Summary
Vi har utvecklat en ögonirritationstest som utnyttjar en tredimensionell rekonstruerad human hornhinna liknande epitel (RHCE) vävnadsmodell. Testet kan skilja mellan ögonirriterande och frätande material (GHS kategori 1 och 2 kombinerade) och de som inte kräver märkning (GHS ingen kategori).
Abstract
För att uppfylla den sjunde ändringen av kosmetikadirektivet och EU: s Reach-lagstiftningen EU behövs validerade utan djurförsök alternativa metoder för säker och korrekt bedömning av okulär toxicitet hos människa. För att tillgodose detta behov har vi utvecklat en ögonirritationstest (EIT) som utnyttjar en tredimensionell rekonstruerad human hornhinna liknande epitel (RHCE) vävnadsmodell som bygger på normala mänskliga celler. EIT kan skilja okulära irriterande och frätande (GHS kategori 1 och 2 kombinerade) och de som inte kräver märkning (GHS ingen kategori). Testet utnyttjar två separata protokoll, en avsedd för flytande kemikalier, och en andra, liknande protokoll för fasta testartiklar. EIT prediktionsmodell använder en enda exponeringsperiod (30 min för vätskor, 6 h för fasta ämnen) och en enda vävnadsviabilitet bryt (60,0% enligt bestämning med MTT-analysen). Baserat på resultaten för 83 kemikalier (44 vätskor och 39 fasta ämnen) EIT uppnådde 95,5 / 68,2 / och 81,8% sensitivity / specificitet och noggrannhet (SS & A) för vätskor, 100,0 / 68,4 / och 84,6% SS & A för fasta och 97,6 / 68,3 / och 83,1% för den totala SS & A. EIT kommer att bidra avsevärt till att klassificera den okulära irritationspotentialen hos ett brett spektrum av flytande och fasta kemikalier utan användning av djur för att uppfylla regulatoriska krav test. Den EpiOcular EIT metoden infördes 2015 i OECD: s testriktlinjer som TG 492.
Introduction
Konsumentprodukter såsom kosmetika, tvättmedel och rengöringsmedel innehåller en mängd olika kemikalier som kan framkalla allvarliga skador om de kommer i kontakt ögonen. Därför är testning av dessa medel för ögonirritation som krävs av USA: s och EU: s tillsynsmyndigheter att garantera konsumenternas säkerhet 1. En bedömning av ögonirritationspotentialen av blandningar och beredningar är också ett krav för att uppfylla REACH (Registration, Evaluation, Authorization och begränsning av kemikalier) lagstiftning för märkning av kosmetiska ingredienser enligt direktivet om EU: s kosmetika för transport av kemikalier, och för märkning av bekämpningsmedel och hushållsprodukter 2. För närvarande, tillsynsmyndigheter kräver okulär riskbedömning med hjälp av globalt harmoniserade systemet för klassificering och märkning av kemikalier (GHS) 3. GHS bygger huvudsakligen på Draize ögonirritation, den mest använda ögonirritation analys, i vilken främmande ämnen och mixtures införs direkt in i konjunktivalsäcken i kaninögat 4. Enligt GHS-klassificering, GHS kategori 1 (ämnen som är frätande) avser att testa kemikalier som orsakar svår initial skada på ögat vävnader eller allvarlig skada på ögat och vision som inte är fullt reversibla inom 21 dagar efter exponering 3,5. GHS kategori 2 avser att testa kemikalier som ger betydande förändringar i ögat som är fullt reversibla inom 21 dagar efter exponering. Test kemikalier som inte är frätande eller irriterande kallas GHS ingen kategori.
För mer än 40 år, har Draize test på kaninögon kritiserats för sin brist på reproducerbarhet, överskattning av reaktioner hos människan, och användning av levande djur 5-8. Dessa farhågor har uppmuntrat många förslag till förfining, reduktion, och ersättning av den in vivo-test 9. Behovet av validerade alternativ till djurförsök stärktes ytterligaregenom antagandet av den sjunde ändringen av kosmetikadirektivet, som förbjöd användning av djur i säkerhetsutvärdering av kosmetiska produkter (2005) och ingredienser (2009) 2.
Sedan 1996 har den rekonstruerade hornhinnan liknande vävnadsmodell använts i stor utsträckning av den kosmetiska industrin för att utvärdera irritationspotentialen av råvaror, ytaktiva baserade formuleringar, och förvärras blandningar som är avsedda för användning i eller i närheten av, ögat 10-13. Användning av vävnadsmodell RHCE möjliggör direkt topisk applicering av testmaterialet på vävnadsytan i dess nativa, outspädd form. På detta sätt kan icke-vattenlösliga formuleringar testas utan att späda dem med lösningsmedel. Som svar på EURL ECVAM: s (Europeiska unionens referenslaboratorium Europeiska centret för validering av alternativa metoder) begäran om en allmänt tillämplig, enkel och ekonomisk metod ögonirritation Test (EIT), som utnyttjar en single exponeringstid och kan skilja okulära irriterande och frätande från material som inte kräver märkning utvecklades (Figur 1) 14. Baserat på resultaten för 83 kemikalier (44 vätskor och 39 fasta ämnen), EIT uppnådde 95,5 / 68,2 / och 81,8% känslighet / specificitet och noggrannhet (SS & A) för vätskor, 100,0 / 68,4 / och 84,6% SS & A för fasta och 97,6 / 68,3 / och 83,1% för den totala SS & A.
År 2007, en multi-laboratorium pre-valideringsstudie sponsrad av Cosmetics Europe (tidigare Colipa) under överinseende av referenslaboratorium ECVAM bedömde relevansen och tillförlitligheten i ETI med målet att föra den till formell validering 15. I denna studie var 298 oberoende studier utförs i sju oberoende laboratorier. Studieresultat visade 99,7% avtal förutsägelse med låga variationskoefficienter över alla deltagande laboratorier 15. Som ett resultat under 2010 EIT protokollet trädde en formell EURL ECVAMvalideringsprogram. Valideringsstudien användes 104 kodade prov kemikalier, inklusive enskilda ämnen och kemiska blandningar, som in vivo-referensdata (Draize ögonirritation) fanns tillgängliga. Baserat på framgångarna med detta arbete var en OECD riktlinje utkast prov lämnas in 2014. Det förväntas att EIT kommer att bidra avsevärt till klassificering av okulär irritationspotentialen hos ett brett spektrum av material enligt FN: s GHS-klassificering och märkning.
Protocol
1. Framställning av RHCE vävnader för behandling - Dag 0
- Vid mottagandet av kommersiella mänskliga hornhinnan liknande epitel (RHCE) kit, kolla alla kitkomponenter för integritet (för kit detaljer visa Standard Assay Kit Components (tabell 1) samt utrustning och material som krävs för att utföra ETI analysen (tabell 2). På dagen för mottagandet, jämvikt vävnader (i sin 24-brunn container) till RT under 15 minuter.
| Mängd | Reagens | Villkor | Källa | Beskrivning | Utgångsdatum |
| 1 | Sealed 24-brunnar i EpiOcular vävnader (OCL-200) | 2-8 ° C | MatTek | Innehåller 24 tissUE cellodling skär, paket på agaros | 72 h |
| 1 flaska, 200 ml | EpiOcular analysmedium (OCL-200-ASY) | 2-8 ° C | MatTek | DMEM baserat medium | 21 dagar |
| 1 flaska, 100 ml | Ca ++ Mg ++ -Free Dulbecco's-PBS (DPBS) | RT | Sigma-Aldrich, D5652, eller motsv. | Används för att skölja skär | 1 år |
| 4 | 6-brunnars plattor | RT | Falcon | Används för att hålla vävnader under analysprotokoll | NA |
| 2 | 12-brunnsplattor | RT | Falcon | Används under analysprotokoll | NA |
| 2 | Plattor med 24 brunnar | RT | Falcon | Används för att utföra MTT-analys | NA |
| 1 injektionsflaska, 0,5 ml | Metylacetat (CAS # 79-20-9) | RT | Sigma-Aldrich, Cat # 186.325 | Används som PC i analysen | 1 månad |
Tabell 1: Standard Assay Kit Components.
| Utrustning / Material | Behövs för: |
| Fuktad inkubator (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO2, 90 ± 10% fuktighet) | Inkubera vävnader före och under analyser |
| Huv med laminärt flöde | Säkert arbete under sterila förhållanden |
| Vakuumpump (tillval) | Aspirera medium och lösningar |
| Plate-läsare fotometer (för 96-brunnsplattor) | Läsning OD |
| Plattskak | Extraktjonen av formazan |
| Sterila, trubbiga pincett | Hantering vävnadsinlägg |
| Stoppur | Tidsschema för tillämpning av testmaterial och andra tids steg i protokollet |
| Vattenbad (37 ± 1 ° C) | Uppvärmnings media och MTT-lösning |
| Mortel | Målning av kornigt fast material |
| Förträngnings pipett (50 pl) | Tillämpning av viskösa och halvfasta material och inställelser |
| Justerbara pipetter (200 | il-2 ml) | Tillämpning av flytande material, analysmedium och MTT |
| Försteriliserade spetsar (200 pl och 20 pl), Rainin Cat # HR-200F och HR-20F (eller motsvarande) | Tillämpning av flytande material, analysmedium och MTT |
| Bred mynnings försteriliserade spetsar (250 | il), Rainin Cat # HR-250WS (eller ekvrande) | Tillämpning av viskösa och halvfasta material och inställelser |
| 8 oz / 220 ml provbehållare, Falcon Cat # 3540200 (eller motsvarande) | Sköljning vävnader |
| Sterila engångssprutor (t.ex. 1 ml tuberkulin spruta Omnifix-F, B. Braun Melsungen AG, katt. Nej 9161406V) | Leverans av ~ 50 mg fasta material (tillval) |
| Ted Pella mikro spatel / sked, Ted Pella Inc., katalognummer 13504 (eller motsvarande, skarp sked eller ben kyrett, t.ex. Aesculap, No: FK 623) | Leverans av ~ 50 mg fasta material |
| Ca ++ och Mg ++ fri Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (Ca ++ Mg ++ fri-DPBS): Sigma-Aldrich, katalognummer D5652 (eller motsvarande) | Skölj vävnader under analys |
| Sterilt avjoniserat vatten, vävnadsodlingskvalitet (kvalitet biologisk eller motsvarande) | <td> Använd som NC|
| 96-brunnars flatbottnade plattor, Falcon (eller motsvarande) | För att läsa OD |
| Bomull spets swappar (steril) | För torkning vävnadsytan (tillval) |
| Tejp eller Parafilm | Täckplattor under formazan utvinning |
| MTT-100 analyssats | Innehåller MTT-tiazolylblått tetrazoliumbromid reagens (Sigma # M-5655) och isopropanol extrakt. |
Tabell 2: Utrustning och material som behövs för att utföra ETI.
- Under sterila betingelser, öppna plastpåsen som innehåller den 24-brunnar med RHCE vävnader och ta bort steril gasbinda. Inspektera alla vävnader för luftbubblor mellan agarosgelen och sätt. Använd inte kulturer med luftbubblor bildas under insatsen täckande> 50% av insatsområdet, defekta vävnader eller vävnader whi ch är helt täckt med vätska.
- Märk 6-brunnsplattor med artikeln test eller styrkoder och exponeringstider. Alikvotera 1,0 ml analysmedium (som tillhandahålls med kitet), förvärmda till ca 37 ° C, i brunnarna på pre-märkt 6-brunnars plattor.
- Använd sterila pincett för att ta bort varje insats innehåller RHCE vävnad och placera insatsen i märkta 6-brunnar. Under detta steg avlägsna eventuellt kvarvarande frakt agaros som vidhäftar till de yttre sidorna av insatsen genom försiktig läskning på sterilt filterpapper. Släpp eventuella luftbubblor fångade under skären.
- Pre-inkubera RHCE vävnader i 6-brunnars plattor till standardodlingsbetingelser (SCC, fuktad atmosfär med 5 ± 1% CO2 vid 37 ± 1 ° C) under 1 timme.
- Efter 1 timme, byt ut analysmedium med 1,0 ml färskt analysmedium uppvärmd till 37 ° C och inkubera RHCE vävnader vid SCC villkor (natten = O / N) (16-24 timmar).
- Efter O / N inkubation, applicera 20 pl Ca2 + Mg2 + -fri-Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS, tillgänglig) med användning av en lämplig pipetteringsanordningen. Om DPBS inte sprids över vävnaderna, knacka försiktigt insatsen på plattan för att säkerställa att DPBS väter hela vävnadsytan.
- Inkubera RHCE vävnader vid SCC under 30 ± 2 min.
Obs: Detta steg är nödvändigt för vävnads hydrering och att efterlikna in vivo förhållanden.
3. Test Material Exponeringsförfaranden
- Applicera varje artikel test och kontroller för att duplicera RHCE vävnader (n = 2). Testföremålet doseringsförfarande är olika för vätskor och fasta ämnen. Lokalt gäller 50 il flytande testartiklar med hjälp av en pipett. Exponeringstiden för vätskor är 30 min. Applicera 50 mg fast testartiklar med användning av en planade sked (kalibrerat för att hålla 50 mg natriumklorid). Exexponering tid för fasta ämnen är 6 timmar.
Obs: Vätskor definieras som flytande substanser (t.ex., vätskor, geler och krämer) som kan tillämpas med användning av en pipetteringsanordning. Fasta ämnen definieras som icke-vätskesubstanser (t.ex. pulver, hartsartade eller vaxartade material) som inte kan tillämpas med användning av en pipett.- Om det fysikaliska tillståndet av testföremål är inte lätt att bestämma, placera rören med testartikeln i ett vattenbad i 15 min (37 ° C). Följ EIT protokoll för vätskor för de test artiklar som vätskeform vid 37 ° C.
- Använd en förträngnings pipett för särskilt viskösa material.
- Dos den negativa kontrollen och positiva kontroller och sedan dosera testföremålen.
- Applicera 50 | il av den negativa kontrollen (NC) och den positiva kontrollen (PC) för att RHCE vävnader med hjälp av en standard pipett. NC är sterilt avjoniserat vatten; PC är metylacetat (CAS # 79-20-9). Applicera NC och PC för 30 minuter när testeting flytande testartiklar och under 6 timmar vid provning av fasta testartiklar.
4. Test Artikel Exposure - Dag 1
- För behandling av flytande testartiklar, följer tidsschemat anges i tabell 3. Lämna 1 minuters intervall mellan tillämpningar av varje testartikel att säkerställa lika exponering för alla vävnader.
- Efter 30 ± 2 min DPBS förbehandling, lokalt tillämpa 50 il NC och PC, och varje vätske artikel testet lokalt på RHCE vävnader med hjälp av en lämplig pipetteringsanordningen.
- Applicera 50 | il av det vätskeformiga artikeln testet direkt på vävnad för att täcka den övre ytan. Skär av den smala punkten av pipettspetsen för att vidga öppningen för viskösa material. För mycket viskösa material, applicera testartikeln till en doseringsanordning (en platt rubriken cylinder med diameter som är något mindre än innerdiametern hos vävnaden insatsen eller en plast pushpinen), invertera doserings dEvice och placera den på vävnaden så att testartikel jämnt i kontakt med vävnadsytan.
- Om testartikel inte sprids över vävnaden, knacka försiktigt insatsen för att säkerställa att den sprids på hela vävnadsytan. Mekanisk spridning av testföremålen (t.ex., med en pipett spets) rekommenderas inte, eftersom det kan skada vävnaderna.
- Inkubera vävnader vid SCC för 30 ± 2 minuter.
- För behandling av solida testartiklar - Dag 1, följer tidsschemat ges i tabell 4 Lämna 2 minuters intervall mellan tillämpningar av varje testartikel att säkerställa lika exponering för alla vävnader..
- Efter 30 ± 2 min DPBS förbehandling, applicera 50 ul av NC och PC topiskt på RHCE vävnaderna med användning av en lämplig pipetteringsanordningen.
- För fast testartikel ansökan, ta bort insatserna (n = 2) från brunnen och placera dem på en steril yta (t.ex. locket av amultiwell platta) för att undvika en testartikel spiller in i mediet.
- Med hjälp av en avvägda sked, topiskt applicera approximativt 50 mg av testföremålet på vävnadsytan; se till att ytan av vävnaden är helt täckt av testartikeln. Om testartikeln inte sprider sig över vävnaden, skaka insatsen försiktigt från sida till sida för att se till att vävnaden är helt täckt av testartikeln. Mekanisk spridning av testföremålen (t.ex., med en pipett spets) rekommenderas inte, eftersom det kan skada vävnaderna.
- Om det behövs, slipa kristallina pulver med en mortel och mortelstöt för att garantera en bättre kontakt mellan artikel testet och vävnaden.
- Alternativt, placera pulver direkt på vävnadskultur i insatsen genom att använda en 1 ml spruta med huvudet avskuret. Stuff pulver in i sprutan när kolven dras tillbaka och sedan tillämpas genom att trycka ned kolven.
- Om den yttre väggen hos insatsen är contaminated t.ex. via pulver, torka partiklarna bort med en steril gasbinda.
- Efter dosering, åter vävnaderna till 6-brunnsplattor innehållande odlingsmedium och inkubera vid SCC under 6 h ± 15 min.
5. Sköljning
- Bered en serie av tre rena bägare (150 ml kapacitet) per testartikeln och fylla var och en av dem med 100 ml DPBS. För varje testartikel, utnyttjar en annan uppsättning av tre bägare.
- I slutet av 30 ± 2 min exponering för flytande material eller 6 timmar ± 15 min exponering för fasta material, ta bort och kasta doseringsanordningen om den användes.
- Lyft skären innehållande RHCE vävnaden ut ur mediet genom att gripa den övre kanten av plast "krage" med fin pincett. Använd böjd pincett att underlätta hantering och dekantering. Skölj vävnaderna två åt gången genom att hålla de dubbla insatserna tillsammans med sina kragar använder pincett. Var försiktig not skada vävnaderna med pincett.
- Dekantera testföremålen eller kontroller från vävnadsytan på ett rent absorberande material (pappershanddukar, gasbinda, etc)
- Doppa insatserna i den första bägaren DPBS, virvla runt i en cirkulär rörelse i DPBS för cirka 2 sekunder, lyft insatserna så att de oftast fyllda med DPBS, och häll upp vätskan tillbaka i bägaren. Upprepa denna process tre gånger i den första bägaren.
- Skölj insatserna i de andra och tredje bägare DPBS tre gånger vardera på samma sätt.
- Häll någon vätska kvar i insatsen på det absorberande materialet. Rotera insatsen till en ungefärlig 45 ° vinkel (öppen ände nedåt) och tryck på överläppen till det absorberande materialet.
Obs: Om det inte är möjligt att ta bort all synlig provmaterial bör ingen ytterligare sköljning göras för att undvika vävnadsskada på grund av överdriven hantering.
6. Post-blöt
- Efter sköljningomedelbart doppa vävnader i 5 ml analysmedium som tidigare värmts till RT i en pre-märkt 12-brunnar.
- Inkubera vävnader för 12 ± 2 min för flytande material eller 25 ± 2 min för fasta material nedsänkta vid RT för att underlätta avlägsnande av eventuellt kvarvarande testartikeln.
7. Post-inkubation
- Vid slutet av Post-Soak nedsänkningsperiod, dekantera analysmedium från vävnaderna och blot skären på ett absorberande material.
- Överför skären in pre-märkt 6-brunnars platta innehållande 1 ml varmt analysmedium.
- Inkubera vävnader för 120 ± 15 minuter vid SCC för flytande provmaterial.
- Inkubera vävnader för 18 ± 0,25 timmar vid SCC för fasta testmaterial.
8. MTT viabilitetsanalys - Dag 1 (Protokoll för vätskor) och Dag 2 (Protokoll för Solids)
- Utför MTT-analysen efter Post-Inkubation av 12077; 15 min för vätskor och 18 ± 0,25 timmar för fasta respektive.
- Bered 1,0 mg / ml MTT-lösning och delprov 0,3 ml av lösningen i varje brunn i en i förväg märkt 24-brunnar.
- Använd kommersiella MTT kit (tabell 5):
- 2 tim före användning, tina MTT koncentratet vid RT. Kombinera 2 ml av MTT koncentratet och 8 ml av MTT-utspädningsmedel för att producera 1,0 mg / ml MTT-lösning.
- Förvara MTT-lösning vid 4 ° C i mörker tills de användes. Förvara inte MTT lösning för mer än en dag.
- Vid slutet av Post Incubation, ta bort varje insats från 6-brunnar och försiktigt blot på ett absorberande material.
- Placera skären in i 24-brunnar innehållande 0,3 ml MTT-lösning. Släpp eventuella luftbubblor fångade under skären. Inkubera plattan i 180 ± 10 minuter vid SCC.
- MTT-extraktion
- Efter 180 ± 10 min inkubation i MTT-lösning, ta bort varje insatsfrån 24-brunnar och blot botten av insatsen på ett absorberande material.
- För icke-färgvätsketestföremål (nedsänkt extraktion): Överför skären in i en pre-märkt 24-brunnars platta innehållande 2,0 ml av en extraktionsmedelslösning (isopropanol), så att den submerges insatsen.
- För fasta ämnen och flytande färgnings (icke-nedsänkta extraktion för att undvika förorening av extraktionsmedelslösningen): Överför skären in i en pre-märkt 6-brunnars platta innehållande 1,0 ml av extraktionsmedelslösningen (isopropanol), så att den inte dränka insatsen.
Obs: Utför samma icke nedsänkta extraktion för motsvarande negativa och positiva kontroller.
- Täta plattorna (t.ex., med parafilm mellan plattan locket och övre kanten av brunnarna eller med ett standardplattförslutning). Placera plattorna på en orbital plattskak och skaka i två till tre timmar vid rumstemperatur för att extrahera MTT.
- Alternativt, utför utvinning O / N vid 2-876, C i mörker utan skakning.
- För icke-färgvätsketestföremål (nedsänkt extraktion): Vid slutet av extraktionsperioden, dekantera vätskan från varje insats tillbaka i brunnen och kassera skär med RHCE vävnader.
- Blanda extraktlösningen och överföra två 200 | il alikvoter i lämpliga brunnar i en pre-märkt 96-brunnars platta i enlighet med den plattkonfiguration (figur 2).
- För fasta ämnen och flytande färgämnen (icke-nedsänkt utvinning): I slutet av utvinning perioden, kasta vävnader (se till att inte tränga igenom vävnaderna).
- Lägg 1,0 ml av extraktionsmedelslösningen in i varje brunn i 24-brunnars platta innehållande lösningen extraherades från vävnaderna. Blanda extraktionsmedelslösningen och överföra två 200 | il alikvoter i lämpliga brunnar i en pre-märkt 96-brunnars platta i enlighet med den plattkonfiguration (figur 2).
- Bestäm tHan optisk densitet (OD) av de extraherade proverna vid en enda våglängd mellan 550 och 590 nm (bör stämma överens med en laboratorie) på en plattläsare eller en spektrofotometer.
- Vid grumliga extraktlösningar som orsakas av olösliga fasta ämnen centrifugeras lösningarna före mätning av OD (svalna centrifugen till 4 ° C för att undvika avdunstning). Vid sköljning inte bort testartikeln (TA) och TA stör MTT minskning, måste ytterligare kontroller användas. Se en detaljerad SOP för att korrigera för MTT nedsättning med 16.
- I det fall en TA visas för att ha, eller för att utveckla färg, som kan samverka med MTT mätningen måste ett ytterligare test utföras för att bestämma mängden färg bunden till, och därefter extraheras från vävnaderna. Se en detaljerad SOP för att korrigera färgade testartiklar 16.
9. Beräkningar för vävnadsviabilitet Test (tabell 6 och figur 3) & #160;
- Allmänna beräkningar
- Beräkna medelvärdet av OD av blanka kontrollbrunnar (OD BLK) för varje experiment.
- Subtrahera OD Blk från varje OD-värdet för samma experiment (Blk korrigeringsdata).
- Beräkna medelvärdet av de två alikvoter för varje vävnad (= korrigerad OD).
- Beräkna den procentuella livskraften hos var och en av de två likadana vävnader för varje kontroll och testartikeln i förhållande till den genomsnittliga negativa kontrollen (100% kontroll).
Viabilitet (%) = [korrigerat OD behandlade vävnader / korrigerade OD negativ kontroll] x 100% - Beräkna skillnaden i lönsamhet (skillnaden lönsamhet mellan två likadana vävnader).
- Beräkna medeltestartikeln viabilitet (TA viabilitet) och klassificera testartikel enligt prognosmodellen.
10. Prediction Model (Figur 3)
- Om TA-behandlade vävnadsviabilitet är> 60,0 i förhållande till NC-behandlad vävnad viability, märka testartikeln som icke-irriterande (NI) (GHS Ingen kategori).
- Om TA-behandlade vävnadsviabilitet är ≤ 60,0 i förhållande till NC-behandlad vävnad livskraft, märka testartikeln som irriterande (I) (GHS kategori 1 och 2).
Obs! EIT testresultat anses uppfylla kraven om:- EIT NC OD> 0,8 och <2,5;
- EIT PC vävnadsviabilitet (%, jämfört med NC) är ≤50.0%;
- Skillnaden mellan de två likadana vävnader (NC, PC, och testa artikeln) är <20,0%.
- EIT NC OD> 0,8 och <2,5;
Representative Results
Representativa EIT resultat utförda med 10 testföremål (TA) och negativa och positiva kontroller presenteras i tabell 6 och figur 3. Den genomsnittliga OD = 1,31 för NC motsvarar 100% vävnadsviabilitet, därför datorn (medelvärde OD = 0,41) hade relativ vävnadsviabilitet på 31,2%. När EIT protokollet utfördes i 15 giltiga oberoende experiment i 7 laboratorier med hjälp av flytande exponeringsprotokoll och 8 oberoende giltiga experiment i 4 laboratorier med fasta exponerings protokollet, den genomsnittliga vävnadsviabilitet för datorn med hjälp av flytande protokollet var 36,4 ± 4,0 % och 32,3 ± 6,4% för fasta ämnen protokollet. I samtliga fall var de positiva kontrollresultat under det avskurna värdet på 60,0% 15.
Såsom visas i fig 3, TA1, TA2, TA4, TA7 och TA8 hade vävnadslivsduglighet> 60,0% och därför klassificerades som "NI". TA3, TA5, TA6, TA9 och TA10 hade vävnads viabilitet X04, 60,0% och därför klassificerades som "I". Skillnaden av vävnadsviabilitet mellan dubbla vävnader var <20,0% för alla terapiområden med undantag av TA2. Därför, resultat för alla test artiklar, med undantag av TA2, ansågs "kvalificerad", eftersom de uppfyllde alla EIT acceptanskriterier (avsnitt 10.2). På grund av hög variabilitet mellan dubbla vävnader för TA2 i första försöket, var nödvändig för att erhålla kvalificerade EIT resultat ett andra försök.
EIT testmetoden som beskrivs häri utnyttja vävnadsmodell RHCE användes för bedömningen av ögonirritation i flera multilaboratory valideringsstudier, inklusive formell validering av EURL ECVAM / Cosmetics Europe 15,17-19. I samtliga studier var EIT visat sig vara reproducerbara och kunde korrekt identifiera kemikalier (både ämnen och blandningar) som inte kräver klassificering och märkning av ögonirritation eller allvarlig ögonskada acligt FN: s GHS 15,17-19. EIT testmetoden uppfyllde kriterierna för validering Management Group (VMG) acceptans för ögonirritation känslighet, specificitet, och totala noggrannheten och för närvarande pågår formellt genomförande som en partiell ersättning för in vivo kanin Draize-test 19.
Figur 1: Sammanfattning av EIT: s protokoll för flytande och fasta testartiklar Förkortningar: AM, analysmedium;. SCC, standardodlingsbetingelser; PBS, Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning; RT, rumstemperatur.
Figur 2:. Den standardiserade konfiguration 96-brunnar för MTT vävnadsviabilitet testet Två 200 il portioner är transferred till de lämpliga brunnarna i en pre-märkt 96-brunnar. Förkortningar: NC, negativ kontroll; PC, positiv kontroll; TA1-TA20, testartiklar 1-20; Blank, extraktionsmedelslösningen. 96- MTT plattkonfiguration används med Excel utformat för att beräkna RHCE vävnadsviabilitet och EIT resultat.
Figur 3: EIT resultat erhölls för 10 testföremål, NC och PC kontroller med hjälp av vävnadsmodell RHCE Grafen genereras från ett Excel-ark konstruerade så att, EIT resultat.. Test kemikalier som minskade vävnadsviabilitet ≤ 60,0% jämfört med NC klassificeras som irriterande ("I", TA3, TA5, TA6, TA9 och TA10) och test kemikalier som hade vävnadsviabilitet> 60,0% klassificeras som icke-Irriterande (" NI ", TA1, TA2, TA4, TA7 och TA8).
| Starttid för EIT protokollarbetsmoment (en dags arbete för en operatör) | |||||||
| Varje rad motsvarar ett par av vävnader | |||||||
| För steg: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Vätskor: | PBS | TA Exponering | Post- Blöt | Post- | MTT Reaktion | MTT Extraktion | Åtgärd |
| 30 min | 30 min | 12 min | 120 min | 180 min | 120 min | OD | |
| NC | 09:00 | 09:30 | 10:00 | 10:12 | 00:12 | 15:12 | efter |
| PC | 09:01 | 09:31 | 10:01 | 10:13 | 00:13 | 15:13 | 17:30 |
| TA-1 | 09:02 | 09:32 | 10:02 | 10:14 | 00:14 | 15:14 | |
| TA-2 </ strong> | 09:03 | 09:33 | 10:03 | 10:15 | 00:15 | 15:15 | |
| TA-3 | 09:04 | 09:34 | 10:04 | 10:16 | 00:16 | 15:16 | |
| TA-4 | 09:05 | 09:35 | 10:05 | 10:17 | 00:17 | 15:17 | |
| TA-5 | 09:06 | 09:36 | 10:06 | 10:18 | 00:18 | 15:18 | |
| TA-6 | 09:07 | 09:37 | 10:07 | 10:19 | 00:19 | 15:19 | |
| TA-7 | 09:08 | 09:38 | 10:08 | 10:20 | 00:20 | 15:20 | |
| 09:09 | 09:39 | 10:09 | 10:21 | 00:21 | 15:21 | ||
| TA-9 | 09:10 | 09:40 | 10:10 | 10:22 | 00:22 | 15:22 | |
| TA-10 | 09:11 | 09:41 | 10:11 | 10:23 | 00:23 | 15:23 | |
Tabell 3:. Prov tidsplan för testning av flytande testartiklar Protocol steg inklusive förvätning vävnaderna med DPBS, Tillämpning av testföremål (TAS), sköljning och efter blöt, Post-inkubationstid, MTT-analys, Utvinning av MTT, och Mätning av MTT OD presenteras i kolumnerna. Tider för de dubbla vävnaderna är organiserade i rader. Hela analystestning 10 resebyråerna och kontroller kan vara klar på en dag.
e_content ">| Starttid för EIT: s protokollsteg (2 dagar arbetar för en operatör) | |||||||
| Varje rad motsvarar ett par av vävnader | |||||||
| Dag 1 | Dag 2 (nästa dag) | ||||||
| För steg: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Fasta ämnen: | PBS | TA Exponering | Post- Blöt | Post- Incubaction | MTT Reaktion | MTT Extraktion | Åtgärd |
| 30 min | 6 h | 26 min | 18 h | 180 min | 120 min | OD | |
| NC | 09:00 | 09:30 | 15:30 | 15:56 | 09:56 | 00:56 efter | |
| PC | 09:02 | 09:32 | 15:32 | 15:58 | 09:58 | 00:58 | 15:30 |
| TA-1 | 09:04 | 09:34 | 15:34 | 16:00 | 10:00 | 13:00 | |
| TA-2 | 09:06 | 09:36 | 15:36 | 16:02 | 10:02 | 13:02 | |
| TA-3 | 09:08 | 09:38 | 15:38 | 16:04 | 10:04 | 13:04 | |
| TA-4 | 09:10 | 09:40 | 15:40 | 16:06 | 10:06 | 13:06 | |
| TA-5 | 09:12 | 09:42 | 15:42 | 16:08 | 10:08 </ td> | 13:08 | |
| TA-6 | 09:14 | 09:44 | 15:44 | 16:10 | 10:10 | 13:10 | |
| TA-7 | 09:16 | 09:46 | 15:46 | 16:12 | 10:12 | 13:12 | |
| TA-8 | 09:18 | 09:48 | 15:48 | 16:14 | 10:14 | 13:14 | |
| TA-9 | 09:20 | 09:50 | 15:50 | 16:16 | 10:16 | 13:16 | |
| TA-10 | 09:22 | 09:52 | 15:52 | 16:18 | 10:18 | 13:18 | |
Tabell 4: Prov tidsplan för testning av fasta testartiklar. Protokoll steg inklusive förvätning vävnaderna med DPBS, Tillämpning av testföremål, sköljning och efter blöt, Post-inkubationstid, MTT-analys, Utvinning av MTT, och Mätning av MTT OD presenteras i kolumnerna. Tider för de dubbla vävnaderna är organiserade i rader. Hela analysen testar 10 resebyråerna och kontroller genomförs under två dagar.
| Mängd | Reagens | Lagringsförhållanden | Källa | Beskrivning | Utgångsdatum |
| 1 injektionsflaska, 2 ml | MTT Koncentrat (MTT-100-CON) | Skyddad från ljus (-20 ° C) | MatTek | Fryst MTT koncentrat | 2 månader |
| 1 injektionsflaska, 8 ml | MTT utspädningsmedel | 2-8 &# 186; C | MatTek | För utspädning MTT koncentrat före användning i MTT-analysen | 2 månader |
| 1 flaska, 60 ml | Isopropanol (CAS # 67-63-0) | RT | Sigma-Aldrich | Extraktionsmedelslösningen | NA |
Tabell 5: MTT-100 Assay Kit Components.
| Kod N ° | Vävnad | Rådata | Blank korrigeringsdata | medelvärdet av OD | % Av lönsamheten | ||
| n | Aliq. 1 | Aliq. 2 | Aliq. 1 | Aliq. 2 | |||
| NC | 1 | 1,316 | 1,352 | 1,316 | 1,352 | 1,334 | 101,6 |
| 2 | 1,277 | 1,309 | 1,277 | 1,309 | 1,293 | 98,4 | |
| PC | 1 | 0,379 | 0,397 | 0,379 | 0,397 | 0,388 | 29,6 |
| 2 | 0,419 | 0,442 | 0,419 | 0,442 | 0,431 | 32,8 | |
| TA1 | 1 | 1,213 | 1,244 | 1,213 | 1,244 | 1,229 | 93,5 |
| 2 | 1,355 | 1,355 | 1,355 | 1,355 | 1,355 | 103,2 | |
| TA2 | 1 | 1.210 | 1,122 | 1.210 | 1,122 | 1,166 | 88,7 |
| 2 | 0,828 | 0,837 | 0,828 | 0,837 | 0,833 | 63,4 | |
| TA3 | 1 | 0,167 | 0,168 | 0,167 | 0,168 | 0,167 | 12,7 |
| 2 | 0,138 | 0,136 | 0,138 | 0,136 | 0,137 | 10,4 | |
| TA4 | 1 | 1,137 | 1,160 | 1,137 | 1,160 | 1,149 | 87,4 |
| 2 | 1,262 | 1,191 | 1,262 | 1,191 | 1,227 | 93,4 | |
| TA5 | 1 | 0,610 | 0,621 | 0,610 | 0,621 | 0,616 | 46,9 |
| 2 | 0,480 | 0,484 | 0,480 | 0,484 | 0,482 | 36,7 | |
| TA6 | 1 | 0,502 | 0,513 | 0,502 | 0,513 | 0,508 | 38,7 |
| 2 | 0,396 | 0,407 | 0,396 | 0,407 | 0,402 | 30,6 | |
| TA7 | 1 | 1,048 | 1,050 | 1,048 | 1,050 | 1,049 | 79,9 |
| 2 | 1,149 | 1,150 | 1,149 | 1,150 | 1,150 | 87,5 | |
| TA8 | 1 | 1,032 | 1,034 | 1,032 | 1,034 | 1,033 | 78,7 |
| 2 | 0,941 | 0,935 | 0,941 | 0,935 | 0,938 | 71,4 | |
| TA9 1 | 0,022 | 0,022 | 0,022 | 0,022 | 0,022 | 1,7 | |
| 2 | 0,144 | 0,149 | 0,144 | 0,149 | 0,147 | 11,2 | |
| TA10 | 1 | 0,150 | 0,150 | 0,150 | 0,150 | 0,150 | 11,4 |
| 2 | 0,254 | 0,255 | 0,254 | 0,255 | 0,255 | 19,4 | |
| betyder | Dif. | medelvärde för | Dif. | Dif. / 2 | Klassificering | ||
| OD | OD | viabilitet [%] | av viabilitet | ||||
| NC | 1,314 | 0,041 | 100,0 | 3,12 | 1,56 | NI | kvalificerad |
| PC | 0,410 | 0,043 | 31,2 | 3,23 | 1,62 | Jag | kvalificerad |
| TA1 | 1,292 | 0,127 | 98,3 | 9,63 | 4,81 | NI | kvalificerad |
| TA2 | 0,999 | 0,333 | 76,1 | 25,36 | 12,68 | NI | D> 20 |
| TA3 | 0,152 | 0,030 | 11,6 | 2,32 | 1,16 | Jag | kvalificerad |
| TA4 | 1,188 | 0,078 | 90,4 | 5,94 | 2,97 | NI | kvalificerad |
| TA5 | 0,549 | 0,134 | 41,8 | 10,16 | 5,08 | Jag | kvalificerad |
| TA6 | 0,455 | 0,106 | 34,6 | 8,07 | 4,03 | Jag | kvalificerad |
| TA7 | 1,100 | 0,101 | 83,7 | 7,65 | 3,82 | NI | kvalificerad |
| TA8 | 0,986 | 0,095 | 75,0 | 7,23 | 3,62 | NI | kvalificerad |
| TA9 | 0,085 | 0,125 | 6,4 | 9,48 | 4,74 | Jag | kvalificerad |
| TA10 | 0,203 | 0,105 | 15,4 | 7,95 | 3,98 | Jag | kvalificerad |
Tabell 6:. EIT resultat som erhållits för 10 testartiklar, NC och PC styr Tabellerna är produced av ett Excel-ark som syftar till att beräkna vävnadsviabilitet och EIT resultat. Test kemikalier som minskade vävnadsviabilitet ≤ 60,0% jämfört med NC klassificeras som irriterande ("I", TA3, TA5, TA6, TA9 och TA10) och test kemikalier som hade vävnadsviabilitet> 60,0% klassificeras som icke-Irriterande (" NI ", TA1, TA2, TA4, TA7 och TA8).
Discussion
Vi har presenterat det ögonirritationstest (Figur 1) som utvecklats för vävnadsmodell EpiOcular. EIT kan skilja okulära irriterande och frätande (GHS kategori 1 och 2 kombinerade) från material som inte kräver märkning (GHS ingen kategori) med hög grad av känslighet och specificitet 17. EIT som presenteras här inte diskriminera mellan GHS Kategori 1 från kategori 2 kemikalier. EIT validerades för klassificering och märkning av okulär irritationspotentialen hos ett brett spektrum av kemikalier, inklusive kosmetika och farmaceutiska substanser. I samband med andra in vitro-tester kommer EIT att fungera som en ersättning för in vivo kaninögonirritationstest.
EIT använder två liknande men distinkta protokoll för flytande och fasta material, som varierar i längd av exponering och efter exponering inkubationsperioder (Figur 1). Ändpunkten används i ETIär vävnadsviabilitet, bestämdes genom MTT-analysen, som tidigare har använts i validerade humana epiteliala vävnadsmodeller 20,21. För att utföra denna analys, behövs ingen särskild utrustning förutom standardcellodlingsutrustning. På grund av den höga nivån av vävnad-till-vävnads reproducerbarhet, n = 2 vävnader i stället för den vanligtvis rekommenderade n = 3 används. Möjligheten att använda n = 2 vävnader är en viktig aspekt av protokollet, eftersom den tillåter en erfaren operatör för att behandla två vävnader samtidigt, vilket minimerar variationen i analysen som kan uppstå på grund av olika hantering av enskilda vävnader 14. Också genom att använda n = 2 vävnader per testartikeln, den irritations av 10 testsubstanser i samma aggregationstillstånd (flytande eller fast), tillsammans med de positiva och negativa kontroller, kan utvärderas med hjälp av ett kit (24 vävnader).
Andra viktiga punkter som säkerställer tillförlitlig klassificering av material specifikationer för den positiva kontrollen SUbstance (vävnadsviabilitet ≤50.0%), reproducerbarhet mellan dubbla vävnader (skillnad <20,0%), och negativ kontroll OD-avläsningar (> 0,8 och <2,5).
När du utför EIT testet, är det viktigt att hålla fast vid det validerade protokollet och den föreslagna doseringen och skölj scheman (tabellerna 3 och 4), eftersom avvikelser från protokollet eller förändringar i inkubationsperioderna kan leda till förändrad utfall. På samma sätt kommer avvikelser från 3 timmar tid för MTT inkubation resultera i olika MTT avläsningar och kan påverka analysresultatet.
Ibland kan en testkemikalie har optiska eller andra egenskaper som kan störa MTT vävnadsviabilitet analys eller orsaka reduktion av MTT. Till exempel kan en testkemikalie direkt minska MTT i blålila reaktionsprodukt, eller kan vara en färgad substans som absorberar ljus i samma storleksordning som MTT formazan (~ 570 nm). Men dessa testkemikalier prESENT ett problem endast om vid tidpunkten för MTT analysen, är fortfarande närvarande på (eller absorberas av) vävnaden en tillräcklig mängd av materialet. För att undvika denna störning är omfattande sköljförfaranden införlivas i EIT protokollet. Om sköljning inte bort TA och TA stör MTT minskning, måste ytterligare kontroller användas för att detektera och korrigera för det. I korthet, vid misstanke direkt MTT minskning av testkemikalien vill säga 50 ^ (eller 50 mg för fasta ämnen) av kemikalien i fråga inkuberades under 3 timmar med arbets MTT-lösning på SCC (NC, 50 l sterilt avjoniserat vatten, bör vara körs samtidigt). Om MTT-lösning blir blå-lila, är testföremålet förmodas ha reducerat MTT. I detta fall bör utföras en funktionskontroll med hjälp av fryst dödade vävnads kontroller för att utvärdera om testmaterialet bindning till vävnaden och leder till en falsk MTT minskning signal. Om det finns märkbar MTT-minskning i TA-exponerad, dödade vävnadskontroll(i förhållande till mängden i den obehandlade viabla vävnaden), den genomsnittliga vävnads livskraft testföremålet måste korrigeras genom att subtrahera medelvärdet livskraft de avlivade kontrollen.
EIT felar på sidan av säkerhet, vilket framgår av den låga förekomsten av falska negativa klassificeringar 14,15,18. Viktigt ingen av GHS kategori 1-ämnen, som är frätande på ögat och som representerar den allvarligaste okulär fara, klassificerades som icke-irriterande i denna analys 14,15,18,19. Slutligen är en av de stora fördelarna med RHCE in vitro testmetod möjligheten att testa ren vätska och fasta material (vilket inte är möjligt med två-dimensionell, nedsänkta cellkulturer).
EIT kommer att bidra avsevärt för att bestämma okulär irritationspotentialen hos ett brett spektrum av material enligt FN: s GHS-klassificering och märkning. Utbyte av djur för att bestämma oCular toxicitet har varit ett mål för toxikologisk forskning i många år. EIT testmetoden har slutfört en formell valideringsstudie som stöds av EURL ECVAM 2014 och EpiOcular EIT genomfördes i OECD: s riktlinjer för test som OECD TG 492 år 2015.
Disclosures
Publiceringsersättningar för den här artikeln betalades av MatTek Corporation.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr John Harbell för hans vetenskapligt stöd och tid ägnas åt EIT projektet. Författarna vill också tacka Beiersdorf AG (Tyskland), IIVS (USA), Mary Kay Inc. (USA), Avon Products Inc. (USA), Procter & Gamble / Cosmital (Schweiz), Laboratoire Pierre Fabre (Frankrike), Harlan Laboratories (United Kingdom), och LVMH Parfym (Frankrike) för att delta i multicenter International Pre-och valideringsundersökningar av ögonirritation Test 15.
References
- National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). Request for Ocular Irritancy Test Data From Human, Rabbit, and In Vitro Studies Using Standardized Testing Methods. Federal Register. 72 (109), 31582-31583 (2007).
- Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC. OJ. L396 (49), European Commission. 1-849 (2006).
- Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). , Fifth revised edition, United Nations. New York and Geneva. (2013).
- Draize, J. H., Woodard, G., Calvery, H. O. Methods for the Study of Irritation and Toxicity of Substances Applied Topically to the Skin and Mucous Membranes. J Pharmacol Exp Ther November. 82, 377-390 (1944).
- Adriaens, E. Retrospective analysis of the Draize test for serious eye damage/eye irritation: importance of understanding the in vivo endpoints under UN GHS/EU CLP for the development and evaluation of in vitro test methods. Arch tox. 88, 701-723 (2014).
- Balls, M., Botham, P. A., Bruner, L. H., Spielmann, H. The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol in Vitro. 9, 871-929 (1995).
- Curren, R. D., Harbell, J. W. Ocular safety: a silent (in vitro) success story. Altern Lab Anim. 30, Suppl 2. 69-74 (2002).
- Wilhelmus, K. R. The Draize Eye Test. Survey of Ophthalmology. 45, 493-515 (2001).
- Curren, R. D., Harbell, J. W. In vitro alternatives for ocular irritation. Environ health persp. 106, 485-492 (1998).
- McCain, N. E., Binetti, R. R., Gettings, S. D., Jones, B. C. Assessment of ocular irritation ranges of market-leading cosmetic and personal-care products using an in vitro tissue equivalent. Toxicologist. 66, 243 (2002).
- Niranjan, P., Dang, A. H., January, B. G., Gomez, C., Harbell, J. W. Use of the EpiOcular assay for preclinical qualification of formulas for human clinical studies. Toxicologist. 96, 249 (2007).
- Yin, X. J. Prediction of ocular irritation potential of surfactants-based formulations at different concentrations using the EpiOcular model. Toxicologist. 108, 378 (2009).
- Harbell, J., Curren, R. In vitro methods for the prediction of ocular and dermal toxicity. Handbook of Toxicology. , 2nd Edition, Informa Healthcare. (2001).
- Kaluzhny, Y. Development of the EpiOcular(TM) eye irritation test for hazard identification and labelling of eye irritating chemicals in response to the requirements of the EU cosmetics directive and REACH legislation. Altern Lab Anim. 39, 339-364 (2011).
- Pfannenbecker, U. Cosmetics Europe Multi-Laboratory Pre-Validation of the EpiOcular Reconstituted Human Tissue Test Method for the Prediction of Eye Irritation. Toxicol in vitro. , (2013).
- MatTek Corporation. EpiOcular™ Eye Irritation Test (OCL-200-EIT) for the prediction of acute ocular irritation of chemicals for use with Reconstructed Human EpiOcular Model (OCL-200-EIT). Protocol#MK-24-007-0055. , MatTek Corporation. (2014).
- Kaluzhny, Y. EpiOcular Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification and Labeling of Eye Irritating Chemicals: Protocol Optimization for Solid Materials and Extended Shipment Times. Altern Lab Anim. 43 (2), 101-127 (2015).
- Kolle, S. N., Kandarova, H., Wareing, B., van Ravenzwaay, B., Landsiedel, R. In-house validation of the EpiOcular(TM) eye irritation test and its combination with the bovine corneal opacity and permeability test for the assessment of ocular irritation. Altern Lab Anim. 39, 365-387 (2011).
- Reconstructed Human Cornea-like Epithelium (RhCE) Test Method for Identifying Chemicals Not Requiring Classification and Labelling for Eye Irritation or Serious Eye Damage. Draft proposal for a new test guideline.. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. , (2014).
- Evaluating the ocular irritation potential of 54 test articles using the EpiOcular Human tissue Construct Model. Toxicol. In Vitro. Blazka, M. E., Harbell, J. 42nd Annual Meeting of the Soc. of Toxicology, Salt Lake City, UT, , (2003).
- Kandarova, H. The EpiDerm Test Protocol for the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests — An Assessment of the Performance of the Optimised Test. Altern Lab Anim. 33, 351-367 (2005).
