Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Engineered Gevasculariseerd Muscle Flap

doi: 10.3791/52984 Published: January 11, 2016
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Buikwand defecten ontstaan ​​vaak na ernstige trauma's, de behandeling van kanker, brandwonden en verwijdering van geïnfecteerde mesh. Deze defecten vaak om significant weefsel verlies, waarvoor ingewikkelde chirurgische procedures en het presenteren van een grote uitdaging voor plastische reconstructie chirurgen 1-4. Tissue engineering onderzoekers op zoek naar nieuwe bronnen voor kunstmatige weefsels hebben verschillende materialen, mobiele bronnen en groeifactoren onderzocht. Succesvolle restauraties van verschillende weefsels, zoals trachea 5,6, blaas 7, 8 hoornvlies, bot 9 en de huid 10 door implantatie van gemanipuleerde weefsels werden eerder gerapporteerd. Echter, fabricage van een dikke gevasculariseerd gemanipuleerde weefsel, in het bijzonder voor de wederopbouw van grote gebreken, blijft een belangrijke uitdaging in tissue engineering.

Een van de belangrijkste factoren die de dikte van een levensvatbare weefselconstruct is de beheersing van zuurstoftoevoer naar de nadelentituent cellen. Als een beroep op diffusie construct dikte beperkt tot die van een zeer dunne laag. De maximale afstand tussen zuurstof en voedingsstoffen leveren capillairen in vivo ongeveer 200 urn, die correleert met de diffusie limiet van zuurstof 11,12. Onvoldoende vascularisatie kunnen leiden tot weefselischemie en escaleren weefsel resorptie of necrose 13.

Bovendien moet het ideale materiaal voor weefselreconstructie biocompatibel en niet-immunogeen zijn. Het moet ook in staat zijn het bevorderen van verdere integratie van gastheercellen met het biomateriaal en onderhouden van structurele integriteit. 14-16 verschillende biologische en synthetische 1,17,18 matrices zijn eerder onderzocht voor weefselreconstructie, maar hun gebruik blijft beperkt door een gebrek aan effectieve bloedtoevoer, infecties of weefsel onvoldoende sterkte.

In deze studie, een biocompatibele, cel-embedded steiger bestaat uit Food and Drug Administration (FDA) -gekeurd poly L-melkzuur (PLLA) / poly-melkzuur-co-glycolzuur (PLGA), werd geïmplanteerd rond de femorale slagader en ader (AV) vaartuigen van een naakt muis en gescheiden van het omliggende weefsel, zodat vascularisatie van alleen de AV vaten. Een week na de implantatie, het transplantaat levensvatbaar was, dik en goed doorbloed. Deze dikke gevasculariseerd weefsel met de AV vaten, werd vervolgens overgebracht als pedicled flap aan een abdominale volledige dikte defect in dezelfde muis. Een week na de overdracht, de flap levensvatbaar was, gevasculariseerd en goed geïntegreerd met het omliggende weefsel, rekening voldoende kracht om de buik ingewanden te ondersteunen. Dus de gemanipuleerde dikke, gevasculariseerd weefsel klep, voorzien van een autologe pedikel, presenteert een nieuwe werkwijze voor het repareren van full-thickness buikwand gebreken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle dierproeven werden goedgekeurd door het Comité van de Ethiek van de dierproeven van het Technion. Voor deze procedure werden athymische naakt muizen gebruikt voor immunologische afstoting te voorkomen. Bij gebruik van een ander type muis, dient de muizen worden geschoren voordat de chirurgische procedure en de toediening van cyclosporine (of een andere anti-afstoting vervangende) aanbevolen.

1. Steiger Voorbereiding en Cell Embedding

  1. Bereid scaffolds samengesteld als 1: 1 mengsel van poly-L-melkzuur (PLLA) en polymelkzuur-co-glycolzuur-zuur (PLGA), op de volgende wijze:
    1. Los 500 mg van PLLA en 500 mg PLGA in 10 ml chloroform.
    2. Voeg 0,24 ml polymeeroplossing 0,4 g natriumchloride deeltjes verzameld in een Teflon matrijzen. Gebruik een zout diameter van 212-600 urn. Laat de chloroform verdampt O / N.
    3. Uitlogen het zout met behulp van gedestilleerd water leidt tot onderling verbonden poreuze 3D steigers.
    4. Snijd polymeer stukkenmet behulp van een schaar, vervolgens weken in 70% ethanol (v / v) gedurende 30 min en was 3 maal in PBS gedurende 2 minuten voor gebruik.
  2. Bereid een tri-kweek van de volgende cellen in 1: 1 endotheliale celmedium (EGM-2 aangevuld met de componenten van zijn bullet kit en spiercel medium (Dulbecco's minimaal essentieel medium (DMEM), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS ), 2,5% HEPES-buffer, 100 U / ml penicilline en 0,1 mg / ml streptomycine (Pen-Strep Solution).
    1. Gebruik 0,5 x 10 6 C2C12-myoblasten, 0,9 x 10 6 humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) en 0,2 x 10 6 Normale menselijke dermale fibroblasten (NHDF).
  3. Meng de cellen samen in een microcentrifugebuis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 4 min, zuig het medium en resuspendeer de pellet in een mengsel van 4 pl ijskoude oplossing extracellulaire matrix en 4 pl celmedium.
  4. Knip een stuk van 10 mm x 7 mm x 1 mm (lengte x breedte x dikte) PLLA / PLGEen scaffold en zaden van de celsuspensie in een 6-wells plaat, zodat de extracellulaire matrix oplossing te stollen (30 min, 37 ° C, 5% CO 2) voor het toevoegen van 4 ml celmedium.
  5. Incubeer de steigers tien dagen vóór implantatie en vervang het medium elke andere dag.

