Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Engineered vaskulariserade Muskel Flap

doi: 10.3791/52984 Published: January 11, 2016
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bukväggen fel uppstår ofta efter svåra trauman, cancerbehandling, brännskador och avlägsnande av infekterade mesh. Dessa defekter innebär ofta betydande vävnadsförlust, kräver komplicerade kirurgiska ingrepp och presentera en stor utmaning för plaståteruppbyggnadskirurger 1-4. Tissue engineering forskare som söker nya källor för artificiella vävnader har utforskat olika material, cellkällor och tillväxtfaktorer. Framgångsrika restaureringar av olika vävnader, såsom trakea 5,6, blåsa 7, hornhinna 8, ben 9 och hud 10, genom implantering av konstruerade vävnader tidigare rapporterats. Men framför allt för rekonstruktion av stora brister fortfarande tillverkning av en tjock kärl konstruerad vävnad, en stor utmaning i tissue engineering.

En av de viktigaste faktorerna som begränsar tjockleken på en livskraftig vävnadskonstrukt är kontrollen av syretillförseln till dess nackdelartituent celler. Om det anlitar diffusion, konstruera tjocklek är begränsad till den av ett mycket tunt skikt. Det maximala avståndet mellan syre- och näringstillförande kapillärer in vivo är ungefär 200 pm, som korrelerar med diffusion gränsen för syre 11,12. Otillräcklig vaskularisation kan resultera i vävnadsischemi och eskalera till vävnads resorption eller nekros 13.

Dessutom måste den ideala material som används för vävnadsrekonstruktion vara biokompatibla och icke-immunogen. Det måste också kunna främja ytterligare integrering av värdceller med biomaterialet, och upprätthålla strukturell integritet. Olika biologiska 14-16 och syntetiska 1,17,18 matriser har tidigare undersökt för vävnadsrekonstruktion, men deras användning fortfarande begränsad på grund av bristen på effektiv blodtillförsel, infektioner eller otillräcklig vävnad styrka.

I denna studie, en biokompatibel, cell embedded byggnadsställning bestående av Food and Drug Administration (FDA) -godkänd poly L-mjölksyra (PLLA) / poly mjölksyra-sam-glykolsyra (PLGA), implanterades kring lårbensartären och venen (AV) fartyg från en naken mus och skild från den omgivande vävnaden, vilket garanterar vaskularisering från AV endast fartyg. En vecka efter implantationen, transplantatet var lönsamt, tjock och väl vaskulariserad. Denna tjocka vaskulariserad vävnad med AV-fartyg, överfördes sedan som en pedicled flik till en buken full tjocklek defekt i samma mus. En vecka efter överföring, fliken var lönsamt, vaskulariserad och väl integrerad med den omgivande vävnaden, med tillräcklig styrka för att stödja buken inälvor. Sålunda den konstruerade tjocka, vaskulariserad vävnadsflik, som bär ett autologt pediculus, presenterar en ny metod för reparation av full tjocklek bukväggen defekter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla djurstudier har godkänts av kommittén för etik djurförsök i Technion. För detta förfarande framställdes atymiska nakna möss användes för att undvika immunologisk avstötning. Om man använder en annan typ av mus, bör mössen rakades innan den kirurgiska proceduren och administrering av cyklosporin (eller annat anti-avstötning substitut) rekommenderas.

1. Scaffold Förberedelse och Cell Bädda

  1. Förbered byggnadsställningar sammansatta av en: en blandning av poly-L-mjölk-syra (PLLA) och polymjölksyra-sam-glykol-syra (PLGA), på följande sätt:
    1. Lös 500 mg PLLA och 500 mg PLGA i 10 ml kloroform.
    2. Lägg 0,24 ml polymerlösning till 0,4 g natriumklorid partiklar samlade i en Teflon formar. Använd ett salt diameter av 212-600 um. Låt kloroformen avdunsta O / N.
    3. Läcka saltet ut med destillerat vatten leder till sammankopplade porösa 3D ställningar.
    4. Skär polymerbitarnamed hjälp av en sax, sedan dra i 70% etanol (volym / volym) under 30 minuter och tvätta 3 gånger i PBS under 2 min före användning.
  2. Bered en tri-kultur av följande celler i en: en endotelial cellmedium (EGM-2 kompletterat med de komponenter av dess kula kit och muskelcellmedium (Dulbeccos minimala essentiella medium (DMEM), kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS ), 2,5% HEPES-buffert, 100 U / ml penicillin och 0,1 mg / ml streptomycin (Pen-Strep lösning).
    1. Använd 0,5 x 10 6 C2C12 myoblaster, 0,9 x 10 6 Mänskliga navelvenendotelceller (HUVEC), och 0,2 x 10 6 Normala humana dermala fibroblaster (NHDF).
  3. Blanda cellerna tillsammans i ett mikrocentrifugrör och centrifugera vid 200 xg under 4 minuter, aspirera mediet och återsuspendera pelleten i en blandning av 4 | il iskall extracellulär matrislösning och 4 | j, l cellmedium.
  4. Klipp en bit 10 mm x 7 mm x 1 mm (längd x bredd x djup) PLLA / PLGEn byggnadsställning och utsäde cellsuspensionen i en 6-brunnsplatta, medger den extracellulära matrislösningen att stelna (30 min, 37 ° C, 5% CO2) före tillsats 4 ml cellmedium.
  5. Inkubera ställningar för tio dagar före implantation och ersätta mediet varannan dag.

2. Innan du börjar det kirurgiska ingreppet

  1. Förbered och sterilisera (autoklav) Följande kirurgiska instrument: en liten, fin, rak sax, en fjäder sax, en rak, spetsig pincett, en tandad pincett och en nålhållare.
  2. Förbered en blandning av ketamin: xylazin lösning i ett mikrocentrifugrör genom att blanda 425 pl ketamin och 75 ul xylazin i en 1 ml spruta.
  3. Späd 0,3 mg / ml buprenorfin i steril saltlösning (01:20).

3. Flap Construction (Graft implantation)

  1. Med hjälp av en insulinspruta, söva musen genom en intraperitoneal injektion av ketamin: xylazin (35 pl per20 g kroppsvikt).
  2. Subkutant injicera buprenorfin (slutkoncentration av 0,05 till 0,1 mg / kg) före opperation.
  3. Placera musen på en scen upphettas till 37 ° C, för att säkerställa normal kroppstemperatur, och därefter fast musen med hjälp av ett plåster.
  4. Med hjälp av bomull tips, administrera smörjögonsalva till musens ögon (för att undvika uttorkning).
  5. Använda bomull tips, ren incisionsstället med jod och sedan med 70% etanol, för att upprätta en aseptisk arbetsfält.
  6. Med små sax och pincett, gör ett snitt genom huden, från nivån på knä inguinal ligament, parallellt med lårbens fartygen tills lårbensartären och venen (AV) fartyg exponeras.
  7. Håll huden nedåt med ett upprullningsdon, för att få bättre tillgång till vävnaden.
  8. Använda våren sax och pincett, försiktigt isolera lårbensartären och ven fartyg från den omgivande vävnaden. Börja från nivå inguinal ligAment till förgreningen av de överlägsna epigastrisk fartyg. Låt profunda orörd, för att bevara blodflödet till benet och förhindra efterföljande ischemi.
  9. Vik transplantatet (från avsnitt 1) ​​runt den exponerade lårbens AV, under profunda och ovanför bifurkationen till skenbens och proneal AV, och gå med sina ändar med hjälp av 8-0 silkessuturer.
  10. För att säkerställa implantat vaskularisering av kapillärerna gro från lårbens AV endast fartyg, linda en bit steriliserad latex runt implantatet, och sutur med 6-0 suturer.
  11. Stäng liggande huden med 4-0 silkessuturer.
  12. Övervaka musen noga tills återhämtning från narkosen och varje dag därefter tills transplantatet överförs som en flik. Subkutant injicera buprenorfin (slutlig koncentration av 0,05-0,1 mg / kg) två gånger per dag i 2-3 dagar.
    OBS! Använd saltlösning i något skede, för att undvika uttorkning av den exponerade vävnaden.

4. Klaff Övergång

  1. Vid en ellertvå veckor postimplantationsförlust, söva musen genom en intraperitoneal injektion av ketamin: xylazin (35 | j, l / 20 g), under användning av en insulinspruta.
  2. Subkutant injicera buprenorfin (slutkoncentration av 0,05 till 0,1 mg / kg) före opperation.
  3. Placera musen på en scen upphettas till 37 ° C, för att säkerställa normal kroppstemperatur, och därefter fast musen med hjälp av ett plåster.
  4. Med hjälp av bomull tips, applicera smörjögonsalva till musens ögon (för att undvika uttorkning).
  5. Med hjälp av bomull tips, rengör snittstället (från knät området till buken) med jod och sedan med 70% etanol, för att upprätta en aseptisk arbetsfält.
  6. Med hjälp av en sax och pincett, öppna försiktigt suturerna i huden och, med hjälp av en sax, gör ett snitt genom huden parallellt med det inguinala ligamentet, fortsätter genom den ventrala huden.
  7. Försiktigt bort latex stycke med pincett och exponera vaskulariserade klaffen.
  8. Med användning av en saxarorer och pincett, dissekera vävnad fliken från den omgivande vävnaden.
  9. Med hjälp av en pincett och en nålhållare, ligera den distala änden av den femorala AV- med 8-0 silkessuturer att förhindra blödning från AV. Därefter, bränna AV vid nivån för knäet, distalt till den vikta implanterade vävnaden och de 8-0 suturer.
  10. Försiktigt överföra lårbens AV- omsluten av transplantatet, mot den ventrala bukväggen, undvika skador på artären, för att bestämma vid vilket avstånd hela tjockleken defekten bör göras.
    VARNING: Dra artären för långt skadar artären.
  11. Med hjälp av en fin sax, göra ett snitt i den ventrala bukväggen.
  12. Med hjälp av en fjäder sax, gör ett snitt i rectus abdominus muskeln. Ta en ca 1 cm x 0,8 cm segment av rectus abdominus muskeln med den överliggande huden.
  13. Överför lårbens AV, omsluten av vaskulariserade implantatet, som en axiell flik, till full tjocklek defekt i ventrala abdomInal vägg.
  14. Sutur klaffen till den omgivande muskelvävnad, med användning av 8-0 silkessuturer, för att förhindra bråck.
  15. För att undvika att suturera de inre organen, höj muskeln med en pincett vid suturering av fliken till den abdominala muskeln. Lämna den ventrala huden exponeras för att efterlikna effekten av en full bukväggen defekt.
  16. Täcka såret i huden med joderad gasväv och ett sterilt förband för att förhindra kontaminering av den exponerade arean.
  17. Sutur huden på benet med användning av 4-0 silkessuturer.
  18. Övervaka musen noga tills återhämtning från narkosen och varje dag därefter, fram till hämtning av klaffen. Subkutant injicera buprenorfin (slutlig koncentration av 0,05-0,1 mg / kg) två gånger per dag i 2-3 dagar.
  19. OBS! Använd saltlösning i något skede för att undvika uttorkning av den exponerade vävnaden.

5. Ultraljud Fastställande av Vascular Perfusion av Graft

OBS! Innan överföring, vaskulär perfusion of transplantatet mäts vid en och två veckor efter implantation, med ultraljud.

  1. Söva musen med 2% isofluran.
  2. Placera musen på en rörlig scen upphettas till 38 ° C, för att säkerställa normal kroppstemperatur, och därefter fast musen med hjälp av ett plåster.
  3. Hitta de femorala artär och ven fartyg med icke-linjär omvandlare inställd på B-läget.
  4. Undersök öppenheten hos lårbens kärlen i transplantat använder omvandlaren inställd på färgdoppler läge.
  5. Förbered icke öronkontrastmedlet enligt tillverkarens anvisningar.
  6. Anslut en svansven kateter (12 cm rör med en 27 G-nål) till en 1 ml spruta fylld med koksaltlösning. Fäst sprutan bredvid musen på upphettningssteget (för att undvika förflyttning av sprutan).
  7. Anslut katetern till mussvansvenen och säkra nålen.
  8. Injicera en del av koksaltlösning för att både se till att injektioner görs i venen och fyllaslangen med saltlösning (för att undvika luftbubblor).
  9. Fyll en 1 ml spruta med 70 pl av kontrastmedel och ersätta saltlösnings sprutan med injektionsspruta kontrastmedlet.
  10. Ställ in ultraljudet till bild injektion av kontrastmedlet. I egenskaperna hos icke-linjära läge ställa in antalet ramar till 1500 och störningar puls till 30% av bilderna.
    OBS: Efter avbrott pulsen, mikrobubbloma re-fill kärlen med en hastighet som beror på flödeshastigheten av mikrobubblorna i kapillärerna och är oberoende av insprutningshastigheten av mikrobubblorna. Antalet bilder kan ändras beroende på fyllningstiden 19,20.
  11. Injicera långsamt kontrastmedlet i svansvenen.
  12. Ta bilder i den icke-linjära kontrastläge för högupplösta ultraljudssystemet.
  13. Analysera resultaten med hjälp av programvaran, som tidigare beskrivits 19,20.
    1. Rita ett område av intresse (ROI) på bilden erhållna imdelbart efter avbrott pulsen i kontrastläge. ROI bör beskriva område fyllt av kontrasten enda agent.
    2. Beräkna toppförbättring (PE), som är förhållandet mellan medelintensiteten hos den icke-linjär signal efter injektionen av mikrobubblorna kontra efter avbrott pulsen, och är ett mått på perfusionen volymen.
    3. Beräkna flödeshastigheten, som bestäms från den tid (T) som förflyter tills toppsignalen (P).

6. Prövning av omfattningen av Graft Vascularization

OBS: Omfattningen av vävnadstransplantatkärlbildning bestäms en eller två veckor efter implantation.

  1. Med användning av en insulinspruta, söva musen genom en intraperitoneal injektion av ketamin: xylazin (35 | j, l / 20 g).
  2. Använda 1 ml spruta, intravenöst injicera 200 pl 10 mg / ml fluoresceinisotiocyanat-konjugerat dextran (FITC-dextran, MW = 500.000) i svansvenen. </ li>
  3. Tio sekunder efter fullbordande av injektionen, avliva musen genom cervikal dislokation.
  4. Öppna benet hos mus och exponera transplantatet.
  5. Tvätta transplantatområdet med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och applicera 10% neutral buffrad formalin.
  6. Bild transplantatet i mus benet, med användning av ett konfokalt mikroskop.
  7. Kvantifiera funktionell kärltäthet (FVD).
    1. Isolera den gröna kanalen (excitation = 488 nm) av de konfokala mikroskopiska bilder.
    2. Passera de resulterande bilderna genom ett högpassfilter, för att accentuera de hög kontrast strukturer.
    3. Använd ett bort fläckar filter för att avlägsna brus som kan ha förstärkts av högpassfiltret.
    4. Ställ in värdet på tröskeln på den resulterande bilden; tröskelvärdet justeras så att funktioner och strukturer i den ursprungliga bilden är synliga i den binära bilden.
    5. Applicera en storlekströskel, så att endast grupper av förbundna bildpunkter är större än den definierade size tröskel förblir i den binära bilden.
    6. Disposition skelettet av fartygen i transplantatet med hjälp av Zhang-Suen algoritm 21.
    7. Beräkna FVD genom att summera längder av mittlinjen för varje fartyg och dividera resultatet med den del av ROI.

7. Immunohistological och histologisk färgning av transplantatet

  1. Immunhistologisk färgning
    1. Efter konfokal avbildning, hämta transplantatet med hjälp av en liten sax och pincett. Dissekera AV kärlen i de två ändarna av transplantatet och hämta transplantatet.
    2. Fäst transplantat i 10% neutral buffrad formalin under 30 min - 2 h.
    3. Placera transplantat i histologi kassetter och lagra i 70% etanol tills paraffininbäddning.
    4. Bädda in i paraffin med en vanlig fixering och bädda protokoll 22 och skiva paraffininbäddade vävnader till 5 pm skivor med hjälp av en mikrotom. Skiva hela vävnaden vinkelrätt mot AVfartyg.
    5. Avparaffinera de paraffininbäddade snitt genom nedsänkning i 100% xylen två gånger, under 10 min vardera.
    6. Ordna glasen i en 250 ml plast Coplin-kärl.
    7. Rehydrera genom serie nedsänkningar i minskande koncentrationer av etanol (100%, 96%, 90%, 80%, 70%, 50%, 30% och dubbeldestillerat vatten (DDW)) för 3 min vardera.
    8. Förbered antigen avslöjande lösning genom att späda 2,35 ml av antigen avslöjande lösning med 250 ml DDW. Värm antigen avslöjande lösning 2 min i en mikrovågsugn inställd på 95 ° C.
    9. Sätt glasen i den förvärmda antigen avslöjande lösning och värmen igen under 3 minuter i en mikrovågsugn inställd på 95 ° C. Kyl glasen till 50 ° C.
    10. Värm igen för 2 minuter och kyl sedan till RT.
    11. Inkubera objektglasen i 3,3% H2O 2-lösning i metanol under 10 min, vid RT för att släcka aktiviteten av endogent peroxidas och skölj sedan två gånger i PBS.
    12. Förbered en inkubationskammare: plats våt absorbent ark inuti en histologi låda och torka bilder med hjälp grannlaga uppgift vindrutetorkare.
    13. Cirkel segmentområdet på objektglaset med användning av en hydrofob penna och inkubera under 30 min vid RT, med cirka 50 | il getserum blockeringslösning (2%, framställd i PBS) per skiva.
    14. Späd kanin-anti-CD31-antikropp 1:50 i blockeringslösning, applicera approximativt 50 pl antikropp per skiva och inkubera O / N, vid 4 ° C. Skölj 3 gånger med PBS, 5 min vardera.
    15. Späd den biotinylerade get anti-kanin sekundär antikropp 1: 400 i PBS, plats över diabilder cirka 50 pl av antikropp per skiva och inkubera under 30 min vid RT.
    16. Skölj 3 gånger med PBS, 5 min vardera.
    17. Späd streptavidin-peroxidas 1: 400 i PBS, sätt till ca 50 | j, l per skiva och inkubera med objektglasen i 30 min, vid RT. Skölj 3 gånger med PBS, 5 min vardera.
    18. Ansök ungefär substrat 50 il aminoethylcarbazole (AEC) per skiva, enligt tillverkaren & #8217; s instruktioner. Doppa dem i DDW för att stoppa reaktionen.
    19. Färga kärnor i blått genom nedsänkning sektionerna på cirka 50 il Mayers hematoxylin lösning under 2 min. Skölj försiktigt i vatten och sedan täcka avsnitten med monteringsmedium.
    20. Kvantifiera CD31-positiv färgning med användning av en dubbel-blind tillvägagångssätt. CD31 färgning visas som en brun fläck. Välj 4-5 olika fält i en 40X förstoring synfält under ett binokulärt mikroskop. Räkna antalet CD31-positiva lumen.
      1. Beräkna det genomsnittliga antalet CD31-positiva lumen per byggnadsställning genom att dividera det totala antalet räknade lumen med antalet fält och fieldarea (enligt kikare data).
        OBS: Den tillämpade reagensvolym måste vara tillräcklig för att täcka hela skiss skiva.
  2. Histologisk färgning
    1. Fix transplantat i 10% neutral buffrad formalin.
    2. Bädda transplantat i paraffin med användning av standardfixering och inbäddning förfaranden.
    3. Avlägsna paraffinet från paraffininbäddade snitt genom nedsänkning i 100% xylen två gånger under 10 minuter.
    4. Snabb tvätta två gånger för rehydrering i 100% isopropanol.
    5. Snabb tvätta två gånger 95% etanol.
    6. Tvätta tre gånger i kranvatten.
    7. Fördjupa sig i Hematoxylin under 10 minuter.
    8. Tvätta tre gånger i kranvatten.
    9. Immere i Eosin för 2 min.
    10. Snabb tvätt torka i 95% etanol två gånger.
    11. Snabb tvätt 100% isopropanol två gånger.
    12. Snabb tvätt 100% xylen två gånger.
    13. Täck med DPX lim med skyddsglas 1,5 mm tjock.
    14. Bild med mikroskop 40X förstoring.

8. Mekaniska egenskaper Bedömning

  1. Hämta transplantatet med hjälp av en liten sax och pincett.
  2. Skölj transplantatet i PBS.
  3. Mät bredden och tjockleken av transplantatet och beräkna tvärsnittsarean som vidden multiplicerad med tjocklek.
  4. Osse testinstrumentet för att generera en spännings-deformationskurva av hydratiserade transplantat.
    1. Montera transplantatet mellan systemdrag grepp och mäta den slutliga längden mellan de två handtag (dvs initial längd).
    2. Applicera en töjningshastighet av 0,01 mm / s, tills brott.
    3. Anteckna utvecklade kraft och förskjutning med hjälp av tillverkarens protokoll.
    4. Generera en spännings-töjningskurva i Matlab.
      1. Beräkna stammen enligt förskjutning dividerad med den ursprungliga längden. Stress är beräknad som den uppmätta kraften dividerat med tvärsnittsytan.
      2. Bestäm styvhet som lutningen för den linjära-regionen i spännings-töjningskurvan och den maximala punkten på kurvan är den ultimata draghållfastheten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Graft vaskularisering och perfusion in vivo

De transplantat implanterades en eller två veckor innan överföringen som axiella flikar. På en och två veckor efter implantation, grov observation av transplantatet området visade livskraftiga och vaskulariserad vävnadstransplantat. Dessa transplantat har visat sig vara i hög grad vaskulariserad, bestämd genom positiv CD31 immunofärgning (Figur 1A), och högt perfunderades, vilket framgår av FITC-dextran svansvenen injektion och ultraljudsmätningar. Många fartyg redan observerats vid en veckor efter implantation, en siffra som steg kraftigt efter ytterligare en vecka i närheten av AV-fartyg. FITC-dextran-baserad bestämning av funktionella fartygets densitet (FVD) (Figur 1B) visade att transplantatet var mycket vaskulariserade vid en veckas postimplantationsförlust och att inga väsentliga förändringar ägde rum i ytterligare en vecka in vivo. Fartygs öppenhet och perfusion visadesmed ultraljud imaging (den FVD var 5,71 mm - 1 ± 0,51 mm - 1 och 10,28 mm - 1 ± 2,71 mm - 1, en ​​och två veckor efter implantation, respektive) Figur 1C bekräftade värd lårbens fartyg öppenhet och integritet efter transplantat implantation. . Dessutom avslöjade ultraljudsundersökning perfusion inom transplantationsområdet, vilket var något högre två veckor efter implantation jämfört med en vecka efter implantation (Figur 1D).

Flap egenskaper

Brutto undersökning av flikarna en vecka efter överföring avslöjade en livskraftig, vaskulariserad och väl integrerad vävnad. Klaffarna gick fast anknytning till sin omgivning. Vid en jämförelse av pre-vaskulariserade, cellinbäddade klaffar för att styra acellulärt, nonvascularized transplantat, tidigare visade överlägsna mekaniska egenskaper, vilket visar sig genom ökad styvhet och hållfasthet (

Figur 1
Figur 1. Transplantat vaskularisering. (A) Densiteten hos CD31-positiva kärl, uppmätt vid en och två veckor postimplantationsförlust jämförelse med kontrollgruppen. Alla värden är normaliserade till transplantatet området (mm 2). * = T-test p <0,05. (B) Funktionskärltäthet (FVD) vid en och två veckor postimplantationsförlust. Ingen signifikant skillnad observerades, p = 0,08 (T-test). (C) Patent AV fartyg som avbildas med ultraljud i färgdoppler läget. Blå och röda repret blodflödet i transplantatet. Den gula kvadranten beskriver transplantatet området. (D) graft perfusion vid en och två veckor postimplantationsförlust. (E och F) H & E färgning av flikarna integreras med värdvävnaden: svart pil punkt livskraftig artär; vita pilarna pekar buken muskelfibrer; gula pilar pekar ställningsåterstår. (H och G) FITC dextran fördelning som framgår av konfokalmikroskopi bilder. För alla bestämningar, urvalsstorleken var n ≥ 3 och alla värden representeras som medelvärde ± standardfel av medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Mekaniska egenskaper hos klaffen en veckapostöverföring. (A) styvhet och (B) dragbrottgränsen (UTS) av flikarna. Kontroll står en tom transplantat utan celler, celler står tri-kultur transplantat. * = T-test p <0,05, n = 3. Värdena representeras som medelvärde ± standardfel av medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Framstegen inom tissue engineering har mötts av en ökad efterfrågan på ersättningsvävnader för återuppbyggnad av olika vävnadstyper. En mängd olika syntetiska 1,17,18 och biologiska 14-16 material samt tillverkningsmetoder har utvärderats för sin förmåga att ta itu med dessa krav. Trots framstegen i klinisk vård och tissue engineering, förblir återställande av full tjocklek bukväggen defekter en utmaning. En vävnads lämplig för återuppbyggnad av sådana massiva defekter måste vara (1) tjocka och (2) vaskulariserad och visa (3) mekanisk integritet, och (4) lönsamhet över tiden 23.

Här presenterar vi en steg-för-steg detaljerat protokoll för att skapa en tjock, livskraftig och vaskulariserad vävnadsflik, som kan fungera som ett alternativ till autologa vävnadsflikar. Den tillverkas klaffen konstruerades i två steg: (1) En PLLA / PLGA schavotten implanterades runt AV kärlen i mouse bakdelen och separeras från den omgivande vävnaden för att tillåta vaskularisering av AV-endast fartyg. (2) Den skapade vaskulariserad, tjock vävnadsflik fördes sedan med AV-fartyg, som tjänade som dess BLOMSTJÄLK, till en full tjocklek bukväggen defekt.

Korrekt flik vaskularisering är avgörande för dess framgångsrika integration i värd 17,18,24. Olika metoder för att skapa vaskulariserad konstruerad vävnad för att förbättra syretillförseln och spridning i tjocka vävnader, har diskuterats i litteraturen. Bland dessa fanns metoder som involverar ympning av endotelceller (ECS) på olika ställningstyper 13,20,25-30, olika tekniker för att leverera angiogena faktorer än implanteringsstället (antingen genom direkt administration genom injektion, användning av transformerade celler som uttrycker de faktorer 31 -34 eller långsam frisättning från olika ställningar 35,36), användning av bioreaktorer för att säkerställa konstruerad vävnadsperfusion 37 38,39. Här ades vävnaden transplantatet vaskulariserad in vivo, genom utnyttjande av autologa fartyg. Transplantatet, som visade sig vara livskraftig, vaskulariserad och perfusion, överfördes sedan som en tjock vävnad flik för att reparera en full tjocklek bukväggen defekt. En vecka efter överföring, fliken var livskraftig och innehöll tillräcklig mekanisk hållfasthet för att stödja buken inälvor. Här har vi använt atymiska nakna möss, som bär en försämrad immunsystemet; vid användning av någon annan typ av mus eller annat djur, bör hänsyn tas till möjligheten för immunreaktioner i beaktande (speciellt när sådd ställningar med celler). Andra begränsningar av denna teknik inkluderar (1) överföring av lårbens AV fartyg som försörjer blodflödet till bakbenen. Men tekniken lämnar profunda och djupa lårbens fartyg orörda och ingen bakbenen ischemi observerades efter klafföverföring. Dessutom i större djur och i människor, användning avperifera kärl kommer att informeras eftersom de är överflödiga i kroppen; (2) den tid som krävs för att uppnå adekvat vaskularisering före flaxa överföring, kan vara en begränsande faktor i brådskande fall, och (3) klaff skapande utförs in vivo, vilket kan begränsa dess relevans hos människa. I framtiden, strävar vi efter att utveckla ett sätt att skapa denna flik ex vivo. Fördelen med den presenterade metoden ligger i förmågan att öka bildningen av en autolog vävnad (med autologa celler) runt ställningen. Det erhållna tissue presenteras ett lämpligt alternativ till en autolog vävnad flik. Dessutom kan ställningen ympas med autologa celler före implantation, för att ytterligare förbättra transplantat kärlbildning och integration i värdvävnaden. Användning av autologa celler och en biologiskt nedbrytbar och biokompatibel ställningen, kan kringgå den betydande risken för immunavstötningsreaktioner och presentera ett alternativ till autologa flikar och samtidigt undvika avverkning och postoperativ scarifikatjon.

Den beskrivna metoden kan översättas till experiment i stora djur och vidareutvecklas till kliniska prövningar i människa. Dessutom kan det översättas till reparera olika skadade vävnader i kroppen. Hos människor och stora djur, kan flikarna genereras kring perifera kärl i stället för på lårbens AV kärlen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
small fine straight scissors Fine Science Tools (FST) 14090-09
spring scissors Fine Science Tools (FST) 15003-08
straight forceps with fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-20
serrated forceps  Fine Science Tools (FST) 11050-10
needle holder Fine Science Tools (FST) 12500-12
Small vessel cauterizer  Fine Science Tools (FST) 18000-00
Duratears Alcon 5686
Sedaxylan Euravet DJ03
Clorketam 1000 Vetoquinol 4A0726B
Buprenorphine vetmarket B15100
4-0 silk sutures Assut sutures 647
6-0 polypropylene sutures Assut sutures 9351F
8-0 silk sutures Assut sutures 684568
Insulin syringe (6 mm needle) BD 324911
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system VisualSonics inc.
MS250 non-linear transducer VisualSonics inc.
Micromarker non-targeted contrast agent VisualSonics inc. VS-11694
tail vein catheter VisualSonics inc. VS-11912
Vevo 2100 software VisualSonics inc.
fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran Sigma FD500S
Matlab Mathworks, MA, USA
Kimwipes Kimtech 34120
antigen unmasking solution Vector laboratories H-3300
anti-CD31 antibody Abcam  ab28364
biotinylated goat anti-rabbit (secondary) antibody Vector laboratories BA-1000
streptavidin-peroxidase Jackson  016-030-084
Mayer's hamatoxylin solution Sigma-Aldrich MHS-16
aminoethylcarbazole (AEC) substrate kit Life technologies, Invitrogen  00-2007
Vectamount Vector laboratories H-5501

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Engelsman, A. F., van der Mei, H. C., Ploeg, R. J., Busscher, H. J. The phenomenon of infection with abdominal wall reconstruction. Biomaterials. 28, (14), 2314-2327 (2007).
  2. De Coppi, P., et al. Myoblast-acellular skeletal muscle matrix constructs guarantee a long-term repair of experimental full-thickness abdominal wall defects. Tissue Eng. 12, (7), 1929-1936 (2006).
  3. Shi, C., et al. Regeneration of full-thickness abdominal wall defects in rats using collagen scaffolds loaded with collagen-binding basic fibroblast growth factor. Biomaterials. 32, (3), 753-759 (2011).
  4. Yezhelyev, M. V., Deigni, O., Losken, A. Management of full-thickness abdominal wall defects following tumor resection. Ann Plast Surg. 69, (2), 186-191 (2012).
  5. Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. First human transplantation of a bioengineered airway tissue. J Thorac Cardiovasc Surg. 128, (4), 638-641 (2004).
  6. Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372, (9665), 2023-2030 (2008).
  7. Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367, (9518), 1241-1246 (2006).
  8. Nishida, K., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med. 351, (12), 1187-1196 (2004).
  9. Petite, H., et al. Tissue-engineered bone regeneration. Nat Biotechnol. 18, (9), 959-963 (2000).
  10. Banta, M. N., Kirsner, R. S. Modulating diseased skin with tissue engineering: actinic purpura treated with Apligraf. Dermatol Surg. 28, (12), 1103-1106 (2002).
  11. Vunjak-Novakovic, G., et al. Challenges in cardiac tissue engineering. Tissue engineering. Part B, Reviews. 16, (2), 169-187 (2010).
  12. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63, (4-5), 300-311 (2011).
  13. Lesman, A., Gepstein, L., Levenberg, S. Vascularization shaping the heart. Ann N Y Acad Sci. 1188, 46-51 (2010).
  14. Patton Jr, H., Berry, S., Kralovich, K. A. Use of human acellular dermal matrix in complex and contaminated abdominal wall reconstructions. The Am J of Surg. 193, (3), 360-363 (2007).
  15. Menon, N. G., et al. Revascularization of human acellular dermis in full-thickness abdominal wall reconstruction in the rabbit model. Ann Plast Surg. 50, (5), 523-527 (2003).
  16. Buinewicz, B., Rosen, B. Acellular cadaveric dermis (AlloDerm): a new alternative for abdominal hernia repair. Ann Plast Surg. 52, (2), 188-194 (2004).
  17. Bringman, S., et al. Hernia repair: the search for ideal meshes. Hernia. 14, (1), 81-87 (2010).
  18. Meintjes, J., Yan, S., Zhou, L., Zheng, S., Zheng, M. Synthetic biological and composite scaffolds for abdominal wall reconstruction. Exp rev of med dev. 8, (2), 275-288 (2011).
  19. Cheng, G., et al. Engineered blood vessel networks connect to host vasculature via wrapping-and-tapping anastomosis. Blood. 118, (17), 4740-4749 (2011).
  20. Shandalov, Y., et al. An engineered muscle flap for reconstruction of large soft tissue defects. PNAS of the USA. 111, (16), 6010-6015 (2014).
  21. Zhang, T. Y., Suen, C. Y. A fast parallel algorithm for thinning digital patterns. Commun. ACM. 27, (3), 236-239 (1984).
  22. Luna, L. G. AFIo Pathology. Manual of Histo Stain Meth ; of the Arm Forcs Inst of Path. Luna, L. G. Blakiston Division, McGraw-Hill. (1968).
  23. Choi, J. H., et al. Adipose tissue engineering for soft tissue regeneration. Tissue engineering. Part B, Reviews. 16, (4), 413-426 (2010).
  24. Bellows, C. F., Alder, A., Helton, W. S. Abdominal wall reconstruction using biological tissue grafts: present status and future opportunities. Exp rev of med dev. 3, (5), 657-675 (2006).
  25. Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circ Res. 100, (2), 263-272 (2007).
  26. Kaufman-Francis, K., Koffler, J., Weinberg, N., Dor, Y., Levenberg, S. Engineered vascular beds provide key signals to pancreatic hormone-producing cells. PloS one. 7, (7), e40741 (2012).
  27. Kaully, T., Kaufman-Francis, K., Lesman, A., Levenberg, S. Vascularization--the conduit to viable engineered tissues. Tiss eng. Part B, Reviews. 15, (2), 159-169 (2009).
  28. Koffler, J., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. PNAS of the USA. 108, (36), 14789-14794 (2011).
  29. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tisseng. Part A. 16, (1), 115-125 (2010).
  30. Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat Biotechnol. 23, (7), 879-884 (2005).
  31. Bearzi, C., et al. PlGF-MMP9-engineered iPS cells supported on a PEG-fibrinogen hydrogel scaffold possess an enhanced capacity to repair damaged myocardium. Cell death & disease. 5, e1053 (2014).
  32. Zhang, M., et al. SDF-1 expression by mesenchymal stem cells results in trophic support of cardiac myocytes after myocardial infarction. FASEB J : official publication of the .Fed Am Soc Exp Biol. 21, (12), 3197-3207 (2007).
  33. Dvir, T., et al. Prevascularization of cardiac patch on the omentum improves its therapeutic outcome. PNAS. 106, (35), 14990-14995 (2009).
  34. Marsano, A., et al. The effect of controlled expression of VEGF by transduced myoblasts in a cardiac patch on vascularization in a mouse model of myocardial infarction. Biomaterials. 34, (2), 393-401 (2013).
  35. Rufaihah, A. J., et al. Enhanced infarct stabilization and neovascularization mediated by VEGF-loaded PEGylated fibrinogen hydrogel in a rodent myocardial infarction model. Biomaterials. 34, (33), 8195-8202 (2013).
  36. Nillesen, S. T. M., et al. Increased angiogenesis in acellular scaffolds by combined release of FGF2 and VEGF. J of Contr Release. 116, (2), e88-e90 (2006).
  37. Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat Commun. 4, 1399 (2013).
  38. Tee, R., et al. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tiss eng. Part A. (19-20), 1992-1999 (2012).
  39. Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115, (3), 353-360 (2007).
Engineered vaskulariserade Muskel Flap
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman, A., Rosenfeld, D., Ben-Shimol, D., Levenberg, S. Engineered Vascularized Muscle Flap. J. Vis. Exp. (107), e52984, doi:10.3791/52984 (2016).More

Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman, A., Rosenfeld, D., Ben-Shimol, D., Levenberg, S. Engineered Vascularized Muscle Flap. J. Vis. Exp. (107), e52984, doi:10.3791/52984 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter