Introduction
Şu anda cranio-maksillofasiyal (CMF) kemik defekti tedavilerin altın standardını kabul hasat otolog greft nakli karmaşık aşılama işlemleri, donör saha morbiditesi ve sınırlı sayıda 1 ile engellenmektedir. Belirli bir zorluk şekillendirme ve osseointegrasyon elde etmek ve greft emilmesini önlemek için defekt içine sıkıca sert otogreft tamir ediyor. Doku mühendisliği bir otograftlama alternatif strateji ve sentetik kemik ikame (örneğin kemik çimentosu) 2,3 olarak incelenmiştir. Doku mühendisliği yaklaşımının başarısı için kritik özelliklerin belirli bir set ile bir iskele olduğunu. İlk olarak, kemik entegrasyonunu elde etmek için, skafold, bitişik kemik dokusunun 4 ile yakın bir temasın oluşturulması gerekir. Iskele aynı zamanda hücre göçü, besin difüzyon ve neotissue birikim 4,5 izin, osteokondüktif olmalıdır. Bu davranış genellikle biyolojik olarak parçalanabilir SCA ile elde edilirffolds oldukça birbirine bağlı gözenek morfolojisi sergileyen. Kemik dokusu 5 çevreleyen ile entegrasyon ve bağ teşvik edecek şekilde Son olarak, iskele biyoaktif olmalıdır.
Burada, bu özelliklere sahip olan, bir doku mühendisliği iskelesi hazırlamak için bir protokol mevcut. Önemlisi, bu iskele de şekil bellekli davranışı 6 nedeniyle düzensiz CMF kusurları içine "self-fit" yeteneği sergiler. Thermoresponsive Şekil belleği olan polimerler (BBOP) 7,8 ısıya maruz kalma üzerine şekil değişimine maruz bilinmektedir. BBOPler kalıcı şekil ve geçici şeklini korumak ve kalıcı şekil kurtarmak "geçiş segmentleri" belirleyen "netpoints" (yani kimyasal veya fiziksel çapraz bağlarının) oluşur. Sviçleme bölümleri, ya cam geçiş (T g) karşılık gelen bir ısı geçiş sıcaklığına (T trans) sergileyen veya polimerin geçiş (Tm) eritin. AsSonuç olarak, BBOPler ardışık T <T trans geçici şekli sabit T> T trans geçici bir şekil, deforme ve T> T trans kalıcı şekil geri kazanılabilir. 6 aşağıdaki gibi Böylece, bir SMP skafold CMF kusur içinde "kendi kendine bağlantı" elde edebiliriz. Temastan sonra tuzlu su (T> T trans), bir SMP iskele şekil kurtarma kusur sınırına iskele genişleme teşvik ile, el-preslenmiş düzensiz bir defekt içine olmak için jenerik hazırlanan silindirik iskele izin, dövülebilir olacaktı ısınmak için. (T <T trans) Soğuduktan sonra, iskele şekil fixity defekti içinde yeni geçici şeklini muhafaza ile nispeten daha sert hale dönecekti. Bu protokol, bir SMP skafold biyolojik olarak parçalanabilir bir polimer, doku rejenerasyonu ve diğer biyomedikal uygulamalar 9-11 için yoğun çalışmalar, polikaprolakton (PCL) hazırlanır. Şekil hafızası için, inciPCL e Tm T trans olarak görev yapar ve PCL 12 arasında molekül ağırlığına bağlı olarak, 43 ve 60 ° C arasında değişir. Bu protokolde, iskele T trans (yani T m) 56.6 ± 0.3 ºC 6.
Osteoconductivity elde etmek için bir protokol, çözücü döküm parçacık-liç (SCPL) yöntemine 6,13,14 dayanan son derece birbirlerine bağlı gözenekleri PCL tabanlı SMP iskeleleri yapmak için geliştirilmiştir. Polikaprolakton diakrilat (PCL-DA) (M n = ~ 10.000 g / mol), hızlı, fotokimyasal çapraz bağlanmasını izin vermek için kullanılmıştır ve tuz şablonu içinde solvent döküm izin vermek için diklorometan (DCM) içinde çözülmüştür. Fotokimyasal tedavi ve çözücü buharlaştırma sonrasında, tuz şablonu su içine damıtılması yoluyla uzaklaştırılmıştır. Ortalama tuz boyutu iskele gözenek boyutu düzenler. Önemli olarak, tuz şablonu önce gözenek interconnectivi elde etmek için döküm çözücü madde su ile kaynaştırıldıty.
Biyoaktivite delik duvarlarının 6 üzerine polydopamine kaplamanın in situ oluşumu ile SMP iskele kazandırılan edildi. Biyoaktivite genellikle cam ya da cam-seramik dolgu 15 dahil edilerek iskeleler sokulur. Bununla birlikte, bu istenmeyen kırılgan mekanik özellikler ortaya çıkarabilir. Dopamin alt tabakalar 16-19 çeşitli yapışkan bir ince polydopamine tabakası oluşturmak için gösterilmiştir. Bu protokol, SMP skafold, tüm gözenekli duvar yüzeyleri 6 polydopamine bir nanothick kaplama oluşturmak için dopamin hafif bazik çözelti (pH = 8.5) tabi tutuldu. Geliştirilmiş hücre yapışması yüzey hidrofilikliğini arttırmak ve yayma ek olarak, polydopamine yapay vücut sıvısı (SBF) 18,20,21 maruziyet üzerine hidroksiapatit oluşumu (HAP) açısından biyolojik olarak aktif olduğu gösterilmiştir. Son bir aşamada, kaplanmış skafold 85 ° C (T> T trans) wh tedaviye ısıya maruz kaldığıIch yoğunlaşma scaffold yol açar. Isıl işlem, daha önce PCL kristal alanlar yakın yakınlık 14 yeniden düzenlenmesi, belki nedeniyle iskele şekil hafıza davranışı için önemli olduğu belirtilmişti.
Biz ayrıca, düzensiz bir model defekti içinde kendini uydurma davranışı karakterize açısından suş kontrollü halkalı-termal, mekanik sıkıştırma testleri bellek davranışı şekil (yani şekil kurtarma ve dinginlik şekil) yöntemlerini tarif morfoloji gözenek ve in vitro biyoetkinlikte. Iskele özelliklerini terzi Stratejiler de sunulmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sentezleme PCL-DA makromer
- Açilleme reaksiyonu çalıştırın.
- Teflon kaplı manyetik karıştırma çubuğu ile donatılmış bir 250 ml'lik yuvarlak tabanlı bir şişeye PCL-diol (Mn = ~ 10.000 g / mol) 20 g tartılır.
- DCM içinde PCL-diol içinde çözülür.
- Şişe 120 mLlof DCM ekle (yoğunluk = 0.17 g / ml).
- Ayrıca, DCM buharlaşmasını önler basınç artışını önlemek için şişenin boynuna gevşek bir lastik septum yerleştirin.
- ~ 250 rpm'de 30 dakika için karıştırın ~ Çözelti, polimerin çözünmesi için.
- Çözeltisine 4-dimetilaminopiridin (DMAP) ~ 6.6 mg eklenir ve karıştırılarak çözülür.
- Balonun boyun sıkıca lastik septum yerleştirin. Çözelti karıştırmaya devam etmesine izin.
- Lastik septum ile, yavaşça, bir pozitif azot basıncı 2 iğne giriş, bir de açık bir iğne kullanılarak ~ 3 dakika süreyle N2 ile tasfiye balonbir çıkış olarak.
- N 2 giriş ve çıkışını sökün.
- Lastik septum içeri sokulan bir iğne ile donatılmış bir cam şırınga ile trietilamin 0.56 ml (4.0 mmol) (N Et 3) damla damla ekleyin.
- Lastik septum içeri sokulan bir iğne ile donatılmış bir cam şırınga yoluyla, akriloil klorür damla damla 0,65 ml (8,0 mmol) ilave edilir.
- Şişeye N2 girişi geri dönün ve içeriği ~ pozitif N2 basıncı altında 30 dakika karışmaya bırakın.
- 55 ºC yağ banyosu önceden ısıtın.
- Ayrılan ~ 30 dakika sonra, N2 girişi kaldırılır ve bir kondenser ile septum değiştirin.
- Önceden ısıtılmış bir yağ banyosu içine şişesi daldırın.
- Şişenin içindekiler, 20 saat boyunca karıştırılmaktadır.
- Ayrılan 20 saat sonra, yağ banyosundan çıkarın ve balon içeriği oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
- Bir dönen buharlaştıncı kullanarak şişeye DCM çözücüyü çıkarın.
- PHam PCL-DA ürünü urify.
- Şişeye etil asetat ~ 135 ml ekleyin ve ham PCL-DA çözülür.
- Yerçekimi temiz bir 250 ml'lik yuvarlak dipli bir şişeye filtre kağıdından çözelti filtre edin. (Not: Çözüm kolayca geçerek değil, filtre kağıdı üzerinde kalınlaştırmak böylece, dikkatli bir ısıtma tabancası ile hafif ısı uygulayın.).
- Bir dönen buharlaştıncı kullanarak, şişeden çözücü etil asetatın ayrılması.
- Şişeye, ~ DCM 140 ml ilave edilir ve ham PCL-DA çözülür.
- 500 ml'lik bir ayırma hunisine aktarın.
- Huni için, 2 M potasyum karbonat (3 K 2 CO) 13.5 ml ekleyin.
- Huni Cap. Yavaşça vana aracılığıyla basınç serbest bırakmak için özen huni tersini hafifçe bir veya iki kez dönen iki katmanları karıştırın. 3 kez tekrarlayın.
- Parafilm bir tabaka ile Kapağı yerine yerleştirin ve kanşım O / N (~ 12 saat) ayırmak için izin verir.
- Dip toplayın, ya da250 ml'lik bir Erlenmeyer şişesi içine Ganiç'in katmanı.
- Şişeye susuz magnezyum sülfat ~ 5 g (MgSO 4) ekleyin ve yavaşça girdap.
- Yerçekimi yuvarlak tabanlı bir şişeye, nitel filtre kağıdı ile ve temiz 250 ml karışımı filtre.
- Bir dönen buharlaştıncı kullanarak şişeye DCM çözücüyü çıkarın.
- Yüksek vakum altında kuru kalıntı DCM kaldırın. (Not: PCL-DA ışıktan uzak muhafaza edilmelidir.)
- 1H NMR 22,23 ile Açilleme onaylayın.
SMP Scaffold hazırlanması 2. (Şekil 1)
- Erimiş tuz şablonu hazırlayın.
- Çapı ~ 460 ± 70 um sodyum klorid (NaCl) partikülleri elde etmek için bir 425 um elek kullanın. (Not: Ortalama partikül büyüklüğü ImageJ yazılımı ile taramalı elektron mikroskobu [SEM] görüntülerden teyit edilebilir.) 14
- 3 ml bir cam şişe (J = 12,9 mm) için, daha önce elenmiş NaCI 1.8 g ekleyin.
- Yavaş yavaş şişeye dört kısım, ağırlık olarak% 7.5 (tuz ağırlığına dayalı olarak) DI su (0,146 g) içerisinde, ekleyin. Suyun her bir porsiyonunun eklenmesinden sonra metal bir spatula ile karıştırın.
- , Şişeyi Cap dokuda sarın ve bir santrifüj tüpüne dik yerleştirin. 3220 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj.
- Kapağını çıkarın ve hava-kuru O / N (~ 12 saat) izin verin.
- Yeni bir cam şişe içinde, DCM ml'si başına PCL-DA 0.15 g birleştirerek bir "makromer çözüm" hazırlanması. (Not:., Bir iskele için, ~ çözeltinin 1 mi hazırlanmalıdır) kap ve yaklaşık 1 dakika boyunca vorteks mikserde yüksek hızda çözelti karıştırılır.
- Yeni 3 ml bir cam şişe içinde, ağırlık olarak% 10 2,2-dimetoksi-2-fenil asetofenon 1-vinil-2-pirolidinon (DMP) (NVP) dayalı bir "foto-başlatıcı bir çözüm" hazırlanması. NVP 1 ml DMP 0.115 g 'ını. (Işığı engellemek için) alüminyum folyo ile sarın, Cap ve vorteks mikserde yüksek hızda çözüm karıştırmak: (180 ul gereklidir ~, tek iskele için. Not)~ 1 dakika karıştırıldı. (Not: Gelişmiş hazırlanmış, çözelti soğutulmuş ve ışıktan korunmalıdır.)
- Alüminyum folyo ile (kapak hariç) makromer çözeltisi içeren vial Wrap (ışık bloke etmek için) ve pipet ile 15 hacim% ekleme foto-başlatıcı çözeltisi (makromer solüsyonunun toplam miktarına dayalı olarak). Cap ve yaklaşık 1 dakika boyunca vorteks mikserde yüksek hızda çözelti karıştırılır.
- Alüminyum folyo ile (kap hariç) sigortalı tuz şablonu içeren flakon sarın (ışığı engellemek için) ve pipet aracılığıyla önceden hazırlanmış makromeri / photoinitiator çözüm eklemek (~ 0.6 ml veya şablon kadar tamamen kaplıdır).
- , Şişeyi Cap dokuda sarın ve bir santrifüj tüpüne dik yerleştirin. Şablonun boyunca makromeri çözümü dağıtmak için 1260 xg'de 10 dakika boyunca santrifüj.
- Alüminyum folyo çıkarın şişe kapağını açmak ve 3 dakika boyunca UV ışığı (365 nm, 25 W) maruz kalmaktadır. Hava kuru O / N.
- "Tuz içeren scaffol kaldırpuanlama ve cam şişe üst çatlatma sonra cımbız ile şişeden d ".
- (: 1 hacim: hacim 1) 400 ml'lik bir cam kaba, ~ çözücü, su / etanol 200 ml hazırlanır.
- Günlük solvent değişiklikler ile 4 gün için çözücü, su / etanol içine daldırılmış iskele koruyun.
- Solvent ve hava kuru O / N iskele çıkarın.
3. SMP Scaffold için Polydopamine Kaplama Uygulanması (Şekil 1)
- Teflon kaplı karıştırma çubuğu ile donatılmış 400 ml'lik bir cam kaba, bir dopamin hidroklorür çözeltisi ~ 200 ml (10 mM Tris tamponu içinde 2 mg / ml, pH = 8,5, 25 ° C) hazırlanır. ~ 150 rpm'de karıştırılır.
- Yarım mesafe iskelesi ile iskele içine ~; bir tek kullanımlık iğne (gösterge = 20 uzunluk = 40 mm) yerleştirin. Iğne hub etrafında bir tel sarın.
- Beher kenarına tel tespit tarafından karıştırma dopamin çözeltisi içine (çözüm yüzeyi üzerinde iğne hub) ile iskele Batmak.
- Iğne hub içine şırınga yerleştirerek ve iskele dışına havayı çekmek için bunu kullanarak iskele degas. (Not: daha fazla hava çıkarılabilir ve çözüm tamamen iskele sızmış zaman gazdan arındırma tamamlandı.)
- 16 st için karıştırmadan dopamin solüsyonunda daldırılmış iskele koruyun.
- Çözeltiden iskele çıkarın ve iğneyi çıkartın. 24 saat boyunca oda sıcaklığında bir vakumlu fırın içinde DI su ve kuru ile durulayın.
- 1 saat 85 ºC fırında iskele yerleştirin.
- Iskele oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Nihai silindirik iskele ~ 6 mm çap x ~ 5 mm yüksekliğinde olacak.
4. Değerlendirme "Kendinden uydurma" Davranış
- Kalınlığı ~ 5 mm sert plastik bir levha kullanarak "düzensiz CMF kusur modeli" hazırlayın. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, ~ 6 mm'den biraz daha az bir ortalama çapa sahip plastik levha içindeki bir boşluğu oluşturmak için bir matkap kullanın.
- Ab olarakEaker, ~ 60 ° C bir sıcaklığa kadar (tuzlu su klinik kullanımı temsil eden), ısı DI suyun.
- Beher ~ 60 ºC su içine iskele yerleştirin. Su tüm alanları açığa, su yüzeyinin altında iskele itmek için cımbız kullanın. ~ 2 dakika boyunca veya iskele fark (Şekil 2B) yumuşayıncaya kadar devam edin.
- Beher gelen iskele çıkarın ve hemen modeli defekt içine (elle) tuşuna basın.
- RT (~ 5-10 dk) (Şekil 2C) soğumasını bekleyin.
- Yeni sabit Geçici bir şekil ve nispeten daha bükülmez durumuna (Şekil 2D) dönüşünü gözlemlemek için bir kusur çıkar.
5. Test Şekil Hafıza Davranışı
- Dinamik mekanik analizciyi kullanarak (DMA, burada kullanıldığı şekilde, örneğin bir TA Instruments Q800), iki döngü (N) şekil sabitliği (Rf) belirlemek ve üzerinde bir platform üzerinde bir gerilme kontrollü siklik termal, mekanik sıkıştırma testiKurtarma (R r) (Şekil 3) şekil.
- 5 dakika boyunca 60 ° C (T yüksek) için dengelenmesi.
- % 50 / dakika maksimum gerilme (ε m =% 50) sıkıştırır.
- Ε m (5 dk) tutun.
- 25 ° C (T düşük) soğutulur ve 10 dakika Geçici bir şekil vermenin düzeltmek boyunca muhafaza edilir.
- Yükü alın.
- (U ε) stressiz durumda nihai gerginlik ölçün.
- 60 ° C (T yüksek) kadar yeniden ısıtın ve 10 dk kalıcı şekil kurtarmak için korumak.
- Kazanılan zorlanma (ε p) ölçün.
- Hala (T yüksek) 60 ° C'de, 2. döngüsü başlatmak (N = 2) 1. döngüden sonra kurtarıldı yüksekliği (N = 1)% 50 iskele sıkıştırarak iken.
- 5.1 Tekrar.3-5.1.8, N = 2.
- Aşağıdaki denklemler kullanılarak N = 1 ve 2 R ve R f r hesaplayın:
Rf (N) = [u ε (N) / ε m] R r (n) = [ε m - ε p (N)] / [ε m - ε p (N-1)]
6. görselleştirme Gözenek Boyutu ve Gözenek Bağlanırlığı bir
- Tarama elektron mikroskobu kullanılarak (SEM; örneğin burada kullanıldığı şekliyle, bir FEI Quanta SEM), gözenek boyutu gözlemlemek ve birleştiricisi gözenek.
- Cımbız kullanarak, SMP iskele tutun 1 dakika boyunca sıvı N 2 daldırın.
- Temiz bir jilet ile iskele ortasında boyunca sıvı N2 ve kırık çıkarın.
- Karbon bandı kullanarak, numune üzerine SMP iskele yarım birini yapıştırmayınKırık yüzeyi yukarı bakacak şekilde sahneye.
- Au-Pt (~ 4 nm) ile ceket sputter.
- 10-15 kV (Şekil 4A) tavsiye edilen bir ivmelendirici gerilim SEM görüntüsünü yakalar.
In vitro biyoaktivitesi 7. Test
- 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içine, ~ 1X SBF 24, 30 ilave edin.
- Orijinal, silindirik kalıplı kalıcı şekil bir iskele edinin. Temiz bir bıçak kullanarak (dairesel kenar boyunca) devre, iskele kesin.
- Hazırlanan santrifüj tüpüne ve kapak içine ayrı bir iskele yarısını yerleştirin.
- Herhangi bir SBF değişikliklerle, statik koşullar altında bir su banyosu içinde 37 ° C 'de muhafaza tüpü.
- 14 gün sonra, 24 saat süre ile SBF ve kuru hava ile ilgili iskele çıkarın.
- Karbon bandı kullanarak, kırık yüzeyi yukarı bakacak şekilde örnek sahneye iskele yapıştırın.
- Au-Pt (~ 4 nm) ile ceket sputter.
- Bir yeniden at SEM görüntü yakalamak10-15 kV (Şekil 4B) hızlanan gerilimi övdü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ortaya çıkan PCL tabanlı SMP iskele kendini saran bir model, CMF defekt içine (Şekil 2) yeteneğine sahiptir. Kısa süreli sonra tuzlu su (~ 60 ° C) ısıtmak için, silindirik bir skafold skafold elle bastırılması ve model kusur içinde genişler sağlayan yumuşatır. Oda sıcaklığına soğutulduktan sonra, skafold kusur çıkarıldıktan sonra tutulan yeni geçici şekline sokuluşu sabitlenir.
Bir SMP skafoldun şekil belleği davranışı şekil sabitliğine (Rf) ve şekli geri (R r) (Şekil 3) cinsinden streyn kontrollü siklik termal, mekanik basınç deneyi ile ölçülür. Bu PCL tabanlı SMP iskele için, döngüler için değerler (%) N = 1 ve 2: Rf (1) = 102.5 0.7, Rf (2) = 101,8 0,3, R r (1) 95,3 0,9 ve R, R (2) 99.8 0.2 6 =.
Görüldüğü gibi SMP iskele son derece birbirine bağlı gözenek morfolojisi görüntülerSEM görüntüleme ile (Şekil 4A). Bu Elenen tuzuna küçük bir su miktarı (Şekil 1) eklenmesi ile oluşturulan bir kaynaşık bir tuzu şablon kullanılması ile elde edilmiştir.
Yapay vücut sıvısı maruz bırakıldıktan sonra, 14 gün boyunca (SBF 1X), SEM görüntüleme böylece skafold biyoaktivitesinin gösteren HKP (Şekil 4B) oluşumunu teyit etmektedir.
Polydopamine. ASMP iskele ile kaplanmış SMP iskele hazırlanması için Şekil 1. şematik tuz şablonu kaynaşmış istihdamı polikaprolakton diakrilat (PCL-DA) bir çözücü döküm partikül-liçi (SCPL) yöntemini kullanarak fotokimyasal tedavi dayalı açıklanan protokol ile imal edilmektedir ve biyolojik olarak aktif polydopamine kaplamanın uygulanması. 85 ° C (T> T trans) final ısıl işlem iskele den indüklerdırılmasına. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Kendi kendine uyan davranış Şekil 2. Gözlem. Silindirik bir SMP skafold (~ x ~ 5 mm yüksekliğinde, 6 mm çapında), bir "düzensiz hata modeli" ile monte edilir (A) aşağıdaki gibi. Su ısıtma üzerine ~ 60 ºC (T> T trans), iskele yumuşatır ve model defekt (C) içinde ("monte") mekanik olarak basılabilir böylece (B) dövülebilir ve olur. Oda sıcaklığına soğutulduktan sonra, SMP iskele kaldırıldı ve yeni sabit geçici şekil (D) korur. ~ 60 ° C'de daha sonra ısıtılmasından sonra, skafold, orijinal genel silindir biçiminde şekil kurtarma maruz kalır. 
Şekil hafızalı davranışı Şekil 3. ölçülmesi. Bir SMP iskele şekil hafızalı davranışı şekil sabitliği (R f) ve esas şekil kurtarma (R r) belirlemek için bir iskele üzerinde büyük bir yük kontrollü halkalı-termal mekanik kompresyon testi ile ölçülür ε m ölçümleri, ε u ve ε s. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Por 4. Gözlem Şekile bağlantısallığı ve hidroksiapatit (HAP) oluşumu. kaplanmamış, ısıl işlem görmüş SMP iskele Temsilcisi SEM görüntüleri (ölçek çubuğu = 200 mikron) (A) ve kaplamalı, 14 gün boyunca SBF (1X) maruziyetten sonra ısıl işlem görmüş iskele (ölçek çubuğu = 50 um) (B). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, kendi kendine uyan davranışı bir polydopamine kaplı, PCL-bazlı yapı iskelesinin hazırlanmasını, hem de Osteoindüktivite kullanılabilirlik ve biyolojik aktivite tarif düzensiz CMF kemik defektlerinin tedavisinde yararlı hale getirir. Protokol Yönleri çeşitli iskele özelliklerini değiştirmek için değiştirilebilir.
Protokol UV kür izin vermek için bir PCL-diol Açilleme ile başlar. Bildirilen örnekte, PCL-diol M n ~ 10.000 g / mol'dür. Bununla birlikte, uygun bir şekilde PCL-DA sırasıyla bir artış, çapraz bağlanma yoğunluğu azaltmak ya da kullanılabilen bir yüksek veya daha düşük Mn sahip bir PCL diolün sentezi sırasında kullanılan akriloil klorür miktarı ve Et3N ayarlayarak.
Erimiş tuz şablon protokolü (Şekil 1) önemli bir bileşenidir. Ortalama tuz boyutu ortaya çıkan iskele gözenek boyutunu belirler. Yukarıda tarif edilen örnekte, ortalama tuzlu boyutu oldu ~ 460 ± 70# 181; m. Daha küçük bir tuzu boyutu kullanılabilmesine rağmen, bu skafold, gözenek boyutunu azaltmak nihai ısı işlemi aşaması esnasında büzülme geçirmektedir akılda tutulmalıdır. Tuz Eleme, bu nedenle, bir gözenek boyutu dağılımına tuzu boyutu dağılımına azaltılması için kullanılır ve kapanır. Yüksek birbirine gözenekleri olan bir iskele üretmek için, tuz füzyon küçük bir su miktarının ilave edilmesi ile indüklenmiştir (7,5 ağırlıkça% tuzu ağırlığına dayalı olarak). Bu, kısmen, sürekli bir poragen şablonu 25,26 izole edilmiş NaCl parçacıkları çözmek bilinmektedir. Ortalama bir tuzu boyutuna bağlı olarak, su ilave olarak 14 ayarlanmalıdır. Ayrıca, tuz füzyon sırasında, su yavaş yavaş, mekanik karıştırılır ve nihayet eşit dağılımını ve tuz parçacıklarının ambalaj sağlamak için santrifüj eklenmelidir.
Kaynaşık bir tuzu şablonu oluşmuş olması, PCL-DA solvent dökümü için DCM içerisinde çözündürülür. Tarif edilen protokol olarak, concentratioDCM içindeki 1 ml başına PCL-DA 0.15 g N kullanılmıştır. Bu konsantrasyon artırılabilir veya azaltılabilir. Artan konsantrasyonlarda skafold modülüne artması beklenmektedir ancak bununla birlikte, aynı zamanda daha düşük bir gözenek bağlantılı hale 14 iskeleleri üretebilir.
Ön-madde çözeltisi tuzu kalıp üzerine eklendikten sonra, santrifüj şablon içine difüzyonuna yardımcı olmak amacıyla yararlıdır. Hızlı UV kür sonrasında, hava kurutma DCM çözücünün buharlaşmasına izin verir. Tuz şablonu kaldırmak için 4 gün boyunca (hacim: hacim 1 1) kalıptan çıkarıldıktan sonra, skafold, su / etanol ıslatılır. SEM görüntüleme oldukça birbirine gözenek morfolojisine (Şekil 4A) oluşumunu teyit etmektedir.
Bir polydopamine kaplama biyoaktivitesinin vermek için skafoldun gözenek duvarları uygulanır. Nedeniyle ortaya çıkan iskele büzülme, nihai ısıl işlem adım 6 öncesi kaplama uygulamak en iyisidir. Buna ek olarak, gaz gidermeSulu dopamin çözeltisi içinde batık ise iskele infiltrasyon yardımcı olur. Çözelti içinde batık gazı alınmış iskele kalıntıları üniforma polydopamine kapsama kolaylaştırmak için. Bir kez kaplanmış ve iyice çalkalandı, daha önce beyaz bir skafold polydopamine 21 bir kahverengi bir karakteristik sergiler. Böylece, yapı iskeletinin her yerinde kapsama polydopamine difüzyon teyit etmek için bir iskele bölünmesiyle görsel muayene ile değerlendirilebilmektedir.
Polydopamine kaplamanın uygulanmasından sonra bir son ısı işlemiyle işleme (85 ºC, 1 saat) uygulanır. Belirtildiği gibi, bu işlem, skafold büzülmesi ile sonuçlanır. Ancak, ısıl işlem yakından yakınlık belki de PCL kristal etki (yani anahtarlama segment) yeniden yapılanmasının, şekil bellekli davranışı 14 ulaşmak için gereklidir.
Şekil 2 de gösterildiği gibi, SMP skafold nedeniyle beni şekil thermoresponsive onun için kendini saran model kusur eldemory doğası. Pozlama tuzlu su ısıtmak için (~ 60 ° C) yumuşatılmış iskelesi modeli noksanlık içine preslenecek olabilir, öyle ki, PCL kristalin etki, endüklenmiş erime. Manuel basınç serbest bırakıldığı zaman, şekil kurtarma düzensiz sınırları doldurmak için iskele genişleme terfi. Oda sıcaklığına soğutulduktan sonra, PCL kristalin alanları kusur çıkarıldıktan sonra muhafaza edildi, yeni, geçici şekil iskele sabitleme ile birlikte, dönüştürülmüş. Daha önce, kaldırıldı iskele kenarlarında delikler kalıp 6 ile temas rağmen oldukça açık kaldığını doğruladı.
Streyn kontrollü siklik termal, mekanik basınç deneyi (Şekil 3) ile ölçüldüğünde, ideal bir şekil belleği davranışı% 100 Rf ve R r değerleri ile karakterize edilir. Tarif SMP iskele için, döngü 1 ve 2 için Rf değerleri hafif>% 100 6 idi. Rf önce biraz gr olduğu gözlenmiştir100% 14.27 den dolayı daha kompakt yapılar 27 içine veya PCL kompresyonu ile indüklenen yeniden kristalleştirme PCL bölümlerinin yeniden kristalleştirme şekil elde sabitlenmesi sırasında sıkıştırma gerilimine hafif bir artışa yiyen. Buna ek olarak, R, döngü 2 ila 6 çevrim 1 yükselmiştir r. R r değerlerindeki artış, daha önce katı 28,29,22 ve gözenekli BBOPler 13,14,23 da dikkat çeker. Bu birinci aşama sırasında, işleme gelen bakiye streyn sonraki döngü 7 öyle ki şekil geri kazanımı artar kaldırılır düşünülmektedir.
Açıklanan doku mühendisliği iskele CMF kemik defektlerinin başarılı tedavisi için kritik özellikleri belirli kümesini ulaşır. Iskele düzensiz CMF kemik defekti içindeki yeteneği "self-fit" aracılığıyla osseointegrasyon kolaylaştırmak için bekleniyor. Osteoconductivity olarak elde gözenek bağlantılı hale göre tahminiskele biyobozunurluk. In vitro testleri (Şekil 4B) içinde HA oluşumu ile gösterildiği gibi Nihayet, polydopamine kaplama, skafold bioactive. Bu biyoaktivite kemik çevreleyen doku ile entegrasyonu ve bağ kolaylaştırmak için tahmin edilmektedir. Böylece, bu iskele CMF kemik defekti tamir için bir otograftlama alternatif ve geleneksel kemik yerine geçen temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar Texas A & M University Mühendislik teşekkür Bu araştırmanın mali destek için İstasyonu (TEES) Deney. Lindsay Nail minnetle Azınlık Katılım Texas A & M University Louis Stokes Alliance (LSAMP) ve Ulusal Bilim Vakfı (NSF) Lisansüstü Araştırma Bursu Programı (GRFP) destek kabul eder. Dawei Zhang teşekkür Texas A & M Üniversitesi Tez Bursu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol) | Sigma-Aldrich | 440752 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | D65100 | Dried over 4A molecular sieves |
| 4-dimethylaminopyridine (DMAP) | Sigma-Aldrich | D5640 | |
| Triethylamine (Et3N) | Sigma-Aldrich | T0886 | |
| Acryloyl chloride | Sigma-Aldrich | A24109 | |
| Ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
| Potassium carbonate (K2CO3) | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher | M65 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| 2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP) | Sigma-Aldrich | 196118 | |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | H8502 | |
| Tris buffer (2mol/L) | Fisher | BP1759 | Used at 10 mM concentration, pH = 8.5 |
| Sieve | VWR | 47729-972 | |
| UV-Transilluminator (365 nm, 25 W) | UVP | 95-0426-02 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) | TA Instruments | Q800 | |
| High Resolution Sputter Coater | Cressington | 208HR | |
| Scanning Electron Microscope (SEM) | FEI | Quanta 600 |
References
- Neovius, E., Engstrand, T. Craniofacial reconstruction with bone and biomaterials: review over the last 11 years. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 63, 1615-1623 (2010).
- Elsalanty, M. E., Genecov, D. G.
- Hollister, S. J., et al.
- Albrektsson, T., Johansson, C.
- Blokhuis, T. J., Arts, J. J. C. Bioactive and osteoinductive bone graft substitutes: Definitions, facts and myths. Injury. 42, S26-S29 (1016).
- Zhang, D., et al. A bioactive “self-fitting” shape memory polymer scaffold with potential to treat cranio-maxillo facial bone defects. Acta Biomater. 10, 4597-4605 (2014).
- Lendlein, A., Kelch, S.
- Hu, J., Zhu, Y., Huang, H., Lu, J. Recent advances in shape-memory polymers: Structure, mechanism, functionality, modeling and applications. Prog Polym Sci. 37, 1720-1763 (2012).
- Middleton, J. C., Tipton, A. J. Synthetic biodegradable polymers as orthopedic devices. Biomaterials. 21, 2335-2346 (2000).
- Sun, H., Mei, L., Song, C., Cui, X., Wang, P. The in vivo degradation, absorption and excretion of PCL-based implant. Biomaterials. 27, 1735-1740 (2006).
- Woodruff, M. A., Hutmacher, D. W. The return of a forgotten polymer-Polycaprolactone in the 21st century. Prog Polym Sci. 35, 1217-1256 (2010).
- Wang, S., Lu, L., Gruetzmacher, J. A., Currier, B. L., Yaszemski, M. J. Synthesis and characterizations of biodegradable and crosslinkable poly(ε-caprolactone fumarate), poly(ethylene glycol fumarate), and their amphiphilic copolymer. Biomaterials. 27, 832-841 (2006).
- Zhang, D., Petersen, K. M., Grunlan, M. A. Inorganic-organic shape memory polymer (SMP) foams with highly tunable properties. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 186-191 (2012).
- Zhang, D., Burkes, W. L., Schoener, C. A., Grunlan, M. A. Porous inorganic-organic shape memory polymers. Polymer. 53, 2935-2941 (2012).
- Van der Stok, J., Van Lieshout, E. M., El-Massoudi, Y., Van Kralingen, G. H., Patka, P. Bone substitutes in the Netherlands-a systematic literature review. Acta Biomater. 7, 739-750 (2011).
- Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318, 426-430 (2007).
- Hong, S., et al. Non-covalent self-assembly and covalent polymerization co-contribute to polydopamine formation. Adv Funct Mater. 22, 4711-4717 (2012).
- Ryu, J., Ku, S. H., Lee, H., Park, C. B. Mussel-inspired polydopamine coating as a universal route to hydroxyapatite crystallization. Adv Funct Mater. 20, 2132-2139 (2010).
- Lee, Y. B., et al. Polydopamine-mediated immobilization of multiple bioactive molecules for the development of functional vascular graft materials. Biomaterials. 33, 8343-8352 (2012).
- Wu, C., Fan, W., Chang, J., Xiao, Y. Mussel-inspired porous SiO 2 scaffolds with improved mineralization and cytocompatibility for drug delivery and bone tissue engineering. J Mater Chem. 21, 18300-18307 (2011).
- Ku, S. H., Ryu, J., Hong, S. K., Lee, H., Park, C. B. General functionalization route for cell adhesion on non-wetting surfaces. Biomaterials. 31, 2535-2541 (2010).
- Schoener, C. A., Weyand, C. B., Murthy, R., Grunlan, M. A. Shape memory polymers with silicon-containing segments. J Mater Chem. 20, 1787-1793 (2010).
- Zhang, D., Giese, M. L., Prukop, S. L., Grunlan, M. A. Poly(ε-caprolactone)-based shape memory polymers with variable polydimethylsiloxane soft segment lengths. J Polym Sci Pol Chem. 49, 754-761 (2011).
- Kokubo, T., Takadama, H. How useful is SBF in predicting in vivo bone bioactivity. Biomaterials. 27, 2907-2915 (2006).
- Murphy, W. L., Dennis, R. G., Kileny, J. L., Mooney, D. J. Salt fusion: an approach to improve pore interconnectivity within tissue engineering scaffolds. Tissue Eng. 8, 43-52 (2002).
- Yang, Q., Chen, L., Shen, X., Tan, Z. Preparation of polycaprolactone tissue engineering scaffolds by improved solvent casting/particulate leaching method. J Macromol Sci Phys. 45, 1171-1181 (2006).
- Madbouly, S. A., Kratz, K., Klein, F., Lüzow, K., Lendlein, A. Thermomechanical behaviour of biodegradable shape-memory polymer foams. 2009 MRS Spring Meeting, 1190, Mater Res Soc Symp Proc. (2009).
- Luo, X., Mather, P. T. Preparation and characterization of shape memory elastomeric composites. Macromolecules. 42, 7251-7253 (2009).
- Lendlein, A., Schmidt, A. M., Langer, R. AB-polymer networks based on oligo(ɛ-caprolactone) segments showing shape-memory properties. Proc Natl Acad Sci. 98, 842-847 (2001).
