Summary
Мы разработали раздражение глаз тест, который использует трехмерное реконструированное человека роговицы, как эпителиальные (RHCE) модель в ткани. Тест способен различать глазной раздражитель и агрессивных материалов (СГС Категории 1 и 2 комбинированных), и те, которые не требуют маркировки (СГС) Нет Категория.
Abstract
В соответствии с седьмой поправкой к Директиве Косметика и REACH ЕС законодательство ЕС, утвержденные альтернативные методы без использования животных для надежной и точной оценки глазной токсичности человека необходимы. Чтобы удовлетворить эту потребность, мы разработали тест раздражение глаз (СПЭ), который использует трехмерную реконструированный человеческой роговицы, как эпителиальные (RHCE) тканей модель, основанную на нормальных человеческих клеток. СПЭ умеет отделять глазные раздражители и коррозионные (СГС Категории 1 и 2 комбинированных), и те, которые не требуют маркировки (СГС Нет категорию). Тест использует два отдельных протоколов, один, предназначенный для жидких химикатов и второй, аналогичной протокола для твердых исследуемых веществ. СПЭ модель прогнозирования использует один период экспонирования (30 мин для жидкостей, 6 ч для твердых веществ) и один жизнеспособности тканей отсечку (60,0%, как определено анализом МТТ). Основываясь на результатах для химических веществ 83 (44 жидкостей и 39 твердых веществ) СПЭ достигается 95,5 / 68.2 / 81,8% Sensitivity / специфичность и точность (СС & A), для жидкостей, 100,0 / 68,4 / 84,6% и СС и для твердых веществ, и 97,6 / 68,3 / 83,1% и для общего СС и А. ВНО будет значительно способствовать классификации раздражения глаз потенциал в широком диапазоне жидких и твердых химических веществ без использования животных для удовлетворения нормативных требований тестирования. Метод EpiOcular СПЭ был реализован в 2015 году в методики ОЭСР в TG 492.
Introduction
Потребительские товары, такие как косметика, моющие средства, и бытовых чистящих средств включают в себя различные химические вещества, которые могут вызвать серьезные повреждения, если они входят в контакт глаза. Таким образом, тестирование этих агентов для раздражения глаз требуется регулирующих органов США и ЕС, чтобы обеспечить безопасность потребителей 1. Оценка глаза раздражения потенциала смесей и составов также является требованием для соблюдения REACH (регистрация, оценка, авторизация и ограничения химических веществ) законодательство для маркировки косметических ингредиентов в соответствии с Директивой ЕС Косметика для перевозки химических веществ, а также для маркировка пестицидов и бытовых товаров 2. В настоящее время регулирующие органы требуют оценки глазной опасности, используя на глобальном уровне системы классификации и маркировки химических веществ (СГС) 3. СГС основывается главным образом на раздражение глаз тест Драйзе, наиболее широко используемый раздражение глаз тест, в котором посторонние вещества и смесиxtures вводятся непосредственно в конъюнктивальный мешок глаза кролика 4. По классификации СГС, категория 1 СГС (глазные коррозионные) относится проверить химических веществ, которые вызывают тяжелые травмы первоначальный тканях глаза или серьезного повреждения глаз и зрения, которая не полностью исчезают в течение 21 дней после воздействия 3,5. СГС Категория 2 относится проверить химических веществ, которые производят значительные изменения в глазу, которые полностью исчезают в течение 21 дней после контакта. Тестовые химикаты, которые не коррозионные или раздражающие называют СГС без категории.
За более чем 40 лет, испытание глаза кролика Дрейза был подвергнут критике за отсутствие воспроизводимости, переоценке человеческих реакций, и использования живых животных 5-8. Эти опасения побудили многие предложения по совершенствованию работы, сокращения и замены в естественных условиях испытания 9. Необходимость проверенных альтернатив неживотного был дополнительно усиленпутем принятия поправки Седьмой к Директиве Косметика, который запретил использование животных в оценке безопасности косметической продукции (в 2005 году) и ингредиентов (в 2009 году) 2.
С 1996 года реконструированы модель ткани роговицы, как широко используется косметической промышленности для оценки раздражение потенциал сырья, препаратов на основе поверхностно-и усугубляется смесей, которые предназначены для использования в, или в непосредственной близости от, глаза 10-13. Использование модели RHCE ткани позволяет напрямую местное применение исследуемого материала на поверхность ткани в его родной, неразбавленном виде. Таким образом, не водорастворимые составы могут быть проверены без разбавления их растворителей. В ответ на Eurl ECVAM в (справочная лаборатория Европейского Союза Европейского центра по валидации альтернативных методов) запроса на широко применимым, простой и экономического метода Раздражение глаз тест (СПЭ), который использует оде время экспозиции и умеет отделять глазные раздражители и коррозионные из материалов, которые не требуют маркировки была разработана (рисунок 1) 14. На основании результатов 83 химических веществ (44 жидкостей и 39 твердых тел), то СПЭ достигается 95,5 / 68,2 / 81,8% чувствительность / специфичность и точность (SS & A) для жидкостей, 100.0 / 68.4 / и 84,6% SS & A для твердых и 97,6 / 68,3 / 83,1% и для общего СС и А.
В 2007, мульти-лабораторное исследование заранее проверка авторами Косметика Европы (ранее Colipa) под эгидой Eurl ECVAM оценили актуальность и надежность ВНО с целью приведения ее к формальному проверки 15. В этом исследовании, 298 независимых испытаний были выполнены в семи независимых лабораторий. Результаты исследования показали, 99,7% в прогнозировании соглашение с низкими коэффициентами вариации во всех участвующих лабораторий 15. В результате, в 2010 году СПЭ Протокол вступил официальное EURL ECVAMПрограмма проверки. Исследование проверка используется 104 кодированных тестов химических веществ, включая индивидуальных веществ и химических смесей, для которых в естественных условиях (справочные данные Дрейза данных раздражение глаз) были доступны. Основываясь на успехе этой работы, проект для тестирования Руководящие принципы ОЭСР был представлен в 2014 году ожидается, что СПЭ будет значительно способствовать классификации раздражения глаз потенциала широкого спектра материалов в соответствии с системы классификации и маркировки СГС ООН.
Protocol
1. Подготовка RHCE тканей для лечения - день 0
- После получения коммерческой человека роговицы, как эпителиальные (RHCE) комплекта, проверить все компоненты набора для целостности (для получения подробной информации комплекта см Стандартный набор для анализа компонентов (Таблица 1) и оборудование и материалы, необходимые для выполнения EIT анализа (таблица 2). На день получения, равновесие тканей (в его 24-а транспортировочный контейнер) до комнатной температуры в течение 15 мин.
| Количество | Реагент | Условия | Источник | Описание | Дата окончания срока |
| 1 | Герметичный 24-луночного планшета из EpiOcular тканей (OCL-200) | 2-8 ° С | Маттек | Содержит 24 TissЕЭС культуре клеток вставляет, пакет на агарозы | 72 ч |
| 1 бутылка, 200 мл | EpiOcular Анализ среднего (OCL-200-ASY) | 2-8 ° С | Маттек | На основе DMEM среднего | 21 дней |
| 1 бутылка, 100 мл | Ca ++ Mg ++ -Бесплатное Dulbecco's-PBS (DPBS) | RT | Sigma-Aldrich, D5652, или экв. | Используется для полоскания вставки | 1 год |
| 4 | 6-луночных планшетах | RT | Сокол | Используется для поддержания тканей в ходе анализа протокола | Не Доступно |
| 2 | 12-луночные планшеты | RT | Сокол | Используется во время протокола анализа | Не Доступно |
| 2 | 24-луночные планшеты | RT | Сокол | Используется для выполнения МТТ | Не Доступно |
| 1 флакон, 0,5 мл | Метилацетата (CAS # 79-20-9) | RT | Sigma-Aldrich, Кот # 186325 | Используется в качестве ПК в анализе | 1 месяц |
Таблица 1: стандартного анализа компоненты набора.
| Оборудование / Материал | Необходим для: |
| Увлажненном инкубаторе (37 ± 1 ° С, 5 ± 1% СО 2, 90 ± 10% влажность) | Инкубации ткани до и во время анализов |
| Ламинаре | Безопасная работа в стерильных условиях |
| Вакуумный насос (опция) | Аспирационные среду и решения |
| Пластина-читатель фотометр (для 96-луночных планшетах) | Чтение ОД |
| Шейкере | Экстрактион формазан |
| Стерильные, тупыми краями щипцы | Обращение ткани вставки |
| Стоп-часы | Сроки применения тестовых материалов и других шагов синхронизированных в протоколе |
| Водяная баня (37 ± 1 ° С) | Потепление СМИ и решение МТТ |
| Ступка и пестик | Шлифовальные сыпучих продуктов |
| Объемный пипетки (50 мкл) | Применение вязких и полутвердых материалов и суспензий |
| Регулируемые пипетки (200 мкл-2 мл) | Применение жидких материалов, анализа среды и МТТ |
| Предварительно стерилизованные наконечники (200 мкл, и 20 мкл), Rainin Cat # HR-200F и HR-20F (или эквивалент) | Применение жидких материалов, анализа среды и МТТ |
| Широкий диафрагма предварительно стерилизуют советы (250 мкл), Rainin Cat # HR-250WS (или эквлентным) | Применение вязких и полутвердых материалов и суспензий |
| 8 унций / 220 мл образца контейнеров, Сокол Cat # 3540200 (или эквивалент) | Промывка ткани |
| Стерильные одноразовые шприцы (например, 1 мл шприц tuberkulin Omnifix-F, B. Braun Melsungen AG, кошки. Нет. 9161406V) | Доставка ~ 50 мг твердых материалов (по желанию) |
| Тед Пелла микро шпателя / ложка, Тед Пелла Inc, Cat # 13504 (или эквивалент, острый ложка или костного кюретки, например Aesculap, нет: ФК 623) | Доставка ~ 50 мг твердых материалов |
| Са ++ и Mg ++ забуференный фосфатом физиологический раствор Дульбекко свободного (Са ++ Mg ++ свободной DPBS): Sigma-Aldrich, Cat # D5652 (или эквивалент) | Промывочные ткани во время анализа |
| Стерильная деионизированная вода, ткани класса культура (качество биологической или эквивалент) | <TD> Использование в качестве NC|
| 96-а плоское дно тарелки, Сокол (или эквивалент) | Для чтения OD |
| Хлопок наконечник свопы (стерильный) | Для сушки поверхности ткани (по желанию) |
| Скотч или парафильмом | Покрытие пластин во время добычи формазанового |
| Комплект для анализа МТТ-100 | Содержит МТТ-тетразолия Тиазолил бромистого реагента (Sigma # М-5655) и изопропанол экстракта. |
Таблица 2: Оборудование и материалы, необходимые для выполнения ЭИТ.
- В стерильных условиях, открыть пластиковый мешок, содержащий 24-луночный планшет с тканями RHCE и удалить стерильной марлей. Осмотрите все ткани для воздушных пузырьков между агарозном геле и вставить. Не следует использовать культуры с пузырьками воздуха под покрытием вставки> 50% площади пластины, дефектных тканей, или тканей WHI ч полностью покрыты жидкостью.
- Этикетка 6-луночных с тестовой статьи или управляющих кодов и времени экспозиции. Алиготе 1,0 мл среды для анализа (поставляемые в наборе), предварительно нагревают приблизительно до 37 ° С, в лунки предварительно помечены пластин 6-а.
- Используйте пинцет, чтобы стерильные удалить каждый вкладыш, содержащий RHCE ткани и поместите вставку в меченого 6-луночного планшета. На этом этапе, удаления остатков доставки агарозы, что придерживается внешних сторонах вкладыша, осторожно блоттинга на стерильную фильтровальную бумагу. Отпустите все пузырьки воздуха в ловушке под вставок.
- Предварительно инкубировать ткани RHCE в 6-луночных планшетах до стандартных условиях культивирования (SCC, увлажненной атмосфере с 5 ± 1% СО 2 при 37 ± 1 ° С) в течение 1 ч.
- Через 1 ч заменить среду для анализа 1,0 мл свежей среды для анализа, предварительно нагретом до 37 ° С и инкубируют ткани RHCE в условиях SCC (ночь = O / N) (16-24 ч).
- После O / N инкубации, применять 20 мкл Са 2+ Mg 2+ -свободных-Дульбекко фосфатно-солевой буфер (DPBS, предоставленной) с использованием соответствующего пипетки устройство. Если DPBS не распределены по ткани, слегка постучать вставку на пластине чтобы гарантировать, что DPBS смачивает всю поверхность ткани.
- Инкубируйте тканей RHCE на ГТК в течение 30 ± 2 мин.
Примечание: Этот шаг необходим для ткани гидратации и имитировать в условиях естественных условиях.
3. Исследуемый материал Процедуры экспозиции
- Применить каждый тест статьи и управления, чтобы дублировать RHCE тканей (п = 2). Порядок дозирования статья тест отличается для жидкостей и твердых тел. Местно применяют по 50 мкл жидкого объекта испытаний с помощью пипетки. Время экспозиции для жидкостей 30 мин. Применить 50 мг твердых статей тестов с использованием выравнивается ложку (калиброванный провести 50 мг хлорида натрия). Эксвремя экспозиции для твердых веществ 6 ч.
Примечание: Жидкости определяются как жидкости веществ (например, жидкостей, гелей, кремов и), которые могут быть применены с использованием пипетки устройство. Твердые вещества определяется как веществ не жидких (например, порошки, смолистые или воскообразные материалы), которые не могут быть применены с помощью пипетки.- Если физическое состояние исследуемых веществ не легко определить, поместить флаконы с тестируемым на водяной бане в течение 15 мин (37 ° C). Последующие EIT протокол для жидкостей для тех исследуемых веществ, что становится жидким при 37 ° С.
- Используйте положительные пипетки смещение для особенно вязких материалов.
- Доза отрицательного контроля и положительных контролей, а затем дозировать исследуемые вещества.
- Применение 50 мкл отрицательного контроля (NC) и положительного контроля (ПК) к тканям RHCE с использованием стандартного пипетки. ЧПУ является стерильной деионизированной воды; ПК является метилацетат (CAS # 79-20-9). Нанесите NC и ПК в течение 30 мин при тестING жидкого теста статьи и в течение 6 часов при тестировании твердых тестовых статей.
4. Тест Статья экспозиции - День 1
- Для обработки жидких тестов статей, следовать графику синхронизации приведены в таблице 3. Оставьте интервалы 1 мин между приложениями каждого тестируемого обеспечить равный экспозиции для всех тканей.
- После 30 ± 2 мин DPBS предварительную обработку, местно применять 50 мкл NC и ПК, и каждый жидкого теста статью местно на ткани RHCE с использованием соответствующего пипетки устройство.
- Применение 50 мкл жидкого теста статье непосредственно на ткани, чтобы покрыть верхнюю поверхность. Отрежьте узкую точку кончика пипетки, чтобы расширить отверстие для вязких материалов. Для очень вязких материалов, подачи тестового статью дозирующим устройством (плоский во главе цилиндра диаметром немного меньше, чем внутренний диаметр вкладыша ткани или пластиковой канцелярской кнопки), инвертировать дозирования Device и поместить его на ткань, так что тест статья равномерно контактирует с поверхностью ткани.
- Если тест статья не распространяется по всей ткани, слегка постучите вставку, чтобы убедиться, что она распространяется по всей поверхности ткани. Механическая распространение тестовых статей (например, с кончика пипетки) не рекомендуется, так как это может привести к повреждению тканей.
- Инкубируйте ткани на ГТК в течение 30 ± 2 мин.
- Для обработки твердых тестовых статей - 1 день, следовать графику синхронизации приведены в таблице 4 Оставьте 2-минутными интервалами между приложениями каждого тестируемого обеспечить равный экспозиции для всех тканей..
- После 30 ± 2 мин DPBS предварительную обработку, применяются 50 мкл NC и ПК местно на ткани RHCE с использованием соответствующего пипетки устройство.
- Для твердых применения тестируемого, удалить вставки (п = 2) из скважины и разместить их на стерильной поверхности (например, крышка часовultiwell пластины), чтобы избежать тест статьи разлив в среду.
- Использование выравнивается ложку, местно применяют примерно 50 мг образца для испытания на поверхность ткани; убедиться, что поверхность ткани полностью покрыт тестируемого изделия. Если тест статье не распределены по ткани, встряхнуть осторожно вставку из стороны в сторону для того, чтобы ткань полностью покрыта тестируемого изделия. Механическая распространение тестовых статей (например, с кончика пипетки) не рекомендуется, так как это может привести к повреждению тканей.
- Если необходимо, измельчить кристаллические порошки с помощью ступки и пестика, чтобы гарантировать лучшее контакт между тестируемым и ткани.
- Кроме того, место порошки непосредственно на культуре ткани внутри вставки с помощью 1 мл шприц с отрубленной головой. Вещи порошки в шприц, когда поршень втягивается обратно, а затем применить нажатием на поршень вниз.
- Если внешняя стенка вкладыша сontaminated например, порошков, протрите частицы с стерильной марлей.
- После дозирования возврата тканей к 6-луночных планшетах, содержащих в культуральную среду и инкубируют при SCC в течение 6 ч ± 15 мин.
5. Промывка
- Подготовьте набор из трех стаканов чистой (150 мл) в емкости тестируемого и заполнить каждый из них с помощью 100 мл DPBS. Для каждого тестируемого, используют различный набор трех стаканов.
- В конце экспозиции мин 30 ± 2 для жидких материалов или 6 ч ± 15 мин экспозиции для твердых материалов, также удалить устройство дозирования, если он был использован.
- Поднимите вставки, содержащие ткани RHCE из среды, взявшись за верхний край пластикового "воротник" с тонким пинцетом. Используйте пинцет, чтобы изогнутые облегчить управляемость и перефасовки. Промыть тканей двух одновременно удерживая повторяющиеся вставки вместе воротники с использованием щипцов. Будьте осторожны нOT повредить ткани с щипцами.
- Слейте тестовые статьи или элементы управления с поверхности ткани на чистую абсорбирующего материала (бумага полотенце, марля, и т.д.)
- Dip вставки в первом стакане DPBS, вихря в круговом движении в DPBS в течение приблизительно 2 сек, поднимать вставки таким образом, что они в основном заполнена DPBS и декантируют жидкость обратно в химический стакан. Повторите эту процедуру три раза в первом стакане.
- Промыть вставки в втором и третьем стаканы ДЗФР три раза в таким же образом.
- Декантировать любой жидкости, оставшейся в вставки на абсорбирующего материала. Поворот вставку приблизительно под углом 45 ° (открытый конец вниз) и коснуться верхнюю губу к абсорбирующим материалом.
Примечание: Если это не возможно, чтобы удалить весь видимый испытуемого материала, в дальнейшем не промывки должно быть сделано, чтобы избежать повреждения ткани из-за чрезмерного обработки.
6. Сообщение замочить
- После промывки,немедленно погружают ткани в 5 мл среды для анализа, предварительно нагретого до комнатной температуры в заранее помечены пластины 12-луночного.
- Инкубируйте ткани для 12 ± 2 мин для жидких материалов или 25 ± 2 мин для твердых материалов, погруженных при комнатной температуре, чтобы облегчить удаление всех остатков исследуемого вещества.
7. После инкубации
- В конце пост-Замочите период погружения, переливать среде для анализа из тканей и промокните вставки на абсорбирующим материалом.
- Передача вставки в предварительно меченных пластины 6-луночный, содержащей 1 мл теплой среды для анализа.
- Инкубируйте ткани для 120 ± 15 мин при ГТК для жидких тестовых материалов.
- Инкубируйте ткани для 18 ± 0,25 ч при ГТК для твердых тестовых материалов.
8. МТТ Жизнеспособность Пробирной - День 1 (протокол для жидкостей) и 2-й день (Протокол для твердых веществ)
- Выполните МТТ после пост-Инкубация 12077; 15 мин для жидкостей и 18 ± 0,25 ч для твердых веществ, соответственно.
- Готовят 1,0 мг / мл раствора МТТ и аликвоту 0,3 мл раствора в каждую лунку предварительно меченных пластины 24-луночного.
- Используйте коммерческого набора МТТ (таблица 5):
- 2 ч перед использованием, оттепель МТТ концентрата в РТ. Смешайте 2 мл МТТ концентрата и 8 мл МТТ разбавителя с получением 1,0 мг / мл раствора МТТ.
- Хранить раствор МТТ при 4 ° С в темноте до использования. Не храните решение МТТ для более чем 1 день.
- В конце сообщение инкубации удалить каждой вставки из пластины 6-луночного и осторожно пятно на абсорбирующего материала.
- Поместите вставки в 24-луночный планшет, содержащий 0,3 мл раствора МТТ. Отпустите все пузырьки воздуха в ловушке под вставок. Инкубируйте планшет для 180 ± 10 мин при ГТК.
- Добыча МТТ
- После 180 ± 10 мин инкубации в МТТ раствора, удалить каждый вкладышот пластины 24-луночного и пятно на нижней части вставки на абсорбирующего материала.
- Для не красителей жидкого теста изделий (погружен экстракции): Передача вставки в предварительно меченных 24-луночного планшета, содержащего 2,0 мл экстрагента раствором (изопропанол) так, чтобы она погружается вставку.
- Для твердых веществ и жидких красителей (не погружен экстракции, чтобы избежать загрязнения экстрагирующего раствора): Передача вставки в предварительно меченных 6-луночного планшета, содержащего 1,0 мл экстрагирующего раствора (изопропанол), так что она не погрузить вставку.
Примечание: Выполните эту же без подводную добычу для соответствующих положительных и отрицательных контролей.
- Уплотнение пластин (например, парапленкой между крышкой и верхним краем лунки или со стандартным планшетов). Место пластин на орбитальном шейкере и встряхивают в течение от 2 до 3 ч при комнатной температуре, чтобы извлечь МТТ.
- В качестве альтернативы, выполните извлечения O / N на 2-876 С в темноте без встряхивания.
- Для не красителей жидкого теста изделий (погружен экстракции): В конце периода экстракции в, декантируют жидкость из каждой вставки обратно в скважину и отбросить вставки с тканями RHCE.
- Смешайте раствор экстракта и передачи двух аликвот по 200 мкл в соответствующие лунки предварительно меченных 96-луночного планшета в соответствии с конфигурацией пластины (Рис.2).
- Для твердых веществ и жидких красителей (не погружен экстракции): В конце периода экстракции отказаться ткани (убедитесь, что не прокалывать ткань).
- Добавить 1,0 мл экстрагирующего раствора в каждую лунку 24-луночного планшета, содержащего раствор экстрагировали из тканей. Смешайте экстрагирующий раствор и передачи двух аликвот по 200 мкл в соответствующие лунки предварительно меченных 96-луночного планшета в соответствии с конфигурацией пластины (Рис.2).
- Определите тон оптической плотности (OD) из извлеченных образцов при одной длине волны от 550 нм и 590 (должны быть согласованы в пределах лаборатории) на планшет-ридере или спектрофотометре.
- В случае мутных растворов экстракта, вызванных нерастворимых твердых веществ, центрифуги решения до измерения оптической плотности (остыть центрифуги до 4 ° С, чтобы избежать испарения). В случае промывки не удалить тестовую статью (TA) и ТА мешает снижению МТТ, дополнительные элементы управления должны быть использованы. Пожалуйста, обратитесь к подробному СОП для коррекции снижения МТТ 16.
- В случае ТА, показано, что, или разработать цвет, который может взаимодействовать с измерением МТТ, дополнительный тест должен выполняться для определения количества цвета, связанный с, а затем экстрагировали из тканей. Пожалуйста, обратитесь к подробному СОП для коррекции цветных тестов статьями 16.
9. Расчеты за ткань жизнеспособности испытаний (таблица 6 и рисунок 3) и #160;
- Общие расчеты
- Рассчитать среднее значение ОП лунок контроля (ОП) для BLK каждого эксперимента.
- Вычитание OD Blk из каждого значения OD того же эксперимента (BLK исправленные данные).
- Рассчитывают среднее значение двух аликвот по каждой ткани (= скорректированный OD).
- Рассчитывают процентное жизнеспособность каждой из двух одинаковых тканей для каждого контроля и исследуемых веществ по сравнению со средним отрицательного контроля (100% контроль).
Жизнеспособность (%) = [исправлено ОД обработанные ткани / исправлены ОД отрицательный контроль] х 100% - Рассчитать разницу жизнеспособности (разница между жизнеспособность двух одинаковых тканей).
- Вычислить среднее жизнеспособность тест статьи (жизнеспособность ТС) и классифицировать тест статьи в зависимости от модели прогнозирования.
10. Прогнозирование Модель (Рисунок 3)
- Если ТА лечение жизнеспособность ткани> 60,0 по отношению к НК обработанной ткани Viability, маркировать тест статью как нераздражающей (NI) (СГС без категории).
- Если ТА лечение жизнеспособность ткани ≤ 60,0 по отношению к НК обработанной ткани жизнеспособности, маркировать тест статью как раздражающее (I) (СГС Категории 1 и 2).
Примечание: Страны с переходной экономикой Результаты испытаний считается правомочным, если:- ОП СПЭ NC> 0,8 и <2,5;
- жизнеспособность ткани СПЭ ПК (%, по отношению к NC) является ≤50.0%;
- разница между двумя повторных тканей (NC, ПК, и тест статья) является <20,0%.
- ОП СПЭ NC> 0,8 и <2,5;
Representative Results
Типичные СПЭ Результаты проведенных с 10 исследуемых веществ (TA) и отрицательных и положительных контролей представлены в таблице 6 и на рисунке 3. Среднее OD = 1,31 для ЧПУ соответствует 100% жизнеспособность тканей, поэтому компьютер (средний OD = 0,41) было относительная жизнеспособность ткани 31,2%. Когда СПЭ протокол был выполнен в 15 действующих независимых экспериментов в 7 лабораториях с использованием протокола жидкого экспозиции и в 8 независимых действительных экспериментов в 4 лабораториях, с использованием протокола прочную экспозиции, средняя жизнеспособность тканей для ПК с помощью жидкого протокол составил 36,4 ± 4,0 % и 32,3 ± 6,4% для протокола твердых веществ. Во всех случаях, положительные результаты управления были ниже отсечения стоимости 60,0% 15.
Как показано на рисунке 3, ТА1, ТА2, ТА4, TA7 и ТА8 были тканей viabilities> 60,0% и, следовательно, были классифицированы как "NI". ТА3, ТА5, TA6, ТА9 и TA10 были тканей viabilities X04; 60,0% и, следовательно, были классифицированы как "I". Разница между ткани жизнеспособности тканей дубликатов был <20,0% для всех ТА с исключением TA2. Таким образом, результаты для всех тестов, статей с исключением TA2, считались "квалифицированный", так как они встретились все СПЭ критерии приемки (раздел 10.2). Из-за высокой изменчивости между дублирующих тканей для TA2 в начальной эксперимента, второй эксперимент был необходим для получения квалифицированных СПЭ результаты.
СПЭ метод испытания, как описано здесь, используя модель RHCE ткани была использована для оценки раздражения глаз в нескольких multilaboratory проверочных исследований, в том числе формального подтверждения по EURL ECVAM / Косметика Европы 15,17-19. Во всех исследованиях СПЭ было показано, что воспроизводимость и смог правильно определить химические вещества (оба вещества и смеси), не требующих классификации и маркировки для раздражения глаз или серьезное повреждение глаз переменного токась, чтобы СГС ООН 15,17-19. Метод испытания СПЭ выполнили критерии приемки группы по валидации управления (VMG) на раздражение глаз для чувствительности, специфичности и точности общей и в настоящее время оно находится на рассмотрении формальное внедрение в качестве частичной замены кролика в естественных условиях Драйзе теста 19.
Рисунок 1: Схема из СПЭ протокола жидких и твердых тестовых статей Сокращения, используемые: А. М., анализ среднего;. ГТК, стандартные условия культивирования; PBS, Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором; RT, температура в помещении.
Рисунок 2:. Стандартизированная конфигурация 96-луночный планшет для испытания МТТ жизнеспособности тканей Два 200 мкл аликвоты TRAnsferred в соответствующие лунки предварительно меченных 96-луночного планшета. Сокращения, используемые: NC, отрицательного контроля; ПК, положительный контроль; ТА1-TA20, тест статьи 1-20; Бланк, экстрагент решение. 96- конфигурации МТТ пластина используется с Excel таблицы, предназначенный для расчета RHCE жизнеспособности тканей и СПЭ результаты.
Рисунок 3: СПЭ результаты для 10 тестовых статей, NC и управления ПК с использованием модели RHCE тканей График генерируется из Excel таблицы предназначены для представления результатов СПЭ.. Тест химические вещества, которые к снижению жизнеспособности тканей ≤ 60,0% по отношению к NC классифицируются как раздражители ("I", TA3, TA5, TA6, ТА9 и TA10) и испытательных химических веществ, которые были жизнеспособности тканей> 60,0%, классифицируются как не-раздражителей (" Н. И. ", ТА1, ТА2, ТА4, TA7 и ТА8).
| Время для работы протокола шагов СПЭ (один день работы на одного оператора) Начало | |||||||
| Каждая строка соответствует одной пары тканей | |||||||
| Порядок действий: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Жидкости: | PBS, | Т. Экспозиция | После- Вымочить | После- | МТТ | Реакция МТТ | Добыча Мера | |
| 30 мин | 30 мин | 12 мин | 120 мин | 180 мин | 120 мин | ОД | |
| Северная Каролина | 9:00 | 9:30 | 10:00 | 10:12 | 12:12 | 15:12 | после |
| ПК | 9:01 | 9:31 | 10:01 | 10:13 | 12:13 | 15:13 | 17:30 |
| ТА-1 | 9:02 | 9:32 | 10:02 | 10:14 | 12:14 | 15:14 | |
| ТА-2 </ STRONG> | 9:03 | 9:33 | 10:03 | 10:15 | 12:15 | 15:15 | |
| ТА-3 | 9:04 | 9:34 | 10:04 | 10:16 | 12:16 | 15:16 | |
| ТА-4 | 9:05 | 9:35 | 10:05 | 10:17 | 12:17 | 15:17 | |
| ТА-5 | 9:06 | 9:36 | 10:06 | 10:18 | 12:18 | 15:18 | |
| ТА-6 | 9:07 | 9:37 | 10:07 | 10:19 | 12:19 | 15:19 | |
| ТА-7 | 9:08 | 9:38 | 10:08 | 10:20 | 12:20 | 15:20 | |
| 9:09 | 9:39 | 10:09 | 10:21 | 12:21 | 15:21 | ||
| TA-9 | 9:10 | 9:40 | 10:10 | 10:22 | 12:22 | 15:22 | |
| ТА-10 | 9:11 | 9:41 | 10:11 | 10:23 | 12:23 | 15:23 | |
Таблица 3:. Образец график для тестирования жидких тестов статей шаги протокола в том числе предварительно смачивания ткани с DPBS, приложение испытательного статей (TAS), полоскания и сообщение замочить, период после инкубации МТТ, Добыча МТТ, и измерение МТТ OD представлены в колонках. Время для дублирующих тканей организованы в ряды. Весь тестирование анализ 10 ТП и управления могут быть завершены в течение одного дня.
e_content ">| Время начала СПЭ шагов протокола (2 дня работать в течение одного оператора) | |||||||
| Каждая строка соответствует одной пары тканей | |||||||
| 1 день | День 2 (на следующий день) | ||||||
| Порядок действий: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Сухой остаток: | PBS, | Т. Экспозиция | После- Вымочить | После- Incubaction | МТТ Реакция | МТТ Добыча | Мера |
| 30 мин | 6 ч | 26 мин | 18 ч | 180 мин | 120 мин | ОД | |
| Северная Каролина | 9:00 | 9:30 | 15:30 | 15:56 | 9:56 | 12:56 после | |
| ПК | 9:02 | 9:32 | 15:32 | 15:58 | 9:58 | 12:58 | 15:30 |
| ТА-1 | 9:04 | 9:34 | 15:34 | 16:00 | 10:00 | 13:00 | |
| ТА-2 | 9:06 | 9:36 | 15:36 | 16:02 | 10:02 | 13:02 | |
| ТА-3 | 9:08 | 9:38 | 15:38 | 16:04 | 10:04 | 13:04 | |
| ТА-4 | 9:10 | 9:40 | 15:40 | 16:06 | 10:06 | 13:06 | |
| ТА-5 | 9:12 | 9:42 | 15:42 | 16:08 | 10:08 </ TD> | 13:08 | |
| ТА-6 | 9:14 | 9:44 | 15:44 | 16:10 | 10:10 | 13:10 | |
| ТА-7 | 9:16 | 9:46 | 15:46 | 16:12 | 10:12 | 13:12 | |
| ТА-8 | 9:18 | 9:48 | 15:48 | 16:14 | 10:14 | 13:14 | |
| TA-9 | 9:20 | 9:50 | 15:50 | 16:16 | 10:16 | 13:16 | |
| ТА-10 | 9:22 | 9:52 | 15:52 | 16:18 | 10:18 | 13:18 | |
Таблица 4: Пример графика время для испытания твердых тестовых статей. Шагов протоколов, включая Предварительное смачивание ткани с DPBS, применение исследуемых веществ, промывки и после выдерживания после инкубационного периода, МТТ, Добыча МТТ, и измерение оптической плотности МТТ представлены в колонках. Время для дублирующих тканей организованы в ряды. Весь анализ тестирования 10 ТП и управления осуществляется в течение двух дней.
| Количество | Реагент | Условия хранения | Источник | Описание | Дата окончания срока |
| 1 флакон, 2 мл | МТТ концентрат (МТТ-100-CON) | Защищенный от света (-20ºC) | Маттек | Замороженные МТТ концентрата | 2 месяца |
| 1 флакон, 8 мл | МТТ разбавителя | 2-8 &# 186; С | Маттек | Для разбавления концентрата МТТ перед использованием в МТТ | 2 месяца |
| 1 бутылка, 60 мл | Изопропанол (CAS # 67-63-0) | RT | Sigma-Aldrich | Экстрагент решение | Не Доступно |
Таблица 5: МТТ-100 Аналитические компоненты набора.
| Код N ° | Ткань | Необработанные данные | Бланк исправленные данные | значит ОД | % Жизнеспособности | ||
| N | Алик. 1 | Алик. 2 | Алик. 1 | Алик. 2 | |||
| Северная Каролина | 1 | 1.316 | 1,352 | 1.316 | 1,352 | 1.334 | 101.6 |
| 2 | 1.277 | 1.309 | 1.277 | 1.309 | 1.293 | 98,4 | |
| ПК | 1 | 0.379 | 0,397 | 0.379 | 0,397 | 0,388 | 29,6 |
| 2 | 0,419 | 0,442 | 0,419 | 0,442 | 0,431 | 32,8 | |
| ТА1 | 1 | 1.213 | 1.244 | 1.213 | 1.244 | 1.229 | 93,5 |
| 2 | 1.355 | 1.355 | 1.355 | 1.355 | 1.355 | 103,2 | |
| ТА2 | 1 | 1.210 | 1.122 | 1.210 | 1.122 | 1.166 | 88,7 |
| 2 | 0,828 | 0,837 | 0,828 | 0,837 | 0.833 | 63,4 | |
| ТА3 | 1 | 0,167 | 0,168 | 0,167 | 0,168 | 0,167 | 12.7 |
| 2 | 0,138 | 0,136 | 0,138 | 0,136 | 0,137 | 10.4 | |
| ТА4 | 1 | 1.137 | 1.160 | 1.137 | 1.160 | 1.149 | 87,4 |
| 2 | 1.262 | 1.191 | 1.262 | 1.191 | 1.227 | 93,4 | |
| ТА5 | 1 | 0,610 | 0,621 | 0,610 | 0,621 | 0,616 | 46,9 |
| 2 | 0,480 | 0.484 | 0,480 | 0.484 | 0.482 | 36,7 | |
| TA6 | 1 | 0,502 | 0.513 | 0,502 | 0.513 | 0,508 | 38,7 |
| 2 | 0,396 | 0.407 | 0,396 | 0.407 | 0,402 | 30,6 | |
| TA7 | 1 | 1.048 | 1.050 | 1.048 | 1.050 | 1.049 | 79,9 |
| 2 | 1.149 | 1.150 | 1.149 | 1.150 | 1.150 | 87,5 | |
| ТА8 | 1 | 1.032 | 1.034 | 1.032 | 1.034 | 1.033 | 78,7 |
| 2 | 0,941 | 0,935 | 0,941 | 0,935 | 0,938 | 71,4 | |
| ТА9 1 | 0,022 | 0,022 | 0,022 | 0,022 | 0,022 | 1.7 | |
| 2 | 0,144 | 0,149 | 0,144 | 0,149 | 0,147 | 11.2 | |
| TA10 | 1 | 0.150 | 0.150 | 0.150 | 0.150 | 0.150 | 11.4 |
| 2 | 0,254 | 0.255 | 0,254 | 0.255 | 0.255 | 19.4 | |
| имею в виду | Диф. | имею в виду, | Диф. | Диф. / 2 | Классификация | ||
| ОД | ОД | viabilities [%] | из viabilities | ||||
| Северная Каролина | 1.314 | 0,041 | 100,0 | 3.12 | 1.56 | Н.И. | квалифицированный |
| ПК | 0.410 | 0,043 | 31,2 | 3.23 | 1.62 | Я | квалифицированный |
| ТА1 | 1.292 | 0,127 | 98,3 | 9.63 | 4.81 | Н.И. | квалифицированный |
| ТА2 | 0.999 | 0.333 | 76,1 | 25.36 | 12.68 | Н.И. | D> 20 |
| ТА3 | 0,152 | 0.030 | 11.6 | 2.32 | 1.16 | Я | квалифицированный |
| ТА4 | 1.188 | 0.078 | 90,4 | 5.94 | 2.97 | Н.И. | квалифицированный |
| ТА5 | 0,549 | 0,134 | 41,8 | 10.16 | 5.08 | Я | квалифицированный |
| TA6 | 0,455 | 0,106 | 34,6 | 8,07 | 4.03 | Я | квалифицированный |
| TA7 | 1.100 | 0,101 | 83,7 | 7,65 | 3,82 | Н.И. | квалифицированный |
| ТА8 | 0.986 | 0,095 | 75,0 | 7,23 | 3.62 | Н.И. | квалифицированный |
| ТА9 | 0,085 | 0,125 | 6.4 | 9.48 | 4.74 | Я | квалифицированный |
| TA10 | 0,203 | 0,105 | 15,4 | 7.95 | 3.98 | Я | квалифицированный |
Таблица 6:. СПЭ результаты, полученные в течение 10 тестовых статей, NC и ПК управления Таблицы Produced помощью Excel таблицы, предназначенный для расчета жизнеспособности тканей и СПЭ результаты. Тест химические вещества, которые к снижению жизнеспособности тканей ≤ 60,0% по отношению к NC классифицируются как раздражители ("I", TA3, TA5, TA6, ТА9 и TA10) и испытательных химических веществ, которые были жизнеспособности тканей> 60,0%, классифицируются как не-раздражителей (" Н. И. ", ТА1, ТА2, ТА4, TA7 и ТА8).
Discussion
Мы представили раздражение глаз тест (рис 1), которая была разработана для модели EpiOcular ткани. СПЭ умеет отделять глазные раздражители и коррозионные (СГС Категории 1 и 2 вместе) из материалов, которые не требуют маркировки (СГС) без категории с высокой степенью чувствительности и специфичности 17. ЭИП, представленные здесь, не делает различий между СГС Категория 1 из 2 категории химикатов. ВНО была подтверждена для классификации и маркировки глазной раздражение потенциала широкого спектра химических веществ, в том числе косметических и фармацевтических ингредиентов. В сочетании с другом в пробирке тесты, ВНО будет служить в качестве замены для в естественных условиях кролик глаз испытания на раздражение.
СПЭ использует два похожих, но различных протоколов для жидких и твердых материалов, которые различаются по длине воздействия и после контакта инкубационных периодов (рисунок 1). Конечная точка используется в EITэто ткань жизнеспособность, определяется МТТ, который был ранее используемой в утвержденных человека эпителиальных тканей моделей 20,21. Для выполнения этого теста, никакого специального оборудования, кроме стандартного оборудования для культивирования клеток не требуется. В связи с высоким уровнем ткани к ткани, воспроизводимость N = 2 ткани вместо обычно рекомендуется п = 3 используются. Возможность использования N = 2 ткани является важным аспектом протокола, так как это позволяет опытным оператором обрабатывать два тканей одновременно, тем самым минимизируя изменчивость анализа, которые могут возникнуть из-за различных обработки отдельных тканей 14. Кроме того, с помощью N = 2 ткани на тест статьи, раздражения 10 испытуемых веществ одной и той же физическом состоянии (жидкие или твердые), наряду с положительным и отрицательным контролем, может быть оценена с помощью одного набора (24 тканей).
Другие ключевые моменты, которые обеспечивают надежную классификацию материалов спецификации для положительного контроля суbstance (ткань жизнеспособность ≤50.0%), воспроизводимость между дублирующих тканей (разница <20,0%), и отрицательный контроль показаний ОП (> 0,8 и <2,5).
При выполнении теста СПЭ, важно придерживаться утвержденной протоколом и в предлагаемом дозирования и промывки расписания (таблицы 3 и 4), так как отклонение от протокола или изменениях в инкубационных периодов может привести к измененной исходом. Точно так же, отклонения от времени 3 ч для МТТ инкубации будет приводить к различным показаниям МТТ и может повлиять на результат анализа.
Иногда тест может иметь химический оптические или другие свойства, которые могут помешать МТТ ткани жизнеспособность анализа или уменьшения вызывают МТТ. Например, тест может непосредственно химической восстанавливают МТТ в сине-фиолетовый продукта реакции или может быть цветным вещество, которое поглощает свет в том же диапазоне, МТТ формазана (~ 570 нм). Тем не менее, эти испытательные химикаты ргESENT проблему, только если в момент МТТ, достаточное количество материала по-прежнему присутствует на (или поглощается) ткань. Чтобы избежать этой помехи, обширные процедуры полоскание включены в ЭИП протокола. Если промывка не удалить TA и ТА мешает снижению МТТ, дополнительные элементы управления должны быть использованы для выявления и исправления для него. Вкратце, если прямого восстановления МТТ исследуемого вещества подозревается, 50 мкл (или 50 мг для твердых веществ) химического вещества в вопросе инкубируют в течение 3 ч с рабочим МТТ раствора при ГТК (штат Северная Каролина, 50 мкл стерильной деионизированной воды, должны быть работать одновременно). Если МТТ раствор становится сине-фиолетовый, тест статьи предполагается уменьшили МТТ. В этом случае функциональная проверка с помощью замораживания-убиты управления ткань должна быть выполнена, чтобы оценить, является ли исследуемый материал связывания с тканью и приводит к ложной сигнала уменьшения МТТ. Если есть снижение заметно МТТ в ТА-открытой, убитого контроля ткани(по отношению к количеству в необработанной ткани) жизнеспособной, среднее ткани жизнеспособность тестируемого изделия должна быть исправлена путем вычитания среднего жизнеспособность убитого управления.
ВНО допускает ошибку на стороне безопасности, как показано на низкой частоте ложных негативных классификаций 14,15,18. Важно отметить, что ни один из химических веществ, категория 1 СГС, которые разъедают глаза и которые не представляют наиболее серьезную опасность глазной, были классифицированы как не раздражает в этом анализе 14,15,18,19. Наконец, одним из основных преимуществ RHCE в пробирке методом испытаний является возможность тестирования аккуратный жидкости и твердые материалы (что не возможно с двумерными, погруженных культур клеток).
ВНО будет в значительной мере способствовать в определении раздражение глаз потенциал в широком диапазоне материалов в соответствии с системы классификации и маркировки СГС ООН. Замена животных, чтобы определить ососудистая токсичность была цель токсикологических исследований на протяжении многих лет. Метод испытания СПЭ завершила формальное изучение проверки поддерживаемый Eurl ECVAM в 2014 году и EpiOcular СПЭ был реализован в принципы испытаний ОЭСР в ТГ ОЭСР 492 в 2015 году.
Disclosures
Публикация сборы для этой статьи были оплачены Маттек Corporation.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Джона Harbell его научной поддержки и времени, посвященного ЭИП проекта. Авторы также хотели бы поблагодарить Beiersdorf AG (Германия), IIVS (США), Mary Kay Inc. (США), Avon Products Inc. (США), Procter & Gamble / Cosmital (Швейцария), Laboratoire Pierre Fabre (Франция), Харлан лаборатории (Великобритания), и LVMH Парфюм (Франция) для участия в нескольких центр Международный Pre-Validation и валидации исследований глаз Раздражение Тест 15.
References
- National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). Request for Ocular Irritancy Test Data From Human, Rabbit, and In Vitro Studies Using Standardized Testing Methods. Federal Register. 72 (109), 31582-31583 (2007).
- Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC. OJ. L396 (49), European Commission. 1-849 (2006).
- Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). , Fifth revised edition, United Nations. New York and Geneva. (2013).
- Draize, J. H., Woodard, G., Calvery, H. O. Methods for the Study of Irritation and Toxicity of Substances Applied Topically to the Skin and Mucous Membranes. J Pharmacol Exp Ther November. 82, 377-390 (1944).
- Adriaens, E. Retrospective analysis of the Draize test for serious eye damage/eye irritation: importance of understanding the in vivo endpoints under UN GHS/EU CLP for the development and evaluation of in vitro test methods. Arch tox. 88, 701-723 (2014).
- Balls, M., Botham, P. A., Bruner, L. H., Spielmann, H. The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol in Vitro. 9, 871-929 (1995).
- Curren, R. D., Harbell, J. W. Ocular safety: a silent (in vitro) success story. Altern Lab Anim. 30, Suppl 2. 69-74 (2002).
- Wilhelmus, K. R. The Draize Eye Test. Survey of Ophthalmology. 45, 493-515 (2001).
- Curren, R. D., Harbell, J. W. In vitro alternatives for ocular irritation. Environ health persp. 106, 485-492 (1998).
- McCain, N. E., Binetti, R. R., Gettings, S. D., Jones, B. C. Assessment of ocular irritation ranges of market-leading cosmetic and personal-care products using an in vitro tissue equivalent. Toxicologist. 66, 243 (2002).
- Niranjan, P., Dang, A. H., January, B. G., Gomez, C., Harbell, J. W. Use of the EpiOcular assay for preclinical qualification of formulas for human clinical studies. Toxicologist. 96, 249 (2007).
- Yin, X. J. Prediction of ocular irritation potential of surfactants-based formulations at different concentrations using the EpiOcular model. Toxicologist. 108, 378 (2009).
- Harbell, J., Curren, R. In vitro methods for the prediction of ocular and dermal toxicity. Handbook of Toxicology. , 2nd Edition, Informa Healthcare. (2001).
- Kaluzhny, Y. Development of the EpiOcular(TM) eye irritation test for hazard identification and labelling of eye irritating chemicals in response to the requirements of the EU cosmetics directive and REACH legislation. Altern Lab Anim. 39, 339-364 (2011).
- Pfannenbecker, U. Cosmetics Europe Multi-Laboratory Pre-Validation of the EpiOcular Reconstituted Human Tissue Test Method for the Prediction of Eye Irritation. Toxicol in vitro. , (2013).
- MatTek Corporation. EpiOcular™ Eye Irritation Test (OCL-200-EIT) for the prediction of acute ocular irritation of chemicals for use with Reconstructed Human EpiOcular Model (OCL-200-EIT). Protocol#MK-24-007-0055. , MatTek Corporation. (2014).
- Kaluzhny, Y. EpiOcular Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification and Labeling of Eye Irritating Chemicals: Protocol Optimization for Solid Materials and Extended Shipment Times. Altern Lab Anim. 43 (2), 101-127 (2015).
- Kolle, S. N., Kandarova, H., Wareing, B., van Ravenzwaay, B., Landsiedel, R. In-house validation of the EpiOcular(TM) eye irritation test and its combination with the bovine corneal opacity and permeability test for the assessment of ocular irritation. Altern Lab Anim. 39, 365-387 (2011).
- Reconstructed Human Cornea-like Epithelium (RhCE) Test Method for Identifying Chemicals Not Requiring Classification and Labelling for Eye Irritation or Serious Eye Damage. Draft proposal for a new test guideline.. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. , (2014).
- Evaluating the ocular irritation potential of 54 test articles using the EpiOcular Human tissue Construct Model. Toxicol. In Vitro. Blazka, M. E., Harbell, J. 42nd Annual Meeting of the Soc. of Toxicology, Salt Lake City, UT, , (2003).
- Kandarova, H. The EpiDerm Test Protocol for the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests — An Assessment of the Performance of the Optimised Test. Altern Lab Anim. 33, 351-367 (2005).