2. Voor het starten van de chirurgische ingreep

  1. Bereiden en steriliseren (autoclaaf) de volgende chirurgische instrumenten: een kleine, fijne, rechte schaar, een veer schaar, een rechte, fijne punt tang, een gekarteld pincet en een naald houder.
  2. Maak een mengsel van ketamine: xylazine oplossing in een microcentrifugebuis door menging van 425 ui ketamine en xylazine 75 pl in een spuit 1 ml.
  3. Verdun 0,3 mg / ml buprenorfine in steriele zoutoplossing (01:20).

3. Flap Construction (Graft Implantatie)

  1. Met behulp van een insulinespuit, verdoven de muis door een intraperitoneale injectie van ketamine: xylazine (35 gl per20 g lichaamsgewicht).
  2. Subcutaan injecteren buprenorfine (uiteindelijke concentratie van 0,05-0,1 mg / kg) vóór opperation.
  3. Plaats de muis op een podium verwarmd tot 37 ° C, de normale lichaamstemperatuur waarborgen, en zet de muis met behulp van een pleister.
  4. Met behulp van katoen tips, beheren smerende oogzalf voor de ogen van de muis (om uitdroging te voorkomen).
  5. Met behulp wattenstaafjes, reinigen van de incisie met jood en daarna met 70% ethanol, een aseptische werkveld stellen.
  6. Met behulp van kleine schaar en forceps, een insnijding door de huid, van de hoogte van de knie om het inguinale ligament, evenwijdig aan de femorale vaten, totdat de femorale slagader en ader (AV) vaartuigen worden blootgesteld.
  7. Houd de huid beneden met een retractor, een betere toegang tot het weefsel te verkrijgen.
  8. Met behulp van de lente een schaar en pincet voorzichtig de femorale slagader en ader schepen uit het omringende weefsel te isoleren. Begin met het niveau van de lies ligAment aan de splitsing van de superieure epigastrische vaten. Laat de profunda onaangetast, zodat de bloedstroom naar het been te houden en tegelijkertijd de daaropvolgende ischemie.
  9. Vouw het transplantaat (uit deel 1) rond de blootgestelde dij AV, onder de profunda en boven de splitsing van het scheenbeen en proneal AV, en doe de uiteinden met 8-0 zijde hechtingen.
  10. Implantaat vascularisatie door de haarvaten ontspruit uit de femorale AV alleen vaartuigen zorgen, wikkel een stuk van gesteriliseerde latex rond het transplantaat en hechting met 6-0 hechtingen.
  11. Sluit de bovenliggende huid met behulp van 4-0 zijden hechtingen.
  12. Controleer de muis nauw tot herstel van de narcose en elke dag daarna, totdat het transplantaat wordt overgebracht als een flap. Subcutaan injecteren buprenorfine (uiteindelijke concentratie van 0,05-0,1 mg / kg) tweemaal per dag gedurende 2-3 dagen.
    OPMERKING: Gebruik een zoutoplossing in elk stadium, om uitdroging van de blootgestelde weefsel te voorkomen.

4. Flap Transfer

  1. Op één oftwee weken na implantatie, verdoven de muis door een intraperitoneale injectie van ketamine: xylazine (35 gl / 20 g) onder toepassing van een insulinespuit.
  2. Subcutaan injecteren buprenorfine (uiteindelijke concentratie van 0,05-0,1 mg / kg) vóór opperation.
  3. Plaats de muis op een podium verwarmd tot 37 ° C, de normale lichaamstemperatuur waarborgen, en zet de muis met behulp van een pleister.
  4. Met behulp van katoen tips, gelden smerende oogzalf voor de ogen van de muis (om uitdroging te voorkomen).
  5. Met behulp wattenstaafjes, reinigen incisie (van de knie op de buik) met jodium en daarna met 70% ethanol, een aseptische werkveld stellen.
  6. Met behulp van een schaar en pincet, de hechtingen in de huid voorzichtig te openen en, met behulp van een schaar, maken een incisie door de huid parallel aan de lies ligament, verder door de ventrale huid.
  7. Haal de latex stuk met een tang en de gevasculariseerde flap bloot.
  8. Met een scissors en tang, ontleden het weefsel flap van het omringende weefsel.
  9. Met behulp van een pincet en een naaldhouder, ligeren het distale uiteinde van de femorale AV met 8-0 zijden hechtingen te voorkomen bloeden uit de AV. Vervolgens cauterize de AV ter hoogte van de knie, distaal aan de gevouwen geïmplanteerde weefsel en 8-0 hechtdraad.
  10. Voorzichtig dragen de femorale AV omhuld door het transplantaat naar de ventrale buikwand, onbeschadigd de slagader te bepalen op welke afstand de gehele dikte defect worden.
    LET OP: Het trekken van de slagader te ver zal de slagader beschadigd.
  11. Met een fijne schaar, een insnijding in de ventrale buikwand.
  12. Met behulp van een veer schaar, een insnijding in rectusabdominus spier. Verwijder een ongeveer 1 cm x 0,8 cm segment van de rectusabdominus spier met de overliggende huid.
  13. Breng de femorale AV, omgeven door de gevasculariseerd transplantaat als axiale flap, de volledige dikte defect in het ventrale abdomrechtelijke muur.
  14. Hecht de klep naar omringende spierweefsel, gebruik 8-0 zijden hechtingen te voorkomen hernia.
  15. Hechten aan de inwendige organen te voorkomen, verhogen de spier met een pincet bij het hechten van de flap aan de buikspier. Laat de ventrale huid blootgesteld aan het effect van een volledige buikwanddefect nabootsen.
  16. Bedek de wond in de huid gejodeerde gaas en een steriel verband om verontreiniging van het blootgestelde gebied te voorkomen.
  17. Hecht de huid van het been using 4-0 zijden hechtdraden.
  18. Monitor de muis nauw tot herstel van de narcose en elke dag daarna, tot het ophalen van de flap. Subcutaan injecteren buprenorfine (uiteindelijke concentratie van 0,05-0,1 mg / kg) tweemaal per dag gedurende 2-3 dagen.
  19. OPMERKING: Gebruik een zoutoplossing in elke fase om uitdroging van de blootgestelde weefsel te voorkomen.

5. Echografie Bepaling van Vasculaire perfusie van de Graft

OPMERKING: Voordat de overdracht, vasculaire perfusie of het transplantaat wordt gemeten bij een en twee weken na implantatie, door ultrasonografie.

  1. Verdoven van de muis met behulp van 2% isofluraan.
  2. Plaats de muis op een beweegbaar platform verwarmd tot 38 ° C, de normale lichaamstemperatuur waarborgen, en zet de muis met behulp van een pleister.
  3. Vind de femorale slagader en ader vaten met niet-lineaire transducer die op de B-mode.
  4. Onderzoekt de doorgankelijkheid van de femorale vaten van het transplantaat met behulp van de op de kleur Doppler mode transducer.
  5. Bereid niet-gerichte contrastmiddel volgens de instructies van de fabrikant.
  6. Sluit een staartader katheter (12 cm buis met een 27 G naald) in een 1 ml injectiespuit gevuld met een zoutoplossing. Bevestig de spuit naast de muis in de verwarmingsstap (om beweging van de injectiespuit te voorkomen).
  7. Sluit de katheter om de muis staartader en zet de naald.
  8. Injecteer enkele van de zoutoplossing te waarborgen dat die injecties van gegevens in de ader en invullende buis met zoutoplossing (om luchtbellen te voorkomen).
  9. Vul een 1 ml spuit met 70 gl contrastmiddel en vervang de zoutoplossingspuit het contrastmiddel spuit.
  10. Het opzetten van de echografie om de afbeelding injectie van het contrastmiddel. In eigenschappen van de niet-lineaire modus het aantal frames tot 1500 en de verstoring puls tot 30% van de frames.
    Opmerking: Na de onderbreking puls, de microbellen de vaten met een snelheid die afhankelijk is van de stroomsnelheid van de microbellen in de haarvaten en onafhankelijk is van de injectiesnelheid van de microbellen opnieuw vullen. Het aantal frames kan worden aangepast aan de vultijd 19,20.
  11. Langzaam injecteren van het contrastmiddel in de staartader.
  12. Leg beelden in de niet-lineaire contrastmodus van de hoge-resolutie ultrageluidsysteem.
  13. Analyseer de resultaten met behulp van de software, zoals eerder beschreven 19,20.
    1. Teken een interessegebied (ROI) van het verkregen beeld immiddellijk na de verstoring puls in de contrast-modus. De ROI moet het gebied opgevuld door alleen het contrastmiddel te schetsen.
    2. Bereken de piekverhogingsfactor (PE), welke de verhouding van de gemiddelde intensiteit van de niet-lineaire signaal na de injectie van de microbellen versus na de onderbreking puls, en is een maat voor de perfusie volume.
    3. Bereken het debiet dat wordt bepaald door de tijd (T) die verstrijkt totdat het sterkste signaal (P).

6. Vaststelling van de omvang van Graft Vascularisatie

NB: De omvang van weefseltransplantaatleidingen vascularisatie wordt bepaald één of twee weken na implantatie.

  1. Met behulp van een insulinespuit, verdoven de muis door een intraperitoneale injectie van ketamine: xylazine (35 gl / 20 g).
  2. Gebruik van 1 ml injectiespuit, intraveneus 200 gl 10 mg / ml fluoresceïne-isothiocyanaat-dextran geconjugeerd (FITC-dextraan, MW = 500.000) in de staartader. </ li>
  3. Tien seconde nadat de injectie euthanaseren de muis door cervicale dislocatie.
  4. Open het been van de muis en het implantaat bloot te leggen.
  5. Was het transplantaat met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en moet 10% neutraal gebufferde formaline.
  6. Afbeelding het transplantaat in de muis been met behulp van een confocale microscoop.
  7. Kwantificeren functionele vaartuig dichtheid (FVD).
    1. Isoleer het groene kanaal (excitatie = 488 nm) van de confocale microscopische beelden.
    2. Leid de beelden via een hoogdoorlaatfilter, teneinde de contrastrijke structuren accentueren.
    3. Gebruik een ontspikkelen filter om ruis die mogelijk zijn versterkt door de high-pass filter te verwijderen.
    4. Stel de waarde van de drempel op het resulterende beeld; de drempelwaarde is ingesteld dat de functies en structuren in het originele beeld zichtbaar in het binaire beeld.
    5. Breng een size-drempel, zodat alleen groepen van verbonden pixels groter dan de gedefinieerde size drempel blijven in het binaire beeld.
    6. Overzicht van het skelet van de schepen in het transplantaat met behulp van de Zhang-Suen algoritme 21.
    7. Bereken de FVD door het optellen van de lengtes van de middellijn van elk vaartuig en het resultaat te delen door het oppervlak van het ROI.

7. Immunohistologische en histologische kleuring van de Graft

  1. Immunohistologische kleuring
    1. Na confocale beeldvorming halen het transplantaat met een kleine schaar en forceps. De AV schepen in de beide einden van het transplantaat ontleden en het transplantaat te halen.
    2. Bevestig de enten in 10% neutrale gebufferde formaline gedurende 30 minuten - 2 uur.
    3. Plaats de grafts histologisch cassettes en opslag in 70% ethanol tot paraffine inbedding.
    4. Inbedden in paraffine met een standaard fixatie en inbedding protocol 22 en snijd de paraffine ingebedde weefsels in 5 micrometer plakjes met behulp van een microtoom. Snijd de hele weefsel loodrecht op de AV-vaartuigen.
    5. Deparaffinize de paraffine ingebedde secties door onderdompeling in 100% xyleen tweemaal gedurende 10 min elk.
    6. Schik de dia's in een 250 ml plastic Coplin potje.
    7. Hydrateren van seriële onderdompelingen in afnemende concentraties ethanol (100%, 96%, 90%, 80%, 70%, 50%, 30% en dubbel gedestilleerd water (DDW)) gedurende 3 min elk.
    8. Bereid antigen ontmaskering oplossing door verdunning 2,35 ml antigeen ontmaskering oplossing 250 ml DDW. Verwarm het antigeen ontmaskering oplossing 2 min in een magnetron ingesteld op 95 ° C.
    9. Plaats de objectglaasjes in de voorverwarmde antigen ontmaskering oplossing en verwarm nogmaals 3 min in een magnetron ingesteld op 95 ° C. Koel de objectglaasjes 50 ° C.
    10. Verwarm opnieuw gedurende 2 minuten en daarna afkoelen tot kamertemperatuur.
    11. Incubeer de glaasjes in 3,3% H 2 O 2 in methanol gedurende 10 min bij kamertemperatuur om de activiteit van endogeen peroxidase te blussen en spoel tweemaal in PBS.
    12. Bereid een incubatiekamer: plaats natte Absorbent sheets in een histologie doos en droog de dia's met behulp delicate taak ruitenwissers.
    13. Circle de segmentgebied op de dia met een hydrofobe pen en incubeer gedurende 30 min bij KT met ongeveer 50 pi geit serum blokkerende oplossing (2%, bereid in PBS) per segment.
    14. Verdun het konijn anti-CD31 antilichaam 1:50 in blokkeringsoplossing, toepassing ongeveer 50 gl antilichaam per segment en geïncubeerd O / N bij 4 ° C. Spoel 3 maal met PBS, 5 minuten elk.
    15. Verdun het gebiotinyleerde geit anti-konijn secundair antilichaam 1: 400 in PBS, plaats over slides ongeveer 50 pl antilichaam per stuk en incubeer gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
    16. Spoel 3 maal met PBS, 5 minuten elk.
    17. Verdunde streptavidine-peroxidase 1: 400 in PBS, gelden ongeveer 50 gl per segment en incubeer met glijbanen gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Spoel 3 maal met PBS, 5 minuten elk.
    18. Breng ongeveer 50 pl aminoethylcarbazole (AEC) substraat per segment, volgens de fabrikant & #8217; s instructies. Dompel de objectglaasjes in DDW om de reactie te stoppen.
    19. Vlekken op de kernen in blauw door onderdompeling van de secties in ongeveer 50 pl Mayer's hematoxyline oplossing 2 min. Voorzichtig afspoelen met water en vervolgens dekking van de secties met montage medium.
    20. Kwantificeren van CD31-positieve kleuring met behulp van een dubbel-blind aanpak. CD31 kleuring weergegeven als bruine vlek. Kies 4-5 verschillende velden in een 40x vergroting viewing veld onder een binoculair microscoop. Tel het aantal CD31-positieve lumen.
      1. Bereken het gemiddelde aantal CD31-positieve lumens per scaffold door het totale aantal getelde lumen het aantal sectoren en fieldarea (volgens de verrekijker data).
        OPMERKING: De toegepaste reagentia volume moet voldoende zijn om de volledige geschetste slice dekken.
  2. Histologische kleuring
    1. Fix enten in 10% neutraal gebufferde formaline.
    2. Insluiten transplantaten in paraffine met standaardfixatie en inbedding procedures.
    3. Verwijder de paraffine van de paraffine ingebedde secties door onderdompeling in 100% xyleen tweemaal gedurende 10 min.
    4. Snelle cyclus tweemaal voor rehydratatie in 100% isopropanol.
    5. Snelle cyclus tweemaal 95% ethanol.
    6. Was drie keer in kraanwater.
    7. Onderdompelen in Hematoxyline gedurende 10 min.
    8. Was drie keer in kraanwater.
    9. Immere in Eosin gedurende 2 minuten.
    10. Snel wassen drogen in 95% ethanol tweemaal.
    11. Snelle cyclus 100% isopropanol tweemaal.
    12. Snelle cyclus 100% xyleen tweemaal.
    13. Dek af met DPX lijm met deksel glas 1,5 mm dik.
    14. Afbeelding met behulp van microscoop in 40x vergroting.

8. Mechanische eigenschappen Assessment

  1. Haal het transplantaat met een kleine schaar en pincet.
  2. Spoel het transplantaat in PBS.
  3. Meet de breedte en dikte van het transplantaat en bereken het doorsnedeoppervlak de breedte vermenigvuldigd met de dikte.
  4. Onse het testinstrument een spanningsrekcurve gehydrateerde grafts genereren.
    1. Monteer het transplantaat tussen het systeem trek grepen en meet de uiteindelijke lengte tussen de twee handgrepen (dwz initiële lengte).
    2. Breng een stam van 0,01 mm / sec, tot mislukking.
    3. Noteer de ontwikkelde kracht en de verplaatsing behulp protocol van de fabrikant.
    4. Genereer een spanning-rek curve in Matlab.
      1. Bereken stam volgens verplaatsing gedeeld door de oorspronkelijke lengte. Stress wordt berekend als de gemeten kracht gedeeld door het dwarsoppervlak.
      2. Bepaal stijfheid als de helling van het lineaire gebied in de spanning-rek curve en het maximum van de curve is de treksterkte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Graft vascularisatie en perfusie in vivo

De implantaten werden geïmplanteerd één of twee weken voorafgaand aan de overdracht als axiale flaps. Op één en twee weken na implantatie, grove observatie van de ent gebied bleek levensvatbaar en doorbloed weefsel enten. Deze transplantaten bleken sterk gevasculariseerd zijn, zoals bepaald met CD31 positieve immunokleuring (figuur 1A), en zeer geperfuseerd, zoals blijkt uit FITC-dextran staartader injectie en ultrasone metingen. Veel schepen werden reeds waargenomen na één week na de implantatie, een aantal dat aanzienlijk steeg na een extra week in de nabijheid van de AV vaten. FITC-dextran-gebaseerde bepaling van de functionele vaatdichtheid (FVD) (Figuur 1B) toonde aan dat het transplantaat was sterk gevasculariseerd op één week na implantatie en dat er geen significante veranderingen plaats in de extra week in vivo. Vat doorgankelijkheid en perfusie werden aangetoonddoor echografie (de FVD was 5,71 mm - 1 ± 0,51 mm - 1 en 10,28 mm - 1 ± 2,71 mm - 1, een en twee weken na implantatie, respectievelijk) figuur 1C bevestigd gastheer dijbeen vat doorgankelijkheid en integriteit na graft implantatie. . Bovendien, echografisch onderzoek bleek perfusie binnen het transplantaat gebied, dat iets hoger twee weken na implantatie was in vergelijking met een week na de implantatie (figuur 1D).

Flap eigenschappen

Bruto onderzoek van de flappen een week na de overdracht blijkt een levensvatbare, gevasculariseerd en goed geïntegreerde weefsel. De flappen onderging sterke gehechtheid aan hun omgeving. Bij het vergelijken van de pre-gevasculariseerd, cel ingesloten kleppen naar acellulair, nonvascularized enten controle, de voormalige toonde superieure mechanische eigenschappen, zoals blijkt uit verhoogde stijfheid en sterkte (

Figuur 1
Figuur 1. Graft vascularisatie. (A) De dichtheid van CD31-positieve vaten, gemeten bij een en twee weken na implantatie in vergelijking met de controlegroep. Alle waarden zijn genormaliseerd op het implantaat gebied (2 mm). * = T-proef p <0,05. (B) Functionele vasculaire dichtheid (FVD) op één en twee weken na implantatie. Geen significant verschil werd waargenomen, p = 0,08 (t-test). (C) Patent AV vaartuigen in beeld via ultrageluid in de kleur Doppler-modus. Blauwe en rode vertegent de bloedstroom in het transplantaat. Het gele kwadrant schetst de graft gebied. (D) Graft perfusie bij één en twee weken na implantatie. (E en F) H & E kleuring van de flappen geïntegreerd in het gastheerweefsel: zwarte pijlpunt levensvatbare slagader; witte pijlen wijzen buikspier vezels; gele pijlen wijzen steiger blijft. (H en G) FITC dextran zoals getoond door confocale microscopie beelden. Voor alle bepalingen, de steekproefomvang was n ≥ 3 en alle waarden worden weergegeven als gemiddelde ± standaardafwijking van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Mechanische eigenschappen van de flap een weekna de overdracht. (A) De stijfheid en (B) de treksterkte (UTS) van de flappen. Controle staat een lege transplantaat zonder cellen, cellen staat tri-cultuur enten. * = T-toets p <0,05, n = 3. De waarden worden weergegeven als gemiddelde ± standaardafwijking van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De vooruitgang in de tissue engineering is voldaan met een groeiende vraag naar vervangende weefsels voor de wederopbouw van verschillende soorten weefsel. Verschillende synthetische en biologische 1,17,18 14-16 materialen en fabricagemethoden zijn beoordeeld op hun vermogen om deze eisen te pakken. Echter, ondanks de vooruitgang in de klinische zorg en tissue engineering, het herstel van de volledige dikte buikwand gebreken blijft een uitdaging. Een weefsel voldoende voor de wederopbouw van een dergelijke massale gebreken moeten (1) dik en (2) doorbloed zijn en tonen (3) mechanische integriteit, en (4) de levensvatbaarheid van de tijd 23.

Hier presenteren we een stap voor stap gedetailleerd protocol voor het maken van een dikke, levensvatbare en gevasculariseerd weefsel flap, die kunnen dienen als alternatief voor autoloog weefsel kleppen. De gefabriceerde klep werd in twee stappen: (1) Een PLLA / PLGA schavot werd geïmplanteerd rond de AV-schepen van de mouse achterbeen en gescheiden van het omliggende weefsel vascularisatie zodat slechts de AV vaten. (2) De gecreëerde gevasculariseerd, dikke flap weefsel werd vervolgens overgebracht van de AV vaten, die diende als de pedikel, een full-thickness buikwanddefect.

Juiste flap vascularisatie is essentieel voor een succesvolle integratie in de gastheer 17,18,24. Verschillende benaderingen gevasculariseerd gemanipuleerde weefsel te creëren om zuurstof en diffusie in dichte weefsels te verbeteren, zijn in de literatuur besproken. Onder deze waren werkwijzen die zaaien van endotheelcellen (EC) op verschillende types scaffold 13,20,25-30, verschillende technieken voor angiogene factoren leveren aan de implantatieplaats (hetzij door directe toediening door injectie, het gebruik van getransformeerde cellen die de elementen 31 -34 of langzame afgifte van verschillende scaffolds 35,36), gebruikt om bioreactoren gemanipuleerde weefselperfusie 37 waarborgen 38,39. Hier werd het weefsel gevasculariseerd transplantaat in vivo, door benutting van autoloog schepen. Het transplantaat dat levensvatbare gevasculariseerde bewezen en geperfuseerd, werd vervolgens overgebracht als een dikke weefselflap een full-thickness buikwanddefect herstellen. Een week na de overdracht, de flap levensvatbaar was en aanbevolen voldoende mechanische sterkte om de buik ingewanden te ondersteunen. Hier gebruikten we athymische naakt muizen, een verzwakt immuunsysteem te dragen; bij gebruik van een ander type muis of ander dier moet de mogelijkheid van immuunreacties rekening gehouden (vooral bij het zaaien scaffolds met cellen). Andere beperkingen van deze techniek omvatten (1) de overdracht van femorale AV vaartuigen die de bloedstroom naar het achterbeen leveren. De techniek laat de profunda en de diepe femorale vaten onaangetast en geen achterbeen ischemie werd waargenomen na flap overdracht. Bovendien is in grotere dieren en mensen, het gebruik vanperifere vaten zal worden geadviseerd omdat ze overbodig in het lichaam; (2) de tijd voor bereiken adequate vascularisatie vóór overdracht flap kan een beperkende factor in spoedeisende gevallen; en (3) flap creatie wordt uitgevoerd in vivo, waarbij de relevantie bij mensen kunnen beperken. In de toekomst willen we een middel van het creëren van deze flap ex vivo te ontwikkelen. Het voordeel van de gepresenteerde methode ligt in het vermogen om de vorming van autologe weefsels (met autologe cellen) rond het schavot verbeteren. Het resulterende weefsel vormt een geschikt alternatief voor autologe weefselflap. Voorts kan de steiger worden geënt met autologe cellen vóór implantatie, verdere verbetering graft vascularisatie en integratie binnen het gastheerweefsel. Het gebruik van autologe cellen en een biologisch afbreekbaar en biocompatibel steiger, kan het aanzienlijke risico van immuno-afstotingsreacties te omzeilen en presenteren een alternatief voor autologe kleppen terwijl het vermijden van de oogst en de postoperatieve scarifikation.

De beschreven werkwijze kan vertaald experimenten in grote dieren en verder uitgebreid om klinische proeven bij de mens. Bovendien kan worden vertaald naar verschillende beschadigde weefsels in het lichaam te herstellen. Bij de mens en bij grote dieren, kunnen de flappen worden gegenereerd rond perifere vaten in plaats van de AV femorale vaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
small fine straight scissors Fine Science Tools (FST) 14090-09
spring scissors Fine Science Tools (FST) 15003-08
straight forceps with fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-20
serrated forceps  Fine Science Tools (FST) 11050-10
needle holder Fine Science Tools (FST) 12500-12
Small vessel cauterizer  Fine Science Tools (FST) 18000-00
Duratears Alcon 5686
Sedaxylan Euravet DJ03
Clorketam 1000 Vetoquinol 4A0726B
Buprenorphine vetmarket B15100
4-0 silk sutures Assut sutures 647
6-0 polypropylene sutures Assut sutures 9351F
8-0 silk sutures Assut sutures 684568
Insulin syringe (6 mm needle) BD 324911
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system VisualSonics inc.
MS250 non-linear transducer VisualSonics inc.
Micromarker non-targeted contrast agent VisualSonics inc. VS-11694
tail vein catheter VisualSonics inc. VS-11912
Vevo 2100 software VisualSonics inc.
fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran Sigma FD500S
Matlab Mathworks, MA, USA
Kimwipes Kimtech 34120
antigen unmasking solution Vector laboratories H-3300
anti-CD31 antibody Abcam  ab28364
biotinylated goat anti-rabbit (secondary) antibody Vector laboratories BA-1000
streptavidin-peroxidase Jackson  016-030-084
Mayer's hamatoxylin solution Sigma-Aldrich MHS-16
aminoethylcarbazole (AEC) substrate kit Life technologies, Invitrogen  00-2007
Vectamount Vector laboratories H-5501

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Engelsman, A. F., van der Mei, H. C., Ploeg, R. J., Busscher, H. J. The phenomenon of infection with abdominal wall reconstruction. Biomaterials. 28, (14), 2314-2327 (2007).
  2. De Coppi, P., et al. Myoblast-acellular skeletal muscle matrix constructs guarantee a long-term repair of experimental full-thickness abdominal wall defects. Tissue Eng. 12, (7), 1929-1936 (2006).
  3. Shi, C., et al. Regeneration of full-thickness abdominal wall defects in rats using collagen scaffolds loaded with collagen-binding basic fibroblast growth factor. Biomaterials. 32, (3), 753-759 (2011).
  4. Yezhelyev, M. V., Deigni, O., Losken, A. Management of full-thickness abdominal wall defects following tumor resection. Ann Plast Surg. 69, (2), 186-191 (2012).
  5. Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. First human transplantation of a bioengineered airway tissue. J Thorac Cardiovasc Surg. 128, (4), 638-641 (2004).
  6. Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372, (9665), 2023-2030 (2008).
  7. Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367, (9518), 1241-1246 (2006).
  8. Nishida, K., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med. 351, (12), 1187-1196 (2004).
  9. Petite, H., et al. Tissue-engineered bone regeneration. Nat Biotechnol. 18, (9), 959-963 (2000).
  10. Banta, M. N., Kirsner, R. S. Modulating diseased skin with tissue engineering: actinic purpura treated with Apligraf. Dermatol Surg. 28, (12), 1103-1106 (2002).
  11. Vunjak-Novakovic, G., et al. Challenges in cardiac tissue engineering. Tissue engineering. Part B, Reviews. 16, (2), 169-187 (2010).
  12. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63, (4-5), 300-311 (2011).
  13. Lesman, A., Gepstein, L., Levenberg, S. Vascularization shaping the heart. Ann N Y Acad Sci. 1188, 46-51 (2010).
  14. Patton Jr, H., Berry, S., Kralovich, K. A. Use of human acellular dermal matrix in complex and contaminated abdominal wall reconstructions. The Am J of Surg. 193, (3), 360-363 (2007).
  15. Menon, N. G., et al. Revascularization of human acellular dermis in full-thickness abdominal wall reconstruction in the rabbit model. Ann Plast Surg. 50, (5), 523-527 (2003).
  16. Buinewicz, B., Rosen, B. Acellular cadaveric dermis (AlloDerm): a new alternative for abdominal hernia repair. Ann Plast Surg. 52, (2), 188-194 (2004).
  17. Bringman, S., et al. Hernia repair: the search for ideal meshes. Hernia. 14, (1), 81-87 (2010).
  18. Meintjes, J., Yan, S., Zhou, L., Zheng, S., Zheng, M. Synthetic biological and composite scaffolds for abdominal wall reconstruction. Exp rev of med dev. 8, (2), 275-288 (2011).
  19. Cheng, G., et al. Engineered blood vessel networks connect to host vasculature via wrapping-and-tapping anastomosis. Blood. 118, (17), 4740-4749 (2011).
  20. Shandalov, Y., et al. An engineered muscle flap for reconstruction of large soft tissue defects. PNAS of the USA. 111, (16), 6010-6015 (2014).
  21. Zhang, T. Y., Suen, C. Y. A fast parallel algorithm for thinning digital patterns. Commun. ACM. 27, (3), 236-239 (1984).
  22. Luna, L. G. AFIo Pathology. Manual of Histo Stain Meth ; of the Arm Forcs Inst of Path. Luna, L. G. Blakiston Division, McGraw-Hill. (1968).
  23. Choi, J. H., et al. Adipose tissue engineering for soft tissue regeneration. Tissue engineering. Part B, Reviews. 16, (4), 413-426 (2010).
  24. Bellows, C. F., Alder, A., Helton, W. S. Abdominal wall reconstruction using biological tissue grafts: present status and future opportunities. Exp rev of med dev. 3, (5), 657-675 (2006).
  25. Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circ Res. 100, (2), 263-272 (2007).
  26. Kaufman-Francis, K., Koffler, J., Weinberg, N., Dor, Y., Levenberg, S. Engineered vascular beds provide key signals to pancreatic hormone-producing cells. PloS one. 7, (7), e40741 (2012).
  27. Kaully, T., Kaufman-Francis, K., Lesman, A., Levenberg, S. Vascularization--the conduit to viable engineered tissues. Tiss eng. Part B, Reviews. 15, (2), 159-169 (2009).
  28. Koffler, J., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. PNAS of the USA. 108, (36), 14789-14794 (2011).
  29. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tisseng. Part A. 16, (1), 115-125 (2010).
  30. Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat Biotechnol. 23, (7), 879-884 (2005).
  31. Bearzi, C., et al. PlGF-MMP9-engineered iPS cells supported on a PEG-fibrinogen hydrogel scaffold possess an enhanced capacity to repair damaged myocardium. Cell death & disease. 5, e1053 (2014).
  32. Zhang, M., et al. SDF-1 expression by mesenchymal stem cells results in trophic support of cardiac myocytes after myocardial infarction. FASEB J : official publication of the .Fed Am Soc Exp Biol. 21, (12), 3197-3207 (2007).
  33. Dvir, T., et al. Prevascularization of cardiac patch on the omentum improves its therapeutic outcome. PNAS. 106, (35), 14990-14995 (2009).
  34. Marsano, A., et al. The effect of controlled expression of VEGF by transduced myoblasts in a cardiac patch on vascularization in a mouse model of myocardial infarction. Biomaterials. 34, (2), 393-401 (2013).
  35. Rufaihah, A. J., et al. Enhanced infarct stabilization and neovascularization mediated by VEGF-loaded PEGylated fibrinogen hydrogel in a rodent myocardial infarction model. Biomaterials. 34, (33), 8195-8202 (2013).
  36. Nillesen, S. T. M., et al. Increased angiogenesis in acellular scaffolds by combined release of FGF2 and VEGF. J of Contr Release. 116, (2), e88-e90 (2006).
  37. Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat Commun. 4, 1399 (2013).
  38. Tee, R., et al. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tiss eng. Part A. (19-20), 1992-1999 (2012).
  39. Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115, (3), 353-360 (2007).
Engineered Gevasculariseerd Muscle Flap
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman, A., Rosenfeld, D., Ben-Shimol, D., Levenberg, S. Engineered Vascularized Muscle Flap. J. Vis. Exp. (107), e52984, doi:10.3791/52984 (2016).More

Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman, A., Rosenfeld, D., Ben-Shimol, D., Levenberg, S. Engineered Vascularized Muscle Flap. J. Vis. Exp. (107), e52984, doi:10.3791/52984 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter