Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Спроектированный васкуляризированных лоскута

Published: January 11, 2016 doi: 10.3791/52984
Automatic Translation
*1, *2, 2,3, 2, 4, 2
1Department of Plastic Surgery, Kaplan Medical Center, 2Biomedical Engineering, Technion Israel Institute of Technology, 3Interdepartmental Program in Biotechnology, Technion Israel Institute of Technology, 4Medicine Department, Technion Israel Institute of Technology
* These authors contributed equally

Introduction

Брюшной дефекты стен часто возникают следующие тяжелой травмы, лечение рака, ожогов и удаления инфицированного сетки. Эти дефекты часто связаны значительные потери тканей, требующих сложных хирургических процедур и представляет серьёзную проблему для пластических хирургов реконструкции 1-4. Тканевая инженерия исследователи в поисках новых источников для искусственных тканей исследовали различные материалы, источники клеток и факторов роста. Успешные реставрации различных тканей, таких как трахеи 5,6, мочевого пузыря, 7 роговицы 8 кости и кожи 9 10 путем имплантации инженерии тканей были ранее. Тем не менее, изготовление густой васкуляризированной инженерии тканей, в частности, на реконструкцию больших дефектов, остается серьезной проблемой в тканевой инженерии.

Одним из основных факторов, ограничивающих толщину жизнеспособного ткани конструкции является контроль подачи кислорода к его минусамtituent клетки. При опираясь на диффузии, построить толщина ограничена, что из очень тонкого слоя. Максимальное расстояние между кислород и питательные поставляющих капилляров в естественных условиях составляет примерно 200 мкм, что коррелирует с диффузионной предела кислорода 11,12. На вашем васкуляризации может привести к ишемии тканей и перерасти в резорбции тканей или некроза 13.

Кроме того, идеальный материал, используемый для восстановления тканей должны быть биосовместимыми и неиммуногенным. Он также должен быть способен промотировать дальнейшей интеграции клеток-хозяев с биоматериала, и поддержание структурной целостности. Различные биологические и синтетические 14-16 1,17,18 матрицы были ранее исследованы на реконструкцию тканей, однако их использование ограничено из-за остаются в отсутствие эффективного кровоснабжения, инфекции или недостаточной прочности ткани.

В этом исследовании, биосовместимые, клеток набedded леса состоят из пищевых продуктов и медикаментов (FDA) -approved поли L-молочной кислоты (PLLA) / поли молочная-со-гликолевой кислоты (PLGA), был имплантирован вокруг бедренной артерии и вены (А.В.) судов голой мыши и отделен от окружающих тканей, обеспечивая васкуляризации из АВ только сосудов. Одна неделя после имплантации, трансплантат был жизнеспособным, толстые и имеют хорошо развитую сосудистую. Этот густой васкуляризации тканей с AV сосудов, затем переносили в pedicled лоскута брюшной дефект полной толщины в той же мыши. Одна неделя после передачи, заслонка была жизнеспособной, васкуляризации и хорошо интегрируется с окружающей тканью, имея достаточную прочность, чтобы поддерживать брюшной полости. Таким образом, разработаны толщиной, васкуляризации тканевый лоскут, принимая аутологичной ножку, представляет новый способ ремонта полную толщину стенки брюшной дефекты.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все исследования на животных были одобрены Комитетом по этике в эксперименты на животных в Технион. Для этой процедуры, бестимусных голых мышей использовали, чтобы избежать иммунологического отторжения. При использовании другой тип мыши, мыши должны быть выбриты до хирургического вмешательства и введения циклоспорина (или другой анти-отвода замены) рекомендуется.

1. Леса Подготовка и сотовый вложения

  1. Подготовка каркасов, состоящих из 1: 1 смеси поли-L-молочной кислоты (PLLA) и полимолочной-со-гликолевой-кислоты (PLGA), в следующем порядке:
    1. Растворить 500 мг ПЛМК и 500 мг PLGA в 10 мл хлороформа.
    2. Добавить 0,24 мл раствора полимера с 0,4 г частиц хлорида натрия, собранных в тефлоновой формы. Используйте диаметр соли 212-600 мкм. Разрешить хлороформ испаряется O / N.
    3. Лич соль с использованием дистиллированной воды, ведущую к взаимосвязанных пористых 3D лесов.
    4. Вырезать куски полимерныхИспользование ножниц, то замочить в 70% -ном этаноле (объем / объем) в течение 30 мин и промыть 3 раза в ФБР в течение 2 мин перед использованием.
  2. Готовят три-культуры из следующих клеток в 1: 1 эндотелиальной среды клеток (EGM-2, дополненной компонентами его пули комплекта и мышечных клеток среднего (минимальной поддерживающей среде Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS ), 2,5% HEPES буфера, 100 ед / мл пенициллина и 0,1 мг / мл стрептомицина (Pen-Strep Решение).
    1. Использование 0,5 х 10 6 C2C12 миобластов, 0,9 х 10 6 пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVECs) и 0,2 × 10 6 Нормальные дермальные фибробласты человека (NHDF).
  3. Смешайте клетки вместе в микроцентрифужных трубки и центрифуги при 200g в течение 4 мин, аспирации среды и повторно приостанавливать осадок в смеси 4 мкл охлажденного льдом раствора внеклеточного матрикса и 4 мкл клеточной среде.
  4. Отрежьте кусок 10 мм х 7 мм х 1 мм (длина х ширина х толщина) ПЛМК / ПГССтроительные леса и семян клеточной суспензии в 6-луночный планшет, позволяют внеклеточный матрикс раствор для отверждения (30 мин 37 ° C, 5% CO 2) перед добавлением 4 мл клеточной среде.
  5. Выдержите каркасов для десяти дней до имплантации и замены среды через день.

2. Перед началом хирургической процедуры

  1. Подготовка и стерилизации (автоклав) следующие хирургические инструменты: небольшие, тонкие, прямые ножницы, весенние ножницы, прямые, остроконечный пинцет, зазубренный щипцы и держатель иглы.
  2. Приготовить смесь кетамина: ксилазина раствора в микроцентрифужных трубки путем смешивания 425 мкл кетамина и 75 мкл ксилазина в 1 мл шприца.
  3. Развести 0,3 мг бупренорфина / мл стерильным солевым физиологическим раствором (1:20).

3. Клапан Строительство (привитой Имплантация)

  1. Использование инсулиновый шприц, анестезию мыши, внутрибрюшинного введения кетамина: ксилазина (35 мкл на20 г веса тела).
  2. Подкожно вводят бупренорфин (конечная концентрация 0,05-0,1 мг / кг) до opperation.
  3. Наведите на сцене, нагретой до 37 ° С, чтобы обеспечить нормальную температуру тела, а затем закрепите мышь, используя клейкую повязку.
  4. Использование хлопка советы, управлять смазочных глазную мазь для глаз мышки (чтобы избежать обезвоживания).
  5. Использование хлопка советы, чистый разрез сайт с йодом, а затем с 70% этанола, чтобы создать рабочую асептической поле.
  6. Использование маленькие ножницы и пинцет, сделать разрез через кожу, от уровня колена до паховой связки, параллельные бедренных сосудов, до тех пор, бедренную артерию и вену (AV) сосуды не подвергаются.
  7. Держите кожу вниз с помощью втягивающего, чтобы получить лучший доступ к ткани.
  8. Использование пружинных ножниц и щипцов, тщательно изолировать артерию и вену сосуды бедренных от окружающей ткани. Начните с уровня паховой осветиАмент бифуркации высших эпигастральной судов. Оставьте profunda нетронутым, чтобы сохранить приток крови к ноге и предотвращения последующего ишемии.
  9. Сложите трансплантат (из раздела 1) вокруг открытой бедренной А.В., ниже profunda и выше бифуркации к большеберцовой и proneal А.В., и присоединиться к своим целям, используя 8-0 шелковые швы.
  10. Для обеспечения имплантата васкуляризации по капиллярам прорастания из бедренных сосудов AV только, оберните кусок латекса стерилизованной вокруг трансплантата, и шов 6-0 швов.
  11. Закройте облегающего кожу, используя 4-0 шелковые швы.
  12. Не Монитор мыши тесно до выхода из наркоза, и каждый день после этого, до тех пор, трансплантат не передается как клапан. Подкожно вводят бупренорфин (конечная концентрация 0,05-0,1 мг / кг) дважды в день в течение 2-3 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте солевой раствор на любой стадии, чтобы избежать обезвоживания открытой ткани.

4. Передача заслонки

  1. На одном илидве недели постимплантационная, анестезию мыши, внутрибрюшинного введения кетамина: ксилазина (35 мкл / 20 г), используя инсулиновый шприц.
  2. Подкожно вводят бупренорфин (конечная концентрация 0,05-0,1 мг / кг) до opperation.
  3. Наведите на сцене, нагретой до 37 ° С, чтобы обеспечить нормальную температуру тела, а затем закрепите мышь, используя клейкую повязку.
  4. Использование хлопка советы, применять смазочные глазную мазь для глаз мышки (чтобы избежать обезвоживания).
  5. Используя ватные палочки, очистить участок разреза (от колена к области живота) с йодом, а затем 70% -ным этанолом, чтобы установить асептический рабочую область.
  6. Использование ножницы и щипцы, осторожно откройте швы на коже и, используя ножницы, сделать разрез через параллельно кожи в паховой связки, продолжая через брюшной кожи.
  7. Осторожно снимите латекса кусок с пинцетом и выставить васкуляризованная клапан.
  8. Использование scissПРС и щипцы, рассекают ткани лоскут от окружающих тканей.
  9. Использование щипцов и иглодержатель, лигировать дистальный конец бедренной AV с 8-0 швами из шелка, чтобы предотвратить кровотечение из AV. Затем прижечь AV на уровне колена, дистальнее имплантированного сложенном ткани и 8-0 швов.
  10. Аккуратно перенести бедренной AV окутан трансплантата, к вентральной брюшной стенки, избегая повреждения артерии, чтобы определить, на каком расстоянии полный дефект толщина должна быть.
    ВНИМАНИЕ: Извлечение артерию слишком далеко повредить артерию.
  11. Использование тонких ножниц, сделать надрез в брюшной брюшной стенки.
  12. Использование пружины ножницы, сделать надрез в прямой брюшной мышцы мышцы. Снимите примерно 1 см х 0,8 см сегмент прямой брюшной мышцы мышцы с кожей вышележащих.
  13. Перевести бедренной А.В., окутан васкуляризированной трансплантата, как осевой заслонкой, в полной толщины дефекта в брюшной abdomИнал стены.
  14. Шовный клапан в окружающую мышечную ткань, используя 8-0 шелковые швы, чтобы предотвратить грыжу.
  15. Чтобы избежать наложения швов внутренние органы, мышцы поднять с пинцетом, когда ушивание лоскута на брюшной мышцы. Оставьте брюшной кожу воздействию имитировать эффект полного брюшной стенки дефекта.
  16. Обложка рану в коже с йодированной марлю и стерильную повязку, чтобы не допустить загрязнения открытой площади.
  17. Шовный кожу ноги, используя 4-0 шелковые швы.
  18. Не Монитор мыши тесно до выхода из наркоза, и каждый день после этого, до тех пор, поиска лоскута. Подкожно вводят бупренорфин (конечная концентрация 0,05-0,1 мг / кг) дважды в день в течение 2-3 дней.
  19. ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте солевой раствор на любой стадии, чтобы избежать обезвоживания открытой ткани.

5. УЗИ Определение сосудистой перфузии трансплантата

ПРИМЕЧАНИЕ: До передачи, сосудистая перфузии ое трансплантат измеряется в одну и две недели после имплантации, с помощью УЗИ.

  1. Обезболить мыши, используя 2% изофлуран.
  2. Наведите на подвижной стадии нагретую до 38 ° С, чтобы обеспечить нормальную температуру тела, а затем закрепите мышь, используя клейкую повязку.
  3. Найти артерия и вена суда бедренных с нелинейной преобразователя, установленного на B-режиме.
  4. Проверьте проходимость сосудов бедренного лоскута с использованием датчика, установленного на режим цветного допплеровского.
  5. Подготовка нецелевой контрастное вещество в соответствии с инструкциями изготовителя.
  6. Подключите хвостовую вену катетер (12 см трубы с 27 G иглой) на 1 мл шприца, заполненного физиологическим раствором. Безопасный шприц рядом с мышью на стадии нагрева (чтобы избежать перемещение шприца).
  7. Подключите катетер к мыши хвостовую вену и закрепить иглу.
  8. Вводите некоторые из физиологического раствора, чтобы гарантировать, что и инъекции делаются в вену и заполнитьтрубка солевым раствором (чтобы избежать воздушных пузырей).
  9. Заполните 1 мл шприц с 70 мкл контрастного вещества и заменить солевой шприц с контрастного агента шприца.
  10. Настройте ультразвук для инъекций изображения контрастного агента. В свойствах нелинейном режиме установить количество кадров в 1500 и нарушение пульса до 30% кадров.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После разрушения импульса, микропузырьки повторно заполнить сосуды в размере, который зависит от скорости потока микропузырьков в капиллярах и не зависит от скорости подачи микропузырьков. Число кадров может быть изменен в зависимости от времени заполнения 19,20.
  11. Медленно вводить контрастное вещество в хвостовую вену.
  12. Захват изображения в нелинейном режиме контрастности ультразвуковой системы с высоким разрешением.
  13. Анализ результатов с помощью программного обеспечения, как описано ранее 19,20.
    1. Нарисуйте область интереса (ROI) на изображении, полученном имопосредствованно после разрушения импульса в режиме контрастного. Окупаемость должна очертить область, заполненную только контрастного агента.
    2. Рассчитать пиковое усиление (PE), который представляет собой отношение средней интенсивности нелинейного сигнала после инъекции микропузырьков в сравнении после разрушения импульса, и является мерой объема перфузии.
    3. Рассчитать расход, который определяется с момента (T), что не прошедшее до пикового сигнала (P).

6. Определение степени васкуляризации трансплантата

Примечание: Степень ткани трансплантата васкуляризации определяется одна или две недели после имплантации.

  1. Использование инсулиновый шприц, анестезию мыши, внутрибрюшинного введения кетамина: ксилазина (35 мкл / 20 г).
  2. Используя 1 мл шприц, внутривенно вводят 200 мкл 10 мг / мл изотиоцианат флуоресцеина декстран-конъюгированные с FITC (декстран, ММ = 500000) в хвостовую вену. </ LI>
  3. Десять секунд после завершения инъекции, эвтаназии мыши цервикальным сдвигом.
  4. Откройте ногу мыши и выставить трансплантата.
  5. Промыть область трансплантата фосфатно-солевым буфером (PBS) и применить 10% формалин в нейтральном буфере.
  6. Изображение трансплантат в ногу мыши, с помощью конфокальной микроскопии.
  7. Количественно функциональной плотности сосудов (FVD).
    1. Изолировать зеленый канал (возбуждение = 488 нм) конфокальной микроскопических изображений.
    2. Передайте полученные изображения через фильтр высоких частот, для того, чтобы подчеркнуть высокое-контрастные структуры.
    3. Использование despeckling фильтр для удаления шума, которые могли быть амплифицированной в фильтр высоких частот.
    4. Установите значение порога по результирующего изображения; пороговое значение устанавливается таким образом, чтобы функции и структуры в исходном изображении видны в бинарном изображении.
    5. Нанесите размер порога, так что только группы связных пикселей больше, чем в определенной СИЗе пороговое остаются в бинарном изображении.
    6. Схема скелет судов в трансплантата с использованием алгоритма Чжан Син-21 в.
    7. Рассчитывают FVD путем суммирования длины средней линии каждого судна и разделив результат на области ROI.

7. иммуногистологических и Гистологическое окрашивание трансплантата

  1. Иммуногистологических Окрашивание
    1. После конфокальной микроскопии, получить трансплантат, используя небольшие ножницы и пинцет. Рассекают AV сосуды на обоих концах трансплантата и извлечения трансплантата.
    2. Закрепить трансплантаты в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 30 мин - 2 ч.
    3. Поместите трансплантатов в гистологии кассеты и в магазине в 70% этаноле до парафин.
    4. Вставить в парафин с использованием стандартного фиксацию и вложения протокол 22 и нарезать парафином тканей в 5 мкм ломтиками с помощью микротома. Нарежьте всю ткань перпендикулярно к AVсосуды.
    5. Deparaffinize секции в парафин погружением в 100% ксилола в два раза, в течение 10 минут каждый.
    6. Упорядочить слайды в 250 мл пластиковых Коплин банку.
    7. Увлажняет путем последовательных погружений в уменьшении концентрации этанола (100%, 96%, 90%, 80%, 70%, 50%, 30% и дважды дистиллированной воды (DDW)) в течение 3 мин каждый.
    8. Подготовка раствора антигена разоблачающий путем разбавления 2,35 мл антигена разоблачения раствора с 250 мл DDW. Нагреть демаскацию антигена раствора в течение 2 мин в микроволновой печи, установленной на 95 ° С.
    9. Вставка слайдов в предварительно нагретом растворе антигена выявление и тепла снова в течение 3 мин в микроволновой печи, установленной на 95 ° С. Охлаждают слайды до 50 ° С.
    10. Тепло снова в течение 2 мин и затем охлаждают до комнатной температуры.
    11. Инкубируйте слайды в 3,3% H 2 O 2 в метаноле решение в течение 10 мин, при комнатной температуре, чтобы утолить активность эндогенного пероксидазы, а затем промыть дважды в PBS.
    12. Подготовка инкубационный камеру: Место мокрой абсоrbent листов внутри гистологии поле и высушить, используя слайды тонкие дворники задач.
    13. Круг область фрагмента на слайде с помощью гидрофобного ручку и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре, приблизительно 50 мкл козьей сывороткой блокирующего раствора (2%, приготовленный в PBS) в расчете на срез.
    14. Разведите кролика против CD31 антитела 1:50 в блокирующем растворе, применяются примерно 50 мкл антител на срез и инкубировать O / N, при 4 ° С. Промыть 3 раза ЗФР, 5 мин каждый.
    15. Развести биотинилированного козьих антител против кроличьего вторичного антитела 1: 400 в PBS, место над слайдов примерно 50 мкл антитела на срез и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
    16. Промыть 3 раза ЗФР, 5 мин каждый.
    17. Развести стрептавидин-пероксидаза 1: 400 в PBS, применяются примерно 50 мкл на срез и инкубировать с горками в течение 30 мин, при комнатной температуре. Промыть 3 раза ЗФР, 5 мин каждый.
    18. Применить примерно 50 мкл aminoethylcarbazole (AEC) субстрата за кусочком, в зависимости от производителя и #8217; s инструкции. Опустите слайдов в DDW, чтобы остановить реакцию.
    19. Пятно ядер в синий погружением разделы примерно в 50 мкл раствора гематоксилин Майера в течение 2 мин. Осторожно промыть в воде, а затем покрыть участки с монтажа среду.
    20. Количественно CD31-положительная окрашивание с использованием двойного слепого подхода. Окрашивание CD31 появляется в виде коричневого пятна. Выберите 4-5 разных полей в поле зрения увеличения 40х под бинокулярным микроскопом. Подсчитайте количество CD31-положительных люмен.
      1. Рассчитывают среднее число CD31-положительных люмен на помост путем деления общего количества подсчитанных люмен с количеством полей и fieldarea (в соответствии с бинокулярной данных).
        ПРИМЕЧАНИЕ: применяется объем реагента должно быть достаточным, чтобы покрыть всю описанную кусочек.
  2. Гистологическое окрашивание
    1. Исправление трансплантаты в 10% нейтральном забуференном формалине.
    2. Код для вставки в трансплантаты парафина с помощью стандартафиксация и вложения процедуры.
    3. Удалить парафин из секций парафин погружением в 100% ксилола в два раза в течение 10 мин.
    4. Быстрая стирка дважды для регидратации в 100% изопропанола.
    5. Быстрая стирка дважды 95% этанола.
    6. Промыть три раза в водопроводной воде.
    7. Погрузитесь в Гематоксилин в течение 10 мин.
    8. Промыть три раза в водопроводной воде.
    9. Immere в эозином в течение 2 мин.
    10. Быстрая стирка обезвоживают в 95% этанола в два раза.
    11. Быстрая стирка 100% изопропанола в два раза.
    12. Быстрая стирка 100% ксилола в два раза.
    13. Накрыть DPX клея с защитным стеклом толщиной 1,5 мм.
    14. Изображение с помощью микроскопа в 40-кратном увеличении.

8. Механическая Оценка недвижимости

  1. Получить трансплантата, используя небольшие ножницы и пинцет.
  2. Промойте трансплантата в PBS.
  3. Измерьте ширину и толщину трансплантата и рассчитать площадь поперечного сечения, как произведение ширины толщиной.
  4. НасЕ измерительный прибор для генерации напряженно-деформированного кривой гидратированных трансплантатов.
    1. Установите трансплантат между системными растяжение ручки и измерьте длину от окончательного двумя зажимами (например, начальная длина).
    2. Применить скорости деформации 0,01 мм / сек, до отказа.
    3. Запишите развитую силу и смещение, используя протокол производителя.
    4. Создание кривой напряженно-деформированного в Matlab.
      1. Рассчитать штамм в соответствии с перемещением по отношению к исходному длины. Стресс рассчитывается как измеренного усилия, деленный на площадь поперечного сечения.
      2. Определите жесткость как наклон линейного-области в кривой напряженно-деформированного и в максимальной точке кривой является предел прочности при растяжении.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Прививка васкуляризации и перфузии в естественных условиях

Трансплантаты были имплантированы одну или две недели до их передачи в осевых лоскутов. На одном и двух недель после имплантации, валовой наблюдение области трансплантата выявлено жизнеспособных и васкуляризированных трансплантатов тканей. Эти трансплантаты оказались весьма васкуляризированной, как определено положительного CD31 иммуноокрашивания (рис 1А), и высоко перфузии, о чем свидетельствует FITC-декстрана инъекций в хвостовую вену и ультразвуковых измерений. Многие сосуды были уже наблюдалось при одной недели после имплантации, число, которое значительно выросли, после дополнительного недели в непосредственной близости от AV сосудов. FITC-декстрана на основе определение функционального плотности сосудов (FVD) (рис 1B) показали, что трансплантат был высоко васкуляризации в одну неделю после имплантации и никаких существенных изменений не произошло в дополнительной недели в естественных условиях. Проходимость сосудов и перфузии были продемонстрированыпо ультразвуковой визуализации (The ФВД был 5,71 мм - 1 ± 0,51 мм - 1 и 10,28 мм - 1 ± 2,71 мм - 1, один и две недели после имплантации, соответственно) Рисунок 1С подтвердил хоста бедренной проходимости и целостности сосудов после трансплантата имплантации. , Кроме того, ультразвуковое обследование показало перфузии в привитой области, которая была немного выше, через две недели после имплантации по сравнению с одной недели после имплантации (рис 1D).

Свойства лепестковые

Полная экспертиза закрылков одну неделю после переноса показали жизнеспособной, васкуляризации и хорошо интегрированный ткани. Клапаны прошли твердую привязанность к своему окружению. При сравнении предварительно васкуляризированных, сотовые встраиваемый закрылки, чтобы управлять НЕКЛЕТОЧНУЮ, nonvascularized трансплантатов, бывший показали превосходные механические свойства, что проявляется увеличением жесткости и прочности (

Рисунок 1
Рисунок 1. Привитые васкуляризации. (А) Плотность CD31-положительных сосудов, измеренный при одном и двух недель постимплантационная сравнению с контрольной группой. Все значения приведены к области трансплантата (мм 2). * = Т-тест р <0,05. (Б) Функциональная плотность сосудистой (ФВД) на одну и две недели после имплантации. Никаких существенных различий не наблюдалось, р = 0,08 (Т-тест). (С) Патент АВ суда как изображается с помощью ультразвука в режиме цветного допплеровского. Синий и красный представит кровоток в трансплантата. Желтый сектор очерчивает область трансплантата. (D), трансплантат перфузии в одну и две недели после имплантации. (Е и F), H & E окрашивание клапанов, интегрированных с принимающей ткани: черный точки стрелки жизнеспособным артерии; Белые стрелки указывают брюшной мышечные волокна; Желтые стрелки указывают эшафот останки. (Н и О) FITC декстран распределение, как показано с помощью конфокального микроскопа изображений. Для всех определений, размер выборки был п ≥ 3, и все значения представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Механические свойства клапаном одну неделюпосле передачи. (A) жесткость и (Б) предел прочности на растяжение (ОТС) закрылков. Контроль стоит пустой трансплантата без клеток, клетки стоит три-культуры трансплантатов. * = Т-тест р <0,05, п = 3. Значения представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Достижения в тканевой инженерии были встречены с растущим спросом на замещающих тканей для реконструкции различных типов тканей. Разнообразие синтетических 1,17,18 и биологических 14-16 материалов, а также методы изготовления были оценены по их способности реагировать на эти требования. Тем не менее, несмотря на прогресс в медицинской помощи и в тканевой инженерии, восстановление полной толщины брюшной стенки дефектов остается проблемой. Тканевый достаточно для реконструкции таких массивных дефектов должны быть (1) толщиной и (2) сосудистую сеть, и продемонстрировать (3) механическую целостность и (4) жизнеспособности в течение долгого времени 23.

Здесь мы представляем шаг за шагом подробный протокол для создания густой, жизнеспособного и васкуляризированных тканей лоскута, который может служить в качестве альтернативы аутологичных лоскутов ткани. Сфабрикованный лоскут был построен в два этапа: (1) ПЛМК / ПМГК эшафот был имплантирован вокруг AV сосудов муSE задних конечностей и отделен от окружающих тканей, чтобы васкуляризации АВ только сосудов. (2) создано васкуляризированной, толщиной ткани лоскут был переведен с AV сосудов, которые служили в качестве ножки, в полную толщину брюшной стенки дефекта.

Правильное лоскут васкуляризация имеет важное значение для его успешной интеграции в принимающей 17,18,24. Различные подходы к созданию васкуляризированных инженерии ткани для того, чтобы улучшить снабжение кислородом и диффузии в толстых тканей, были обсуждены в литературе. Среди них были способы, включающие посев эндотелиальных клеток (ECS) на различных типах лесов 13,20,25-30 различные методы для поставки ангиогенные факторы в месте имплантации (либо путем непосредственного введения путем инъекции, использование трансформированных клеток, экспрессирующих факторы 31 -34 или медленное высвобождение из разных лесов 35,36), использование биореакторов для обеспечения инженерии тканевой перфузии 37 38,39. Здесь ткань трансплантата васкуляризации в естественных условиях, по эксплуатации аутологичных сосудов. Трансплантат, который оказался жизнеспособным, васкуляризированной и перфузии, затем переносили в толстой ткани лоскута на ремонт всю толщину брюшной стенки дефект. Одна неделя после передачи, клапан был жизнеспособным и признакам достаточную механическую прочность, чтобы поддерживать брюшной полости. Здесь мы использовали бестимусных голых мышей, которые несут нарушенную иммунную систему; При использовании любого другого типа мыши или другого животного, возможность иммунных реакций следует учитывать (особенно при посеве каркасов с клетками). Другие ограничения этого метода включают в себя (1) передачу бедренных сосудов AV, которые поставляют приток крови к задней конечности. Тем не менее, этот метод оставляет profunda и глубокие бедренных сосудов нетронутой и не ишемии задней конечности не наблюдалось после передачи закрылка. Кроме того, в более крупных животных и у человека, использованиепериферических сосудов будет рекомендовано как они являются избыточными в организме; (2) время, необходимое для достижения адекватной васкуляризации до махать передачу, может быть ограничивающим фактором в экстренных случаях; и (3) создание лоскут выполняется в естественных условиях, которые могут ограничить его значение в организме человека. В будущем, мы стремимся развивать средства создания этой лоскут экс VIVO. Преимущество предложенного метода заключается в способности для повышения образования аутологичной ткани (с аутологичных клеток) вокруг эшафота. В результате ткани представляет подходящий вариант для аутологичных тканей лоскута. Кроме того, леса могут быть посеяны с аутологичных клеток до имплантации, для дальнейшего улучшения васкуляризации трансплантата и интеграции в ткани хозяина. Использование аутологичных клеток и биоразлагаемого и биосовместимого эшафот, можно обойти существенный риск иммуно-реакции отторжения и представить альтернативу аутологичных лоскутов, избегая сбор и послеоперационный scarifiкатион.

Описанный метод может переводится на эксперименты в крупных животных и расширена клинических испытаний на людях. Кроме того, он может быть переведен на ремонт различных поврежденных тканей в организме. В организме человека и животных в больших, закрылки могут быть получены вокруг периферических сосудов, а не на бедренных сосудов AV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
small fine straight scissors Fine Science Tools (FST) 14090-09
spring scissors Fine Science Tools (FST) 15003-08
straight forceps with fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-20
serrated forceps  Fine Science Tools (FST) 11050-10
needle holder Fine Science Tools (FST) 12500-12
Small vessel cauterizer  Fine Science Tools (FST) 18000-00
Duratears Alcon 5686
Sedaxylan Euravet DJ03
Clorketam 1000 Vetoquinol 4A0726B
Buprenorphine vetmarket B15100
4-0 silk sutures Assut sutures 647
6-0 polypropylene sutures Assut sutures 9351F
8-0 silk sutures Assut sutures 684568
Insulin syringe (6 mm needle) BD 324911
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system VisualSonics inc.
MS250 non-linear transducer VisualSonics inc.
Micromarker non-targeted contrast agent VisualSonics inc. VS-11694
tail vein catheter VisualSonics inc. VS-11912
Vevo 2100 software VisualSonics inc.
fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran Sigma FD500S
Matlab Mathworks, MA, USA
Kimwipes Kimtech 34120
antigen unmasking solution Vector laboratories H-3300
anti-CD31 antibody Abcam  ab28364
biotinylated goat anti-rabbit (secondary) antibody Vector laboratories BA-1000
streptavidin-peroxidase Jackson  016-030-084
Mayer's hamatoxylin solution Sigma-Aldrich MHS-16
aminoethylcarbazole (AEC) substrate kit Life technologies, Invitrogen  00-2007
Vectamount Vector laboratories H-5501

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Engelsman, A. F., van der Mei, H. C., Ploeg, R. J., Busscher, H. J. The phenomenon of infection with abdominal wall reconstruction. Biomaterials. 28 (14), 2314-2327 (2007).
  2. De Coppi, P., et al. Myoblast-acellular skeletal muscle matrix constructs guarantee a long-term repair of experimental full-thickness abdominal wall defects. Tissue Eng. 12 (7), 1929-1936 (2006).
  3. Shi, C., et al. Regeneration of full-thickness abdominal wall defects in rats using collagen scaffolds loaded with collagen-binding basic fibroblast growth factor. Biomaterials. 32 (3), 753-759 (2011).
  4. Yezhelyev, M. V., Deigni, O., Losken, A. Management of full-thickness abdominal wall defects following tumor resection. Ann Plast Surg. 69 (2), 186-191 (2012).
  5. Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. First human transplantation of a bioengineered airway tissue. J Thorac Cardiovasc Surg. 128 (4), 638-641 (2004).
  6. Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9665), 2023-2030 (2008).
  7. Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
  8. Nishida, K., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
  9. Petite, H., et al. Tissue-engineered bone regeneration. Nat Biotechnol. 18 (9), 959-963 (2000).
  10. Banta, M. N., Kirsner, R. S. Modulating diseased skin with tissue engineering: actinic purpura treated with Apligraf. Dermatol Surg. 28 (12), 1103-1106 (2002).
  11. Vunjak-Novakovic, G., et al. Challenges in cardiac tissue engineering. Tissue engineering. Part B, Reviews. 16 (2), 169-187 (2010).
  12. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
  13. Lesman, A., Gepstein, L., Levenberg, S. Vascularization shaping the heart. Ann N Y Acad Sci. 1188, 46-51 (2010).
  14. Patton Jr, H., Berry, S., Kralovich, K. A. Use of human acellular dermal matrix in complex and contaminated abdominal wall reconstructions. The Am J of Surg. 193 (3), 360-363 (2007).
  15. Menon, N. G., et al. Revascularization of human acellular dermis in full-thickness abdominal wall reconstruction in the rabbit model. Ann Plast Surg. 50 (5), 523-527 (2003).
  16. Buinewicz, B., Rosen, B. Acellular cadaveric dermis (AlloDerm): a new alternative for abdominal hernia repair. Ann Plast Surg. 52 (2), 188-194 (2004).
  17. Bringman, S., et al. Hernia repair: the search for ideal meshes. Hernia. 14 (1), 81-87 (2010).
  18. Meintjes, J., Yan, S., Zhou, L., Zheng, S., Zheng, M. Synthetic biological and composite scaffolds for abdominal wall reconstruction. Exp rev of med dev. 8 (2), 275-288 (2011).
  19. Cheng, G., et al. Engineered blood vessel networks connect to host vasculature via wrapping-and-tapping anastomosis. Blood. 118 (17), 4740-4749 (2011).
  20. Shandalov, Y., et al. An engineered muscle flap for reconstruction of large soft tissue defects. PNAS of the USA. 111 (16), 6010-6015 (2014).
  21. Zhang, T. Y., Suen, C. Y. A fast parallel algorithm for thinning digital patterns. Commun. ACM. 27 (3), 236-239 (1984).
  22. Luna, L. G. AFIo Pathology. Manual of Histo Stain Meth ; of the Arm Forcs Inst of Path. Luna, L. G. , Blakiston Division, McGraw-Hill. (1968).
  23. Choi, J. H., et al. Adipose tissue engineering for soft tissue regeneration. Tissue engineering. Part B, Reviews. 16 (4), 413-426 (2010).
  24. Bellows, C. F., Alder, A., Helton, W. S. Abdominal wall reconstruction using biological tissue grafts: present status and future opportunities. Exp rev of med dev. 3 (5), 657-675 (2006).
  25. Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circ Res. 100 (2), 263-272 (2007).
  26. Kaufman-Francis, K., Koffler, J., Weinberg, N., Dor, Y., Levenberg, S. Engineered vascular beds provide key signals to pancreatic hormone-producing cells. PloS one. 7 (7), e40741 (2012).
  27. Kaully, T., Kaufman-Francis, K., Lesman, A., Levenberg, S. Vascularization--the conduit to viable engineered tissues. Tiss eng. Part B, Reviews. 15 (2), 159-169 (2009).
  28. Koffler, J., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. PNAS of the USA. 108 (36), 14789-14794 (2011).
  29. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tisseng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).
  30. Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
  31. Bearzi, C., et al. PlGF-MMP9-engineered iPS cells supported on a PEG-fibrinogen hydrogel scaffold possess an enhanced capacity to repair damaged myocardium. Cell death & disease. 5, e1053 (2014).
  32. Zhang, M., et al. SDF-1 expression by mesenchymal stem cells results in trophic support of cardiac myocytes after myocardial infarction. FASEB J : official publication of the .Fed Am Soc Exp Biol. 21 (12), 3197-3207 (2007).
  33. Dvir, T., et al. Prevascularization of cardiac patch on the omentum improves its therapeutic outcome. PNAS. 106 (35), 14990-14995 (2009).
  34. Marsano, A., et al. The effect of controlled expression of VEGF by transduced myoblasts in a cardiac patch on vascularization in a mouse model of myocardial infarction. Biomaterials. 34 (2), 393-401 (2013).
  35. Rufaihah, A. J., et al. Enhanced infarct stabilization and neovascularization mediated by VEGF-loaded PEGylated fibrinogen hydrogel in a rodent myocardial infarction model. Biomaterials. 34 (33), 8195-8202 (2013).
  36. Nillesen, S. T. M., et al. Increased angiogenesis in acellular scaffolds by combined release of FGF2 and VEGF. J of Contr Release. 116 (2), e88-e90 (2006).
  37. Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat Commun. 4, 1399 (2013).
  38. Tee, R., et al. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tiss eng. Part A. (19-20), 1992-1999 (2012).
  39. Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).

Tags

Биоинженерия выпуск 107 лоскут тканевая инженерия леса васкуляризация модель мыши васкуляризированной ткани мышцы
Спроектированный васкуляризированных лоскута
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman,… More

Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman, A., Rosenfeld, D., Ben-Shimol, D., Levenberg, S. Engineered Vascularized Muscle Flap. J. Vis. Exp. (107), e52984, doi:10.3791/52984 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter