Introduction
Momenteel beschouwd als de gouden standaard van cranio-maxillofaciale (CMF) botdefect behandelingen, is transplantatie van geoogst autologe transplantaten gehinderd door complexe enten procedures, donorplaats morbiditeit en beperkte beschikbaarheid 1. Een bijzonder probleem is het vormgeven en de vaststelling van de starre autograft stevig in het defect om osseointegratie te verkrijgen en graft resorptie te voorkomen. Tissue engineering is onderzocht als een alternatieve strategie om autografting en synthetische botvervangers (bv botcement) 2,3. Cruciaal voor het succes van een tissue engineering aanpak is een steiger met een bepaalde set eigenschappen. Ten eerste, om osseointegratie te bereiken, moet het schavot nauw contact met aangrenzend botweefsel 4 vormen. Het schavot moet ook osteoconductief zijn, waardoor celmigratie, diffusie van voedingsstoffen en neotissue depositie 4,5. Dit gedrag wordt algemeen bereikt met biologisch afbreekbare SCAffolds vertonen een sterk onderling verbonden poriën morfologie. Tenslotte moet het schavot bioactief zijn om integratie en binding bevorderen omliggende botweefsel 5.
Hier presenteren we een protocol bij een tissue engineering scaffold met deze eigenschappen te bereiden. Belangrijk is dat deze scaffold vertoont het vermogen tot "zelf-fit" in onregelmatige CMF beschadigingen als gevolg van het vormgeheugen gedrag 6. Thermoresponsieve vormgeheugen polymeren (SMP) is bekend dat vormverandering ondergaan bij blootstelling aan hitte 7,8. SMP bestaan uit "netpoints" (dwz chemische of fysische verknopingen) waar de vaste vorm en "switching segmenten", die de tijdelijke vorm te behouden en te herstellen van de permanente vorm te bepalen. De schakelsegmenten vertonen een thermische overgangstemperatuur (T trans) die behoren tot de glasovergang (Tg) of smeltovergang (Tm) van het polymeer. AlsHierdoor kunnen SMP's achtereenvolgens worden vervormd tot een tijdelijke vorm bij T> T trans, in de tijdelijke vorm bij T <T trans vaste en hersteld tot de vaste vorm bij T> T trans. Zo zou een SMP scaffold "self-fitting" als volgt 6 te bereiken binnen een CMF defect. Na blootstelling aan warme zoutoplossing (T> T trans), zou een SMP steiger kneedbaar geworden, waardoor een generiek bereid cilindrische steiger aan de hand gedrukt in een onregelmatige defect zijn, met terugwinning vorm bevorderen uitbreiding van de steiger om het defect grens. Na afkoelen (T <T trans), zou het schavot terugkeren naar zijn relatief stijvere toestand met de vorm vastheid handhaven van zijn nieuwe tijdelijke vorm in het defect. In dit protocol wordt een SMP scaffold bereid uit polycaprolacton (PCL), een biologisch afbreekbaar polymeer uitgebreid bestudeerd voor weefselregeneratie en andere biomedische toepassingen 9-11. Voor het geheugen vorm, the Tm van PCL dient als T trans- en varieert tussen 43 en 60 ° C, afhankelijk van het molecuulgewicht van de PCL 12. In dit protocol, de T trans (dwz T m) van de steiger is 56,6 ± 0,3 ºC 6.
Om osteoconductiviteit te bereiken, werd een protocol ontwikkeld om PCL-gebaseerde SMP steigers met sterk onderling verbonden poriën gebaseerd op een methode 6,13,14-solvent casting deeltjes-uitloging (SCPL) te maken. Polycaprolacton diacrylaat (PCL-DA) (Mn = ~ 10000 g / mol) werd gebruikt om snelle, fotochemische verknoping mogelijk te maken en werd opgelost in dichloormethaan (DCM) om oplosmiddel-gieten via zout sjabloon toe. Volgende fotochemische cure en verdamping van het oplosmiddel, werd het zout template verwijderd door uitspoeling in het water. De gemiddelde grootte van zout regelt steiger poriegrootte. Belangrijk is dat het zout template versmolten met water voorafgaand aan de oplosmiddel-gieten om porie interconnectivi bereikenty.
Bioactiviteit werd bijgebracht de SMP steiger door de in situ vorming van een polydopamine bekleding op poriewanden 6. Biologische activiteit wordt vaak ingebracht in scaffolds door de opname van glas of glaskeramiek vullers 15. Desalniettemin kunnen leiden tot ongewenste brosse mechanische eigenschappen te geven. Dopamine is aangetoond dat een hechtende, polydopamine dunne laag op allerlei substraten 16-19 vormen. In dit protocol werd het SMP scaffold onderworpen aan een licht basische oplossing (pH = 8,5) van dopamine een nanothick bekleding van polydopamine alle poriën wandoppervlakken 6 vormen. Naast de verbetering oppervlakte hydrofiliciteit voor betere celadhesie en spreiding is polydopamine aangetoond bioactieve wat betreft de vorming van hydroxyapatiet (HAp) na blootstelling aan gesimuleerde lichaamsvloeistof (SBF) 18,20,21 te zijn. In een laatste stap wordt het beklede scaffold blootgesteld aan een warmtebehandeling bij 85 ° C (T> T trans) whIch leidt tot verdichting schavot. Warmtebehandeling werd eerder opgemerkt essentieel voor het geheugen steiger vorm van gedrag te zijn, misschien te wijten aan PCL kristallijne domeinen reorganiseren om dichter 14.
We beschrijven tevens de werkwijzen om het zelf-fitting gedrag in een onregelmatige model defect kenmerkend vormgeheugen gedrag qua-stam gecontroleerde cyclische thermische mechanische compressietests (dwz vormherstel en vorm vastheid), poriën morfologie en in vitro bioactiviteit. Strategieën om steiger eigenschappen op maat worden ook gepresenteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Synthesizing PCL-DA Macromeer
- Voer de acrylering reactie.
- Weeg 20 g PCL-diol (M n = ~ 10000 g / mol) in een 250 ml rondbodemkolf uitgerust met een met teflon bedekte magnetische roerstaaf.
- Los de PCL-diol in DCM.
- Voeg 120 mLlof DCM aan de kolf (concentratie = 0,17 g / ml).
- Plaats een rubber septum losjes in de hals van de kolf om drukopbouw te vermijden als behandeling verdamping van DCM.
- Roer oplossing ~ 30 min bij 250 rpm ~ volledig oplossen van het polymeer.
- Voeg ~ 6,6 mg 4-dimethylaminopyridine (DMAP) aan de oplossing en oplossen onder roeren.
- Plaats een rubber septum stevig in de hals van de fles. Laat de oplossing verder geroerd.
- Door het rubber septum voorzichtig zuiveren de kolf met N2 voor ~ 3 min met behulp van een positieve N2-druk naald inlaat en een open naaldals een uitlaatklep.
- Verwijder de N2 inlaat en uitlaat.
- Voeg 0,56 ml (4,0 mmol) triethylamine (Et3N) toegevoegd via een injectiespuit voorzien van een naald door het rubberen septum.
- Voeg 0,65 ml (8,0 mmol) acryloylchloride druppelsgewijs via een injectiespuit voorzien van een naald door het rubberen septum.
- Zet de N2 inlaat van de kolf en laat de inhoud geroerd onder positieve druk gedurende 2 N ~ 30 min.
- Verwarm een oliebad tot 55 ° C.
- Na de toegekende ~ 30 min, verwijder de N2 inlaat en vervang het septum met een koeler.
- Dompel de kolf in de voorverwarmde oliebad.
- Laat de inhoud van de kolf roeren 20 uur.
- Na de toegekende 20 uur, verwijder de kolf uit het oliebad en laat de inhoud afkoelen tot kamertemperatuur.
- Met behulp van een rotatieverdamper verwijderd DCM oplosmiddel uit de kolf.
- Purify het ruwe PCL-DA product.
- Aan de kolf, voeg ~ 135 ml ethylacetaat en los het ruwe PCL-DA.
- Gravity Filtreer de oplossing door filtreerpapier in een schone 250 ml rondbodemkolf. (Opmerking: Solution kan verdikken op het filter papier, niet gemakkelijk passeren Als dat zo is, zorgvuldig toepassen milde warmte met een pistool verwarmen..)
- Met behulp van een rotatieverdamper verwijderd ethylacetaat oplosmiddel uit de kolf.
- Aan de kolf, voeg ~ 140 ml DCM en los het ruwe PCL-DA.
- Breng de inhoud van een 500 ml scheitrechter.
- Om de trechter, voeg 13,5 ml van 2 M kaliumcarbonaat (K 2 CO 3).
- Cap de trechter. Meng de twee lagen door het omkeren van de trechter en wervelende voorzichtig een of twee keer, de zorg om de druk via de kraan. Herhaal dit 3 keer.
- Plaats de dop met een laag Parafilm en laat het mengsel O / N (= 12 uur) te scheiden.
- Het verzamelen van de bodem, ofnische laag in een 250 ml erlenmeyer.
- Voeg ~ 5 g watervrij magnesiumsulfaat (MgSO4) aan de kolf en zwenk.
- Gravity filter het mengsel door kwalitatief filterpapier en in een schone 250 ml rondbodemkolf.
- Met behulp van een rotatieverdamper verwijderd DCM oplosmiddel uit de kolf.
- Droog onder hoog vacuüm om de resterende DCM verwijderen. (Let op: PCL-DA moet worden bewaard van het licht.)
- Bevestig acrylering met 1H NMR 22,23.
2. Voorbereiden van de SMP Steiger (figuur 1)
- Bereid de gesmolten zout template.
- Gebruik een 425 urn zeef natriumchloride (NaCl) deeltjes 460 ± 70 urn ~ diameter. (Let op: Gemiddeld deeltjesgrootte kan worden bevestigd van scanning elektronenmicroscopie [SEM] beelden met ImageJ software.) 14
- Aan een 3 ml glazen flesje (ID = 12,9 mm), voeg 1,8 g van het eerder gezeefd NaCl.
- Voeg langzaam in vier porties, 7,5 gewichts% (gebaseerd op het gewicht zout) DI water (0,146 g) aan het flesje. Meng met een metalen spatel na toevoeging van elke portie water.
- Cap het flesje, wikkel in het weefsel en plaats verticaal in een centrifugebuis. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 3220 x g.
- Verwijder de dop en laat drogen aan de lucht O / N (~ 12 uur).
- In een nieuw glazen flesje, stelt een "oplossing van macromeren" door het combineren van 0,15 g PCL-DA per ml DCM. (NB:. Voor een steiger, ~ 1 ml oplossing worden bereid) Cap en meng de oplossing bij hoge snelheid op een vortex menger gedurende ~ 1 minuut.
- In een nieuw 3 ml glazen flesje, stelt een "foto-initiator solution" gebaseerd op 10 gew% 2,2-dimethoxy-2-fenylacetofenon (DMP) in 1-vinyl-2-pyrrolidon (NVP). Combineer in 1 ml NVP 0,115 g DMP. (NB: Voor een steiger, ~ 180 ul is vereist.) Cap, wikkel in aluminiumfolie (om licht te blokkeren) en meng de oplossing op hoge snelheid op een vortex mixergedurende ~ 1 minuut. (Opmerking: als opgesteld in geavanceerde, moet de oplossing worden gekoeld en beschermd tegen licht.)
- Wikkel de flacon met de macromeer oplossing (exclusief de dop) met aluminiumfolie (om licht te blokkeren) en voeg via pipet 15 vol% (gebaseerd op het totale volume van de macromeer oplossing) van de foto-initiator-oplossing. Cap en meng de oplossing op hoge snelheid op een vortex mixer voor ~ 1 min.
- Wikkel de flacon met het gesmolten zout template (exclusief de dop) met aluminiumfolie (om licht te blokkeren) en voeg via pipet de eerder bereide macromeer / initiator-oplossing (~ 0,6 ml of totdat de sjabloon is volledig bedekt).
- Cap het flesje, wikkel in het weefsel en plaats verticaal in een centrifugebuis. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 1260 xg om de oplossing van macromeren gehele sjabloon te verdelen.
- Verwijder de aluminiumfolie, Haal het beschermkapje van de flacon en blootstellen aan UV-licht (365 nm, 25 W) gedurende 3 min. Lucht drogen O / N.
- Verwijder de "zout bevatten scaffold "van de flacon met een pincet na het noteren en breken de bovenkant van het glazen flesje.
- In een bekerglas van 400 ml, bereiden ~ 200 ml van een water / ethanol oplosmiddel (1: 1 vol: vol).
- Handhaving van de steiger ondergedompeld in het water / ethanol oplosmiddel voor 4 dagen met dagelijkse oplosmiddel veranderingen.
- Verwijder de steiger van het oplosmiddel en de lucht drogen O / N.
3. Het toepassen Polydopamine Coating om SMP Steiger (figuur 1)
- In 400 ml beker voorzien van een met teflon bedekte roerstaaf, te bereiden ~ 200 ml van een dopamine hydrochloride-oplossing (2 mg / ml in 10 mM Tris buffer, pH = 8,5, 25 ° C). Roer bij ~ 150 tpm.
- Plaats een wegwerpnaald (lengte = 40 mm; gauge = 20) in de scaffold, ~ de helft van de afstand door het schavot. Wikkel een draad rond de naald hub.
- Dompel de steiger (de naaldnaaf boven het oppervlak oplossing) in de oplossing roeren van dopamine verankerd de draad aan de rand van de beker.
- Ontgas de steiger door het plaatsen van een spuit in de naald hub en het te gebruiken om de lucht te trekken uit het schavot. (Opmerking: ontgassing is voltooid wanneer geen lucht meer kan worden verwijderd en de oplossing volledig geïnfiltreerd de steiger.)
- Handhaaf de scaffold ondergedompeld in de oplossing roeren van dopamine 16 uur.
- Verwijder de steiger van de oplossing en verwijder de naald. Spoelen met gedeïoniseerd water en droog in een vacuümoven bij kamertemperatuur gedurende 24 uur.
- Plaats het scaffold in een 85 ° C oven gedurende 1 uur.
- Laat het schavot afkoelen tot kamertemperatuur. De uiteindelijke cilindrische steiger zal ~ 6 mm diameter x ~ 5 mm hoog zijn.
4. Evaluatie van "Self-fitting" Gedrag
- Bereid een "onregelmatige CMF defect model" met een vel van stijf kunststof waarvan de dikte ~ 5 mm. Gebruik een boor om een leegte in de kunststof plaat te maken met een gemiddelde diameter iets kleiner dan ~ 6 mm, zoals getoond in figuur 2A.
- In abEaker, warmte DI water (die het klinisch gebruik van zout) tot een temperatuur van -60 ° C.
- Plaats de steiger in de beker van ~ 60 ºC water. Gebruik een pincet om het schavot te duwen onder het wateroppervlak, waardoor alle gebieden aan het water. Doorgaan ~ 2 minuten of totdat het schavot is merkbaar verzacht (Figuur 2B).
- Verwijder de steiger van de beker en onmiddellijk op (met de hand) in het model defect.
- Laat afkoelen tot kamertemperatuur (~ 5-10 min) (figuur 2C).
- Haal uit het gebrek aan de nieuwe, tijdelijke vaste vorm en de terugkeer van de relatief stijve toestand (figuur 2D) te observeren.
5. Testen Vormgeheugen Gedrag
- Met een dynamisch mechanische analyse (DMA, bijvoorbeeld een TA Instruments Q800 zoals hierin gebruikt), voert een stam gecontroleerde cyclische thermische mechanische samendrukkingsproef op een steiger over twee cycli (N) vorm vastheid (Rf) te bepalen envormherstel (Rr) (figuur 3).
- Equilibreren tot 60 ° C (T hoog) gedurende 5 min.
- Comprimeren tot een maximale rek (ε m = 50%) bij 50% / min.
- Houden op ε m (5 min).
- Koel tot 25 ° C (T laag) en gedurende 10 min naar het tijdelijke vorm vast.
- Verwijder de belasting.
- Meet de ultieme spanning in de stress-vrije staat (ε u).
- Verwarm tot 60 ° C (T hoog) en gedurende 10 min aan de permanente vorm vasthouden.
- Meet de teruggewonnen stam (ε p).
- Hoewel nog steeds bij 60 ° C (T hoog), start de 2e cyclus (N = 2) Door samendrukken van de steiger tot 50% van de hoogte teruggewonnen na 1 cyclus (N = 1).
- Herhaal 5.1.3-5.1.8 Voor N = 2.
- Bereken Rf en R R N = 1 en 2 met behulp van de volgende vergelijkingen:
Rf (N) = [ε u (N) / ε m] R r (N) = [ε m - ε p (N)] / [ε m - ε p (N -1)]
6. Visualiseren Poriegrootte en Pore interconnectiviteit
- Met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM, bijvoorbeeld een FEI Quanta SEM zoals hierin gebruikt), acht de poriegrootte en poriën interconnectiviteit.
- Met behulp van een pincet om de SMP schavot te houden, onder te dompelen in vloeibare N 2 voor 1 min.
- Verwijder uit vloeibare N2 en breuk langs het midden van het schavot met een schoon scheermesje.
- Met behulp van koolstof tape aanbrengen één van de SMP steiger helften op het monsterpodium met de gebroken naar boven.
- Sputteren jas met Au-Pt (~ 4 nm).
- Leg beeld SEM in een aanbevolen versnellingsspanning van 10-15 kV (Figuur 4A).
7. Het testen van in vitro bioactiviteit
- In een 50 ml centrifugebuis, voeg ~ 30 ml 1X SBF 24.
- Het verkrijgen van een steiger in de originele, cilindrisch-gevormde vaste vorm. Snijd de steiger in de helft (over de cirkelvormige rand) met een schoon mes.
- Plaats een individuele steiger helft in de voorbereide centrifugebuis en dop.
- Handhaaf de buis bij 37 ° C in een waterbad onder statische omstandigheden zonder SBF veranderingen.
- Na 14 dagen, verwijder het skelet van het SBF en drogen gedurende 24 uur.
- Met behulp van koolstof tape aanbrengen het schavot op het monster podium met de gebroken naar boven.
- Sputteren jas met Au-Pt (~ 4 nm).
- Leg beeld SEM bij een regeprezen versnellingsspanning van 10-15 kV (Figuur 4B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resulterende PCL gebaseerde SMP steiger staat zichzelf passen in een model CMF defect (figuur 2). Na korte blootstelling aan warme zoutoplossing (~ 60 ° C), de cilindrische scaffold verzacht zodat de steiger handmatig worden geperst en uitbreiding in het model defect. Na afkoelen tot KT wordt het skelet bevestigd in de nieuwe tijdelijke vorm die wordt gehandhaafd bij verwijdering van het defect.
De vormgeheugen gedrag van een SMP steiger wordt gekwantificeerd door-stam beheerste cyclische thermische mechanische compressietests qua vorm vastheid (Rf) en vormherstel (Rr) (figuur 3). Hiervoor PCL gebaseerde SMP schavot waarden (%) voor rijwielen N = 1 en 2 zijn: R f (1) = 102,5 0,7, Rf (2) = 101,8 0,3, R r (1) 95,3 0,9 en Rr (2) = 99,8 0,2 6.
De SMP steiger toont een sterk onderling verbonden poriën morfologie zoals waargenomenSEM beeldvorming (Figuur 4A). Dit werd bereikt door het gebruik van een gesmolten zout sjabloon, gevormd door toevoeging van een kleine hoeveelheid water om het zout gezeefd (figuur 1).
Na blootstelling aan gesimuleerde lichaamsvloeistof (SBF, 1X) gedurende 14 dagen, SEM beeldvorming bevestigt de vorming van HAp (figuur 4B) waardoor aangegeven scaffold bioactiviteit.
Figuur 1. Schematische voor de bereiding van SMP steiger bekleed met polydopamine. ASMP steiger wordt gefabriceerd via het protocol beschreven op basis van de fotochemische genezing van polycaprolacton diacrylaat (PCL-DA) met behulp van een oplosmiddel gieten deeltjes-uitloging (SCPL) methode in dienst gesmolten zout template en aanbrengen van een bioactieve coating polydopamine. De laatste warmtebehandeling bij 85 ° C (T> T trans) induceert scaffold dencatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. waarneming van zelf-passend gedrag. Een cilindrische SMP steiger (~ 6 mm diameter x ~ 5 mm hoog) wordt in een "onregelmatige defect model" gemonteerd (A) als volgt. Bij verhitting in water bij ~ 60 ° C (T> T trans), de steiger wordt verzacht en kneedbaar (B) en dus mechanisch worden gedrukt ("aangebracht") in het model defect (C). Na afkoelen tot kamertemperatuur wordt het SMP scaffold verwijderd en behoudt zijn nieuwe, tijdelijke vaste vorm (D). Bij daaropvolgende verwarming bij ~ 60 ° C, het skelet ondergaat vormherstel aan de oorspronkelijke, algemeen cilindrische vorm. 
Figuur 3. Meting van vormgeheugen gedrag. Het geheugen vorm gedrag van een SMP steiger wordt gekwantificeerd door middel van een stam gecontroleerde cyclische-thermische mechanische compressie-test op een steiger aan vorm vastheid (R f) en vorm herstel (R r) op basis van te bepalen metingen van ε m, ε u, en ε blz. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 4. Waarneming van pore interconnectiviteit en vorming van hydroxyapatiet (HAp). Representatieve SEM beelden van een onbekleed, hittebehandeld SMP scaffold (schaal bar = 200 urn) (A) en gecoat, hittebehandeld steiger na blootstelling aan SBF (1X) gedurende 14 dagen (schaalbalk = 50 pm) (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft de bereiding van een polydopamine bekleed, PCL gebaseerde scaffold wiens eigen fitting gedrag, alsmede osteoinductiviteit en bioactiviteit, maakt het van belang bij de behandeling van onregelmatige CMF botdefecten. Aspecten van het protocol kan worden gewijzigd om verschillende schavot functies veranderen.
Het protocol begint met acrylering van een PCL-diol UV uitharding mogelijk. In de gerapporteerde voorbeeld de PCL-diol Mn ~ 10000 g / mol. Echter, door het geschikt aanpassen hoeveelheid acryloyl chloride en Et3N tijdens de synthese van PCL-DA, een PCL diol met een hogere of lagere Mn kunnen worden gebruikt voor verhoging, respectievelijk, de verknopingsdichtheid verlagen of.
Het gesmolten zout template is een belangrijke component van het protocol (figuur 1). De gemiddelde zout grootte bepaalt de resulterende schavot poriegrootte. In het beschreven voorbeeld, de gemiddelde grootte was salt ~ 460 ± 70 &# 181; m. Terwijl een kleinere omvang zout kunnen worden toegepast, moet er rekening mee dat het skelet ondergaat krimp tijdens de laatste warmtebehandeling stap welke poriegrootte vermindert bewaard. Zeven van het zout wordt gebruikt om het zout grootteverdeling verminderen en derhalve de poriëngrootteverdeling. Om een steiger met sterk onderling verbonden poriën te produceren, werd zout fusie geïnduceerd door de toevoeging van een kleine hoeveelheid water (7,5 gew% gebaseerd op het gewicht zout). Dit staat bekend om geïsoleerde NaCl deeltjes gedeeltelijk te ontbinden in een continue poragen template 25,26. Afhankelijk van de gemiddelde grootte zout, moet de hoeveelheid water toegevoegd worden aangepast 14. Bovendien, tijdens zout fusion, moet het water geleidelijk mechanisch gemengd en tenslotte gecentrifugeerd om de gelijkmatige verdeling en het verpakken van de zoutdeeltjes garanderen toegevoegd.
Na vormden de gesmolten zout template, wordt de PCL-DA opgelost in DCM voor solvent-casting. In het beschreven protocol, een concentration van 0,15 g PCL-DA per 1 ml DCM werd gebruikt. Deze concentratie kan worden verhoogd of verlaagd. Hoewel toenemende concentraties verwachting scaffold modulus te vergroten, kunnen ook scaffolds lagere poriën interconnectiviteit 14.
Nadat de precursor-oplossing werd toegevoegd aan het zout vorm, centrifugeren is nuttig om te helpen bij de verspreiding in de template. Volgende snelle UV-cure, drogen aan de lucht laat verdampen van het oplosmiddel DCM. Na verwijdering uit de matrijs, wordt de scaffold geweekt in water / ethanol (1: 1 vol: vol) gedurende 4 dagen om het zout template te verwijderen. SEM beeldvorming bevestigt de vorming van een sterk onderling verbonden poriën morfologie (figuur 4A).
Een polydopamine coating wordt aangebracht op de poreuze wanden van de steiger op bioactiviteit geven. Door de resulterende schavot krimp, is het het beste om de coating aan te brengen voordat de laatste warmtebehandeling stap 6. Daarnaast ontgassinghet schavot terwijl ondergedompeld in de waterige oplossing dopamine helpt infiltratie. De ontgaste scaffold blijft ondergedompeld in de oplossing om een uniforme dekking polydopamine vergemakkelijken. Zodra gecoat en grondig gespoeld, het eerder witte steiger vertoont een bruine kleur kenmerk van polydopamine 21. Zo kan dekking in het hele steiger worden beoordeeld door visuele inspectie door een steiger halveren om polydopamine diffusie bevestigen.
Na het aanbrengen van de coating polydopamine wordt een laatste warmtebehandeling uitgevoerd (85 ° C, 1 uur). Zoals opgemerkt, veroorzaakt dit proces scaffold krimp. Echter, thermische behandeling is essentieel voor het bereiken van vormgeheugen gedrag 14, misschien te wijten aan de reorganisatie van de PCL-kristallijne domeinen (dwz schakelen segmenten) in dichter.
Zoals getoond in figuur 2, de SMP scaffold bereikte zichzelf passend in een model defect vanwege zijn vorm thermoresponsieve meMory natuur. Blootstelling aan warme zoutoplossing (~ 60 ° C) geïnduceerde smelten van het PCL kristallijne domeinen, zodanig dat het verweekte steiger in het model defect kan worden gedrukt. Als de handmatige druk werd uitgebracht, het herstel vorm bevorderd uitbreiding van de steiger aan de onregelmatige grenzen te vullen. Na afkoelen tot kamertemperatuur, het PCL kristallijne domeinen hervormd vaststelling van de steiger in zijn nieuwe tijdelijke vorm die werd gehandhaafd bij verwijdering van het defect. Eerder hebben we bevestigd dat de poriën langs de randen van de verwijderde steiger vrij open ondanks contact met de mal 6 blijven.
Gemeten per stam gecontroleerde cyclische thermische mechanische compressietests (figuur 3), ideaal vormgeheugen gedrag wordt gekenmerkt door Rf en Rr-waarden van 100%. Voor de beschreven SMP scaffold, Rf waarden voor cycli 1 en 2 waren enigszins> 100% 6. Rf werd eerder waargenomen enigszins gr zijneter dan 100% 14,27 gevolg van een lichte toename van drukspanning in vorm fixeren van de herkristallisatie van PCL segmenten in compacter structuren 27 of compressie veroorzaakte herkristallisatie van PCL. Daarnaast R r steeg van cyclus 1 tot cyclus 2 6. Een toename in R r waarden eerder is opgemerkt voor vaste 28,29,22 en poreuze SMP 13,14,23. Men denkt dat tijdens de eerste cyclus, restspanning afkomstig van verwerking is zodanig dat vormherstel verhogingen van de volgende cyclus 7 verwijderd.
De beschreven tissue engineering scaffold behaalt de specifieke set eigenschappen van cruciaal belang voor de succesvolle behandeling van CMF botdefecten. De scaffold wordt verwacht dat osseointegratie te bevorderen door zijn vermogen om "self-fit" in een onregelmatige CMF botdefect. Osteoconductiviteit wordt voorspeld op basis van de bereikte porie interconnectiviteit alsooksteiger biologische afbreekbaarheid. Tenslotte vanwege de polydopamine coating, de steiger bioactieve zoals aangegeven door de vorming van HA in in vitro testen (Figuur 4B). Deze bioactiviteit wordt voorspeld integratie en binding vergemakkelijken met omliggende botweefsel. Aldus is deze scaffold is een alternatief voor conventionele autografting en botvervangers van CMF botdefectherstel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs danken Texas A & M University Engineering en Experiment Station (TEE) voor de financiële ondersteuning van dit onderzoek. Lindsay Nagel erkent dankbaar steun van de Texas A & M University Louis Stokes Alliantie voor Minority Participatie (LSAMP) en de National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship Program (GRFP). Dawei Zhang dankzij de Texas A & M University Proefschrift Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol) | Sigma-Aldrich | 440752 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | D65100 | Dried over 4A molecular sieves |
| 4-dimethylaminopyridine (DMAP) | Sigma-Aldrich | D5640 | |
| Triethylamine (Et3N) | Sigma-Aldrich | T0886 | |
| Acryloyl chloride | Sigma-Aldrich | A24109 | |
| Ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
| Potassium carbonate (K2CO3) | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher | M65 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| 2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP) | Sigma-Aldrich | 196118 | |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | H8502 | |
| Tris buffer (2mol/L) | Fisher | BP1759 | Used at 10 mM concentration, pH = 8.5 |
| Sieve | VWR | 47729-972 | |
| UV-Transilluminator (365 nm, 25 W) | UVP | 95-0426-02 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) | TA Instruments | Q800 | |
| High Resolution Sputter Coater | Cressington | 208HR | |
| Scanning Electron Microscope (SEM) | FEI | Quanta 600 |
References
- Neovius, E., Engstrand, T. Craniofacial reconstruction with bone and biomaterials: review over the last 11 years. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 63, 1615-1623 (2010).
- Elsalanty, M. E., Genecov, D. G. Bone grafts in craniofacial surgery. Craniomaxillofac Trauma Reconstr. 2, 125-134 (2009).
- Hollister, S. J., et al. Engineering craniofacial scaffolds. Orthod Craniofacial Res. 8, 162-173 (2005).
- Albrektsson, T., Johansson, C. Osteoinduction, osteoconduction and osseointegration. Eur Spine J. 10, S96-S101 (2001).
- Blokhuis, T. J., Arts, J. J. C. Bioactive and osteoinductive bone graft substitutes: Definitions, facts and myths. Injury. 42, S26-S29 (1016).
- Zhang, D., et al. A bioactive “self-fitting” shape memory polymer scaffold with potential to treat cranio-maxillo facial bone defects. Acta Biomater. 10, 4597-4605 (2014).
- Lendlein, A., Kelch, S. Shape-memory polymers. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2034-2057 (2002).
- Hu, J., Zhu, Y., Huang, H., Lu, J. Recent advances in shape-memory polymers: Structure, mechanism, functionality, modeling and applications. Prog Polym Sci. 37, 1720-1763 (2012).
- Middleton, J. C., Tipton, A. J. Synthetic biodegradable polymers as orthopedic devices. Biomaterials. 21, 2335-2346 (2000).
- Sun, H., Mei, L., Song, C., Cui, X., Wang, P. The in vivo degradation, absorption and excretion of PCL-based implant. Biomaterials. 27, 1735-1740 (2006).
- Woodruff, M. A., Hutmacher, D. W. The return of a forgotten polymer-Polycaprolactone in the 21st century. Prog Polym Sci. 35, 1217-1256 (2010).
- Wang, S., Lu, L., Gruetzmacher, J. A., Currier, B. L., Yaszemski, M. J. Synthesis and characterizations of biodegradable and crosslinkable poly(ε-caprolactone fumarate), poly(ethylene glycol fumarate), and their amphiphilic copolymer. Biomaterials. 27, 832-841 (2006).
- Zhang, D., Petersen, K. M., Grunlan, M. A. Inorganic-organic shape memory polymer (SMP) foams with highly tunable properties. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 186-191 (2012).
- Zhang, D., Burkes, W. L., Schoener, C. A., Grunlan, M. A. Porous inorganic-organic shape memory polymers. Polymer. 53, 2935-2941 (2012).
- Van der Stok, J., Van Lieshout, E. M., El-Massoudi, Y., Van Kralingen, G. H., Patka, P. Bone substitutes in the Netherlands-a systematic literature review. Acta Biomater. 7, 739-750 (2011).
- Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318, 426-430 (2007).
- Hong, S., et al. Non-covalent self-assembly and covalent polymerization co-contribute to polydopamine formation. Adv Funct Mater. 22, 4711-4717 (2012).
- Ryu, J., Ku, S. H., Lee, H., Park, C. B. Mussel-inspired polydopamine coating as a universal route to hydroxyapatite crystallization. Adv Funct Mater. 20, 2132-2139 (2010).
- Lee, Y. B., et al. Polydopamine-mediated immobilization of multiple bioactive molecules for the development of functional vascular graft materials. Biomaterials. 33, 8343-8352 (2012).
- Wu, C., Fan, W., Chang, J., Xiao, Y. Mussel-inspired porous SiO 2 scaffolds with improved mineralization and cytocompatibility for drug delivery and bone tissue engineering. J Mater Chem. 21, 18300-18307 (2011).
- Ku, S. H., Ryu, J., Hong, S. K., Lee, H., Park, C. B. General functionalization route for cell adhesion on non-wetting surfaces. Biomaterials. 31, 2535-2541 (2010).
- Schoener, C. A., Weyand, C. B., Murthy, R., Grunlan, M. A. Shape memory polymers with silicon-containing segments. J Mater Chem. 20, 1787-1793 (2010).
- Zhang, D., Giese, M. L., Prukop, S. L., Grunlan, M. A. Poly(ε-caprolactone)-based shape memory polymers with variable polydimethylsiloxane soft segment lengths. J Polym Sci Pol Chem. 49, 754-761 (2011).
- Kokubo, T., Takadama, H. How useful is SBF in predicting in vivo bone bioactivity. Biomaterials. 27, 2907-2915 (2006).
- Murphy, W. L., Dennis, R. G., Kileny, J. L., Mooney, D. J. Salt fusion: an approach to improve pore interconnectivity within tissue engineering scaffolds. Tissue Eng. 8, 43-52 (2002).
- Yang, Q., Chen, L., Shen, X., Tan, Z. Preparation of polycaprolactone tissue engineering scaffolds by improved solvent casting/particulate leaching method. J Macromol Sci Phys. 45, 1171-1181 (2006).
- Madbouly, S. A., Kratz, K., Klein, F., Lüzow, K., Lendlein, A. Thermomechanical behaviour of biodegradable shape-memory polymer foams. 2009 MRS Spring Meeting, 1190, Mater Res Soc Symp Proc. (2009).
- Luo, X., Mather, P. T. Preparation and characterization of shape memory elastomeric composites. Macromolecules. 42, 7251-7253 (2009).
- Lendlein, A., Schmidt, A. M., Langer, R. AB-polymer networks based on oligo(ɛ-caprolactone) segments showing shape-memory properties. Proc Natl Acad Sci. 98, 842-847 (2001).
