Introduction
För närvarande anses vara den gyllene standarden för kranio-maxillofacial (CMF) bendefekt behandlingar, är transplantation av skördade autologa transplantat hindras av komplicerade ympning förfaranden, givarstället sjuklighet och begränsad tillgänglighet 1. En särskild svårighet är att forma och fixera den styva autograft tätt i defekten för att få osseointegration och för att förhindra graft resorption. Tissue engineering har undersökts som en alternativ strategi för att autotransplantation och syntetiska bensubstitut (t.ex. bencement) 2,3. Kritiskt för framgången för en vävnadsteknik tillvägagångssätt är en byggnadsställning med en specifik uppsättning av egenskaper. Först, i syfte att uppnå osseointegration, måste byggnadsställningen bildar nära kontakt med intilliggande benvävnad 4. Ställningen bör också vara osteokonduktivt, tillåter cellmigration, närings diffusion och neotissue avsättning 4,5. Detta beteende är i allmänhet uppnås med biologiskt nedbrytbar scaffolds uppvisar en tätt sammanlänkad por morfologi. Slutligen bör ställningen vara bioaktiva för att främja integration och bindning med omgivande benvävnaden 5.
Här presenterar vi ett protokoll för att förbereda en tissue engineering byggnadsställning med dessa egenskaper. Viktigt, uppvisar denna ställningen förmåga att "själv-fit" i oregelbundna CMF defekter på grund av dess formminnesbeteende 6. Termoresponsiv formminnespolymerer (SMP) är kända att undergå formförändring vid exponering för värme 7,8. SMP består av "netpoints" (dvs. kemiska eller fysikaliska tvärbindningar) som bestämmer permanent form och "kopplingssegment" som upprätthåller den temporära formen och återställa den permanenta formen. Omkopplingssegmenten uppvisar en termisk övergångstemperatur (Tövergång) motsvarande antingen glasövergångs (Tg) eller smält övergång (Tm) för polymeren. Somett resultat kan SMPs sekventiellt deformeras till en temporär form vid T> Tövergång, fixerades i den temporära formen vid T <Tövergång och utvanns till den permanenta formen vid T> Tövergång. Sålunda kunde en SMP schavotten uppnå "self-montering" inom en CMF defekt enligt följande sex. Efter exponering för varm saltlösning (T> Tövergång), en SMP byggnadsställning skulle bli smidbart, medger en allmänt iordningställda cylindriska byggnadsställning för hand pressas in en oregelbunden defekt, med formåtervinning främja expansion av byggnadsställningen till defekten gränsen. Vid kylning (T <träns), skulle ställningen återvända till dess relativt styvare tillstånd, med formen oföränderlighet behålla sin nya temporära formen inom defekten. I detta protokoll är en SMP klätterställning framställd från polykaprolakton (PCL), en biologiskt nedbrytbar polymer studerats ingående för vävnadsregenerering och andra biomedicinska tillämpningar 9-11. För formminne, the Tm för PCL tjänar som Tövergång och varierar mellan 43 och 60 ° C, beroende på molekylvikten för PCL 12. I detta protokoll Tövergång (dvs. Tm) av ställningen är 56,6 ± 0,3 ºC 6.
För att uppnå osteokonduktivitet ades ett protokoll som utvecklats för att göra PCL-baserade SMP ställningar med starkt sammanbundna porer baserat på ett lösningsmedelsgjutning partikelformig-urlakning (SCPL) -metoden 6,13,14. Polykaprolakton diakrylat (PCL-DA) (Mn = ~ 10 tusen g / mol) användes för att medge snabb, fotokemisk tvärbindning och löstes i diklormetan (DCM) för att tillåta lösningsmedelsgjutning över salt mallen. Efter fotokemisk härdning och lösningsmedelsavdunstning, ades saltet mall avlägsnas genom läkning i vatten. Den genomsnittliga saltstorlek reglerar ställningen porstorlek. Viktigt var salt mallen smält med vatten före lösningsmedels gjutning att uppnå por interconnectivity.
Bioaktivitet applicerades på den SMP-ställningen genom in situ bildning av en polydopamine beläggning på porväggarna 6. Bioaktivitet ofta införes i byggnadsställningar genom införlivandet av glas eller glaskeramiska fyllmedel 15. Dessa kan dock ge upphov till oönskade spröda mekaniska egenskaper. Dopamin har visats för att bilda en vidhäftande, tunn polydopamine skikt på en mängd olika substrat 16-19. I detta protokoll var SMP ställningen utsattes för en svagt basisk lösning (pH = 8,5) av dopamin för att bilda en nanothick beläggning av polydopamine på alla por väggytor 6. Förutom att förbättra ythydrofilicitet för förbättrad vidhäftning cell och spridning har polydopamine visat sig vara bioaktiva när det gäller bildandet av hydroxyapatit (HAp) vid exponering för simulerad kroppsvätska (SBF) 18,20,21. I ett sista steg, är den belagda ställningen utsätts för värmebehandling vid 85 ° C (T> Tövergång) which leder till scaffold förtätning. Värmebehandling har nämnts tidigare att vara väsentlig för byggnadsställning formminnesbeteende, kanske på grund av PCL kristallina områden omorganisera till närmare närhet 14.
Vi beskriver dessutom metoder för att karakterisera själv passande beteende inom en oregelbunden modell defekt, formminnes beteende när det gäller spänningsstyrda cyklisk termisk mekanisk kompressionsprov (dvs form återhämtning och forma oföränderlighet), por morfologi, och in vitro bioaktivitet. Strategier för att skräddarsy ställnings egenskaper presenteras också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. syntes PCL-DA makromer
- Kör akrylereaktionen.
- Väg upp 20 g av PCL-diol (Mn = ~ 10 tusen g / mol) i en 250 ml rundbottnad kolv utrustad med en teflontäckt magnetisk omrörarstav.
- Lös PCL-diolen i DCM.
- Lägg 120 mLlof DCM till kolven (koncentration = 0,17 g / ml).
- Placera ett gummiseptum löst i kolvens hals för att undvika tryckuppbyggnad och samtidigt förhindrar avdunstning av DCM.
- Rör ihop lösning för ~ 30 minuter vid ~ 250 rpm för att fullständigt lösa polymeren.
- Lägg ~ 6,6 mg 4-dimetylaminopyridin (DMAP) till lösningen och lös upp med omröring.
- Placera ett gummiseptum ordentligt i kolvens hals. Låt lösningen fortsätta omrörning.
- Genom gummimembran, försiktigt rensa kolven med N2 under ~ 3 min med hjälp av ett positivt N2-tryck nål inlopp och ett öppet nålsom ett utlopp.
- Avlägsna N 2 inlopp och utlopp.
- Lägg 0,56 ml (4,0 mmol) trietylamin (Et3N) droppvis via en glasspruta försedd med en nål införd genom gummiväggen.
- Lägg 0,65 ml (8,0 mmol) akryloylklorid droppvis via en glasspruta försedd med en nål införd genom gummiväggen.
- Returnera N2-inlopp till kolven och låta innehållet omröras under positivt N2-tryck under ~ 30 minuter.
- Förvärm ett oljebad till 55 ° C.
- Efter den tilldelade ~ 30 minuter, avlägsna N 2 inlopp och ersätta septumet med en kondensor.
- Sänk kolven in i den förvärmda oljebad.
- Låt innehållet i kolven under omröring i 20 timmar.
- Efter den tilldelade 20 timmar, ta bort kolven från oljebadet och låt innehållet svalna till RT.
- Med användning av en rotationsindunstare, avlägsna DCM lösningsmedel från kolven.
- Purify den råa PCL-DA produkt.
- Till kolven, tillsätt ~ 135 ml etylacetat och lös den orena PCL-DA.
- Gravity filtrera lösningen genom filterpapper i en ren 250 ml rundbottnad kolv. (Obs: Lösning kan tjockna på filterpapper, inte lätt passerar så försiktigt applicera mild värme med en värmepistol..)
- Med användning av en rotationsindunstare, avlägsna etylacetatlösningsmedel från kolven.
- Till kolven, tillsätt ~ 140 ml DCM och lös den orena PCL-DA.
- Överför innehållet till en 500 ml separationstratt.
- Till tratten, tillsätt 13,5 ml av 2 M kaliumkarbonat (K 2 CO 3).
- Cap tratten. Blanda försiktigt de två lagren genom att vända tratten och snurra försiktigt en eller två gånger, var noga med att minska trycket via kranen. Upprepa 3 ggr.
- Sätt tillbaka locket med ett skikt av Parafilm och låt blandningen separera O / N (~ 12 h).
- Samla botten, ellerGanic skiktet till en 250 ml-Erlenmeyerkolv.
- Lägg ~ 5 g vattenfritt magnesiumsulfat (MgSO 4) till kolven och snurra försiktigt.
- Gravity filtrera blandningen genom kvalitativ filterpapper och i en ren 250 ml rundbottnad kolv.
- Med användning av en rotationsindunstare, avlägsna DCM lösningsmedel från kolven.
- Torka under högvakuum för att avlägsna återstående DCM. (Obs! PCL-DA ska förvaras åtskilt från ljus.)
- Bekräfta akryle med ett H-NMR 22,23.
2. Förbereda SMP Ställning (figur 1)
- Förbered det smälta salt mallen.
- Använd en 425 um sikt för erhållande av natriumklorid (NaCl) partiklar ~ 460 ± 70 ^ m i diameter. (Obs: Genomsnittlig partikelstorlek kan bekräftas från svepelektronmikroskopiska [SEM] bilder med ImageJ programvara.) 14
- Till en glasflaska 3 ml (ID = 12,9 mm), tillsätt 1,8 g av den tidigare siktats NaCI.
- Tillsätt långsamt, i fyra portioner, 7,5 vikt% (baserat på saltvikten) Dl-vatten (0,146 g) och flaskan. Blanda med en metallspatel efter tillsatsen av varje portion vatten.
- Förslut flaskan, linda in i vävnad och placera vertikalt i ett centrifugrör. Centrifugera i 15 minuter vid 3220 x g.
- Ta av locket och låt lufttorka O / N (~ 12 timmar).
- I en ny glasflaska, förbereda en "makromerlösningen" genom att kombinera 0,15 g PCL-DA per ml DCM. (Obs. För en byggnadsställning, ~ 1 ml lösning bör beredas) Cap och blanda lösningen i hög hastighet på en vortexblandare för ~ 1 min.
- I en ny 3 ml injektionsflaska av glas, förbereda en "fotoinitiator lösning" baserad på 10 vikt% 2,2-dimetoxi-2-fenylacetofenon (DMP) i 1-vinyl-2-pyrrolidinon (NVP). Kombinera 0,115 g DMP i 1 ml NVP. (Obs! För en byggnadsställning, ~ 180 pl krävs.) Cap, linda in i aluminiumfolie (för att blockera ljus) och blanda lösningen i hög hastighet på en virvelblandareför ~ 1 minut. (Obs! Om upprättats i avancerade, bör lösningen kylas och skyddas från ljus.)
- Wrap flaskan med makromerlösningen (exklusive locket) med aluminiumfolie (för att blockera ljus) och tillsätt via pipett 15 volym-% (räknat på totala volymen av makromerlösningen) av fotoinitiatorn lösningen. Locket och blanda lösningen i hög hastighet på en virvelblandare under ~ 1 minut.
- Linda injektionsflaskan med smält salt mallen (exklusive cap) med aluminiumfolie (för att blockera ljus) och lägg via pipett den tidigare beredda makromeren / fotoinitiator lösning (~ 0,6 ml eller tills mallen är helt täckt).
- Förslut flaskan, linda in i vävnad och placera vertikalt i ett centrifugrör. Centrifugera i 10 min vid 1260 xg för att fördela makromerlösningen hela mallen.
- Avlägsna aluminiumfolie, fixed flaskan och utsättas för UV-ljus (365 nm, 25 W) i 3 min. Lufttorka O / N.
- Ta bort "saltinnehållande scaffold "från flaskan med pincett efter poäng och sprickbildning i toppen av glasflaskan.
- I en 400 ml-bägare, förbereda ~ 200 ml av en vatten / etanollösningsmedel (1: 1 volym: volym).
- Behåll ställningen nedsänkt i vatten / etanol lösningsmedel för 4 dagar med dagliga förändringar lösningsmedel.
- Avlägsna ställningen från lösningsmedlet och lufttorka O / N.
3. Tillämpa polydopamine Coating till SMP Ställning (figur 1)
- I 400 ml bägare utrustad med en Teflon-täckt omrörarstav, förbereda ~ 200 ml av en dopaminhydrokloridlösning (2 mg / ml i 10 mM Tris-buffert, pH = 8,5, 25 ° C). Rör om vid ~ 150 rpm.
- Placera en engångsnål (längd = 40 mm, spårvidd = 20) till schavotten, ~ halva avståndet genom schavotten. Linda en tråd runt nålnavet.
- Sänk ställningen (med nålnavet ovanför lösningen ytan) i den omrörda dopamin lösningen genom att förankra tråden till kanten av bägaren.
- Avlufta den byggnadsställning genom att placera en spruta in i nålnavet och använda den för att dra luft ut ur ställningen. (Notera: Avgasning är fullbordad när ingen mer luft kan avlägsnas och lösningen har fullständigt infiltrerat ställningen.)
- Behåll ställningen nedsänkt i omrörning dopaminlösning under 16 timmar.
- Ta schavotten från lösningen och ta bort nålen. Skölj med DI-vatten och torka i en vakuumugn vid RT under 24 h.
- Placera ställningen i en 85 ºC ugn under 1 timme.
- Låt ställningen svalna till RT. Den slutliga cylindriska ställningen kommer att vara ~ 6 mm diameter x ~ 5 mm höjd.
4. Utvärdera "Self-montering" Beteende
- Förbered en "oregelbunden CMF defekt modell" med ett ark av styv plast vars tjocklek är ~ 5 mm. Använd en borr för att skapa ett tomrum inuti plastarket med en genomsnittlig diameter som är något mindre än ~ 6 mm, såsom visas i figur 2A.
- I abEaker, värme Dl-vatten (representerande den kliniska användningen av saltlösning) till en temperatur av ~ 60 ° C.
- Placera ställningen i bägaren på ~ 60 ° C vatten. Använd pincett för att driva ställningen under vattenytan, utsätta alla områden till vattnet. Fortsätt i ~ 2 min eller tills skelettet märk uppmjukas (Figur 2B).
- Ta schavotten från bägaren och omedelbart tryck (för hand) i modellen defekten.
- Låt svalna till RT (~ 5-10 min) (figur 2C).
- Ta bort från defekten att observera den nya, fasta temporära formen och återlämnande av relativt styvare tillstånd (figur 2D).
5. Test med formminne Beteende
- Med användning av en dynamisk mekanisk analysator (DMA; t.ex. en TA Instruments Q800 som används häri), köra en stam-styrd cyklisk-termisk mekanisk kompressionstest på en byggnadsställning över två cykler (N) för att bestämma formen oföränderlighet (Rf) ochforma återhämtning (Rr) (Figur 3).
- Jämvikta till 60 ° C (T hög) under 5 min.
- Komprimera till ett maximalt stam (ε m = 50%) vid 50% / min.
- Håll vid ε m (5 min).
- Kyl till 25 ° C (T låg) och bibehålla i 10 min för att fixera temporära formen.
- Ta bort lasten.
- Mät den ultimata töjningen i spänningsfritt tillstånd (ε u).
- Reheat till 60 ° C (T hög) och bibehålla i 10 min för att återvinna den permanenta formen.
- Mät den återvunna stammen (ε p).
- Medan fortfarande vid 60 ° C (T hög), starta 2: a cykeln (N = 2) genom att komprimera ställningen till 50% av höjden återhämtat sig efter en m cykeln (n = 1).
- Upprepa 5,1.3-5.1.8 För N = 2.
- Beräkna Rf och R r för N = 1 och 2 med följande ekvationer:
Rf (N) = [ε u (n) / ε m] R R (n) = [ε m - ε P (n)] / [ε m - ε P (n -1)]
6. Visualisera porstorlek och Pore Interconnectivity
- Med svepelektronmikroskop (SEM, t.ex. FEI Quanta SEM som används häri), observera porstorlek och pore samtrafik.
- Med hjälp av en pincett för att hålla SMP schavotten, dränka i flytande N2 under 1 minut.
- Ta bort från flytande N2 och brott längs mitten av byggnadsställningen med en ren rakblad.
- Med hjälp av kol tejp, anbringa ett av SMP ställningshalvorna på provetsteg med den brutna ytan uppåt.
- Spotta päls med Au-Pt (~ 4 nm).
- Fånga SEM-bilden vid en rekommenderad accelererande spänning av 10-15 kV (Figur 4A).
7. Provning av in vitro Bioaktivitet
- I en 50 ml centrifugrör, tillsätt ~ 30 ml 1X SBF 24.
- Skaffa en byggnadsställning i sin ursprungliga, cylindriskt formade permanent form. Skär ställningen i hälften (över den cirkulära kanten) med en ren blad.
- Placera en enskild byggnadsställning hälften i den förberedda centrifugrör och mössa.
- Bibehåll röret vid 37 ° C i ett vattenbad under statiska betingelser utan SBF förändringar.
- Efter 14 dagar, ta bort ställningen från SBF och lufttorka i 24 timmar.
- Med hjälp av kol tejp, anbringa ställningen på prov scenen med den brutna ytan uppåt.
- Spotta päls med Au-Pt (~ 4 nm).
- Fånga SEM-bilden på en relovordade accelererande spänning av 10-15 kV (Figur 4B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den erhållna PCL-baserade SMP byggnadsställning är kapabel att självpassande till en modell CMF defekt (figur 2). Efter kortvarig exponering för varm saltlösning (~ 60 ° C), mjuknar den cylindriska ställningen tillåter byggnadsställningen att manuellt pressas in i och expandera inom modellen defekten. Efter kylning till RT, byggnadsställningen fixerad i dess nya temporära formen som kvarhålles vid avlägsnande från defekten.
Formminnes beteende en SMP schavotten kvantifieras genom stam styrda cykliska termisk mekaniska kompressionsprov i form av form oföränderlighet (Rf) och form återhämtning (R r) (Figur 3). För denna PCL-baserade SMP-byggnadsställning, värden (%) för cykler N = 1 och 2 är: Rf (1) = 102,5 0,7, Rf (2) = 101,8 0,3, Rr (1) 95,3 0,9, och Rr (2) = 99,8 0,2 6.
SMP-ställningen visar en tätt sammanlänkad por morfologi som observeratsgenom SEM avbildning (Figur 4A). Detta uppnåddes genom användning av en smälta salt mall, bildad genom tillsats av en liten mängd vatten till den siktade saltet (Figur 1).
Efter exponering för simulerad kroppsvätska (SBF, 1X) under 14 dagar, bekräftar SEM avbildning bildningen av HAp (figur 4B) därigenom indikerar scaffold bioaktivitet.
Figur 1. Schematisk för framställning av skummjölkspulver byggnadsställning belagd med polydopamine. ASMP byggnadsställning är tillverkad via beskrivna protokollet baserat på den fotokemiska härdningen av polykaprolakton diakrylat (PCL-DA) användning av ett lösningsmedel-gjutning partikelformig-urlakning (SCPL) förfarande som använder smälta salt mall och tillämpning av ett bioaktivt polydopamine beläggning. Den slutliga värmebehandlingen vid 85 ° C (T> Tövergång) inducerar scaffold hålacering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Observation av självpassande beteende. En cylindrisk SMP-byggnadsställning (~ 6 mm diameter x ~ 5 mm hög) är monterad inom en "oregelbunden defekt modell" (A) enligt följande. Vid upphettning i vatten vid ~ 60 ° C (T> Tövergång), ställningen mjuknar och blir formbar (B) och kan således mekaniskt pressas ("monterad") inom modellen defekt (C). Efter kylning till RT, SMP ställningen avlägsnas och behåller sin nya, fasta temporära formen (D). Vid efterföljande upphettning vid ~ 60 ° C, undergår ställningen formåtervinning till den ursprungliga, generiska cylindrisk form. 
Figur 3. Mätning av formminnes beteende. Formminnes beteendet hos en SMP byggnadsställning kvantifieras genom en stam styrd cyklisk termisk mekanisk kompression test på en byggnadsställning för att bestämma formen oföränderlighet (Rf) och form återhämtning (R r) baserat på mätningar av ε m, ε u, och ε s. klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 4. Observation av pore sammankoppling och bildandet av hydroxyapatit (HAp). Representant SEM-bilder av en obelagd, värmebehandlad SMP byggnadsställning (skala bar = 200 pm) (A) och bestruket, värmebehandlad ställningen efter exponering för SBF (1X) under 14 dagar (skala bar = 50 pm) (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver framställningen av en polydopamine belagd, PCL-baserade byggnadsställning vars själv passande beteende, liksom osteoinduktivitet och bioaktivitet, gör det intressant för behandling av oregelbundna CMF bendefekter. Aspekter av protokollet kan ändras för att ändra olika ställningsfunktioner.
Protokollet börjar med akryle av en PCL-diol att tillåta UV-härdning. I det rapporterade exemplet är PCL-diol M n ~ 10000 g / mol. Men genom att på lämpligt sätt justera mängden av akryloylklorid och Et3N användes under syntesen av PCL-DA, en PCL diol med en högre eller lägre Mn kan användas för att minska eller öka, respektive, den tvärbindningstätheten.
Den smält salt mall är en viktig komponent för att protokollet (Figur 1). Den genomsnittliga salt storlek avgör den resulterande schavotten porstorlek. I det beskrivna exemplet, den genomsnittliga saltstorleken var ~ 460 ± 70 &# 181; m. Medan en mindre saltstorlek kan användas, bör man hålla i minnet att byggnadsställningen undergår krympning under det slutliga värmebehandlingssteget som kommer att minska porstorleken. Siktning av saltet användes för att minska spridning av saltet storlek och därför porstorleksfördelningen. För att producera en byggnadsställning med starkt sammanbundna porer, var saltfusion inducerades genom tillsats av en liten mängd vatten (7,5 vikt-% baserat på saltvikten). Detta är känt för att delvis lösa isolerade NaCl-partiklar till en kontinuerlig poragen mall 25,26. Beroende på den genomsnittliga salt storlek, måste mängden vatten som tillsätts justeras 14. Dessutom, under salt fusion, vattnet måste tillsättas gradvis, mekanisk blandas och slutligen centrifugeras för att säkerställa dess jämn fördelning samt packning av saltpartiklarna.
Efter att ha bildat smält salt mallen är PCL-DA löst i DCM för lösningsmedelsgjutning. I det beskrivna protokollet, en concentration av 0,15 g PCL-DA per 1 ml DCM användes. Denna koncentration kan ökas eller minskas. Men samtidigt ökande koncentrationer förväntas öka ställningsmodul, det kan också producera ställningar med lägre pore samtrafik 14.
När prekursorlösningen har lagts på salt mögel, är centrifugering hjälp till medhjälpare i dess spridning i mallen. Efter snabb UV-härdning medger lufttorkning avdunstning av DCM lösningsmedlet. Efter avlägsnande från formen, är byggnadsställningen indränkt i vatten / etanol (1: 1 volym: volym) under 4 dagar för att avlägsna saltet mallen. SEM avbildning bekräftar bildningen av en i hög grad sammankopplade porer morfologi (Figur 4A).
En polydopamine beläggning appliceras på porväggarna i byggnadsställningen att förläna bioaktivitet. På grund av den resulterande schavotten krympning, är det bäst att applicera beläggningen innan den slutliga värmebehandlingen steg 6. Dessutom avgasningställningen medan nedsänkt i vattendopaminlösning hjälper infiltration. Den avgasade ställnings resterna nedsänkta i lösningen för att underlätta likformig polydopamine täckning. När belagda och sköljdes noggrant, uppvisar den tidigare vita schavotten en brun färg karakteristisk för polydopamine 21. Således kan täckning i hela ställningen bedömas genom visuell inspektion genom att halvera en byggnadsställning för att bekräfta polydopamine diffusion.
Efter applicering av polydopamine beläggningen, är en slutlig värmebehandling utförs (85 ° C, 1 h). Som nämnts, resulterar denna process ställnings krympning. Men är värmebehandling nödvändig för att uppnå formminnesbeteende 14, kanske på grund av omorganisationen av PCL kristallina domäner (dvs kopplingssegment) närmare varandra.
Såsom visas i fig 2, SMP byggnadsställning uppnås självpassande i en modell defekt på grund av dess termoresponsiv forma migMory natur. Exponering för varm saltlösning (~ 60 ° C) inducerade smältning av PCL kristallina områden, så att det uppmjukade ställningen kunde pressas in i modellen defekten. När den manuella trycket frigjordes, främjat formåtervinning expansion av byggnadsställning för att fylla de oregelbundna gränser. Vid kylning till RT, PCL kristallina områden reformeras, fastställande av ställningen in i dess nya temporära formen som bibehölls vid avlägsnande från defekten. Tidigare bekräftade vi att porerna längs kanterna av den borttagna schavotten varit ganska öppen trots kontakt med formen 6.
Vid mätning av spänningsstyrda cyklisk termiska mekaniska kompressionsprov (Figur 3), ideala formminnesbeteende kännetecknas av Rf och R r värden på 100%. För den beskrivna SMP byggnadsställning, Rf-värdena för cyklerna 1 och 2 var något> 100% 6. Rf har tidigare observerats vara något greater än 100% 14,27 på grund av en svag ökning av tryckpåkänning under form fixeringen från kristallisation av PCL segment i mer kompakta strukturer 27 eller från kompressions inducerad omkristallisering av PCL. Dessutom r R ökade från cykel 1 till cykel 2 6. En ökning av R R-värden har tidigare noterats för fast 28,29,22 och porös SMP 13,14,23. Man tror att under den första cykeln, är resttöjning härrör från bearbetning avlägsnas så att formen återvinning ökar i nästa cykel 7.
Den beskrivna vävnadsteknik byggnadsställning uppnår den specifika uppsättning egenskaper kritiska för en framgångsrik behandling av CMF bendefekter. Ställningen förväntas underlätta osseointegration genom sin förmåga att "själv passning" inom en oregelbunden CMF bendefekten. Osteokonduktivitet förutses baseras på uppnådd porer sammankoppling samtställnings nedbrytbarhet. Slutligen, på grund av polydopamine beläggningen, är byggnadsställningen bioaktiv såsom indikeras genom bildningen av HA under in vitro-tester (figur 4B). Denna bioaktivitet förväntas att underlätta integrationen och bindning med omgivande benvävnaden. Således representerar detta schavotten ett alternativ till autotransplantation och konventionella bensubstitut för CMF bendefekten reparation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna tackar Texas A & M University Engineering och Experiment Station (TRÖJA) för finansiellt stöd av denna forskning. Lindsay Nail är tacksam stöd från Texas A & M University Louis Stokes alliansen för minoriteters deltagande (LSAMP) och National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship Program (GRFP). Dawei Zhang tackar Texas A & M University Disputation Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol) | Sigma-Aldrich | 440752 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | D65100 | Dried over 4A molecular sieves |
| 4-dimethylaminopyridine (DMAP) | Sigma-Aldrich | D5640 | |
| Triethylamine (Et3N) | Sigma-Aldrich | T0886 | |
| Acryloyl chloride | Sigma-Aldrich | A24109 | |
| Ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
| Potassium carbonate (K2CO3) | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher | M65 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| 2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP) | Sigma-Aldrich | 196118 | |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | H8502 | |
| Tris buffer (2mol/L) | Fisher | BP1759 | Used at 10 mM concentration, pH = 8.5 |
| Sieve | VWR | 47729-972 | |
| UV-Transilluminator (365 nm, 25 W) | UVP | 95-0426-02 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) | TA Instruments | Q800 | |
| High Resolution Sputter Coater | Cressington | 208HR | |
| Scanning Electron Microscope (SEM) | FEI | Quanta 600 |
References
- Neovius, E., Engstrand, T. Craniofacial reconstruction with bone and biomaterials: review over the last 11 years. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 63, 1615-1623 (2010).
- Elsalanty, M. E., Genecov, D. G.
- Hollister, S. J., et al.
- Albrektsson, T., Johansson, C.
- Blokhuis, T. J., Arts, J. J. C. Bioactive and osteoinductive bone graft substitutes: Definitions, facts and myths. Injury. 42, S26-S29 (1016).
- Zhang, D., et al. A bioactive “self-fitting” shape memory polymer scaffold with potential to treat cranio-maxillo facial bone defects. Acta Biomater. 10, 4597-4605 (2014).
- Lendlein, A., Kelch, S.
- Hu, J., Zhu, Y., Huang, H., Lu, J. Recent advances in shape-memory polymers: Structure, mechanism, functionality, modeling and applications. Prog Polym Sci. 37, 1720-1763 (2012).
- Middleton, J. C., Tipton, A. J. Synthetic biodegradable polymers as orthopedic devices. Biomaterials. 21, 2335-2346 (2000).
- Sun, H., Mei, L., Song, C., Cui, X., Wang, P. The in vivo degradation, absorption and excretion of PCL-based implant. Biomaterials. 27, 1735-1740 (2006).
- Woodruff, M. A., Hutmacher, D. W. The return of a forgotten polymer-Polycaprolactone in the 21st century. Prog Polym Sci. 35, 1217-1256 (2010).
- Wang, S., Lu, L., Gruetzmacher, J. A., Currier, B. L., Yaszemski, M. J. Synthesis and characterizations of biodegradable and crosslinkable poly(ε-caprolactone fumarate), poly(ethylene glycol fumarate), and their amphiphilic copolymer. Biomaterials. 27, 832-841 (2006).
- Zhang, D., Petersen, K. M., Grunlan, M. A. Inorganic-organic shape memory polymer (SMP) foams with highly tunable properties. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 186-191 (2012).
- Zhang, D., Burkes, W. L., Schoener, C. A., Grunlan, M. A. Porous inorganic-organic shape memory polymers. Polymer. 53, 2935-2941 (2012).
- Van der Stok, J., Van Lieshout, E. M., El-Massoudi, Y., Van Kralingen, G. H., Patka, P. Bone substitutes in the Netherlands-a systematic literature review. Acta Biomater. 7, 739-750 (2011).
- Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318, 426-430 (2007).
- Hong, S., et al. Non-covalent self-assembly and covalent polymerization co-contribute to polydopamine formation. Adv Funct Mater. 22, 4711-4717 (2012).
- Ryu, J., Ku, S. H., Lee, H., Park, C. B. Mussel-inspired polydopamine coating as a universal route to hydroxyapatite crystallization. Adv Funct Mater. 20, 2132-2139 (2010).
- Lee, Y. B., et al. Polydopamine-mediated immobilization of multiple bioactive molecules for the development of functional vascular graft materials. Biomaterials. 33, 8343-8352 (2012).
- Wu, C., Fan, W., Chang, J., Xiao, Y. Mussel-inspired porous SiO 2 scaffolds with improved mineralization and cytocompatibility for drug delivery and bone tissue engineering. J Mater Chem. 21, 18300-18307 (2011).
- Ku, S. H., Ryu, J., Hong, S. K., Lee, H., Park, C. B. General functionalization route for cell adhesion on non-wetting surfaces. Biomaterials. 31, 2535-2541 (2010).
- Schoener, C. A., Weyand, C. B., Murthy, R., Grunlan, M. A. Shape memory polymers with silicon-containing segments. J Mater Chem. 20, 1787-1793 (2010).
- Zhang, D., Giese, M. L., Prukop, S. L., Grunlan, M. A. Poly(ε-caprolactone)-based shape memory polymers with variable polydimethylsiloxane soft segment lengths. J Polym Sci Pol Chem. 49, 754-761 (2011).
- Kokubo, T., Takadama, H. How useful is SBF in predicting in vivo bone bioactivity. Biomaterials. 27, 2907-2915 (2006).
- Murphy, W. L., Dennis, R. G., Kileny, J. L., Mooney, D. J. Salt fusion: an approach to improve pore interconnectivity within tissue engineering scaffolds. Tissue Eng. 8, 43-52 (2002).
- Yang, Q., Chen, L., Shen, X., Tan, Z. Preparation of polycaprolactone tissue engineering scaffolds by improved solvent casting/particulate leaching method. J Macromol Sci Phys. 45, 1171-1181 (2006).
- Madbouly, S. A., Kratz, K., Klein, F., Lüzow, K., Lendlein, A. Thermomechanical behaviour of biodegradable shape-memory polymer foams. 2009 MRS Spring Meeting, 1190, Mater Res Soc Symp Proc. (2009).
- Luo, X., Mather, P. T. Preparation and characterization of shape memory elastomeric composites. Macromolecules. 42, 7251-7253 (2009).
- Lendlein, A., Schmidt, A. M., Langer, R. AB-polymer networks based on oligo(ɛ-caprolactone) segments showing shape-memory properties. Proc Natl Acad Sci. 98, 842-847 (2001).
