes) के साथ दो केशिकाओं बनाने के लिए दोनों सिरों पर खींच लिया जाएगा।
नोट: उत्पाद दिशानिर्देश का पालन करके, कच्चे पिपेट की यात्रा की आकृति विज्ञान 6-8 मिमी शंकु और 0.1-0.5 माइक्रोन टिप है। - Micropipette फोर्ज (तालिका 1) के पिपेट धारक पर एक कच्चा पिपेट माउंट। हीट फोर्ज पर गिलास क्षेत्र पिघला करने के लिए। गिलास क्षेत्र के अंदर कच्चे पिपेट की नोक डालें। गिलास क्षेत्र शांत हो जाओ और इसे बाहर से तोड़ने के लिए और क्षेत्र के अंदर अपनी टिप छोड़ने के लिए कच्चे पिपेट खींच। वांछित टिप छिद्र प्राप्त किया जाता है जब तक इस प्रक्रिया को दोहराएँ।
एक micropipette टिप भीतरी व्यास के उदाहरण: नोट एक आरबीसी के लिए 2.0-2.4 माइक्रोन, एक मनका के लिए ~ 1.5 माइक्रोन, ~ टी-सेल के लिए 2-4 माइक्रोन और एक हाइब्रिडोमा सेल के लिए -7 माइक्रोन।
- लंबाई में लगभग 3 इंच के छोटे टुकड़े में एक गिलास कटर के साथ कट लंबे केशिका ग्लास ट्यूब (1 टेबल)। Micropipette खींचने (तालिका 1), "पुल" पर क्लिक करें पर माउंट एक टुकड़ा है, लेकिनटन इतना है कि केशिका के बीच मशीन द्वारा गर्म हो जाएगा और केशिका तेज सुझावों (कच्चे micropipettes) के साथ दो केशिकाओं बनाने के लिए दोनों सिरों पर खींच लिया जाएगा।
- एक सेल चैंबर बिल्डिंग
नोट: सेल कक्ष एक घर में पागल के आधार पर बनाया गया हैदो धातु वर्गों के टुकड़े (तांबा / एल्यूमीनियम) और उन्हें एक साथ जोड़ता है कि एक संभाल (चित्रा -1) के होते हैं, जो ई चैम्बर धारक,। - दो 40 मिमी x 11 मिमी x 0.2 मिमी टुकड़ों में एक ग्लास कटर का उपयोग करते हुए एक 40 मिमी x 22 मिमी x 0.2 मिमी coverslip के कट (1 coverslip और 2)। गोंद यह दो धातु चौकों कि पुल के रास्ते में चैम्बर धारक के ऊपर की ओर करने के लिए तेल से coverslip के 1, और एक समानांतर-coverslip सेल कक्ष (चित्रा -1) के रूप में होगा, जो नीचे की ओर करने के लिए इसी तरह गोंद coverslip के 2,।
- दो coverslips के बीच में प्रयोगात्मक बफर के 200 μl इंजेक्षन करने के लिए एक विंदुक का उपयोग करें। बफर दोनों coverslips के लिए देता है सुनिश्चित करें। धीरे बारी बारी से और बफर चैम्बर के दोनों सिरों को छूने के लिए चैम्बर हिला।
- ध्यान से इस तरह खुली हवा से बफर सील प्रयोगात्मक बफर जोन flanking चैंबर के दोनों पक्षों में खनिज तेल इंजेक्षन। (उदाहरण के लिए, pMHC लिपटे मोतियों) जांच मोतियों की निलंबन, लाल रक्त कोशिकाओं और लक्ष्यों को इंजेक्षनक्रमशः बफर जोन की, उच्च मध्यम और निचले क्षेत्रों में (उदाहरण के लिए, टी कोशिकाओं)।
6. BFP प्रयोग
चित्रा 1: fBFP विधानसभा (ए) fBFP हार्डवेयर सिस्टम का अवलोकन तस्वीर।। (बी) fBFP हार्डवेयर प्रणाली का एक योजनाबद्ध ड्राइंग। (सी) उच्च गति कैमरा (नीला) और एक प्रतिदीप्ति कैमरा (सफेद) घुड़सवार थे पर जो दोहरे सीएएम सिस्टम "DC2" (नारंगी)। (डी) एक प्रयोग के चैम्बर और तीन micropipette का हेरफेर सिस्टम adapts कि खुर्दबीन मंच। (ई और एफ) एक प्रायोगिक कक्ष में BFP सेटिंग के micrographs। (ई) Micropipettes विधानसभा जांच पिपेट (बाएं), लक्ष्य पिपेट (ऊपरी दाएं) और सहायक पिपेट दिखा रहा है (कम Right)। (एफ) जांच मनका नियुक्ति। एक जांच मनका एक बल की जांच के लिए फार्म का एक आरबीसी सुप्रीम करने के लिए एक सहायक पिपेट से छेड़छाड़ और संलग्न किया गया था। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
- माइक्रोस्कोप (1 टेबल) और प्रकाश स्रोत को चालू करें। मुख्य खुर्दबीन मंच (चित्रा 1 ए, डी) पर चैम्बर जगह।
- (लक्ष्य एक सेल या मनका, निचले सही हड़पने के लिए::: एक आरबीसी, सही हड़पने के लिए, जांच एक मनका हड़पने के लिए, सहायक। चित्रा -1 वाम) BFP के सभी तीन micropipettes स्थापित करें।
- प्रयोगात्मक बफर के साथ एक micropipette backfill के लिए एक माइक्रो इंजेक्टर (तालिका 1) का प्रयोग करें। पिपेट धारक (तालिका 1) उतारो और टिप से पानी टपकता अनुमति देने के लिए एक कम जगह में पकड़ है। जल्दी धारक टिप में micropipette डालने और कोई हवा बुलबुला micropipette में हो जाता है सुनिश्चित करेंसम्मिलन के दौरान। धारक पेंच कस।
- अपनी इसी सूक्ष्म जोड़तोड़ पर प्रत्येक पिपेट धारक माउंट। उनके सुझावों कक्ष बफर क्षेत्र में प्रवेश इतना है कि चैम्बर की ओर micropipette पुश। Micropipette की स्थिति को समायोजित करें और देखने के खुर्दबीन क्षेत्र के तहत उन्हें लगता है।
