Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

Published: August 23, 2015 doi: 10.3791/52979
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1MatTek Corporation, 2MatTek In Vitro Life Science Laboratories

Summary

لقد قمنا بتطوير اختبار تهيج العين التي تستخدم نموذج الأنسجة ثلاثي الأبعاد أعيد بناؤها مثل القرنية الطلائية البشري (RHCE). الاختبار هو قادرا على التمييز بين توتر العين والمواد المسببة للتآكل (GHS فئات 1 و 2 معا) وتلك التي لا تتطلب وضع العلامات (GHS لا الفئة).

Abstract

ليتوافق مع التعديل السابع لقانون مستحضرات التجميل التوجيه والاتحاد الأوروبي REACH الاتحاد الأوروبي، وهناك حاجة إلى طرق بديلة غير حيوانية التحقق من صحة لتقييم موثوق ودقيق للسمية العين في الإنسان. لتلبية هذه الحاجة، قمنا بتطوير اختبار تهيج العين (EIT) الذي يستخدم الأبعاد أعيد بناؤها مثل القرنية الطلائية (RHCE) نموذج الأنسجة البشرية الثلاث التي تقوم على الخلايا البشرية العادية. وEIT غير قادرة على فصل المهيجات والمواد المسببة للتآكل العين (GHS فئات 1 و 2 معا) وتلك التي لا تتطلب وضع العلامات (GHS لا الفئة). اختبار يستخدم بروتوكولين منفصلين، أحدهما مصمم للمواد الكيميائية السائلة و، والبروتوكول الثاني مماثل لاختبار المواد الصلبة. يستخدم نموذج التنبؤ تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال فترة واحدة تعرض (30 دقيقة للسوائل، 6 ساعة للمواد الصلبة) وقابلية النسيج قطع واحد (60.0٪ كما يحددها فحص MTT). وبناء على نتائج 83 المواد الكيميائية (44 السوائل والمواد الصلبة 39) حقق EIT 95.5 / 68.2 / 81.8٪ والسناتورitivity / خصوصية ودقة (SS & A) للسوائل، 100.0 / 68.4 / 84.6٪ وSS & A للمواد الصلبة، و97.6 / 68.3 / 83.1٪ وعن العام SS & A. سوف EIT تسهم إسهاما كبيرا في تصنيف إمكانيات تهيج العين من مجموعة واسعة من المواد الكيميائية السائلة والصلبة من دون استخدام الحيوانات لتلبية متطلبات الاختبار التنظيمية. تم تنفيذ طريقة EpiOcular EIT في عام 2015 إلى المبادئ التوجيهية اختبار OECD كما TG 492.

Introduction

المنتجات الاستهلاكية مثل مستحضرات التجميل والمنظفات، والمنظفات المنزلية وتشمل مجموعة متنوعة من المواد الكيميائية التي يمكن أن تسبب أضرارا خطيرة إذا ما اتصل العينين. لذلك، لا بد من اختبار هذه العوامل لتهيج العين من قبل الهيئات التنظيمية الأمريكية والاتحاد الأوروبي لضمان سلامة المستهلك 1. تقييما لاحتمال تهيج العين من الخلطات والتركيبات هو أيضا شرط للامتثال REACH (التسجيل والتقييم والتفويض، وتقييد المواد الكيميائية) تشريع لوضع العلامات من مكونات مستحضرات التجميل تحت توجيه الاتحاد الأوروبي مستحضرات التجميل لنقل المواد الكيميائية، ولل وسم المبيدات الحشرية والمنتجات المنزلية 2. حاليا، تتطلب الهيئات التنظيمية تقييم المخاطر العين باستخدام النظام المنسق عالميا لتصنيف المواد الكيميائية ووسمها (GHS) 3. ويستند GHS أساسا على اختبار دريز تهيج العين، وتهيج العين الأكثر استخداما على نطاق واسع في فحص المواد التي الأجنبية وميليتم إدخال xtures مباشرة في كيس الملتحمة من العين أرنب 4. وفقا لتصنيف GHS، GHS الفئة 1 (المواد المسببة للتآكل العين) يشير لاختبار المواد الكيميائية التي تسبب الإصابة الأولية الشديدة للأنسجة العين أو أضرار خطيرة للعين والرؤية التي ليس عكسها تماما في غضون 21 يوما بعد التعرض 3،5. GHS الفئة 2 يشير إلى اختبار المواد الكيميائية التي تنتج تغييرات كبيرة في العين التي هي عكسها تماما في غضون 21 يوما من التعرض. ويشار إلى المواد الكيميائية الاختبار التي ليست المواد المسببة للتآكل أو المهيجات باسم GHS لا الفئة.

لأكثر من 40 عاما، وقد انتقد اختبار أرنب العين دريز لافتقارها للاستنساخ، المبالغة في تقدير ردود فعل الإنسان، واستخدام الحيوانات الحية 5-8. وقد شجعت هذه المخاوف العديد من المقترحات لتحسينها، والحد، واستبدال اختبار في الجسم الحي 9. وتعززت الحاجة إلى بدائل غير حيوانية المصادق مزيدقبل اعتماد التعديل السابع لتوجيه مستحضرات التجميل، والتي حظرت استخدام الحيوانات في تقييم سلامة منتجات التجميل (في عام 2005) والمكونات (في عام 2009) 2.

منذ عام 1996، وقد نموذج الأنسجة مثل القرنية أعيد استخدامها على نطاق واسع من قبل صناعة مستحضرات التجميل لتقييم إمكانات تهيج المواد الخام، ومستحضرات القائم السطحي، وتتفاقم الخلطات التي تم تصميمها للاستخدام في، أو في محيط، والعين 10-13. استخدام نموذج الأنسجة RHCE يسمح التطبيق الموضعي المباشر للمواد الاختبار على سطح الأنسجة في شكله مخفف الأصلي. وبهذه الطريقة، يمكن اختبار تركيبات قابلة للذوبان غير المياه دون تمييعها مع المذيبات. ردا على EURL ECVAM في (المركز الأوروبي مختبر الاتحاد الأوروبي المرجعي للتحقق من الطرق البديلة) طلب طريقة للتطبيق على نطاق واسع، واضحة، والاقتصادي وتهيج اختبار العين (EIT) الذي يستخدم سينغلوقد وضعت ه وقت التعرض وغير قادرة على فصل المهيجات العين والمواد المسببة للتآكل من المواد التي لا تتطلب وضع العلامات (الشكل 1) 14. وبناء على نتائج 83 المواد الكيميائية (44 السوائل و39 المواد الصلبة)، حقق EIT 95.5 / 68.2 / و 81.8٪ الحساسية / خصوصية ودقة (SS & A) للسوائل، 100.0 / 68.4 / و84،6٪ SS & A للمواد الصلبة، و97،6 / 68.3 / 83.1٪ وعن العام SS & A.

في عام 2007، ودراسة ما قبل المصادقة متعددة مختبر ترعاه مستحضرات التجميل أوروبا (COLIPA سابقا) تحت رعاية ECVAM EURL تقييم مدى ملاءمة وموثوقية EIT بهدف الوصول بها إلى المصادقة رسميا 15. في هذه الدراسة، تم تنفيذ 298 محاكمات مستقلة في سبعة مختبرات مستقلة. وأظهرت نتائج الدراسة اتفاق 99،7٪ في التنبؤ مع معاملات منخفضة من الاختلاف في جميع المختبرات المشاركة 15. ونتيجة لذلك، في عام 2010 دخل بروتوكول تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال لEURL ECVAM رسميةبرنامج التحقق من الصحة. استخدمت الدراسة التحقق من صحة 104 الكيماويات اختبار مشفرة، بما في ذلك المواد الفردية والخلائط الكيميائية، والتي كانت في الجسم الحي البيانات المرجعية (دريز البيانات تهيج العين) المتاحة. وبناء على نجاح هذا العمل، قدم مشروع اختبار OECD التوجيهي في عام 2014. ومن المتوقع أن EIT سوف تسهم إسهاما كبيرا في تصنيف احتمال تهيج العين من مجموعة واسعة من المواد وفقا لتصنيف ووسم منظومة الأمم المتحدة GHS.

Protocol

1. إعداد RHCE الأنسجة لعلاج - يوم 0

  1. وعند استلام هذا التجاري مثل القرنية الطلائية البشري (RHCE) عدة، تحقق من كل مكونات عدة لسلامة (لمزيد من التفاصيل طقم نرى الفحص عدة مكونات قياسي (الجدول 1) والمعدات والمواد المطلوبة لأداء الاختبار تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال (الجدول 2). وفي يوم استلام، تتوازن الأنسجة (في حاوية شحن 24 بئر لها) لRT لمدة 15 دقيقة.

كمية كاشف الظروف مصدر وصف تاريخ إنتهاء الصلاحية
1 مختومة 24 لوحة جيدا من الأنسجة EpiOcular
(OCL-200) 		2-8 ° C ماتيك يحتوي على 24 TISSUES الثقافة خلية إدراج، الحزمة على الاغاروز 72 ساعة
1 زجاجة،
200 مل 		EpiOcular الفحص المتوسطة
(OCL-200-ASY) 		2-8 ° C ماتيك المتوسطة DMEM مقرها 21 يوما
1 زجاجة،
100 مل 		الكالسيوم والمغنيسيوم ++ خالية Dulbecco's-PBS (DPBS) RT سيغما الدريتش، D5652، أو EQUIV. المضمضة إدراج 1 سنة
4 6-حسنا لوحات RT صقر تستخدم للحفاظ على الأنسجة خلال بروتوكول مقايسة NA
2 12-حسنا لوحات RT صقر استخدمت خلال بروتوكول مقايسة NA
2 24-حسنا لوحات RT صقر استخدامها لإجراء فحص MTT NA
1 قارورة،
0.5 مل 		خلات الميثيل
(CAS # 79-20-9) 		RT سيغما الدريتش،
القط # 186325 		تستخدم الكمبيوتر في مقايسة 1 شهر

الجدول 1: المكونات القياسية الفحص كيت.

<td> كما استخدم NC
معدات / مواد اللازمة ل:
حاضنة ترطيب (37 ± 1 ° C، 5 ± 1٪ CO 2، 90 ± 10٪ الرطوبة) الأنسجة احتضان قبل وأثناء المقايسات
غطاء تدفق الصفحي العمل الآمن تحت ظروف معقمة
مضخة فراغ (اختياري) الشفط حلول متوسطة و
لوحة قارئ مضواء (لوحات 96-جيدا) القراءة OD
لوحة شاكر استخراجأيون من formazan
عقيمة، ملقط ذو حدين كليلة التعامل مع إدراج الأنسجة
وقف الساعات توقيت تطبيق مواد الاختبار وخطوات موقوتة أخرى في البروتوكول
حمام الماء (37 ± 1 ° C) ارتفاع درجة حرارة سائل الإعلام والحل MTT
هاون ومدقة طحن المواد الصلبة الحبيبية
ماصة الإزاحة الإيجابية (50 ميكرولتر) تطبيق المواد وتعليق لزجة وشبه الصلبة
الماصات قابل للتعديل (200 ميكرولتر-2 مل) تطبيق المواد السائلة، فحص المتوسطة وMTT
نصائح ما قبل تعقيمها (200 ميكرولتر و 20 ميكرولتر)، Rainin القط # HR-200F-20F وHR (أو ما يعادلها) تطبيق المواد السائلة، فحص المتوسطة وMTT
نصائح فوهة واسعة تعقيمها قبل (250 ميكرولتر)، Rainin القط # HR-250WS (أو EQUIValent) تطبيق المواد وتعليق لزجة وشبه الصلبة
8 أوقية / 220 مل عينة حاويات، فالكون القط # 3540200 (أو ما يعادلها) الشطف الأنسجة
الحقن ذات الاستخدام الواحد العقيمة (على سبيل المثال 1 مل tuberkulin حقنة Omnifix-F، B. براون Melsungen AG، القط رقم 9161406V) تسليم 50 ~ المواد الصلبة ملغ (اختياري)
تيد بيلا الصغيرة ملعقة / ملعقة، تيد بيلا شركة، القط # 13504 (أو ما يعادلها، حادة ملعقة أو العظام كوريت، على سبيل المثال أيسكولاب، رقم: FK 623) تسليم 50 ~ المواد الصلبة ملغ
CA ++ والمغنيسيوم ++ الفوسفات مخزنة المالحة الحرة Dulbecco و(CA ++ مغ ++ الحرة DPBS): سيغما الدريتش، القط # D5652 (أو ما يعادلها) الأنسجة الشطف خلال فحص
معقم الماء منزوع الأيونات، زراعة الأنسجة الصف (جودة البيولوجية أو ما يعادلها)
96-جيدا لوحات مسطحة القاع، الصقر (أو ما يعادلها) لقراءة OD
مقايضة طرف القطن (عقيمة) لتجفيف سطح الأنسجة (اختياري)
شريط لاصق أو Parafilm تغطي لوحات أثناء استخراج formazan
MTT-100 طقم الفحص يحتوي MTT-Thiazolyl الأزرق نتروبلو بروميد كاشف (سيغما # M-5655) والأيسوبروبانول استخراج.

الجدول 2: والمعدات والمواد المطلوبة لأداء EIT.

  1. تحت ظروف معقمة، فتح كيس من البلاستيك يحتوي على 24 لوحة جيدا مع الأنسجة RHCE وإزالة الشاش المعقم. تفقد جميع أنسجة لفقاعات الهواء بين هلام الاغاروز وإدراج. لا تستخدم الثقافات مع فقاعات الهواء تحت غطاء إدراج> 50٪ من مساحة إدراج، الأنسجة التالفة، أو الأنسجة مبادرة الخوذ البيضاء الفصل تغطيها تماما مع السائل.
  2. تسمية 6 لوحات جيدا مع مادة الاختبار أو رموز التحكم والتعرض مرات. قسامة 1.0 مل من الفحص المتوسطة (المقدمة مع عدة)، قبل تحسنت إلى ما يقرب من 37 درجة مئوية، في الآبار لوحات وصفت قبل 6 جيدا.
  3. استخدام ملقط معقم لإزالة كل إدراج تحتوي على أنسجة RHCE ومكان إدراج في المسمى وحة 6 جيدا. خلال هذه الخطوة، وإزالة أي المتبقية الاغاروز الشحن التي تلتزم الاطراف الخارجية للإدراج من قبل النشاف لطيف على ورق الترشيح العقيمة. الإفراج عن أي فقاعات الهواء محاصرين تحت إدراج.
  4. قبل احتضان الأنسجة RHCE في 6 لوحات جيدا لظروف ثقافة القياسية (SCC، جو مرطب مع CO 2 5 ± 1٪ عند 37 ± 1 درجة مئوية) لمدة 1 ساعة.
  5. بعد 1 ساعة، يحل محل الفحص المتوسطة مع 1.0 مل من جديد الفحص متوسط ​​prewarmed إلى 37 درجة مئوية، واحتضان الأنسجة RHCE في ظروف SCC (بين عشية وضحاها = O / N) (16-24 ساعة).
. ove_title "> 2 المعالجة المسبقة - يوم 1

  1. بعد O / N الحضانة، وتطبيق 20 ميكرولتر من الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ خالية-Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS، المقدمة) باستخدام جهاز pipetting لالمناسب. إذا كان DPBS لا ينتشر عبر الأنسجة، اضغط بلطف إدراج على لوحة للتأكد من أن DPBS يبلل سطح النسيج كله.
  2. احتضان الأنسجة RHCE في SCC لمدة 30 ± 2 دقيقة.
    ملاحظة: هذه الخطوة غير ضرورية لترطيب الأنسجة وتحاكي في ظروف الجسم الحي.

3. اختبار المواد إجراءات التعرض

  1. تطبيق كل مادة الاختبار والضوابط لتكرار الأنسجة RHCE (ن = 2). إجراء اختبار المادة الجرعات هو مختلف عن السوائل والمواد الصلبة. تطبيق موضعيا 50 ميكرولتر من اختبار المواد السائلة باستخدام ماصة. الساعة التعرض للسوائل هو 30 دقيقة. تطبيق 50 ملغ من اختبار المواد الصلبة باستخدام ملعقة تعادل (معايرة لعقد 50 ملغ من كلوريد الصوديوم). السابقينالوقت posure للمواد الصلبة هو 6 ساعات.
    ملاحظة: يتم تعريفها على أنها مواد السوائل السوائل (مثل السوائل والمواد الهلامية، والكريمات) التي يمكن تطبيقها باستخدام جهاز pipetting ل. يتم تعريف المواد الصلبة باعتبارها مواد غير السائل (على سبيل المثال، مساحيق ومواد راتنجية أو شمعية) التي لا يمكن تطبيقها باستخدام ماصة.
    1. إذا كانت الحالة المادية للمواد الاختبار ليست سهلة لتحديد، ضع قارورة مع اختبار المادة في حمام مائي لمدة 15 دقيقة (37 ° C). اتبع بروتوكول تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال للسوائل لتلك المواد الاختبار التي تسيل في 37 ° C.
    2. استخدام ماصة الإزاحة الإيجابية للمواد اللزجة بشكل خاص.
  2. جرعة سيطرة سلبية والضوابط الإيجابية أولا ثم إعطاء جرعات من المواد الاختبار.
    1. تطبيق 50 ميكرولتر من سيطرة سلبية (NC) والسيطرة الايجابية (PC) إلى الأنسجة RHCE باستخدام ماصة القياسية. وNC هو غير المتأينة الماء المعقم. الكمبيوتر هو خلات الميثيل (CAS # 79-20-9). تطبيق NC وPC لمدة 30 دقيقة عند اختبارجي اختبار المواد السائلة وعن 6 ساعات عند اختبار اختبار المواد الصلبة.

4. اختبار المادة التعرض - يوم 1

  1. لعلاج اختبار المواد السائلة، اتبع جدول توقيت الواردة في الجدول 3. ترك 1 دقيقة فترات بين التطبيقات من كل مادة الاختبار لضمان التعرض المساواة لجميع الأنسجة.
    1. بعد 30 ± 2 دقيقة DPBS ما قبل المعالجة، وتطبيق موضعيا 50 ميكرولتر من NC والكمبيوتر، وكل اختبار المادة السائلة موضعيا على الأنسجة RHCE باستخدام جهاز pipetting لالمناسب.
    2. تطبيق 50 ميكرولتر من اختبار المادة السائلة مباشرة على الأنسجة لتغطية السطح العلوي. قطع نقطة ضيقة من طرف ماصة لتوسيع فتحة للالمواد اللزجة. لزجة جدا المواد، وتطبيق المادة اختبار لجهاز الجرعات (اسطوانة ترأسها مسطحة قطرها أقل بقليل من القطر الداخلي للإدراج الأنسجة أو الدبوس البلاستيك)، عكس الجرعات دevice وضعه على النسيج بحيث يصبح نص المادة اختبار بالتساوي الاتصالات سطح الأنسجة.
    3. إذا لا ينتشر اختبار المادة في جميع أنحاء الأنسجة، اضغط بلطف إدراج للتأكد من أنه ينتشر على سطح الأنسجة بأكمله. نشر الميكانيكية لاختبار المواد (على سبيل المثال، مع تلميح ماصة) لا ينصح لأنه قد يؤدي إلى تلف الأنسجة.
    4. احتضان الأنسجة في SCC لمدة 30 ± 2 دقيقة.
  2. لعلاج اختبار المواد الصلبة - يوم 1، اتبع جدول توقيت الواردة في الجدول 4 ترك 2 دقيقة فترات بين التطبيقات من كل مادة الاختبار لضمان التعرض المساواة لجميع الأنسجة.
    1. بعد 30 ± 2 دقيقة DPBS ما قبل المعالجة، وتطبيق 50 ميكرولتر من NC وPC موضعيا على الأنسجة RHCE باستخدام جهاز pipetting لالمناسب.
    2. لمتين تطبيق اختبار المادة، وإزالة إدراج (ن = 2) من البئر ووضعها على سطح معقم (على سبيل المثال، غطاء صباحاultiwell لوحة) لتجنب مادة الاختبار يصب في المتوسط.
    3. باستخدام ملعقة عادل، وتطبيق موضعيا حوالي 50 ملغ من مادة الاختبار على سطح الأنسجة. تأكد من أن سطح الأنسجة مغطاة بالكامل من قبل مادة الاختبار. إذا لم نشر المقال الاختبار عبر الأنسجة، ويهز إدراج بلطف من جانب إلى آخر للتأكد من أن الأنسجة يتم تغطيتها بالكامل من قبل مادة الاختبار. نشر الميكانيكية لاختبار المواد (على سبيل المثال، مع تلميح ماصة) لا ينصح لأنه قد يؤدي إلى تلف الأنسجة.
      1. إذا لزم الأمر، وطحن المساحيق البلورية مع هاون ومدقة لضمان اتصال أفضل بين المادة الاختبار والأنسجة.
      2. بدلا من ذلك، قطع مساحيق مكان مباشرة على زراعة الأنسجة داخل إدراج باستخدام حقنة 1 مل مع رئيسها خارج. مساحيق الاشياء في حقنة عندما يتم سحب المكبس إلى الخلف ومن ثم تطبيق عن طريق الضغط على المكبس إلى أسفل.
      3. إذا كان الجدار الخارجي للإدراج هو contaminated على سبيل المثال، من خلال مساحيق، ومسح الجزيئات قبالة مع شاش معقم.
    4. بعد الجرعات، وعودة الأنسجة إلى 6 لوحات جيدا يحتوي على مستنبت ويحضن في SCC لمدة 6 ساعات ± 15 دقيقة.

5. شطف

  1. إعداد مجموعة من ثلاثة أكواب نظيفة (150 مل القدرات) في اختبار المادة وملء كل واحد منهم مع 100 مل من DPBS. لكل مادة الاختبار، واستخدام مجموعة مختلفة من ثلاثة أكواب.
  2. في نهاية دقيقة تعرض 30 ± 2 للمواد السائلة أو 6 ساعة 15 دقيقة ± التعرض للمواد الصلبة، وإزالة والتخلص من جهاز الجرعات إذا تم استخدامه.
  3. رفع إدراج تحتوي على أنسجة RHCE من المتوسطة من خلال استيعاب الحافة العلوية من 'طوق "من البلاستيك مع ملقط غرامة. استخدام ملقط منحنية لتسهيل التعامل والصب. شطف الأنسجة اثنين في وقت واحد عن طريق الضغط على إدراج مكررة معا الياقات الخاصة بهم باستخدام ملقط. كن حذرا نبعد التمديد لتلف الأنسجة مع ملقط.
  4. صب اختبار المواد أو التحكم من سطح الأنسجة على مادة ماصة نظيفة (منشفة ورقية، والشاش، الخ)
  5. تراجع تدرج في الكأس الأول من DPBS، دوامة في حركة دائرية في DPBS لحوالي 2 ثانية، ورفع إدراج بحيث تمتلئ في الغالب هم مع DPBS، وصب السائل مرة أخرى في الكأس. كرر هذه العملية ثلاث مرات في الكأس الأول.
  6. شطف إدراج في الأكواب الثاني والثالث من كل DPBS ثلاث مرات بنفس الطريقة.
  7. صب أي السائل المتبقي في إدراج على مادة ماصة. تدوير إدراج لالتقريبية بزاوية 45 درجة (نهاية مفتوحة لأسفل) وتلمس الشفة العليا إلى مادة ماصة.
    ملاحظة: إذا لم يكن من الممكن إزالة جميع المواد اختبار مرئية، لا مزيد من الشطف ينبغي القيام به لتجنب تلف الأنسجة بسبب التعامل المفرط.

6. بعد نقع

  1. بعد الشطف،تزج فورا الأنسجة في 5 مل من الفحص متوسط ​​درجة حرارة سابقا لRT في لوحة 12-جيدا وصفت مسبقا.
  2. احتضان الأنسجة لمدة 12 ± 2 دقيقة للمواد السائلة أو 25 ± 2 دقيقة للمواد الصلبة مغمورة في RT لتسهيل إزالة أي اختبار المادة المتبقية.

7. ما بعد الحضانة

  1. في نهاية مرحلة ما بعد نقع فترة الغمر، صب الفحص المتوسطة من الأنسجة وصمة عار على إدراج على مادة ماصة.
  2. نقل إدراج في لوحة 6 جيدا وصفت مسبقا تحتوي على 1 مل باب الحارة الفحص المتوسطة.
    1. احتضان الأنسجة لمدة 120 ± 15 دقيقة في SCC للمواد اختبار السائل.
    2. احتضان الأنسجة لمدة 18 ± 0.25 ساعة على SCC لمواد الاختبار الصلبة.

8. MTT قابلية الفحص - يوم 1 (بروتوكول للسوائل) ويوم 2 (بروتوكول المواد الصلبة)

  1. إجراء فحص MTT بعد ما بعد الحضانة من 12077؛ 15 دقيقة للسوائل و 18 ± 0.25 ساعة للمواد الصلبة، على التوالي.
  2. إعداد 1.0 ملغ / مل MTT حل وقسامة 0.3 مل من محلول في كل بئر من 24 لوحة جيدا وصفت مسبقا.
    1. استخدام عدة MTT التجارية (جدول رقم 5):
    2. 2 ساعة قبل الاستخدام، وذوبان الجليد والتركيز MTT في RT. الجمع بين 2 مل من التركيز MTT و 8 مل من مخفف MTT لإنتاج 1.0 ملغ / مل من محلول MTT.
    3. تخزين الحل MTT في 4 درجات مئوية في الظلام حتى الاستخدام. لا تخزن الحل MTT لأكثر من 1 في اليوم.
  3. في نهاية الموضوع الحضانة، وإزالة كل إدراج من لوحة 6 جيدا وصمة عار بلطف على مادة ماصة.
  4. ضع تدرج في لوحة 24-جيدا تحتوي على 0.3 مل من محلول MTT. الإفراج عن أي فقاعات الهواء محاصرين تحت إدراج. احتضان لوحة لمدة 180 ± 10 دقيقة في SCC.
  5. استخراج MTT
    1. بعد 180 ± 10 دقيقة حضانة في حل MTT، وإزالة كل إدراجمن 24 لوحة جيدا وصمة عار في الجزء السفلي من إدراج على مادة ماصة.
    2. من غير تلوين اختبار السائل المواد (استخراج المغمورة): نقل إدراج الى 24 لوحة جيدا وصفت مسبقا تحتوي على 2.0 مل من محلول مستخلصة (الأيسوبروبانول) بحيث يغطس إدراج.
    3. بالنسبة للمواد الصلبة والملونات السائلة (غير غمرت استخراج لتجنب التلوث من الحل مستخلصة): نقل إدراج في لوحة 6 جيدا وصفت مسبقا تحتوي على 1.0 مل من محلول مستخلصة (الأيسوبروبانول) بحيث لا يغرق إدراج.
      ملاحظة: إجراء استخراج نفسه غير المغمورة لضوابط السلبية والإيجابية المقابلة.
  6. ختم لوحات (على سبيل المثال، مع parafilm بين غطاء لوحة والحافة العليا من الآبار أو مع لوحة سداده القياسية). وضع لوحات على لوحة شاكر المداري ويهز لمدة 2-3 ساعة على RT لاستخراج MTT.
    1. بدلا من ذلك، نفذ استخراج O / N في 2-876؛ C في الظلام دون أن تهتز.
  7. من غير تلوين اختبار السائل المواد (استخراج المغمورة): في نهاية فترة الاستخراج، صب السائل من كل إدراج مرة أخرى إلى البئر وتجاهل إدراج مع الأنسجة RHCE.
    1. مزيج الحل استخراج ونقل اثنان 200 مكل في الآبار الملائمة لوصفت قبل وحة 96-جيدا وفقا لتكوين لوحة (الشكل 2).
  8. بالنسبة للمواد الصلبة والسائلة تلوينات (الاستخراج غير المغمورة): في نهاية فترة الاستخراج، والتخلص من الأنسجة (تأكد من عدم اختراق الأنسجة).
    1. إضافة 1.0 مل من محلول مستخلصة في كل بئر من لوحة 24 كذلك يحتوي الحل المستخرجة من الأنسجة. مزيج الحل مستخلصة ونقل اثنان 200 مكل في الآبار الملائمة لوحة 96-جيدا وصفت مسبقا وفقا لتكوين لوحة (الشكل 2).
  9. تحديد رانه الكثافة الضوئية (OD) من العينات المستخرجة عند طول موجي واحد بين 550 و 590 نانومتر (يجب أن تكون متسقة داخل مختبر) على قارئ لوحة أو معمل.
    1. في حالة حلول استخراج العكرة التي تسببها المواد الصلبة غير القابلة للذوبان، الطرد المركزي الحلول السابقة لقياس OD (تهدئة الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية لتجنب التبخر). في حالة الشطف لا يزيل المادة اختبار (TA) وTA يتداخل مع خفض MTT، يجب استخدام عناصر تحكم إضافية. يرجى الرجوع إلى SOP مفصل لتصحيح MTT تخفيض 16.
    2. في حال أظهرت TA لديك، أو لوضع اللون الذي يمكن أن تتفاعل مع قياس MTT، يجب إجراء اختبار إضافي لتحديد مقدار اللون متجهة ل، وانتزعت في وقت لاحق من الأنسجة. يرجى الرجوع إلى SOP مفصل لتصحيح الملونة اختبار المواد (16).

9. الحسابات لاختبار قابلية الأنسجة (الجدول 6 والشكل 3) & #160؛

  1. الحسابات العامة
    1. حساب قيمة التطوير التنظيمي يعني من آبار المراقبة فارغة (OD بلوك) لكل تجربة.
    2. طرح OD بلوك من كل قيمة OD من نفس التجربة (بلوك تصحيح البيانات).
    3. حساب القيمة المتوسطة للقسامات اثنين لكل الأنسجة (OD = تصحيح).
  2. حساب الجدوى في المئة من كل اثنين من الأنسجة تكرار لمراقبة واختبار المادة كل نسبة إلى متوسط ​​مراقبة سلبية (مراقبة 100٪).
    الجدوى (٪) = [تصحيح OD الأنسجة المعالجة / OD تصحيح سيطرة سلبية] × 100٪
  3. حساب الفرق للبقاء (الفرق بين بقاء الأنسجة مكرر).
  4. حساب متوسط ​​الجدوى اختبار المادة (TA الجدوى) وتصنيف المادة الاختبار وفقا للنموذج التنبؤ.

10. التنبؤ نموذج (الشكل 3)

  1. إذا كان بقاء الأنسجة TA المعاملة هي> 60.0 نسبة إلى NC المعاملة الأنسجة الخامسiability، تسمية المادة اختبار كما غير مهيجة (NI) (GHS لا الفئة).
  2. إذا كان بقاء الأنسجة TA المعاملة هي ≤ 60.0 بالنسبة لبقاء الأنسجة NC المعاملة، تسمية المادة الاختبار كما مهيجة (I) (GHS فئات 1 و 2).
    ملاحظة: تعتبر نتائج الاختبار تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال مؤهلة إذا:
    • وOD EIT NC> 0.8 و <2.5؛
    • الجدوى الأنسجة EIT PC (٪، نسبة إلى NC) هي ≤50.0٪.
    • الفرق بين الأنسجة تكرار (NC، PC، واختبار المادة) هو <20.0٪.

Representative Results

وتعرض النتائج تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقالية تمثيلية أجريت مع 10 اختبار المواد (TA) والضوابط السلبية والإيجابية في الجدول رقم 6 والشكل 3. ويعني OD = 1.31 لNC يتوافق مع 100٪ بقاء الأنسجة، وبالتالي فإن PC (يعني OD = 0.41) وكان سلامة الأنسجة النسبية 31.2٪. عندما تم تنفيذ بروتوكول تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال في 15 تجارب مستقلة صالحة في 7 مختبرات باستخدام بروتوكول التعرض السائل و8 التجارب صالحة مستقلة في 4 مختبرات، وذلك باستخدام بروتوكول التعرض الصلبة، كان متوسط ​​بقاء الأنسجة للكمبيوتر باستخدام بروتوكول السائل 36.4 ± 4.0 ٪ و 32.3 ± 6.4٪ لبروتوكول المواد الصلبة. في جميع الحالات، وكانت النتائج إيجابية السيطرة دون قطع قيمة 60.0٪ 15.

كما هو مبين في الشكل (3)، TA1، TA2، TA4، TA7، وكان TA8 viabilities الأنسجة> 60.0٪، وبالتالي تم تصنيفها على أنها "NI". TA3، TA5، TA6، كان TA9، وTA10 viabilities الأنسجة X04، 60.0٪، وبالتالي تم تصنيفها على أنها "I". كان الفارق الجدوى الأنسجة بين أنسجة مكررة <20.0٪ لجميع المشرفون الدوليون مع استثناء من TA2. ولذلك، النتائج لجميع المواد اختبار، مع استثناء من TA2، واعتبرت "مؤهل" لأنها استوفت جميع معايير القبول تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال (القسم 10.2). بسبب التباين الشديد بين أنسجة مكررة لTA2 في التجربة الأولى، وكانت التجربة الثانية اللازمة للحصول على نتائج تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال المؤهلة.

تم استخدام أسلوب اختبار تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال كما هو موضح هنا باستخدام نموذج الأنسجة RHCE لتقييم تهيج العين في العديد من الدراسات التحقق من صحة multilaboratory، بما في ذلك التحقق رسميا من قبل EURL ECVAM / مستحضرات أوروبا 15،17-19. في كل الدراسات، تبين أن EIT أن تكون قابلة للتكرار وكان قادرا على تحديد المواد الكيميائية (سواء المواد والخلطات) لا تتطلب تصنيف ووسم لتهيج العين أو خطيرة الأضرار التي تصيب العين ميلان بشكل صحيححبال إلى الأمم المتحدة GHS 15،17-19. الوفاء طريقة الاختبار تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال معايير القبول من فريق الإدارة التحقق (VMG) لتهيج العين الحساسية والنوعية، والدقة الشاملة ويتداول حاليا في انتظار التنفيذ رسميا كبديل جزئي للفي الجسم الحي الأرنب دريز اختبار 19.

الشكل 1
الشكل 1: مخطط بروتوكول تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال لالسائلة والصلبة اختبار المواد المختصرات المستخدمة: AM، فحص المتوسطة؛ SCC، وظروف ثقافة القياسية؛ PBS، Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة. RT، درجة حرارة الغرفة.

الرقم 2
الشكل 2: وموحد 96-جيدا تكوين لوحة لاختبار MTT الجدوى الأنسجة اثنين 200 مكل هي هيئة تنظيم الاتصالات nsferred إلى الآبار المناسبة من لوحة وصفت قبل 96 جيدا. الاختصارات المستخدمة: NC، سيطرة سلبية. PC، مراقبة إيجابية. TA1-TA20، اختبار المواد 1-20. فارغة، حل مستخلصة. 96- يستخدم تكوين لوحة MTT مع جداول البيانات إكسل مصممة لحساب RHCE الجدوى الأنسجة ونتائج تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال.

الشكل (3)
الرقم 3: نتائج الاقتصادات الانتقالية التي تم الحصول عليها للمواد 10 اختبار، NC والضوابط PC باستخدام نموذج الأنسجة RHCE يتم إنشاء الرسم البياني من جدول بيانات Excel مصممة لتقديم نتائج تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال. يتم تصنيف المواد الكيميائية الاختبار الذي خفض قابلية الأنسجة ≤ 60.0٪ مقارنة NC كما المهيجات ("I"، TA3، TA5، TA6، TA9، وTA10) والمواد الكيميائية الاختبار الذي كان بقاء الأنسجة> تصنف 60.0٪ أنها غير مهيجات (" NI "، TA1، TA2، TA4، TA7، وTA8).

نانوغرام = "0">
وقت البدء للخطوات عمل بروتوكول EIT (عمل يوم واحد لمشغل واحد)
كل سطر يتوافق مع زوج واحد من الأنسجة
ترتيب الخطوات التالية: 1 2 3 4 5 6 7
السوائل: PBS TA
تعرض 		مرحلة ما بعد
نقع 		مرحلة ما بعد MTT
رد فعل 		MTT
استخلاص 		التدبير
30 دقيقة 30 دقيقة 12 دقيقة 120 دقيقة 180 دقيقة 120 دقيقة OD
NC 09:00 09:30 10:00 10:12 00:12 15:12 بعد
PC 09:01 09:31 10:01 10:13 00:13 15:13 17:30
TA-1 09:02 09:32 10:02 10:14 00:14 15:14
TA-2 </ قوي> 09:03 09:33 10:03 10:15 00:15 15:15
TA-3 09:04 09:34 10:04 10:16 00:16 15:16
TA-4 09:05 09:35 10:05 10:17 00:17 15:17
TA-5 09:06 09:36 10:06 10:18 00:18 15:18
TA-6 09:07 09:37 10:07 10:19 00:19 15:19
TA-7 09:08 09:38 10:08 10:20 00:20 15:20
نانوغرام> TA-8 09:09 09:39 10:09 10:21 00:21 15:21
TA-9 09:10 09:40 10:10 10:22 00:22 15:22
TA-10 09:11 09:41 10:11 10:23 00:23 15:23

الجدول 3: الجدول الزمني عينة لاختبار اختبار المواد السائلة خطوات بروتوكول بما في ذلك ما قبل ترطيب الأنسجة مع DPBS، تطبيق اختبار المواد (TAS)، الشطف وبعد نقع، فترة ما بعد الحضانة، MTT الفحص، استخراج MTT، ويتم عرض قياس MTT OD في الأعمدة. ويتم تنظيم الأوقات لأنسجة مكررة في الصفوف. كامل اختبار فحص 10 المشرفون الدوليون وضوابط يمكن أن تنتهي في يوم واحد.

e_content ">

وقت البدء للخطوات بروتوكول تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال (2 أيام عمل للمشغل واحد)
كل سطر يتوافق مع زوج واحد من الأنسجة
اليوم 1 يوم 2 (اليوم التالي)
ترتيب الخطوات التالية: 1 2 3 4 5 6 7
المواد الصلبة: PBS TA
تعرض 		مرحلة ما بعد
نقع 		مرحلة ما بعد
Incubaction 		MTT
رد فعل 		MTT
استخلاص 		التدبير
30 دقيقة 6 ساعة 26 دقيقة 18 ساعة 180 دقيقة 120 دقيقة OD
NC 09:00 09:30 15:30 15:56 09:56 00:56 بعد
PC 09:02 09:32 15:32 15:58 09:58 00:58 15:30
TA-1 09:04 09:34 15:34 16:00 10:00 13:00
TA-2 09:06 09:36 15:36 16:02 10:02 13:02
TA-3 09:08 09:38 15:38 16:04 10:04 13:04
TA-4 09:10 09:40 15:40 16:06 10:06 13:06
TA-5 09:12 09:42 15:42 16:08 10:08 </ td> 13:08
TA-6 09:14 09:44 15:44 16:10 10:10 13:10
TA-7 09:16 09:46 15:46 16:12 10:12 13:12
TA-8 09:18 09:48 15:48 16:14 10:14 13:14
TA-9 09:20 09:50 15:50 16:16 10:16 13:16
TA-10 09:22 09:52 15:52 16:18 10:18 13:18

الجدول 4: الجدول الزمني عينة لاختبار اختبار المواد الصلبة. خطوات بروتوكول بما في ذلك الأنسجة مع DPBS، تطبيق اختبار المواد، والشطف وبعد نقع، فترة ما بعد الحضانة، وفحص MTT، استخراج MTT، ويتم عرض قياس MTT OD في الأعمدة ترطيب مسبقا. ويتم تنظيم الأوقات لأنسجة مكررة في الصفوف. يتم إجراء فحص كامل اختبار 10 المشرفون الدوليون والضوابط على مدى يومين.

كمية كاشف شروط التخزين مصدر وصف تاريخ إنتهاء الصلاحية
1 قارورة،
2 مل 		MTT التركيز (MTT-100-CON) محمية من الضوء (-20ºC) ماتيك المجمدة MTT التركيز 2 أشهر
1 قارورة،
8 مل 		MTT مخفف 2-8 و# 186؛ C ماتيك لتمييع التركيز MTT قبل استخدامها في فحص MTT 2 أشهر
1 زجاجة،
60 مل 		الأيسوبروبانول
(CAS # 67-63-0) 		RT سيغما الدريتش حل مستخلصة NA

الجدول 5: MTT-100 الفحص مكونات عدة.

كود N ° الأنسجة البيانات الأولية البيانات المصححة فارغة يعني من OD ٪ من الجدوى
ن عليق. 1 عليق. 2 عليق. 1 عليق. 2
NC 1 1،316 1،352 1،316 1،352 1،334 101.6
2 1،277 1،309 1،277 1،309 1،293 98.4
PC 1 0،379 0،397 0،379 0،397 0،388 29.6
2 0،419 0،442 0،419 0،442 0،431 32.8
TA1 1 1،213 1،244 1،213 1،244 1،229 93.5
2 1،355 1،355 1،355 1،355 1،355 103.2
TA2 1 1.210 1،122 1.210 1،122 1،166 88.7
2 0،828 0،837 0،828 0،837 0،833 63.4
TA3 1 0،167 0،168 0،167 0،168 0،167 12.7
2 0.138 0.136 0.138 0.136 0،137 10.4
TA4 1 1،137 1.160 1،137 1.160 1،149 87.4
2 1،262 1،191 1،262 1،191 1،227 93.4
TA5 1 0.610 0،621 0.610 0،621 0،616 46.9
2 0.480 0،484 0.480 0،484 0،482 36.7
TA6 1 0،502 0،513 0،502 0،513 0،508 38.7
2 0،396 0،407 0،396 0،407 0،402 30.6
TA7 1 1،048 1.050 1،048 1.050 1،049 79.9
2 1،149 1.150 1،149 1.150 1.150 87.5
TA8 1 1،032 1،034 1،032 1،034 1،033 78.7
2 0،941 0،935 0،941 0،935 0.938 71.4
TA9 1 0،022 0،022 0،022 0،022 0،022 1.7
2 0،144 0،149 0،144 0،149 0،147 11.2
TA10 1 0.150 0.150 0.150 0.150 0.150 11.4
2 0،254 0،255 0،254 0،255 0،255 19.4
تعني ضيف. يعني من ضيف. ضيف. / 2 تصنيف
من OD من OD viabilities [٪] من viabilities
NC 1،314 0،041 100.0 3.12 1.56 NI تأهل
PC 0.410 0،043 31.2 3.23 1.62 أنا تأهل
TA1 1،292 0،127 98.3 9.63 4.81 NI تأهل
TA2 0.999 0،333 76.1 25.36 12.68 NI D> 20
TA3 0،152 0.030 11.6 2.32 1.16 أنا تأهل
TA4 1،188 0،078 90.4 5.94 2.97 NI تأهل
TA5 0،549 0،134 41.8 10.16 5.08 أنا تأهل
TA6 0،455 0،106 34.6 8.07 4.03 أنا تأهل
TA7 1،100 0،101 83.7 7.65 3.82 NI تأهل
TA8 0،986 0،095 75.0 7.23 3.62 NI تأهل
TA9 0.085 0.125 6.4 9.48 4.74 أنا تأهل
TA10 0،203 0،105 15.4 7.95 3.98 أنا تأهل

الجدول 6: النتائج التي تم الحصول عليها الاقتصادات الانتقالية لمدة 10 اختبار المواد، NC وPC الضوابط والجداول همزuced بواسطة جداول البيانات إكسل مصممة لحساب الجدوى الأنسجة ونتائج تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال. يتم تصنيف المواد الكيميائية الاختبار الذي خفض قابلية الأنسجة ≤ 60.0٪ مقارنة NC كما المهيجات ("I"، TA3، TA5، TA6، TA9، وTA10) والمواد الكيميائية اختبار قابلية الأنسجة> تصنف 60.0٪ أنها غير المهيجات التي كان (" NI "، TA1، TA2، TA4، TA7، وTA8).

Discussion

لقد قدم تهيج اختبار العين (الشكل 1) التي وضعت لنموذج الأنسجة EpiOcular. وEIT غير قادرة على فصل المهيجات والمواد المسببة للتآكل العين (GHS فئات 1 و 2 معا) من المواد التي لا تتطلب وضع العلامات (GHS لا الفئة) مع درجة عالية من الحساسية والنوعية 17. وEIT كما وردت في هذه الوثيقة لا تميز بين GHS الفئة 1 من الفئة 2 الكيميائية. تم التحقق من صحة EIT لتصنيف ووضع العلامات على احتمال تهيج العين من مجموعة واسعة من المواد الكيميائية، بما في ذلك مستحضرات التجميل والأدوية المكونات. بالتزامن مع الآخر في اختبارات المختبر، فإن EIT بمثابة بديل للفي الجسم الحي الأرنب العين اختبار تهيج.

يستخدم EIT بروتوكولين مماثلة ولكن متميزة للمواد السائلة والصلبة، والتي تختلف في طول التعرض وفترات الحضانة بعد التعرض لل(الشكل 1). نقطة النهاية المستخدمة في EITهي حيوية الأنسجة، والتي تحددها فحص MTT، والتي تم استخدامها سابقا في التحقق من صحة نماذج الأنسجة الظهارية الإنسان 20،21. لإجراء هذا الاختبار، ليس هناك حاجة إلى معدات خاصة بالإضافة إلى المعدات القياسية ثقافة الخلية. نظرا لمستوى عال من الأنسجة إلى أنسجة استنساخ، ن = 2 الأنسجة بدلا من عادة يوصى ن = تستخدم 3. القدرة على استخدام ن = 2 الأنسجة هو الجانب الحاسم من البروتوكول، لأنه يسمح للعامل من ذوي الخبرة لمعالجة اثنين من الأنسجة في وقت واحد، وبالتالي التقليل من تقلب الفحص التي يمكن أن تنشأ بسبب التعامل مختلفة من الأنسجة الفردية 14. أيضا، باستخدام ن = 2 الأنسجة في اختبار المادة، وتهيج من 10 مواد الاختبار من نفس الحالة الفيزيائية (سائلة أو صلبة)، جنبا إلى جنب مع الضوابط الإيجابية والسلبية، يمكن تقييمها باستخدام مجموعة واحدة (24 الأنسجة).

النقاط الرئيسية الأخرى التي تضمن تصنيف موثوق بها من مواد هي المواصفات لمراقبة إيجابية سوbstance (قابلية الأنسجة ≤50.0٪)، واستنساخ بين أنسجة مكررة (الفرق <20.0٪)، ومراقبة سلبية قراءات OD (> 0.8 و <2.5).

عند إجراء اختبار تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال، من المهم أن تلتزم بروتوكول التحقق من صحة والجرعات المقترحة والشطف جداول (الجداول 3 و 4)، لأن الانحراف عن بروتوكول أو تغييرات في فترات الحضانة قد يؤدي إلى نتائج غيرت. وبالمثل، فإن الانحرافات من الوقت 3 ساعات لMTT الحضانة يؤدي إلى قراءات مختلفة MTT ويمكن أن تؤثر نتيجة الفحص.

في بعض الأحيان، قد يكون مادة كيميائية اختبار الخصائص البصرية أو غيرها التي قد تتداخل مع الأنسجة MTT جدوى فحص أو سبب خفض MTT. على سبيل المثال، وهي مادة كيميائية اختبار قد يقلل بشكل مباشر MTT إلى الأزرق الأرجواني ناتج التفاعل، أو قد يكون عبارة عن مادة الملونة التي تمتص الضوء في نفس النطاق كما MTT formazan (~ 570 نانومتر). ومع ذلك، فإن هذه المواد الكيميائية اختبار العلاقات العامةESENT مشكلة فقط، إذا كان في ذلك الوقت من فحص MTT، كمية كافية من المواد لا تزال موجودة على (أو استيعابها من قبل) الأنسجة. لتجنب هذا التدخل، تدرج الإجراءات الشطف واسعة في بروتوكول تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال. إذا الشطف لا يزيل TA TA ويتداخل مع خفض MTT، يجب استخدام عناصر تحكم إضافية للكشف عن وصحيحة لذلك. باختصار، إذا كان يشتبه خفض MTT المباشر للمادة الكيميائية الاختبار، 50 ميكرولتر (أو 50 ملغ المواد الصلبة) من هذه المادة الكيميائية في السؤال هو المحتضنة لمدة 3 ساعات مع العمل الحل MTT في SCC (NC، 50 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات معقمة، يجب أن يكون تشغيل في نفس الوقت). إذا كان هذا الحل MTT إلى اللون الأزرق الأرجواني، يفترض المقال اختبار لقد قلل من MTT. في هذه الحالة فحص وظيفي باستخدام عناصر تحكم الأنسجة قتل تجميد ينبغي إجراء تقييم ما إذا كانت مادة الاختبار ملزما للأنسجة ويؤدي إلى تخفيض كاذبة إشارة MTT. إذا كان هناك انخفاض ملموس في MTT، ومراقبة الأنسجة TA مكشوفة قتل(نسبة لكمية في أنسجة قابلة للحياة غير المعالجة)، لا بد من تصحيح يعني بقاء الأنسجة من هذه المادة الاختبار عن طريق طرح الجدوى المتوسطة للسيطرة قتل.

