Summary
Vi har utviklet et øye irritasjon test som benytter en tredimensjonal rekonstruert menneskelig hornhinnen lignende epithelial (RHCE) vev modell. Testen er i stand til å skille mellom okulær irriterende og etsende stoffer (GHS kategori 1 og 2 kombinert) og de som ikke krever merking (GHS Ingen kategori).
Abstract
For å overholde den syvende Amendment til EU kosmetikkdirektivet og EUs REACH-regelverket, er validert ikke-animalske alternative metoder for pålitelig og nøyaktig vurdering av okulær toksisitet hos mannen trengte. For å møte dette behovet, har vi utviklet en øyeirritasjon test (EIT) som benytter en tredimensjonal rekonstruert menneskelig hornhinnen lignende epithelial (RHCE) vev modell som er basert på normale menneskelige celler. EIT er i stand til å skille okulære irritanter og korrosjonsmidler (GHS kategori 1 og 2 kombinert) og de som ikke krever merking (GHS Ingen kategori). Testen benytter to separate protokoller, en beregnet for flytende kjemikalier og en andre, tilsvarende protokollen for faste testartiklene. Den EIT prediksjon modellen bruker en enkelt eksponeringsperiode (30 minutter for væsker, 6 timer for faste stoffer) og et enkelt vev levedyktighet cut-off (60,0% som bestemt ved MTT-analyse). Basert på resultatene for 83 kjemikalier (44 væsker og 39 faste stoffer) EIT oppnådde 95,5 / 68,2 / og 81,8% sensitivity / spesifisitet og nøyaktighet (SS & A) for væsker, 100,0 / 68,4 / og 84,6% SS & A for faste stoffer, og 97,6 / 68,3 / og 83,1% for generelle SS & A. EIT vil bidra vesentlig til å klassifisere okulær irritasjon potensialet i et bredt spekter av flytende og faste kjemikalier uten bruk av dyr for å møte regulatoriske testkrav. Den EpiOcular EIT metoden ble implementert i 2015 inn i OECD retningslinjene som TG 492.
Introduction
Forbrukerprodukter som kosmetikk, vaskemidler og vaskemidler inneholder en rekke kjemikalier som kan forårsake alvorlige skader hvis de kontakt med øynene. Derfor er testing av disse midlene for øyeirritasjon kreves av amerikanske og europeiske regulatoriske myndigheter for å sikre forbrukernes sikkerhet 1. En vurdering av øyeirritasjon potensialet i blandinger og formuleringer er også en forutsetning for å etterkomme REACH (Registration, Evaluation, Authorization, og begrensning av kjemikalier) regelverk for merking av kosmetiske ingredienser under EUs kosmetikkdirektiv for transport av kjemikalier, og for merking av plantevernmidler og husholdningsprodukter 2. Foreløpig etatene krever okulær risikovurdering ved bruk Globalt Harmonisert System for Klassifisering og merking av kjemikalier (GHS) 3. GHS er hovedsakelig basert på Draize øyeirritasjon test, den mest brukte øyeirritasjon analyse hvor fremmedstoffer og mixtures innføres direkte inn i konjunktivalsekken i det kaninøye 4. Ifølge GHS klassifisering, GHS kategori 1 (okulær corrosives) refererer til å teste kjemikalier som forårsaker alvorlig innledende skade på øyet vev eller alvorlig skade på øyet og synet som ikke er fullt reversible innen 21 dager etter eksponering 3,5. GHS kategori 2 refererer til å teste kjemikalier som produserer betydelige endringer i øyet som er fullt reversible innen 21 dager etter eksponering. Test kjemikalier som ikke er korroderende eller irriterende blir referert til som GHS No kategori.
For mer enn 40 år har Draize kaninøyne test blitt kritisert for sin manglende reproduserbarhet, overvurdering av menneskelige reaksjoner, og bruk av levende dyr 5-8. Disse bekymringer har oppmuntret mange forslag til avgrensning, reduksjon, og utskifting av in vivo-test 9. Behovet for validerte ikke-animalske alternativer ble ytterligere styrketved vedtakelsen av Seventh Endring til kosmetikkdirektivet, som forbød bruk av dyr i sikkerhetsevaluering av kosmetiske produkter (i 2005) og ingredienser (i 2009) 2.
Siden 1996 har rekonstruert hornhinne-lignende vev modellen blitt mye brukt av den kosmetiske industrien for å evaluere irritasjonspotensialet av råvarer, overflatebaserte formuleringer, og forsterket blandinger som er utviklet for bruk i, eller i nærheten av, øyet 10-13. Bruk av RHCE vevet modellen tillater direkte topisk applikasjon av testmaterialet på vevsoverflaten i sin native, ufortynnet form. På denne måte kan ikke-vannoppløselige formuleringer testes uten å fortynne dem med oppløsningsmidler. Som svar på EURL ECVAM (European Union Reference Laboratory europeiske senteret for validering av alternative metoder) anmodning om et allment gjeldende, grei, og økonomisk metoden Øyeirritasjonstest (EIT) som benytter en single eksponeringstid og er i stand til å skille okulære irritanter og korrosjonsmidler fra materialer som ikke krever merking ble utviklet (figur 1) 14. Basert på resultatene for 83 kjemikalier (44 væsker og 39 faste stoffer), EIT oppnådde 95,5 / 68,2 / og 81,8% sensitivitet / spesifisitet og nøyaktighet (SS-A) for væsker, 100,0 / 68,4 /, og 84,6% SS & A for faststoffer, og 97,6 / 68.3 / og 83,1% for generelle SS & A.
I 2007, en multi-laboratorium pre-valideringsstudie sponset av Cosmetics Europe (tidligere Colipa) i regi av den EURL ECVAM vurderes relevansen og påliteligheten av EIT med mål om å bringe det til formell validering 15. I denne studien ble 298 uavhengige studier utført i syv uavhengige laboratorier. Resultatene fra denne undersøkelsen viste 99,7% enighet i prediksjon med lave variasjonskoeffisienter tvers av alle deltakende laboratorier 15. Som et resultat i 2010 på EIT protokollen inngått en formell EURL ECVAMvalideringsprogram. Valideringsstudien benyttet 104 kodede test kjemikalier, inkludert enkeltstoffer og kjemiske blandinger, som i vivo referansedata (Draize øyeirritasjon data) var tilgjengelige. Basert på suksessen av dette arbeidet, ble en OECD utkast TG levert i 2014. Det er forventet at EIT betydelig bidrar til klassifisering av okulær irritasjon potensialet i et bredt spekter av materialer i henhold til FN GHS klassifisering og merking.
Protocol
1. Utarbeidelse av RHCE Vev for behandling - dag 0
- Ved mottak av kommersielle menneskelig hornhinnen lignende epithelial (RHCE) kit, sjekk alle kit komponenter for integritet (for kit informasjon se Standard Assay Kit komponenter (tabell 1), og utstyr og materialer som kreves for å utføre EIT analysen (tabell 2). På dag for mottak, ekvilibrere vev (i sin 24-brønners container) til RT i 15 min.
| Beløp | Reagens | Vilkår | Source | Beskrivelse | Utgåelsesdato |
| 1 | Forseglet 24-brønns plate av EpiOcular vev (OCL-200) | 2-8 ° C | Mattek | Inneholder 24 tissues av cellekultur setter inn, pakke på agarose | 72 timer |
| En flaske, 200 ml | EpiOcular analysen Medium (OCL-200-ASY) | 2-8 ° C | Mattek | DMEM basert medium | 21 dager |
| En flaske, 100 ml | Ca ++ Mg ++ -Gratis Dulbecco's-PBS (DPBS) | RT | Sigma-Aldrich, D5652, eller ekv. | Brukes til skylling inserts | 1 år |
| 4 | 6-brønners plater | RT | Falcon | Brukes for å opprettholde vev under analyseprotokollen | NA |
| 2 | 12-brønners plater | RT | Falcon | Brukt under analyseprotokollen | NA |
| 2 | 24-brønners plater | RT | Falcon | Brukes til å utføre MTT analysen | NA |
| 1 hetteglass, 0,5 ml | Metylacetat (CAS # 79-20-9) | RT | Sigma-Aldrich, Cat # 186325 | Brukes som PC i analysen | 1 måned |
Tabell 1: Standard Assaysett Components.
| Utstyr / Material | Trengs for: |
| Fuktet inkubator (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO2, 90 ± 10% fuktighet) | Rugetiden vev før og under analyser |
| Laminær hette | Sikkert arbeid under sterile forhold |
| Vakuumpumpe (valgfritt) | Aspirere medium og løsninger |
| Plate-leseren fotometer (for 96-brønners plater) | Reading OD |
| Plate shaker | Ekstraktion av formazan |
| Sterile, sløv kanter tang | Håndtering vev inserts |
| Stopp-klokker | Tidspunkt for bruk av prøvemateriale og andre tidsbestemte trinn i protokollen |
| Vannbad (37 ± 1 ° C) | Varming media og MTT løsning |
| Morter | Sliping granulære faste stoffer |
| Fortrengnings pipette (50 ul) | Påføring av flytende og seigtflytende materialer og suspensjoner |
| Justerbare pipetter (200 ul-2 ml) | Påføring av flytende materialer, analysemedium og MTT |
| Pre-steriliserte spisser (200 ul og 20 ul), Rainin Cat # HR-200F og HR-20F (eller tilsvarende) | Påføring av flytende materialer, analysemedium og MTT |
| Wide åpnings pre-sterilisert tips (250 mikroliter), Rainin Cat # HR-250WS (eller ekvkova-lente) | Påføring av flytende og seigtflytende materialer og suspensjoner |
| 8 oz / 220 ml prøvebeholdere, Falcon Cat # 3540200 (eller tilsvarende) | Skylling vev |
| Sterile engangssprøyter (f.eks 1 ml tuberkulin sprøyte Omnifix-F, B. Braun Melsungen AG, kat. Nr 9161406V) | Levering av ~ 50 mg solide materialer (valgfritt) |
| Ted Pella mikro spatel / sluk, Ted Pella Inc., Cat # 13504 (eller tilsvarende, skarp skje eller bein kyrette, f.eks Aesculap, No: FK 623) | Levering av ~ 50 mg solide materialer |
| Ca ++ og Mg ++ fri Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (Ca ++ Mg ++ fritt DPBS): Sigma-Aldrich, Cat # D5652 (eller tilsvarende) | Skylle vev under analysen |
| Sterilt avionisert vann, vevskultur grad (kvalitet biologisk eller tilsvarende) | <td> Bruk som NC|
| 96-brønners flatbunnede plater, Falcon (eller tilsvarende) | For å lese OD |
| Cotton tippe swaps (sterilt) | For tørking vevsflaten (valgfritt) |
| Teip eller Parafilm | Dekker plater under formazan utvinning |
| MTT-100 analysesett | Inneholder MTT-Thiazolyl Blå tetrazoliumbromid reagent (Sigma # M-5655) og isopropanol ekstrakt. |
Tabell 2: Utstyr og materialer som kreves for å utføre EIT.
- Under sterile betingelser ved å åpne plastposen med den 24-brønns plate med RHCE vev og ta ut sterilt gasbind. Inspiser alle vev for luftbobler mellom agarosegel og sett. Ikke bruk kulturer med luftbobler under innsatsen dekker> 50% av innsatsen området, defekte vev, eller vev WHI ch er helt dekket med væske.
- Merke seks-brønns plater med testen artikkel eller kontrollkoder og eksponeringstider. Aliquot 1,0 ml prøvemedium (levert med settet), forvarmet til ca. 37 ° C, inn i brønnene av pre-merkede 6-brønns plater.
- Bruk steril tang til å fjerne hver innsats som inneholder RHCE vev og plassere innsatsen i den merkede seks-brønns plate. Under dette trinnet, må du fjerne eventuelle gjenværende frakt agarose som fester seg til de ytre sidene av innsatsen ved forsiktig blotting på sterilt filterpapir. Slipp eventuelle luftbobler inni og under innleggene.
- Pre-inkuberes RHCE vev i 6-brønns plater til standard dyrkningsbetingelser (SCC, fuktet atmosfære med 5 ± 1% CO2 ved 37 ± 1 ° C) i 1 time.
- Etter en time, erstatte prøvemedium med 1,0 ml fersk analyse Medium forvarmet til 37 ° C og inkuber RHCE vev på SCC forhold (over natten = O / N) (16-24 timer).
- Etter at O / N inkubering bruke 20 ul av Ca2 + Mg2 + -fri-Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS, forut) ved hjelp av en egnet anordning pipettering. Hvis DPBS ikke sprer seg på tvers av vev, banke forsiktig innsatsen på tallerkenen for å sikre at de DPBS tisser hele vev overflaten.
- Inkuber RHCE vevet på SCC for 30 ± 2 min.
Merk: Dette trinnet er nødvendig for vev hydrering og å etterligne in vivo forhold.
3. Test Material stråling
- Påfør hver test artikkel og kontroller for å duplisere RHCE vev (n = 2). Artikkelen dosering Testprosedyren er forskjellig for væsker og faste stoffer. Topisk anvendelse 50 ul av flytende test artikler ved hjelp av en pipette. Eksponeringstiden for væsker er 30 min. Anvende 50 mg av faste artikler ved hjelp av en test flatet skjefull (kalibrert for å holde 50 mg natriumklorid). Exposure tid for faste stoffer er 6 timer.
Merk: Væsker defineres som flytende stoffer (f.eks væsker, geler, og kremer) som kan brukes benytte en pipettering enhet. Solids er definert som ikke-flytende stoffer (f.eks pulver, resinous eller voksaktige materialer) som ikke kan brukes ved hjelp av en pipette.- Dersom den fysiske tilstand av test artikler er ikke lett å bestemme, plassere ampullene med testartikkel i et vannbad i 15 min (37 ° C). Følg EIT protokoll for væsker for de test artikler som flytende ved 37 ° C.
- Bruk en positiv forskyvning pipette for spesielt viskøse materialer.
- Dosere negativ kontroll og positive kontroller først og deretter dosetest artikler.
- Anvende 50 ul av den negative kontroll (NC), og den positive kontroll (PC) til de RHCE vev ved hjelp av en standard pipette. NC er sterilt avionisert vann; PC er metyl acetat (CAS # 79-20-9). Påfør NC og PC i 30 minutter når testing flytende test artikler og i 6 timer når testing solide test artikler.
4. Test Artikkel Exposure - Dag 1
- For behandling av flytende testartiklene, følger timingen plan gitt i tabell 3. La 1 minutts intervaller mellom påføring av hvert testartikkel for å sikre lik eksponering av alt vev.
- Etter 30 ± 2 min DPBS forbehandling, lokalt gjelder 50 ul av NC og PC, og hver væske test artikkel lokalt på de RHCE vev ved hjelp av en passende pipettering enhet.
- Anvende 50 pl av den flytende testartikkel direkte på vevet for å dekke den øvre overflaten. Klipp av den smale poenget med pipettespissen å utvide åpningen for viskøse materialer. For meget viskøse materialer, gjelder testartikkelen til en doseringsinnretning (en flat ledet sylinder med diameter som er litt mindre enn den indre diameter av innsatsen vevet eller plast stift), inverterer doserings device og plasser det i vevet, slik at testen artikkelen jevnt kontakter vevet overflate.
- Hvis test artikkelen ikke spredt over vevet, banke forsiktig på innsatsen for å sørge for at det sprer seg på hele vev overflaten. Mekanisk spredning av test artikler (f.eks, med en pipette tips) anbefales ikke da det kan skade vev.
- Inkuber vev på SCC for 30 ± 2 min.
- For behandling av faste testartiklene - dag 1, følger timingen plan gitt i tabell 4 La 2 minutters intervaller mellom påføring av hvert testartikkel for å sikre lik eksponering av alt vev..
- Etter 30 ± 2 min DPBS forbehandling, gjelder 50 ul av NC og PC lokalt på RHCE vev ved hjelp av en passende pipettering enhet.
- For solid test artikkel søknad, fjerne innleggene (n = 2) fra brønnen og plassere dem på en steril overflate (f.eks lokket amultiwell plate) for å unngå en testartikkel renner inn i mediet.
- Ved hjelp av en planert skje, topisk anvendelse ca 50 mg av testproduktet på overflaten vev; sørge for at overflaten av vevet er fullstendig dekket av testartikkel. Hvis testen artikkelen ikke spredd over hele vevet rist innsatsen forsiktig fra side til side for å sikre at vevet er fullstendig dekket av testartikkel. Mekanisk spredning av test artikler (f.eks, med en pipette tips) anbefales ikke da det kan skade vev.
- Hvis nødvendig, male krystallinske pulver med en morter og støter for å sikre bedre kontakt mellom testartikkel og vevet.
- Alternativt sted pulvere direkte på vevskultur inne i innsatsen ved hjelp av en 1 ml sprøyte med hodet kuttet av. Stuff pulver inn i sprøyten når stempelet er trukket tilbake og deretter bruker ved å trykke stempelet ned.
- Hvis den ytre vegg av innsatsen er contaminated eksempel ved pulver, tørk partiklene med en steril kompress.
- Etter dosering, returnerer vev til 6-brønns plater inneholdende kulturmedium og inkuber ved SCC i 6 timer ± 15 min.
5. Skylling
- Forberede et sett med tre rene begre (150 ml kapasitet) per test artikkelen og fyll hver av dem med 100 ml DPBS. For hver testartikkel, bruke et annet sett av tre begre.
- Ved slutten av 30 ± 2 min eksponering for flytende materialer eller 6 t ± 15 min eksponering for faste materialer, fjernes og kastes doseringsanordningen hvis den ble brukt.
- Løft innsatsene som inneholder RHCE vev ut fra mediet ved å gripe den øvre kant av plast "krage" med fin pinsett. Bruk buet pinsett for å lette håndtering og dekantering. Skyll vev to på en gang ved å holde de like innsatser sammen med sine krage som bruker tang. Vær forsiktig not å skade vevet med pinsett.
- Dekanter test artikler eller kontroller fra vevet overflaten på en ren absorberende materiale (papir håndkle, gasbind, etc.)
- Dypp innsatsene inn i det første beger med DPBS, virvel i en sirkulær bevegelse i DPBS i omtrent 2 sekunder, løft innsatsene, slik at de er hovedsakelig fylt med DPBS, og dekanter væsken tilbake i begerglasset. Gjenta denne prosessen tre ganger i første beger.
- Skyll innsatsene i den andre og tredje begerglass av DPBS tre ganger hver på samme måte.
- Dekanter hvilken som helst væske som er igjen i innsatsen på det absorberende materiale. Roter innsatsen til en omtrentlig 45 ° vinkel (åpen ende ned) og trykk på overleppen til absorberende materiale.
Merk: Hvis det ikke er mulig å fjerne alt av det synlige testmaterialet, bør det ikke lenger skylle gjøres for å unngå vevsskade som følge av overdreven håndtering.
6. Post-suge
- Etter skylling,umiddelbart dyppe vev i 5 ml prøvemedium som tidligere oppvarmet til romtemperatur i en pre-merket 12-brønns plate.
- Inkuber vevene i 12 ± 2 min for flytende materialer eller 25 ± 2 min for faste materialer nedsenkede ved RT for å lette fjerning av eventuelt gjenværende testartikkel.
7. Post-inkubasjon
- Ved slutten av post-Soak nedsenking periode, dekanter prøvemedium fra vevene og tørk innsatsene på et absorberende materiale.
- Overfør innsatsene i den på forhånd merkede 6-brønners plate inneholdende 1 ml varm prøvemedium.
- Inkuber vev til 120 ± 15 minutter ved SCC for væskeprøvemateriale.
- Inkuber vev for 18 ± 0,25 timer på SCC for faste prøvemateriale.
8. MTT Livskraftig Assay - Dag 1 (Protokoll for Liquids) og Dag 2 (Protokoll for Solids)
- Utfør MTT analysen etter at Post-Inkubasjon av 12077; 15 min for væsker og 18 ± 0,25 h for faste stoffer, hhv.
- Forbered 1,0 mg / ml MTT-oppløsning og 0,3 ml aliquot av løsningen i hver brønn av en pre-merket 24-brønns plate.
- Bruke MTT kommersielle kit (tabell 5):
- 2 timer før bruk, tine MTT konsentratet ved RT. Kombinere 2 ml av MTT konsentratet og 8 ml av MTT fortynningsmiddel for å fremstille 1,0 mg / ml MTT-oppløsning.
- Oppbevar MTT-løsning ved 4 ° C i mørke inntil bruk. Ikke oppbevar MTT løsningen for mer enn en dag.
- Ved slutten av den Post Inkubering, fjerne hver innsatsen fra 6-brønns plate og forsiktig blot på et absorberende materiale.
- Plasser innsatsene inn i 24-brønners plate inneholdende 0,3 ml MTT-oppløsning. Slipp eventuelle luftbobler inni og under innleggene. Inkuber platen til 180 ± 10 minutter ved SCC.
- MTT utvinning
- Etter 180 ± 10 min inkubasjon i MTT løsning, fjerne hver innsatsfra 24-brønns plate og blot bunnen av innsatsen på et absorberende materiale.
- For ikke-fargestoff flytende testartiklene (neddykket ekstraksjon): Overføring av innsatsene i et på forhånd merket 24-brønners plate inneholdende 2,0 ml av et ekstraksjonsmiddel oppløsning (isopropanol), slik at det undertrykker innsatsen.
- For faststoffer og flytende fargestoffer (ikke-neddykket ekstraksjon for å unngå forurensning av det ekstraherende oppløsning): Overføring av innsatsene i et på forhånd merket 6-brønners plate inneholdende 1,0 ml av det ekstraherende oppløsning (isopropanol), slik at den ikke dykker innsatsen.
Merk: Utfør den samme ikke-neddykket ekstrahering for de tilsvarende negative og positive kontroller.
- Forsegle platene (f.eks, med parafilm mellom platedekselet og overkanten av brønnene eller med en standard plate sealer). Plasserer platene på en orbital platerister og rist i 2 til 3 timer ved romtemperatur for å ekstrahere MTT.
- Alternativt utføre utvinning O / N ved 2-876 C i mørket uten risting.
- For ikke-fargestoff flytende testartiklene (neddykket ekstraksjon): Ved slutten av ekstraksjonen perioden, dekanter væsken fra hvert sett tilbake i brønnen og kast innsatsene med RHCE vev.
- Bland ekstraktløsningen og overføre to 200 pl alikvoter inn i de passende brønner av en pre-merket 96-brønners plate i samsvar med den plateform (figur 2).
- For faste stoffer og flytende fargestoffer (ikke-nedsenket extraction): På slutten av utvinning perioden, forkaste vev (sørg for ikke å pierce vev).
- Tilsett 1,0 ml av ekstraktløsning i hver brønn på 24-brønners plate inneholdende oppløsningen ble ekstrahert fra vev. Bland ekstraksjonsmidlet løsningen og overføre to 200 pl alikvoter inn i de passende brønner av en pre-merket 96-brønners plate i samsvar med den plateform (figur 2).
- Bestem tHan optisk tetthet (OD) av de ekstraherte prøver ved en enkelt bølgelengde mellom 550 og 590 nm (bør være konsistent innenfor et laboratorium) på en plate-leser eller et spektrofotometer.
- Ved turbide ekstraktløsninger forårsakes av uoppløselige faste stoffer, sentrifuger løsningene før måling av OD (avkjøles sentrifugen til 4 ° C for å unngå fordampning). Ved skylling fjerner ikke testen artikkelen (TA) og TA forstyrrer MTT reduksjon, må ytterligere kontroller brukes. Vennligst henvis til en detaljert SOP å korrigere for MTT reduksjon 16.
- I tilfelle et TA er vist å ha, eller for å utvikle farge som kan interagere med MTT-måling, må en tilleggstest blir utført for å bestemme mengden av farge er bundet til, og deretter ekstrahert fra vev. Vennligst henvis til en detaljert SOP å korrigere for fargede test artikler 16.
9. Beregninger for Tissue Livskraftig Test (tabell 6 og figur 3) & #160;
- Generelle beregninger
- Beregn middelverdien OD-verdien av blanke kontrollbrønner (OD Blk) for hvert eksperiment.
- Trekk fra OD Blk fra hver OD verdien for det samme eksperimentet (Blk korrigerte data).
- Beregn middelverdien av de to porsjoner for hvert vev (= korrigert OD).
- Beregn prosent levedyktigheten til hver av de to gjentatte vev for hver kontroll og test artikkelen i forhold til det gjennomsnittlige negative kontroll (100% kontroll).
Levedyktighet (%) = [korrigerte OD behandlet vev / korrigert OD negativ kontroll] x 100% - Beregn differansen av levedyktighet (levedyktighet forskjellen mellom to replikate vev).
- Beregn middelverdien testartikkel levedyktighet (TA levedyktighet) og klassifisere testartikkelen i henhold til forutsigelse modell.
10. prognosemodell (figur 3)
- Dersom TA behandlet vev levedyktighet er> 60,0 i forhold til NC-behandlet vev viability, merke testen artikkel som ikke-irriterende (NI) (GHS Ingen kategori).
- Dersom TA behandlet vev levedyktighet er ≤ 60,0 i forhold til NC-behandlet vev levedyktighet, merke testen artikkelen som irriterende (I) (GHS kategori 1 og 2).
Merk: EIT testresultatene anses kvalifisert dersom:- EIT NC OD> 0,8 og <2,5;
- EIT PC vev levedyktighet (%, i forhold til NC) er ≤50.0%;
- forskjellen mellom de to replikere vev (NC, PC, og testartikkel) er <20,0%.
- EIT NC OD> 0,8 og <2,5;
Representative Results
Representative EIT resultater utført med 10 test artikler (TA) og negative og positive kontroller er presentert i Tabell 6 og figur 3. Den midlere OD = 1,31 for NC tilsvarer 100% vev levedyktighet, derfor PC (midlere OD = 0,41) hadde relative vev levedyktighet på 31,2%. Når EIT protokollen ble utført i 15 gyldige uavhengige eksperimenter i 7 laboratorier ved bruk av flytende eksponering protokollen og i 8 uavhengige gyldige eksperimenter i 4 laboratorier, med solid eksponering protokollen, gjennomsnittlig vev levedyktighet for PC ved hjelp av flytende-protokollen var 36,4 ± 4,0 % og 32,3 ± 6,4% for de faste stoffer protokollen. I alle tilfeller ble den positive kontroll-resultatene under avskåret verdi på 60,0% 15.
Som vist i figur 3, TA1, TA2, TA4, TA7, og TA8 hadde vev viabilities> 60,0%, og derfor ble klassifisert som «NI". TA3, TA5, TA6, TA9, og TA10 hadde vev viabilities X04, 60,0% og derfor ble klassifisert som "I". Forskjellen vev levedyktighet mellom dupliserte vev var <20,0% for alle TAs med et unntak av TA2. Derfor resultater for alle test artikler, med et unntak av TA2, ble betraktet som "kvalifisert" siden de møtte alle EIT akseptkriterier (§ 10.2). På grunn av høy variabilitet mellom dupliserte vev for TA2 i den innledende eksperiment, ble en andre eksperiment er nødvendig for å oppnå kvalifiserte EIT resultater.
EIT testmetode som beskrevet her utnytte RHCE vev modellen ble brukt for vurdering av okulær irritasjon i flere multilaboratory valideringsstudier, inkludert formelle godkjenningen av EURL ECVAM / Cosmetics Europe 15,17-19. I alle studiene ble EIT vist seg å være reproduserbar og var i stand til å identifisere kjemikalier (både stoffer og stoffblandinger) som ikke krever klassifisering og merking for øyeirritasjon eller alvorlig øyeskade ac riktighold til FN GHS 15,17-19. EIT testmetode oppfylte akseptkriteriene i Validation Management Group (VMG) for øyeirritasjon for sensitivitet, spesifisitet, og samlet nøyaktighet og tiden det venter formelle gjennomføringen som en delvis erstatning for in vivo kanin Draize test 19.
Figur 1: Oversikt over EIT protokollen for flytende og faste testartiklene Forkortelser anvendt: AM, analysemedium;. SCC, standard kultur forhold; PBS, Dulbeccos Fosfatbufret saltvann; RT romtemperatur.
Fig. 2: Den standardiserte 96-brønns plate konfigurasjon for MTT-vevet levedyktighet test To 200 pl prøver er transferred til de passende brønner i en pre-merket 96-brønns plate. Forkortelser anvendt: NC, negativ kontroll; PC, positiv kontroll; TA1-TA20, test artikler 1-20; Blank, ekstraktant løsning. 96- MTT plate konfigurasjonen brukes med Excel regneark laget for å beregne RHCE vev levedyktighet og EIT resultater.
Figur 3: EIT resultater oppnådd for 10 test artikler, NC og PC-kontroller som bruker RHCE vev modellen Grafen er generert fra et Excel-regneark laget for å presentere EIT resultater.. Test kjemikalier som reduserte vev levedyktighet ≤ 60,0% i forhold til NC er klassifisert som irriterende ("I", TA3, TA5, TA6, TA9, og TA10) og teste kjemikalier som hadde vev levedyktighet> 60.0% er klassifisert som ikke-Irritanter (" NI ", TA1, TA2, TA4, TA7, og TA8).
| Starttid for EIT protokollarbeidstrinn (en dags arbeid for én operatør) | |||||||
| Hver linje tilsvarer en par av vev | |||||||
| Order of trinn: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Væsker: | PBS | TA Eksponering | Post- Sug | Post- | MTT Reaksjon | MTT Utvinning | Mål |
| 30 min | 30 min | 12 min | 120 min | 180 min | 120 min | OD | |
| NC | 09:00 | 09:30 | 10:00 | 10:12 | 12:12 | 15:12 | etter |
| PC | 09:01 | 09:31 | 10:01 | 10:13 | 12:13 | 15:13 | 17:30 |
| TA-en | 09:02 | 09:32 | 10:02 | 10:14 | 12:14 | 15:14 | |
| TA-2 </ strong> | 09:03 | 09:33 | 10:03 | 10:15 | 12:15 | 15:15 | |
| TA-3 | 09:04 | 09:34 | 10:04 | 10:16 | 12:16 | 15:16 | |
| TA-4 | 09:05 | 09:35 | 10:05 | 10:17 | 12:17 | 15:17 | |
| TA-5 | 09:06 | 09:36 | 10:06 | 10:18 | 12:18 | 15:18 | |
| TA-6 | 09:07 | 09:37 | 10:07 | 10:19 | 12:19 | 15:19 | |
| TA-7 | 09:08 | 09:38 | 10:08 | 10:20 | 12:20 | 15:20 | |
| 09:09 | 09:39 | 10:09 | 10:21 | 12:21 | 15:21 | ||
| TA-9 | 09:10 | 09:40 | 10:10 | 10:22 | 12:22 | 15:22 | |
| TA-10 | 09:11 | 09:41 | 10:11 | 10:23 | 12:23 | 15:23 | |
Tabell 3:. Prøve tidsplan for testing av flytende test artikler Protocol skritt inkludert pre-fukte vev med DPBS, Påføring av Test Artikler (TAS), skylling og Post-suge, Post-inkubasjonstiden, MTT analysen, Utvinning av MTT, og måling av MTT OD er gjengitt i kolonner. Tider for de dupliserte vev er organisert i rader. Hele analysen testing 10 TAs og kontroller kan være ferdig på en dag.
e_content ">| Starttid for EIT protokoll trinn (2 dager jobber for en operatør) | |||||||
| Hver linje tilsvarer en par av vev | |||||||
| Dag 1 | Dag 2 (neste dag) | ||||||
| Order of trinn: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Solids: | PBS | TA Eksponering | Post- Sug | Post- Incubaction | MTT Reaksjon | MTT Utvinning | Mål |
| 30 min | 6 hr | 26 min | 18 timer | 180 min | 120 min | OD | |
| NC | 09:00 | 09:30 | 15:30 | 15:56 | 09:56 | 12:56 etter | |
| PC | 09:02 | 09:32 | 15:32 | 15:58 | 09:58 | 12:58 | 15:30 |
| TA-en | 09:04 | 09:34 | 15:34 | 16:00 | 10:00 | 13:00 | |
| TA-2 | 09:06 | 09:36 | 15:36 | 16:02 | 10:02 | 13:02 | |
| TA-3 | 09:08 | 09:38 | 15:38 | 16:04 | 10:04 | 13:04 | |
| TA-4 | 09:10 | 09:40 | 15:40 | 16:06 | 10:06 | 13:06 | |
| TA-5 | 09:12 | 09:42 | 15:42 | 16:08 | 10:08 </ td> | 13:08 | |
| TA-6 | 09:14 | 09:44 | 15:44 | 16:10 | 10:10 | 13:10 | |
| TA-7 | 09:16 | 09:46 | 15:46 | 16:12 | 10:12 | 13:12 | |
| TA-8 | 09:18 | 09:48 | 15:48 | 16:14 | 10:14 | 13:14 | |
| TA-9 | 09:20 | 09:50 | 15:50 | 16:16 | 10:16 | 13:16 | |
| TA-10 | 09:22 | 09:52 | 15:52 | 16:18 | 10:18 | 13:18 | |
Tabell 4: Eksempel på tidsplan for testing av faste test artikler. Protokoll trinn inkludert pre-fukte vev med DPBS, Påføring av Test Artikler, Skylling og Post-suge, Post-inkubasjonstiden, MTT analysen, Utvinning av MTT, og måling av MTT OD er presentert i kolonner. Tider for de dupliserte vev er organisert i rader. Hele analysen teste 10 TAs og kontroller er utført over en to dagers periode.
| Beløp | Reagens | Lagringsforhold | Source | Beskrivelse | Utgåelsesdato |
| 1 hetteglass, 2 ml | MTT Concentrate (MTT-100-CON) | Beskyttet mot lys (-20 ºC) | Mattek | Frozen MTT konsentrat | 2 måneder |
| 1 hetteglass, 8 ml | MTT fortynningsmiddel | 2-8 &# 186; C | Mattek | For fortynning av MTT konsentrat før bruk i MTT-assayet | 2 måneder |
| En flaske, 60 ml | Isopropanol (CAS # 67-63-0) | RT | Sigma-Aldrich | Ekstraktant løsning | NA |
Tabell 5: MTT-100 Analyse Kit Components.
| Kode N ° | Tissue | Rådata | Blank korrigerte data | bety av OD | % Av levedyktighet | ||
| n | Aliq. 1 | Aliq. 2 | Aliq. 1 | Aliq. 2 | |||
| NC | 1 | 1,316 | 1,352 | 1,316 | 1,352 | 1,334 | 101,6 |
| 2 | 1,277 | 1,309 | 1,277 | 1,309 | 1,293 | 98,4 | |
| PC | 1 | 0,379 | 0,397 | 0,379 | 0,397 | 0,388 | 29.6 |
| 2 | 0,419 | 0,442 | 0,419 | 0,442 | 0,431 | 32.8 | |
| TA1 | 1 | 1,213 | 1,244 | 1,213 | 1,244 | 1,229 | 93,5 |
| 2 | 1.355 | 1.355 | 1.355 | 1.355 | 1.355 | 103.2 | |
| TA2 | 1 | 1.210 | 1,122 | 1.210 | 1,122 | 1,166 | 88.7 |
| 2 | 0.828 | 0,837 | 0.828 | 0,837 | 0,833 | 63.4 | |
| TA3 | 1 | 0,167 | 0.168 | 0,167 | 0.168 | 0,167 | 12.7 |
| 2 | 0,138 | 0,136 | 0,138 | 0,136 | 0,137 | 10.4 | |
| TA4 | 1 | 1,137 | 1.160 | 1,137 | 1.160 | 1,149 | 87.4 |
| 2 | 1,262 | 1,191 | 1,262 | 1,191 | 1,227 | 93.4 | |
| TA5 | 1 | 0,610 | 0,621 | 0,610 | 0,621 | 0,616 | 46.9 |
| 2 | 0.480 | 0,484 | 0.480 | 0,484 | 0,482 | 36.7 | |
| TA6 | 1 | 0,502 | 0,513 | 0,502 | 0,513 | 0,508 | 38.7 |
| 2 | 0,396 | 0,407 | 0,396 | 0,407 | 0,402 | 30.6 | |
| TA7 | 1 | 1.048 | 1.050 | 1.048 | 1.050 | 1,049 | 79.9 |
| 2 | 1,149 | 1.150 | 1,149 | 1.150 | 1.150 | 87.5 | |
| TA8 | 1 | 1.032 | 1.034 | 1.032 | 1.034 | 1.033 | 78,7 |
| 2 | 0,941 | 0,935 | 0,941 | 0,935 | 0,938 | 71.4 | |
| TA9 1 | 0,022 | 0,022 | 0,022 | 0,022 | 0,022 | 1.7 | |
| 2 | 0,144 | 0,149 | 0,144 | 0,149 | 0,147 | 11.2 | |
| TA10 | 1 | 0.150 | 0.150 | 0.150 | 0.150 | 0.150 | 11.4 |
| 2 | 0,254 | 0,255 | 0,254 | 0,255 | 0,255 | 19.4 | |
| mener | Dif. | bety for | Dif. | Dif. / 2 | Klassifisering | ||
| OD | OD | viabilities [%] | av viabilities | ||||
| NC | 1,314 | 0,041 | 100,0 | 3.12 | 1,56 | NI | kvalifisert |
| PC | 0.410 | 0,043 | 31.2 | 3.23 | 1.62 | Jeg | kvalifisert |
| TA1 | 1,292 | 0.127 | 98.3 | 9,63 | 4,81 | NI | kvalifisert |
| TA2 | 0,999 | 0,333 | 76.1 | 25.36 | 12.68 | NI | D> 20 |
| TA3 | 0,152 | 0,030 | 11.6 | 2.32 | 1.16 | Jeg | kvalifisert |
| TA4 | 1.188 | 0,078 | 90.4 | 5,94 | 2,97 | NI | kvalifisert |
| TA5 | 0,549 | 0,134 | 41.8 | 10.16 | 5.08 | Jeg | kvalifisert |
| TA6 | 0,455 | 0,106 | 34.6 | 8.07 | 4,03 | Jeg | kvalifisert |
| TA7 | 1.100 | 0,101 | 83,7 | 7,65 | 3,82 | NI | kvalifisert |
| TA8 | 0,986 | 0,095 | 75,0 | 7,23 | 3,62 | NI | kvalifisert |
| TA9 | 0,085 | 0.125 | 6.4 | 9,48 | 4,74 | Jeg | kvalifisert |
| TA10 | 0,203 | 0,105 | 15.4 | 7,95 | 3,98 | Jeg | kvalifisert |
Tabell 6:. EIT resultater oppnådd for 10 test artikler, NC og PC kontroller Bordene er produced av et Excel-regneark utviklet for å beregne vev levedyktighet og EIT resultater. Test kjemikalier som reduserte vev levedyktighet ≤ 60,0% i forhold til NC er klassifisert som irriterende ("I", TA3, TA5, TA6, TA9, og TA10) og teste kjemikalier som hadde vev levedyktighet> 60.0% er klassifisert som ikke-Irritanter (" NI ", TA1, TA2, TA4, TA7, og TA8).
Discussion
Vi har presentert den Øyeirritasjonstest (figur 1) som ble utviklet for EpiOcular vev modell. EIT er i stand til å skille okulære irritanter og korrosjonsmidler (GHS kategori 1 og 2 kombinert) fra materialer som ikke krever merking (GHS Ingen kategori) med høy grad av sensitivitet og spesifisitet 17. EIT som presenteres her ikke diskriminerer mellom GHS kategori 1 fra kategori 2 kjemikalier. EIT ble validert for klassifisering og merking av okulær irritasjon potensialet i et bredt spekter av kjemikalier, inkludert kosmetiske og farmasøytiske ingredienser. I forbindelse med andre in vitro tester, vil EIT tjene som en erstatning for den in vivo kanin øyeirritasjon test.
EIT bruker to lignende, men forskjellige protokoller for flytende og faste materialer, som varierer i lengde av eksponering og posteksponerings inkubasjonsperioder (figur 1). Sluttpunktet brukes i EITer vevet levedyktighet, bestemt ved MTT-analysen, som tidligere er blitt brukt i validerte humane epitel-vevsmodeller 20,21. For å utføre denne analysen, er ikke noe spesielt utstyr i tillegg til standard cellekultur utstyr som er nødvendig. På grunn av det høye nivået av vev til vev reproduserbarhet, n = 2 vev i stedet for den normalt anbefalte n = 3 blir brukt. Muligheten til å bruke n = 2 vev er en kritisk del av protokollen, siden det gir en erfaren operatør for å behandle to vev samtidig, for derved å minimalisere variasjonen av analysen som kan oppstå på grunn av forskjellig håndtering av individuelle vev 14. Også, ved hjelp av n = 2 vev per testartikkel, den irritasjon av 10 testsubstanser i samme fysiske tilstand (flytende eller fast), sammen med de positive og negative kontroller, kan evalueres ved hjelp av en kit (24 vev).
Andre viktige punkter som sikrer pålitelig klassifisering av materialer er spesifikasjoner for den positive kontrollen substance (tissue levedyktighet ≤50.0%), reproduserbarhet mellom dupliserte vev (forskjell <20,0%), og negativ kontroll OD-avlesninger (> 0,8 og <2,5).
Når du utfører EIT test, er det viktig å følge den godkjente protokollen og til foreslått dosering og skylle tidsplaner (tabell 3 og 4), siden avvik fra protokollen eller endringer i de inkubasjonsperioder kan resultere i endret utfallet. Likeledes vil avvik fra tre timers tid for MTT inkubasjon resultere i forskjellige MTT opplesninger og kan påvirke analyseresultatet.
Av og til kan en test kjemisk ha optiske eller andre egenskaper som kan forstyrre MTT vev levedyktighet analysen eller forårsake reduksjon av MTT. For eksempel kan en prøve kjemisk direkte redusere MTT til blå-purpur reaksjonsprodukt, eller det kan være et farget stoff som absorberer lys i det samme området som MTT formazan (~ 570 nm). Imidlertid vil disse testkjemikalier prESENT et problem bare, om i den tiden av MTT-analysen, er en tilstrekkelig mengde av materiale som fremdeles er tilstede på (eller absorberes av) vevet. For å unngå dette interferens, er omfattende renseprosedyrer innlemmet i EIT protokollen. Hvis skylling fjerner ikke TA og TA forstyrrer MTT reduksjon, må ytterligere kontroller brukes til å avdekke og korrigere for det. I korte trekk, hvis direkte MTT reduksjon av forsøksstoff er mistenkt, blir 50 ul (eller 50 mg for faste stoffer) av det aktuelle kjemikaliet inkubert i 3 timer med arbeids MTT-løsning ved SCC (NC, 50 ul sterilt deionisert vann, bør kjøre samtidig). Dersom MTT løsningen blir blå-purpur, blir testartikkel antatt å ha redusert MTT. I dette tilfellet er en funksjonskontroll ved bruk av fryse-drepte vev kontroller må utføres for å vurdere hvorvidt testmaterialet binding til vev, og fører til et falsk MTT-reduksjon signal. Hvis det er merkbart MTT reduksjon i TA-eksponerte, drepte vevskontroll(i forhold til mengden i det ubehandlede levedyktig vev), den midlere levedyktighet av vev testartikkelen må korrigeres ved å subtrahere den midlere levedyktighet av drepte kontroll.
EIT feiler på siden av sikkerhet, som demonstrert av den lave forekomsten av falske negative klassifikasjoner 14,15,18. Viktigere, ingen av GHS kategori 1 kjemikalier, som er etsende for øyet og som representerer den mest alvorlige okulær fare, ble klassifisert som ikke-irriterende i denne analysen 14,15,18,19. Endelig er en av de store fordelene med den RHCE in vitro testmetode er mulighet for testing av ren væske og faste materialer (som ikke er mulig med to-dimensjonale, neddykkede cellekulturer).
EIT vil bidra vesentlig i å bestemme okulær irritasjon potensialet i et bredt spekter av materialer i henhold til FN GHS klassifisering og merking. Utskiftningen av dyr for å bestemme osielt toksisitet har vært et mål for toksikologisk forskning i mange år. EIT testmetode har gjennomført en formell valideringsstudie støttet av EURL ECVAM i 2014 og EpiOcular EIT ble implementert i OECDs test retningslinjer som OECD TG 492 i 2015.
Disclosures
Publiserings avgifter for denne artikkelen ble betalt av Mattek Corporation.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Dr. John Harbell for sin vitenskapelig støtte og tid dedikert til EIT prosjektet. Forfatterne ønsker også å takke Beiersdorf AG (Tyskland), IIVS (USA), Mary Kay Inc. (USA), Avon Products Inc. (USA), Procter & Gamble / Cosmital (Sveits), Laboratoire Pierre Fabre (Frankrike), Harlan Laboratories (Storbritannia), og LVMH Parfume (Frankrike) for deltakelse i Multi-senter International Pre-validering og valideringsstudier av Øyeirritasjonstest 15.
References
- National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). Request for Ocular Irritancy Test Data From Human, Rabbit, and In Vitro Studies Using Standardized Testing Methods. Federal Register. 72 (109), 31582-31583 (2007).
- Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC. OJ. L396 (49), European Commission. 1-849 (2006).
- Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). , Fifth revised edition, United Nations. New York and Geneva. (2013).
- Draize, J. H., Woodard, G., Calvery, H. O. Methods for the Study of Irritation and Toxicity of Substances Applied Topically to the Skin and Mucous Membranes. J Pharmacol Exp Ther November. 82, 377-390 (1944).
- Adriaens, E. Retrospective analysis of the Draize test for serious eye damage/eye irritation: importance of understanding the in vivo endpoints under UN GHS/EU CLP for the development and evaluation of in vitro test methods. Arch tox. 88, 701-723 (2014).
- Balls, M., Botham, P. A., Bruner, L. H., Spielmann, H. The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol in Vitro. 9, 871-929 (1995).
- Curren, R. D., Harbell, J. W. Ocular safety: a silent (in vitro) success story. Altern Lab Anim. 30, Suppl 2. 69-74 (2002).
- Wilhelmus, K. R. The Draize Eye Test. Survey of Ophthalmology. 45, 493-515 (2001).
- Curren, R. D., Harbell, J. W. In vitro alternatives for ocular irritation. Environ health persp. 106, 485-492 (1998).
- McCain, N. E., Binetti, R. R., Gettings, S. D., Jones, B. C. Assessment of ocular irritation ranges of market-leading cosmetic and personal-care products using an in vitro tissue equivalent. Toxicologist. 66, 243 (2002).
- Niranjan, P., Dang, A. H., January, B. G., Gomez, C., Harbell, J. W. Use of the EpiOcular assay for preclinical qualification of formulas for human clinical studies. Toxicologist. 96, 249 (2007).
- Yin, X. J. Prediction of ocular irritation potential of surfactants-based formulations at different concentrations using the EpiOcular model. Toxicologist. 108, 378 (2009).
- Harbell, J., Curren, R. In vitro methods for the prediction of ocular and dermal toxicity. Handbook of Toxicology. , 2nd Edition, Informa Healthcare. (2001).
- Kaluzhny, Y. Development of the EpiOcular(TM) eye irritation test for hazard identification and labelling of eye irritating chemicals in response to the requirements of the EU cosmetics directive and REACH legislation. Altern Lab Anim. 39, 339-364 (2011).
- Pfannenbecker, U. Cosmetics Europe Multi-Laboratory Pre-Validation of the EpiOcular Reconstituted Human Tissue Test Method for the Prediction of Eye Irritation. Toxicol in vitro. , (2013).
- MatTek Corporation. EpiOcular™ Eye Irritation Test (OCL-200-EIT) for the prediction of acute ocular irritation of chemicals for use with Reconstructed Human EpiOcular Model (OCL-200-EIT). Protocol#MK-24-007-0055. , MatTek Corporation. (2014).
- Kaluzhny, Y. EpiOcular Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification and Labeling of Eye Irritating Chemicals: Protocol Optimization for Solid Materials and Extended Shipment Times. Altern Lab Anim. 43 (2), 101-127 (2015).
- Kolle, S. N., Kandarova, H., Wareing, B., van Ravenzwaay, B., Landsiedel, R. In-house validation of the EpiOcular(TM) eye irritation test and its combination with the bovine corneal opacity and permeability test for the assessment of ocular irritation. Altern Lab Anim. 39, 365-387 (2011).
- Reconstructed Human Cornea-like Epithelium (RhCE) Test Method for Identifying Chemicals Not Requiring Classification and Labelling for Eye Irritation or Serious Eye Damage. Draft proposal for a new test guideline.. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. , (2014).
- Evaluating the ocular irritation potential of 54 test articles using the EpiOcular Human tissue Construct Model. Toxicol. In Vitro. Blazka, M. E., Harbell, J. 42nd Annual Meeting of the Soc. of Toxicology, Salt Lake City, UT, , (2003).
- Kandarova, H. The EpiDerm Test Protocol for the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests — An Assessment of the Performance of the Optimised Test. Altern Lab Anim. 33, 351-367 (2005).