- एक-एक करके तीन तत्वों की कालोनियों (लाल रक्त कोशिकाओं, लक्ष्य और जांच मोती) को खोजने के लिए चैम्बर धारक मंच के चारों ओर ले जाएँ। Micropipette के दृष्टिकोण से एक सेल / मनका की नोक जाने के लिए manipulators के knobs के मोड़ से इसी micropipette की स्थिति को समायोजित करें। इसी micropipette के अंदर दबाव का समायोजन करके सेल / मनका aspirate। सभी तीन micropipettes उनके इसी तत्वों पर कब्जा करेगा।
- दूर प्रयोग प्रदर्शन किया जाएगा, जहां इंजेक्शन के तत्वों की कालोनियों से एक खुली जगह खोजने के लिए चैम्बर धारक मंच के चारों ओर ले जाएँ। कंप्यूटर अनुप्रयोग पर छवि कल्पना करने के लिए माइक्रोस्कोप दृश्य मोड स्विचकंप्यूटर स्क्रीन पर uter कार्यक्रम। कार्यक्रम की दृष्टि क्षेत्र में पिपेट सुझावों पर सभी तीन तत्व स्थानांतरित।
- संक्षेप में वापस लेना धीरे आरबीसी पर मनका टकराना और, जांच मनका और आरबीसी संरेखित करें, और ध्यान से आरबीसी के शीर्ष करने के लिए जांच मनका छल। यह आरबीसी सुप्रीम (चित्रा 1F) पर चिपके छोड़ दिया जाएगा, जिससे कि धीरे दूर मनका उड़ाने के लिए सहायक micropipette के दबाव को समायोजित करें। सहायक micropipette दूर ले जाने और लक्ष्य और जांच मनका (2A चित्रा) पंक्ति में।
चित्रा 2:। BFP योजना है और इसके परीक्षण चक्र (ए) के एक शक्ति जांच (बाएं) और उनके संबंधित pipettes.The स्थिर बल जांच से aspirated एक लक्ष्य टी सेल (दाएं) का चित्रण वीडियो माइक्रोग्राफ एक सूजन आरबीसी और एक संलग्न होते हैं ligand के असर मनका। रिसेप्टर असरटी-सेल (लक्ष्य) की जांच करने के लिए विपरीत है गठबंधन एक piezotranslator करने के लिए मुहिम शुरू की है। आरओआई हरे रंग में संकेत दिया है। धार पर नजर रखने वाली एक ब्लू लाइन में संकेत दिया है। डालने नारंगी में चिह्नित क्षेत्र में दो परस्पर विरोधी सतहों पर लिगेंड (pMHC, मनका की ओर) और रिसेप्टर (TCR, टी सेल की ओर) की जोड़ी को दर्शाया गया है। (बी) (ए) में मनका बढ़त की तीव्रता प्रोफ़ाइल। एक्स -direction में आरओआई क्षेत्र एक्स धुरी (पिक्सेल संख्या में) और (ग्रे स्केल मूल्य में) प्रकाश की तीव्रता Y -direction साथ 30 पिक्सल binning द्वारा औसतन रूप में साजिश रची है। (सी) आरबीसी के नीचे को झुकाव और मनका की स्थिति और बल दबाना परख का एक परीक्षण चक्र में लक्ष्य (टी सेल)। ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज धराशायी लाइनों क्रमशः, आरबीसी सुप्रीम और समय के पाठ्यक्रम के शून्य-बल स्थिति से संकेत मिलता है। आरबीसी विरूपण की लाइन किनारे पर नजर रखने के लिए प्रत्येक पैनल में नीले रंग में दिखाया गया है। एक ही अभी तक कम चरणों आसंजन आवृत्ति में अपनाया जाता है("अलग कर देना" के कदम का अभाव है) और थर्मल अस्थिरता परख ("दबाना" और "अलग कर देना" के इस कदम का अभाव है) परख।
- कार्यक्रम को दृष्टि क्षेत्र खिड़की में जांच micropipette (आर पी) के संबंधित त्रिज्या को मापने के लिए कार्यक्रम में उपकरणों का उपयोग, आरबीसी (आर 0), आरबीसी और जांच मनका (आर सी) के बीच परिपत्र संपर्क क्षेत्र , निम्न समीकरण 17,30 द्वारा आरबीसी (कश्मीर) के लगातार वसंत के आकलन की अनुमति देता है,
जहां Δ पी जांच पिपेट नोक पर आकांक्षा दबाव है।
नोट: यह बाध्यकारी बल, एफ, वसंत निरंतर और जांच मनका (घ) के विस्थापन, यानी, एफ = डी के उत्पाद द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है कि हूक के नियम से इस प्रकार है (चित्रा -2)। - (प्रोटोकॉल खंड 6.6 का संदर्भ लें। वसंत लगातार आमतौर पर बल दबाना परख और आसंजन आवृत्ति परख के लिए 0.25 या 0.3 पी.एन. / एनएम और थर्मल अस्थिरता परख के लिए 0.1 पी.एन. / एनएम पर सेट किया जाता है) कार्यक्रम में वांछित आरबीसी लगातार वसंत दर्ज , जो पानी की सेंटीमीटर की इकाई में एक आवश्यक आकांक्षा दबाव में वापस आ जाएगी। आवश्यक aspirating दबाव पहुँच जाता है जब तक जांच की पिपेट के लिए लिंक है कि पानी की टंकी की ऊंचाई समायोजित करें।
- इस रेखा के साथ प्रत्येक पिक्सेल की चमक (ग्रे स्केल मूल्य) का संकेत आसन्न खिड़की में एक वक्र निकलेगा जो आरबीसी सुप्रीम भर में एक क्षैतिज रेखा खींचना। वक्र (2A चित्रा, बी) का करीब आधा गहराई में होने की दहलीज रेखा खींचें।
नोट: दहलीज रेखा से नीचे चमक की अवस्था पर न्यूनतम बिंदु मनका सीमा की स्थिति है, इस प्रकार केवल एक स्थानीय न्यूनतम अनुमति दी है इंगित करता है। दो या दो से अधिक स्थानीय minima वर्तमान में कर रहे हैं, यहछवि (कारण ध्यान से बाहर किया जा रहा है छवि, या जांच मनका और आरबीसी के बीच एक गरीब संरेखण की संभावना) इष्टतम नहीं है इंगित करता है। - थर्मल अस्थिरता परख, आसंजन आवृत्ति परख या बल दबाना परख: वांछित प्रयोग मोड का चयन करें। (बल दबाना परख के लिए बल = 20 पी.एन. (clamping जैसे, ठोकर बल = 15 पी.एन., लदान दर = 1,000 पी.एन. / एस, संपर्क समय = 1 सेकंड), आदि) के रूप में वांछित मापदंडों सेट करें।
- और जांच के साथ संपर्क से बाहर (विवरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें) में लक्ष्य पिपेट कदम है और लक्ष्य ड्राइव करने के लिए कार्यक्रम की अनुमति देता है जो "शुरू" पर क्लिक करें। डाटा संग्रह वास्तविक समय में जांच मनका की स्थिति को रिकॉर्ड करता है जो समानांतर, में प्रदर्शन किया जाएगा। एक खिड़की का अधिग्रहण डेटा को बचाने की अनुमति के लिए बाहर पॉप जाएगा, जो समय पर बटन "रोक प्रयोग", पर क्लिक करके कार्यक्रम को रोकने के।
7. प्रतिदीप्ति BFP (fBFP) प्रयोग
- Fluore का उपयोग करने के लिएBFP प्रणाली के scence समारोह, एक अलग कार्यक्रम (तालिका 1) के द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं, जो उत्तेजना प्रकाश स्रोत (1 टेबल) और प्रतिदीप्ति कैमरा (1 टेबल), पर बारी। कार्यक्रम पर, आदि लाभ, प्रदर्शन, उत्तेजना चैनल (इस मामले में, 340 एनएम और 380 एनएम प्रकाश), सहित प्रतिदीप्ति इमेजिंग, के लिए मानकों का चयन करें। 340 एनएम या 380 एनएम उत्तेजना प्रकाश से उत्साहित लक्ष्य सेल लाइव फ्लोरोसेंट छवि के दृश्य के लिए अनुमति देगा जो जांच और लक्ष्य, aligning सहित BFP प्रयोग प्रोटोकॉल में सभी तैयारी, का पालन करें।
- मोटे तौर पर खंड क्षेत्र के भीतर जो सेल पूरी रिकॉर्डिंग की अवधि के दौरान रहेगी करने सेक्शनिंग उपकरण का उपयोग करें।
नोट: कारण दृष्टिकोण से संपर्क करें-त्याग चक्र का उपयोग करने के लिए, सेल इस प्रकार sectioned क्षेत्र सेल खुद से भी ज्यादा बड़ा है, repetitively आगे और पीछे की ओर आगे बढ़ जाएगा। - 340 एनएम एक अनुमति देने के लिए "रिकॉर्ड" पर क्लिक करेंडी 380 एनएम प्रकाश बारी-बारी से बारी-बारी से के बारे में एक बार हर दूसरा दर्ज किया जाएगा इंट्रासेल्युलर प्रतिदीप्ति डाई (Fura2), और प्रतिदीप्ति छवियों इसी की एक जोड़ी उत्तेजित करने के लिए। इसके साथ ही विश्लेषण आणविक बातचीत और intracellular कैल्शियम संकेतन नजर रखने के लिए प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रयोग के लिए BFP प्रयोग शुरू करने के लिए कार्यक्रम में "शुरू" पर क्लिक करें। प्रणाली बाध्यकारी रिसेप्टर ligand के लिए एक कच्चे डेटा फ़ाइल (नीचे चित्रा 6A देखें) और कैल्शियम संकेतों के लिए झगड़ा प्रारूप में फ्लोरोसेंट छवियों की एक श्रृंखला का उत्पादन होगा।
8. डेटा विश्लेषण
- BFP डेटा विश्लेषण
- आसंजन आवृत्ति परख के लिए डेटा विश्लेषण
- क्रमिक प्रत्येक चक्र के "बल समय बनाम" संकेत का निरीक्षण किया और बस चक्र ऐसा नहीं एक आसंजन घटना होते हैं और जो जो रिकार्ड है, और एक औसत आसंजन आवृत्ति उपज के लिए संक्षेप।
- , प्रत्येक आसंजन घटना का टूटना बल लीजिए जोबांड टूटना से पहले रैखिक के ramped बल के शिखर मूल्य है। रैंप दरों की एक सीमा में टूटना बलों के लिए पर्याप्त मात्रा में इकट्ठा करने के बाद, बल-निर्भर ऑफ दर रिसेप्टर ligand के पृथक्करण के गतिशील बल स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण 18,31 का उपयोग कर ली गई है जिसमें से प्रत्येक रैंप दर पर टूटना बल वितरण निकाले जाते हैं।
- थर्मल अस्थिरता परख के लिए डेटा विश्लेषण
- क्रमिक संभावना कई बंधन एसोसिएशन और हदबंदी की घटनाओं में शामिल है जो प्रत्येक चक्र के clamping के चरण संकेत का निरीक्षण किया। एक बांड के बाद से, बंधन एसोसिएशन और हदबंदी घटनाओं भेद करने के लिए एक गाइड के रूप में संकेत "समय बनाम बल" में क्लेम्पिंग चरण थर्मल अस्थिरता स्तर (मनका स्थिति के 70 अनुक्रमिक समय अंक की एक रपट के अंतराल के औसत मानक विचलन) का प्रयोग करें गठन के थर्मल उतार-चढ़ाव में कमी से मेल खाती है।
- जब वहाँ (बंधन हदबंदी की तत्काल से अंतराल नामितमॉल में उतार-चढ़ाव समय इंतजार के रूप में अगले बंधन गठन के तुरंत करने के लिए) सामान्य स्तर पर शुरू, और दोनों डेटा निरीक्षण के दौरान एकत्र कर रहे हैं जो बांड जीवनकाल के रूप में हदबंदी करने के लिए अपने सहयोग से बांड की अवधि नामित। क्रमश: शून्य-बल 16,30 के तहत बंद दर्जे की पर-दर की पारस्परिक और प्रतिबिंबित है, जो औसत प्रतीक्षा समय और औसत बंधन जीवन भर की गणना।
- बल दबाना परख के लिए डेटा विश्लेषण
- एक एक संचयी जीवनकाल वक्र आकर्षित करने की अनुमति देगा जो क्रम संख्या के साथ ही शुरू करने के समय और समाप्त होने के समय के साथ औसत बल और बांड जीवनकाल सहित सभी जीवन भर की घटनाओं का रिकॉर्ड मानकों (उदाहरण के लिए, चित्रा 6C, पीले रंग की वक्र)।
- बलों की एक श्रृंखला के तहत जीवन भर की घटनाओं के लिए पर्याप्त मात्रा में ले लीजिए। प्रत्येक बल बिन में एक औसत जीवनकाल उपज है, और कुल मिलाकर एक "औसत जीवनकाल बनाम निकलेगा जो विभिन्न बल डिब्बे में समूह उन्हें,। बल "वक्र (चित्रा 4)।
- आसंजन आवृत्ति परख के लिए डेटा विश्लेषण
- कैल्शियम प्रतिदीप्ति इमेजिंग डेटा विश्लेषण
- प्रतिदीप्ति छवियों पृष्ठभूमि शोर के बिना दोनों 340 एनएम और 380 एनएम चैनलों में सेल का एक स्पष्ट समोच्च दिखाने तक तीव्रता दहलीज समायोजित (चित्रा 5 ए, बी)। तो फिर 340 एनएम / 380 एनएम की तीव्रता के अनुपात के आधार पर ली गई है जो तीव्रता के स्तर (चित्रा 6B) का संकेत एक छद्म रंग, साथ फ्रेम से इंट्रासेल्युलर सीए 2 + संकेत फ्रेम की समीक्षा, बनाम "सामान्यीकृत सीए 2 + तीव्रता उत्पन्न करने के लिए । समय "वक्र (चित्रा 6C)। दूसरे के द्वारा प्रतिदीप्ति स्तर दूसरे को प्रदर्शित करता है कि एक फिल्म का निर्माण करने के छद्म रंग प्रतिदीप्ति छवियों का उपयोग करें।
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Representative Results
BFP तकनीक 1995 17 में इवांस प्रयोगशाला ने बीड़ा उठाया था। इस picoforce उपकरण बड़े पैमाने पर, उनके ligands के 16,19,20 के साथ बातचीत के आसंजन अणुओं के दो आयामी कैनेटीक्स का विश्लेषण करने के लिए इतनी के रूप में, सतहों पर प्रोटीन की बातचीत को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है 30, आणविक लोच 21,29 को मापने के लिए, और प्रोटीन गठनात्मक 21 परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए। के लिए एक fBFP, जोड़ा जाता है इसी सॉफ्टवेयर प्रणाली (तालिका 1) के साथ महामारी प्रतिदीप्ति से संबंधित उपकरणों (चित्रा 1 ए - सी) का एक अतिरिक्त सेट।
fBFP प्रणाली एक हार्डवेयर सिस्टम (ऑप्टिकल, यांत्रिक और विद्युत उपकरणों) और एक सॉफ्टवेयर प्रणाली (1 टेबल और चित्रा 1 ए, बी) के होते हैं। उज्ज्वल क्षेत्र और महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सक्रिय करने के लिए ऑप्टिकल घटकों के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप (चित्रा 1 ए, मध्य) मुख्य शरीर के ऊपर बना देताप्रयोग के चरण में है और पिपेट manipulators बढ़ रहे हैं पर जो fBFP प्रणाली,। एक प्रतिदीप्ति प्रकाश स्रोत नियंत्रक (चित्रा 1 ए, ऊपरी बाएँ कोने) बारी उत्तेजना रोशनी देने के लिए प्रयोग किया जाता है। एक दोहरे सीएएम सिस्टम "DC2" दो में प्रकाश विभाजन और एक उच्च गति कैमरा (नीला) और एक प्रतिदीप्ति कैमरा (सफेद) (चित्रा 1 ए, निचले बाएँ कोने) के लिए उन्हें स्थानांतरित करता है। पूर्व की स्थिति दृढ़ संकल्प और दो तरंग लंबाई में लक्ष्य सेल से उत्सर्जित उत्तरार्द्ध एकत्र प्रतिदीप्ति छवियों के लिए जांच छवि एकत्र करता है। प्रयोग पर नजर रखी और उच्च गति कैमरा और प्रतिदीप्ति कैमरा दोनों से जुड़ा है (कारण स्थान की कमी के लिए चित्रा 1 ए, ऊपरी दाहिने कोने में, तस्वीर में फसली) मेजबान पीसी 1, जिनमें से दो कंप्यूटर द्वारा नियंत्रित और प्रयोग के निष्पादन के लिए जिम्मेदार है और डाटा अधिग्रहण, और मेजबान पीसी 2 निगरानी कैमरे से जुड़ा है और BFP अनुभव का एक पूरा दृश्य पेश करने के लिए जिम्मेदार हैबयान (चित्रा 1 ए, बी)।
एक प्रयोग के दौरान, experimentalist हड़पने के लिए और क्रमशः कोशिकाओं और microspheres (चित्रा 1E, एफ) में हेरफेर करने के लिए तीन micropipettes का उपयोग करता है। एक BFP प्रयोग का एक विशिष्ट छवि एक aspirated आरबीसी के शीर्ष पर एक जांच मनका संलग्न द्वारा इकट्ठा किया है एक शक्ति है जो जांच, और एक लक्ष्य सेल / मनका (2A चित्रा) के होते हैं। आरबीसी सुप्रीम पर मनका के किनारे क्षेत्र में शामिल है, जो ब्याज की एक क्षेत्र (आरओआई), वास्तविक समय में आरबीसी की विकृति पर नजर रखने के लिए एक तेज गति कैमरा (2,000 एफपीएस) ने पता लगाया है। फिर मनका की नज़र रखी विस्थापन BFP के वसंत निरंतर दी, बल जांच पर लगाए जाने वाले बाहरी बल की गणना (प्रोटोकॉल खंड 6.6 में नोट देखें) करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्रा 2A, बी)।
आसंजन आवृत्ति परख, थर्मल अस्थिरता परख, और बल दबाना परख एक BFP प्रणाली पर तीन आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक तरीके हैं। विज्ञापनइन तीन मोड के किसी भी चयन कर, एक BFP प्रयोग क्रमिक रूप से प्रदर्शन कर रहे हैं दोहराया है कि परीक्षण के चक्र से बना है।
आसंजन आवृत्ति परख में, लक्ष्य दृष्टिकोण और संपर्कों को एक दिया संपर्क समय पर जांच मनका (उदाहरण के लिए, 1 सेकंड) और सीधे वापस मूल स्थान को पलटा और अगले चक्र शुरू करते हैं। एक आसंजन घटना त्याग चरण के दौरान एक तन्य शक्ति के संकेत से परिलक्षित होता है। इस दृष्टिकोण से संपर्क करें-त्याग चक्र आसंजन आवृत्ति का एक मतलब है SEM, एक पी गणना करने के लिए कम से कम 3 लक्ष्य जांच जोड़े के लिए 50 बार दोहराया है।
थर्मल अस्थिरता परख शून्य-बल के तहत जीवन भर के मापन के लिए प्रयोग किया जाता है। प्रत्येक चक्र में, जांच मनका छूने के बाद, लक्ष्य शून्य बल स्थिति के लिए मुकर गया है और संपीड़न या 20 सेकंड के लिए तनाव या तो बिना मनका के साथ संपर्क में clamped, और फिर अगले चक्र शुरू करने के लिए मूल स्थिति में वापस आती है। बॉन्ड संघ / हदबंदी शून्य सेना के अधीन हैमनका 16,30 के थर्मल उतार चढ़ाव में अचानक गिरावट / वृद्धि के रूप में प्रकट।
सेना दबाना परख बलों के तहत जीवन भर के मापन के लिए प्रयोग किया जाता है। (उदाहरण के लिए, 20 PN) एक वांछित clamping बल प्रयोग करने से पहले निर्धारित है। लक्ष्य एक रिसेप्टर / ligand के बंधन के गठन की अनुमति के लिए (उदाहरण के लिए, 1 सेकंड) किसी दिए गए संपर्क समय के लिए जांच मनका संपर्क करने के लिए बार-बार प्रेरित है (चित्रा -2, पैनलों 2 और 3) और फिर वापस लेना (चित्रा -2, पैनल 4 )। कोई बंधन का गठन किया गया है, तो पूर्व निर्धारित clamping बल पर पहुंचने से पहले बंधन ruptures, लक्ष्य मूल स्थिति में लौटने और अगले चक्र शुरू कर देंगे, तो आरबीसी पर कोई तन्यता बल संकेत से परिलक्षित होता है, या। त्याग चरण है कि जीवित बाध्यकारी घटनाओं में, लक्ष्य बंधन विखंडित (चित्रा -2, पैनलों 5 और 6), और फिर मूल मंज़ूर करने के लिए रिटर्न जब तक डी द्वारा आरबीसी की एक इसी बढ़ाव के साथ clamping बल पर आयोजित किया जाता हैआयन अगले चक्र (चित्रा -2, पैनल 7) शुरू करने के लिए। बल बंधन हदबंदी 20 के तुरंत करने के लिए वांछित स्तर पर पहुंच गया जब लाइफटाइम पल से समय अंतराल के रूप में परिभाषित किया गया है।
इन सभी तीन BFP प्रयोगात्मक विधियों के लिए, experimentalist दृष्टिकोण-टकराना संपर्क-retract- (दबाना -) को देखने के लिए सक्षम होना चाहिए (dissociate-) कई बार 16,20 के लिए दोहराया जाएगा, जो वापसी का परीक्षण चक्र (चित्रा -2), 21।
BFP से प्रत्येक प्रयोगात्मक मोड से एकत्र आंकड़ों वांछित परिणाम प्राप्त करने के लिए विभिन्न तरीकों से विश्लेषण किया जा सकता है। औसत जीवनकाल वक्र बल दबाना परख (चित्रा 4) से एक प्रतिनिधि परिणाम है। यह बलों के तहत रिसेप्टर ligand के पृथक्करण के पारस्परिक ऑफ दरों को दर्शाता है। थर्मल अस्थिरता परख 2 डी के लक्षण वर्णन दर पर और ऑफ दर शून्य बल 16 के तहत एक रिसेप्टर-लिगेंड जोड़ी के लिए अनुमति देता है; आसंजन freq जबकिuency परख ऑफ दर और आत्मीयता शून्य बल 13 के तहत, पर-दर 2 डी प्रदान करता है।
प्रतिदीप्ति इमेजिंग समारोह का ऐड-इन के लिए इस प्रणाली में कोशिका संकेतन के readout के रूप में प्रयोग किया जाता है जो किसी एकल कक्ष, के intracellular सीए 2 + स्तर की निगरानी के लिए अनुमति देता है। एक fBFP प्रयोग के दौरान इस समारोह का उपयोग करने के लिए, एक एक सीए 2 + सूचक के साथ कोशिकाओं को पहले से लोड की जरूरत है। Fura2-पूर्वाह्न फ्लोरोसेंट रंजक होने के मामले में, 340 एनएम और 380 एनएम उत्तेजना चैनलों के तहत एक ही सेल के प्रतिदीप्ति छवियों प्रयोग में बारी-बारी से दर्ज किए गए और विश्लेषण में जोड़ी-दर-जोड़ी का निरीक्षण किया। एक तीव्रता दहलीज सेल समोच्च (चित्रा 5) पृष्ठभूमि शोर को दूर करने और पहचान करने के लिए प्रत्येक चैनल के फ्लोरोसेंट छवि को सौंपा गया था। प्रतिदीप्ति छवियों के प्रत्येक जोड़ी की तुलना इंट्रासेल्युलर की गणना की अनुमति देता है सीए 2 + स्तर। दोनों 340 एनएम के तहत सेल की साफ फ्लोरोसेंट छवियोंऔर 380 एनएम उत्तेजना चैनल (चित्रा 5 ए, बी) सीए 2 + स्तर का सही माप के लिए जरूरी हैं, गैर नगण्य पृष्ठभूमि शोर के साथ गरीब छवियों पक्षपाती परिणामों में परिणाम होगा और (चित्रा 5C) से बचा जाना चाहिए।
2 + स्तर एक साथ सेल और रिकॉर्ड सेल सीए पर चलाया हुआ यांत्रिक stimulations के शुरू करके, fBFP एक जीवित कोशिका पर Mechano-पारगमन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली एकल अणु उपकरण प्रदान करता है। यह यहाँ वर्णित मंच काफी बहुमुखी है, कि ध्यान देने योग्य है; सिद्धांत रूप में, एक विशेष उद्देश्यों के अनुरूप करने के लिए सेल करने के लिए बल लगाने और समवर्ती हित के विभिन्न संकेत घटनाओं की निगरानी के कई तरीके डिजाइन कर सकते हैं। बल पर निर्भर गतिज विवरण तो बल विनियमित रिसेप्टर ligand के कैनेटीक्स, प्रेरित संकेतन, और उनके सह-संबंध की विशेषताओं को निकालने के लिए चुना संकेतन readout के संदर्भ में विश्लेषण कर रहे हैं। TCR के हस्ताक्षर के उदाहरण मेंnaling, एक agonist-विशिष्ट TCR-pMHC पकड़ बंधन पहले की खोज की थी और उसके बाद टी-सेल सीए 2 + प्रवाह के लिए अपनी प्रासंगिकता 27 जांच की गई। रणनीति संकेतन readout के adhesions की संख्या, बंधन के बल आयाम, औसत जीवनकाल, सबसे लंबे समय तक जीवन और संचयी सहित विभिन्न गतिज मापदंडों के बीच अपनी सबसे अच्छा भविष्यवक्ता तलाश करने के लिए के रूप में सीए 2 + प्रवाह के शिखर मूल्य लेने के लिए किया गया था क्रमिक रूप से गठन बाइंडिंग के जीवनकाल। एक टी-सेल (10 पी.एन. के एक clamping बल लागू किया गया था, जहां) और इसी सीए 2 + संकेत की अवस्था के साथ साथ उनके संचय एक साथ दर्ज की गई व्यक्तिगत बांड जन्मों का एक उदाहरण चित्रा 6 में दिखाया गया है। सीए 2 + स्तर 10 सेकेंड का बंधन जीवन भर की राशि जमा करने, 55 सेकंड में तरक्की के लिए शुरू हुई जब इस मामले में, चार जीवन भर की घटनाओं समय से पहले हुआ। जीवन भर के संचय का यह स्तर सामान्यीकृत Fura2 अनुपात के एक चोटी के साथ एक सीए 2 + संकेत ट्रिगर1.8 के 65 सेकंड पर हुई है। कई व्यक्ति की कोशिकाओं से एकत्र इस तरह के डेटा का एक व्यवस्थित गणितीय विश्लेषण ताकत संकेत जन्मों दोहराया TCR-pMHC बातचीत के 1 सेंट मिनट में cumulated है 2 + सीए का सबसे अच्छा सहसंबंधी (तकनीकी जानकारी के लिए 27 संदर्भ के लिए देखें) का पता चला।
चित्रा 3: एक नहीं, आसंजन घटना (ए) के अनुकरणीय समय-बल कच्चे डेटा घटता, एक टूटना बल घटना (बी) और एक जीवनकाल घटना (सी)। चक्र के विभिन्न चरणों और इसी वक्र खंडों क्रमश: प्रत्येक पैनल में चिह्नित कर रहे हैं। चित्रा -2 के रूप में दिखाया बल (y- अक्ष), जांच मनका की स्थिति बदलने पर नज़र रखने से ली गई है। (क) कोई आसंजन: संपर्क चरण रिटर्न टी में दबाने (नकारात्मक) बलत्याग पर ओ शून्य। (बी) के एक टूटना बल घटना: एक तन्य (सकारात्मक) बल त्याग चरण के दौरान ruptures जो आरबीसी, बढ़ाना रिसेप्टर ligand के बंधन के माध्यम से खींचती है। (सी) एक जीवन भर घटना: clamping बल पहुंच गया और उसके बाद विघटित होकर जाता है जब तक बंधन बनी रहती है। जीवनकाल घटना की अवधि के संकेत दिया है। टूटना बल घटना (बी) और आजीवन घटना (सी) की शुरुआत एक तारक द्वारा डाला जाता है।
चित्रा 4:। "बल बनाम औसत जीवनकाल" OT1 टी सेल की वक्र अपने एगोनिस्ट ओवीए (हरा) और प्रतिपक्षी जी -4 (नीला) के साथ बातचीत के दौरान जमा डेटा अलग बल डिब्बे में बांटा, और मतलब बंधन जन्मों के SEM है ± रहे हैं बल बनाम साजिश रची है।
चित्रा 5:। दो तरंग दैर्ध्य में उत्साहित प्रतिनिधि सीए 2 + छवियों (ए, बी) एक टी सेल की सही छवि मान्यता बिंदु करने वाली के आधार पर 340 एनएम (ए) और 380 एनएम (बी) चैनलों में (लाल रंग में संकेत दिया) एक ठीक सौंपा तीव्रता दहलीज का उपयोग कर स्क्रीनिंग इशारा करते हैं। कारण गरीब Fura2 लोड हो रहा है, 340 एनएम उत्तेजना चैनल में (लाल रंग में संकेत दिया) एक टी सेल के प्रतिदीप्ति छवि पहचान करने के लिए (सी) अक्षमता।
चित्रा 6: "इंट्रासेल्युलर सीए 2 + स्तर बनाम समय (सापेक्ष Fura2 अनुपात)" और एक OT1 टी सेल का घटता "समय बनाम संचयी जीवनकाल" के superimposition उत्पन्नबार बार 300 सेकंड से अधिक एक ओवीए लेपित मनका के साथ टी सेल को छू द्वारा डी। (ए) गैर आसंजन, टूटना बल, और समय के साथ दोहराया संपर्कों के द्वारा उत्पन्न की जीवन भर की घटनाओं का एक दृश्य दिखा बल की अवस्था। (बी) के अलग अलग समय बिंदुओं पर टी सेल में intracellular सीए 2 + संकेतों के महामारी प्रतिदीप्ति छद्म रंग छवियों। सामान्यीकृत सीए 2 + स्तर सही पर छद्म रंग पैमाने ने संकेत दिया है। सीए 2 + संकेत वक्र (लाल) और एक ही समय के पाठ्यक्रम पर संचयी जीवनकाल वक्र (पीला) (सी) superimposition। सीए 2 + वक्र सीए 2 + इमेजिंग के आधार पर साजिश रची गई थी। एक सीए 2 + प्रवाह सामान्यीकृत Fura2 अनुपात में तेजी से पदोन्नति द्वारा signified है। सीए 2 + चरम पर पहुंचता है जब समय एक धराशायी लाइन ने संकेत दिया है। प्रत्येक जीवनकाल घटना के शुरू होने के समय संचयी जीवनकाल वक्र (ठोस त्रिकोण) पर चिह्नित किया है।
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Discussion
एक सफल fBFP प्रयोग कुछ महत्वपूर्ण बातों को जरूरत पर जोर देता। बल गणना विश्वसनीय होने के लिए सबसे पहले, micropipette, आरबीसी, और जांच मनका संभव के रूप में समाक्षीय करने के लिए करीब के रूप में गठबंधन किया जाना चाहिए। आरबीसी और पिपेट के बीच घर्षण नगण्य है इतना है कि पिपेट अंदर आरबीसी के प्रक्षेपण के बारे में एक जांच पिपेट व्यास होना चाहिए। एक ठेठ मानव आरबीसी के लिए, इष्टतम पिपेट व्यास 1 समीकरण 17,30 के एक सबसे अच्छा फिट जो पैदावार 2.0-2.4 माइक्रोन है। दूसरा, बल दबाना परख और थर्मल अस्थिरता परख में माप एकल बांड के लिए ज्यादातर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए, 20% है के तहत की एक आसंजन आवृत्ति 10,13,30 को बनाए रखा जाएगा। यहां, गैर विशिष्ट आसंजन ध्यान से (बीएसए के साथ पर्याप्त अवरुद्ध करके आम तौर पर <5%) नियंत्रित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, डेटा केवल एक ही बल-बूंद के साथ आसंजन घटनाओं से एकत्र किया जाना चाहिए - एक एकल-चरण लापता होने के लिए एक एकल अणु व्यवहार की बानगी (अनुरूपएकल अणु में प्रतिदीप्ति) झल्लाहट। प्रतिदीप्ति डाई का तीसरा, लोड हो रहा है एकाग्रता सबसे अच्छा इमेजिंग गुणवत्ता प्राप्त करने के एक मामले दर मामले के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए। चौथा, टी-सेल या ब्याज की अन्य कोशिकाओं को डाई लोड हो रहा है की विषाक्तता के प्रत्येक प्रयोग से पहले जांच की जानी चाहिए। उदाहरण के लिए, डाई लोडिंग पर रिसेप्टर ligand के बातचीत के बंधन आत्मीयता डाई लोड हो रहा है कि बिना मापा और तुलना करने की जरूरत है। बाध्यकारी आत्मीयता लोड हो रहा है डाई करने के लिए नाटकीय रूप से की वजह से बदलने जाता है, तो एक अलग डाई या एक अलग लोड हो रहा है एकाग्रता विचार किया जाना है। पांचवां, टर्मिनली बायोटिन टैग प्रोटीन प्रोटीन 'देशी उन्मुखीकरण को बरकरार रखता है कि सुविधाजनक, विशिष्ट, और मजबूत युग्मन अनुमति देने के लिए पसंद कर रहे हैं।
FBFP का एक प्रमुख ताकत है कि यह एक एकल कोशिका पर एक एकल बंधन परख प्रदर्शन करती है। कम throughput के बावजूद, एकल बंधन विश्लेषण अक्सर पारंपरिक पहनावा मेरे द्वारा दुर्गम हैं जो महत्वपूर्ण सुविधाओं uncoversthods। उदाहरण के लिए, प्रत्येक बल बिन पर जीवन भर के वितरण की जांच करके, एक बल 20,32 बदलता प्रोटीन गठनात्मक को नियंत्रित करता है पर अंतर्दृष्टि प्रदान करने, प्रोटीन गठनात्मक राज्यों के साथ अलग बंधन विशेषताओं सहसंबंधी कर सकते हैं। BFP भी प्रोटीन गठनात्मक गतिशीलता 20,21 जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो त्याग चरण के बल और piezo-अनुवादक विस्थापन डेटा से आणविक कठोरता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
कई तरीकों रिसेप्टर की मध्यस्थता सेल आसंजन और संकेतन अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। रिसेप्टर ligand के बंधन कैनेटीक्स आम तौर पर सेलुलर पर्यावरण से पूरा अलगाव में पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ मापा जाता है। इस तरह के व्यवहार संभावित समस्याग्रस्त है। उदाहरण के लिए, यह हाल ही में काफी रिसेप्टर & # के उपन्यास अंतर्दृष्टि का खुलासा, इसी पुनः संयोजक प्रोटीन 14 का उपयोग करके मापा उस से अलग जीवित कोशिकाओं पर मापा जाता है कि बगल में कैनेटीक्स दिखाया गया है8217 के सेलुलर कार्यों। इतना ही नहीं बगल में रिसेप्टर ligand के कैनेटीक्स बढ़ाता करने में सक्षम fBFP है, लेकिन अधिक महत्वपूर्ण बात, यह भी एक साथ बाध्यकारी प्रेरित कोशिका संकेतन रिकॉर्ड कर सकते हैं। TCR के 27, fBFP उनके संबंधों का विश्लेषण और Mechano-पारगमन के आणविक तंत्र को समझने के लिए एक अभूतपूर्व अवसर प्रदान करता है का उपयोग कर प्राप्त संकेत अमीर बंधन विशेषताओं की जानकारी और सेल के लिए प्रदर्शन किया है। यह fBFP अन्य महत्वपूर्ण रिसेप्टर ligand के सिस्टम में अधिक आवेदन मिल जाएगा संभावना है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | N2-5% buffer preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | N2-5% buffer preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | N2-5% buffer preparation |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | N2-5% buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Bead functionalization |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Nystatin | Sigma-Aldrich | N6261 | RBC osmolarity adjustment |
| Ammonium Hydroxide (NH4OH) | Sigma-Aldrich | A-6899 | Glass bead silanization |
| Methanol | BDH | 67-56-1 | Glass bead silanization |
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | J. T. Barker | Jan-86 | Glass bead silanization |
| Acetic Acid (Glacial) | Sigma-Aldrich | ARK2183 | Glass bead silanization |
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology | 9002 | Glass bead functionalization |
| Streptavidin−Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Fura2-AM | Life Technologies | F-1201 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | BD LSR II | Density quantification |
| Capillary Tube 0.7-1.0 mm x 30 inches | Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette making |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | sutter instrument | P-97 | Micropipette making |
| Pipette microforce | Narishige | MF-900 | Micropipette making |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
| Micro-injector | World Precision Instruments | MF34G-5 | Chamber assembly |
| 1 ml syringe | BD | 309602 | chamber assembly |
| Micropipette holder | Narishige | HI-7 | Chamber assembly |
| Home-designed mechanical parts and adaptors fabrications using CNC machining. | Biophysics Instrument | All parts are customized according to the CAD designs. | BFP system |
| Microscope (TiE inverted) | Nikon | MEA53100 | BFP system |
| Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg) | Nikon | MRH00401 | BFP system |
| Camera, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, mono | Graftek Imaging | 02-2020C | BFP system |
| Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADC | Graftek Imaging | 02-2185A | BFP system |
| Manual submicron probehead with high resolution remote control | Karl Suss | PH400 | BFP system |
| Anti-vibration table (5’ x 3’) | TMC | 77049089 | BFP system |
| 3D manual translational stage | Newport | 462-XYZ-M | |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2012 SP5 | BFP system |
| LabVIEW software | National Instruments | Version 2009 | BFP system, BFP program |
| 3D piezo translational stage | Physik Instrumente | M-105.3P | BFP system |
| Linear piezo accuator | Physik Instrumente | P-753.1CD | BFP system |
| Micromanager software | Version 1.4 | fBFP system, fluorescence imaging program | |
| Dual Cam (DC-2) | Photometrics | 77054724 | fBFP system |
| Dual Cam emission filter (T565LPXR) | Photometrics | 77054725 | fBFP system |
| Fluorescence Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600-10B | fBFP system |
| Plastic paraffin film (Parafilm) | Bemis Company, Inc | PM996 | bottle sealing |
| Carbonate/bicarbonate buffer (pH 8.5) | 8.4 g/L sodium carbonate (Na2CO3), 10.6 g/L sodium bicarbonate (NaHCO3) | ||
| Phosphate buffer (pH 6.5-6.8) | 27.6 g/L NaPhosphate monobasic (NaH2PO4 • H2O), 28.4 g/L Anhy. NaPhosphate dibasic (Na2HPO4) | ||
| N2-5% buffer (pH 7.2) | 20.77 g/L potassium chloride (KCl), 2.38 g/L sodium chloride (NaCl), 0.13 g/L potassium phosphate monobasic (KH2PO4), 0.71 g/L anhy. sodium phosphate dibasic (Na2HPO4), 9.70 g/L sucrose |
References
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