وEIT يخطئ على جانب السلامة، كما يدل على ذلك حدوث انخفاض التصنيفات السلبية الكاذبة 14،15،18. الأهم من ذلك، أيا من المواد الكيميائية GHS الفئة 1، والتي هي تآكل للعين والتي تمثل الخطر العين الأكثر خطورة، تم تصنيفها على أنها غير مزعجة في هذا الاختبار 14،15،18،19. وأخيرا، واحدة من المزايا الرئيسية للRHCE في طريقة الاختبار في المختبر هو إمكانية اختبار السائل أنيق والمواد الصلبة (وهو أمر غير ممكن مع ثنائي الأبعاد، مزارع الخلايا المغمورة).

سوف EIT تسهم إسهاما كبيرا في تحديد احتمال تهيج العين من مجموعة واسعة من المواد وفقا لتصنيف ووسم منظومة الأمم المتحدة GHS. استبدال الحيوانات لتحديد سوكانت دائرية سمية هدف البحث السمية لسنوات عديدة. طريقة الاختبار تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال أكملت دراسة المصادقة الرسمية المعتمدة من قبل EURL ECVAM في عام 2014 ونفذ EpiOcular EIT في المبادئ التوجيهية اختبار OECD كما OECD TG 492 في عام 2015.

Disclosures

تم دفع رسوم النشر لهذه المادة من قبل شركة ماتيك.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور جون Harbell لدعمه العلمي والوقت المخصص للمشروع تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال. أيضا فإن الكتاب أود أن أشكر بيرسدورف AG (ألمانيا)، IIVS (الولايات المتحدة الأمريكية)، ماري كاي شركة (الولايات المتحدة)، آفون منتجات شركة (الولايات المتحدة الأمريكية)، وبروكتر أند غامبل / Cosmital (سويسرا)، مختبر بيار فابر (فرنسا)، مختبرات هارلان (المملكة المتحدة)، وLVMH برفوم (فرنسا) للمشاركة في موضوع الوسط الدولي قبل التحقق والتحقق دراسات عن تجارب تهيج العين 15.

References

  1. National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). Request for Ocular Irritancy Test Data From Human, Rabbit, and In Vitro Studies Using Standardized Testing Methods. Federal Register. 72 (109), 31582-31583 (2007).
  2. Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC. OJ. L396 (49), European Commission. 1-849 (2006).
  3. Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). , Fifth revised edition, United Nations. New York and Geneva. (2013).
  4. Draize, J. H., Woodard, G., Calvery, H. O. Methods for the Study of Irritation and Toxicity of Substances Applied Topically to the Skin and Mucous Membranes. J Pharmacol Exp Ther November. 82, 377-390 (1944).
  5. Adriaens, E. Retrospective analysis of the Draize test for serious eye damage/eye irritation: importance of understanding the in vivo endpoints under UN GHS/EU CLP for the development and evaluation of in vitro test methods. Arch tox. 88, 701-723 (2014).
  6. Balls, M., Botham, P. A., Bruner, L. H., Spielmann, H. The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol in Vitro. 9, 871-929 (1995).
  7. Curren, R. D., Harbell, J. W. Ocular safety: a silent (in vitro) success story. Altern Lab Anim. 30, Suppl 2. 69-74 (2002).
  8. Wilhelmus, K. R. The Draize Eye Test. Survey of Ophthalmology. 45, 493-515 (2001).
  9. Curren, R. D., Harbell, J. W. In vitro alternatives for ocular irritation. Environ health persp. 106, 485-492 (1998).
  10. McCain, N. E., Binetti, R. R., Gettings, S. D., Jones, B. C. Assessment of ocular irritation ranges of market-leading cosmetic and personal-care products using an in vitro tissue equivalent. Toxicologist. 66, 243 (2002).
  11. Niranjan, P., Dang, A. H., January, B. G., Gomez, C., Harbell, J. W. Use of the EpiOcular assay for preclinical qualification of formulas for human clinical studies. Toxicologist. 96, 249 (2007).
  12. Yin, X. J. Prediction of ocular irritation potential of surfactants-based formulations at different concentrations using the EpiOcular model. Toxicologist. 108, 378 (2009).
  13. Harbell, J., Curren, R. In vitro methods for the prediction of ocular and dermal toxicity. Handbook of Toxicology. , 2nd Edition, Informa Healthcare. (2001).
  14. Kaluzhny, Y. Development of the EpiOcular(TM) eye irritation test for hazard identification and labelling of eye irritating chemicals in response to the requirements of the EU cosmetics directive and REACH legislation. Altern Lab Anim. 39, 339-364 (2011).
  15. Pfannenbecker, U. Cosmetics Europe Multi-Laboratory Pre-Validation of the EpiOcular Reconstituted Human Tissue Test Method for the Prediction of Eye Irritation. Toxicol in vitro. , (2013).
  16. MatTek Corporation. EpiOcular™ Eye Irritation Test (OCL-200-EIT) for the prediction of acute ocular irritation of chemicals for use with Reconstructed Human EpiOcular Model (OCL-200-EIT). Protocol#MK-24-007-0055. , MatTek Corporation. (2014).
  17. Kaluzhny, Y. EpiOcular Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification and Labeling of Eye Irritating Chemicals: Protocol Optimization for Solid Materials and Extended Shipment Times. Altern Lab Anim. 43 (2), 101-127 (2015).
  18. Kolle, S. N., Kandarova, H., Wareing, B., van Ravenzwaay, B., Landsiedel, R. In-house validation of the EpiOcular(TM) eye irritation test and its combination with the bovine corneal opacity and permeability test for the assessment of ocular irritation. Altern Lab Anim. 39, 365-387 (2011).
  19. Reconstructed Human Cornea-like Epithelium (RhCE) Test Method for Identifying Chemicals Not Requiring Classification and Labelling for Eye Irritation or Serious Eye Damage. Draft proposal for a new test guideline.. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. , (2014).
  20. Evaluating the ocular irritation potential of 54 test articles using the EpiOcular Human tissue Construct Model. Toxicol. In Vitro. Blazka, M. E., Harbell, J. 42nd Annual Meeting of the Soc. of Toxicology, Salt Lake City, UT, , (2003).
  21. Kandarova, H. The EpiDerm Test Protocol for the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests — An Assessment of the Performance of the Optimised Test. Altern Lab Anim. 33, 351-367 (2005).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 102، الطرق البديلة، القرنية، EpiOcular، EURL ECVAM، تهيج العين، في المختبر، MTT جدوى الفحص، تهيج العين، والوصول إلى، إعادة بناء نموذج الأنسجة العين، RHCE
العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Kaluzhny, Y., Kandárová,… More

Kaluzhny, Y., Kandárová, H., d’Argembeau-Thornton, L., Kearney, P., Klausner, M. Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model. J. Vis. Exp. (102), e52979, doi:10.3791/52979 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter