Summary
Трансфер ящик избегание обучения хорошо разработана в поведенческой неврологии. Этот протокол описывает, как трансфер ящик обучения у грызунов может быть в сочетании с конкретным участкам электрической интракортикальных микростимуляции (ICMS) и одновременного хронического IN VIVO записей в качестве инструмента для изучения различных аспектов обучения и восприятия.
Abstract
Избегание Трансфер ящик обучение является хорошо признанным методом в поведенческих нейронауки и экспериментальных установок традиционно заказ; необходимое оборудование теперь доступно несколько коммерческих компаний. Этот протокол обеспечивает детальное описание двустороннего избегания трансфер ящик обучения парадигмы у грызунов (песчанки здесь; монгольские Мерион unguiculatus) в сочетании с конкретным участкам электрической интракортикальных микростимуляции (ICMS) и одновременно хронических электрофизиологических естественных условиях записей в. Детальный протокол применим для изучения различных аспектов поведения обучения и восприятия в различных видов грызунов.
Сайт конкретных ICMS слуховых корковых схем, как условные раздражители здесь используется в качестве инструмента для проверки восприятия актуальности конкретных афферентных, эфферентных и интракортикальных соединений. Различные модели активации можно вызвать с помощью другой стимуляции электрода обрн я для местных, уровня зависит от ICMS или отдаленные участки. ICMS Использование поведенческого анализа для обнаружения сигнала может быть определено, какая стратегия стимуляции наиболее эффективными для выявления в поведенчески обнаруживаемого и характерные сигнал. Кроме того, параллельные многоканальный записи с использованием различных конструкций электродов (поверхностных электродов, глубины электроды и т.д.) позволяют для исследования нейронных наблюдаемых за время курса таких процессов обучения. Это будет обсуждаться, как изменения поведенческого дизайна может повысить познавательную сложность (например, обнаружение, дискриминация, реверсивное обучение).
Introduction
Фундаментальная цель поведенческой неврологии является установление конкретных связей между нейронными структурных и функциональных свойств, обучения и восприятия. Нейронная активность связана с восприятием и обучения может быть изучен электрофизиологические записи потенциалов действия и локальных потенциалов поля в различных структурах головного мозга в нескольких сайтах. В то время как электрофизиологические записи обеспечивают корреляционные связи между нервной деятельности и поведения, прямое электрическое Внутрикорковый микростимуляции (ICMS) на протяжении более века была наиболее прямой метод для тестирования причинно-следственных связей возбужденных популяций нейронов и их поведенческих и перцептивных эффектов 1 - 3. Многие исследования показали, что животные способны использовать различные пространственные и временные свойства электрических стимулов в перцептивных задач в зависимости от места стимуляции в например retinotopic 4, тonotopic 5 или 6 somatotopic регионы коры. Распространение электрически вызванной активности в коре головного мозга, в основном, определяется расположение аксонов волокон и их распределенной синаптической связи 2, что в коре головного мозга, явно слой зависит от 7. Полученный полисинаптический активации, вызванный ICMS отныне гораздо более широкое распространение, чем прямого воздействия электрического поля 2,8,9. Это объясняет, почему пороги восприятия эффектов вызываемые интракортикальных микростимуляции может быть сильно зависит от слоя 8,10,11 и сайт-зависимой 9. Недавнее исследование продемонстрировало подробно, что стимуляция верхних слоев дали больше широко распространенное активации corticocortical схем в основном supragranular слоев, в то время как стимуляция глубоких слоев коры результате в фокальной, рецидивирующим кортикофугальный intracolumnar активации. Параллельные поведенческие эксперименты показали, что последний имеет значительно более низкую восприятия THR обнаруженияesholds 8. Таким образом, преимущество сайт-специфической ICMS в условных раздражителей было использовано в комбинации с электрофизиологических записей в причинно связаны определенные корковых активаций цепи от 8 до поведенческих мер обучения и восприятия в челночной коробке.
Двусторонний трансфер ящик парадигма хорошо создана лабораторная установка для изучения избегания обучения 12. Трансфер-окно состоит из 2 отделений, разделенных препятствие или дверях. Условный раздражитель (CS), что представляется подходящим сигнала как свет или звук, является условно сопровождается отвращение безусловного раздражителя (США), как, например, ноги шок над полом из металлической сетки. Субъекты могут научиться избегать США по курсируя от одного трансфер ящика отсека в другой в ответ на CS. Трансфер ящик обучение включает в себя последовательность различимых этапов обучения 13,14: Во-первых,предметы научиться предсказывать нас от CS классической кондиционирования и уйти от США инструментальной кондиционирования, как США расторгается челночные. В следующей фазе, предметы научиться избегать США вообще по курсируя в ответ на CS до начала американской (реакция избегания). Как правило, трансфер-окно включает в себя классическую обучения кондиционер, инструментальную кондиционер, а также целенаправленное поведение в зависимости от фазы 14 обучения.
Процедура трансфер-коробка может быть установлена легко и обычно приводит к получению надежной поведение после нескольких ежедневных тренировок 15 - 17. В дополнение к простой избегания кондиционирования (обнаружения), трансфер-коробка может быть дополнительно использован для изучения дискриминации по стимулированию, используя Go / NoGo парадигмы. Здесь животные обучаются избегать США по условной реакции (CR) (перейти поведение; трансфер в обратном ящиком) в ответ на <сильный> го-раздражитель (CS +) и NoGo поведения (остается в текущем отсека; не CR) в ответ на NoGo-стимула (CS-) Параллельно микростимуляции и запись нейронной активности с массивами многоэлектродной высокой плотности позволяют изучать. физиологические механизмы, лежащие в основе успешного обучения. , Будут обсуждаться несколько технических деталей, которые имеют основополагающее значение для успешных комбинаций трансфер ящика обучения, ICMS и параллельного электрофизиологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты, представленные в этой работе были проведены в соответствии с этическими стандартами, определенными немецкого закона о защите экспериментальных животных. Эксперименты были одобрены комитетом по этике в земле Саксония-Анхальт.
1. заказ многоканальных матриц электродов для записи и микростимуляции
- Заказ массив микростимуляции
- Для доставки холодильников, подготовить стимуляции электроды в нужном пространственного дизайна (здесь боковое массива из 2 каналов), используя 3-сантиметровые провода из нержавеющей стали с тефлоновым изоляцией (Ø с изоляцией = 50 мкм). Смотрите рисунок 2.
- Обжимные один конец провода к мужской системы PIN (1,25 мм шаг).
- Для массива 2-канальный с ~ 0,5 мм или 0,7 мм ~ расстояние между электродами проходят провода перпендикулярно через два вертикально ориентированных электронной микроскопии объектно-держатель сетки (расстояние сеток ~ 5 мм) руководящие провода (0,1654 мм шаг).
- Положите штырьков в корпус разъема.
- Положите электрод в блюдо с раствором электролита (например, 0,9% хлорида натрия) и измерьте сопротивление каждого канала с соответствующей измерения импеданса устройства (например,., ФЭК сопротивление Кондиционер модуль). Направьте на сопротивлений в 100 до 500 кОм диапазоне.
- Если сопротивление слишком высока, обеспечивают короткое электрический ток (1 сек, 1 мА) через каналы, чтобы снизить его. Проверьте сопротивление снова.
- Массивы многоканальной записи на заказ высокого разрешения
Примечание: этот протокол описывает изготовление поверхности массивов для записи данных ЭГ (ЭГ). Тем не менее, проекты могут быть адаптированы для удовлетворения требований соответствующего вопроса исследования (глубина записи и т.д.). Многоканальные массивы высокого разрешения являются Builт проводами тефлона изоляцией из нержавеющей стали (Ø с изоляцией = 50 мкм) гофрированные мужского пола системы PIN (1,25 мм шаг).- Для поверхностных электродов массивов, руководство провода через 18 3 х 6 матрицы двух подготовленных электронной микроскопии объектно-держатель сетям.
- Встроить расположение проводов между сетками с зубной акрила 6 х 3 и поставить штифты в корпусе штекера.
- Измельчить зубной акрила в прямоугольный блок с помощью шлифовальной машины, прикрепленную к ручным сверлом.
- Убедитесь, что импеданс всех каналов (см 1.1.6) находится в диапазоне между 100 - 500 кОм.
- Перед имплантацией (этап 2) помола поверхность массивов в соответствии с выпуклостью поверхности коры.
2. Хирургическое Имплантация массивов в слуховой коре в анестезированной монгольских Herbils для хронической Использование
- Держите официальное разрешение на выполнение всех необходимых экспериментальных шагов, которые запланированы. Носите APPROтаже защитная одежда (пальто, стерильные перчатки, хирургические маски, капот).
- Используйте взрослых мужчин монгольских песчанок (Мерион unguiculatus) или каких-либо других видов грызунов. Носите защитные перчатки и пальто и всегда использовать стерилизованные и хорошо выявленных хирургические инструменты.
- В случае песчанок, обезболивания животных с внутрибрюшинной инъекции смеси кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (5 мг / кг), разведенного в 0,9% растворе хлорида натрия стерильной. Поддержание путем инфузии 0,6 мл / ч / кг смеси кетамина сочинения: ксилазина: хлорид натрия (0,9%) в соотношении 9: 1: 10.
- Поместите животное на нагревательной пластине для поддержания температуры тела при 37 ° С с помощью системы обратной связи ректальный зонд (например, World Precision Instruments).
- Бритье меха покрытия interoccipital, теменной и височных костей. Консерванта подготовить разреза с эффективным дезинфицирующим (например., Чередуя Бетадин или Nolvasan и 70% спиртом кусты 3 раза). ПрЗащищать глаза от высыхания по глазной мази.
- Вырезать черепной кожа, покрывающая interoccipital, теменной и лобных костей, используя скальпель и удалить надкостницы аккуратно перемещая сверло по поверхности кости.
- Дрель маленькие отверстия в противоположной теменной и лобной кости в боковой, как можно не мешает позже глава крепление. Теперь винт два костных винтов с диаметром около 1 мм плотно в отверстия. Убедитесь, что винт имеет теменную хороший контакт с твердой мозговой оболочки, как это будет использоваться в качестве общей ссылки и землей, а также возвратный электрод для электрической стимуляцией позже.
- Клей небольшой алюминиевый бар медиально по лобных костей и использовать его в качестве главного фиксации во время имплантации в головодержатель.
- Удалить кожу покрытия Musculus TEMPORALIS на одной стороне с использованием ножниц.
- Отрежьте спинной части височной мышцы для получения допуска к височной кости.
- Expose слуховую кору по трепанации черепа (~ 3 мм х 4 мм)Височная кость с помощью бормашины. Определить местоположение слуховой коры на основе типичной гематоэнцефалический сосуда подписи 18,19.
- Осторожно сделать разрез твердой мозговой с микро скальпелем в месте, где стимуляция электрод имплантируют в мозг. Осторожно двигаться вдоль поверхности до твердой мозговой слезы запретить ущерб основной нейропиля.
- Вставьте стимуляции массив под контролем микроманипулятора. Выбрать тангенциальный угол вставки, чтобы позволить эпидуральной массив быть размещены над интересующей области. В зависимости от угла вставки и положения и направленной месте раздражения, внимательно рассмотреть глубину погружения.
- Поместите эпидуральной регистрирующей поверхности с хорошего контакта с поверхностью мозга, покрывающей область интереса (здесь слуховую кору) с помощью второго микроманипулятором. Позаботьтесь о том, массив соответствует кривизне коры не отступа твердую мозговую оболочку.
- Зафиксируйте оба электрода массивов и их пробкуКорпуса с зубной акрила с черепом.
- Обложка подвергаются поверхности коры с антисептическим смазки (например, KY Jelly-) и тесном трепанации черепа с зубной акрила (например, Paladur, Heraeus Ulzer). Имейте в виду, что полимеризация может произвести тепло. Использование достаточную смазку между нейропиля и зубной акриловой чтобы не допустить контакта зубной акриловой и поверхности коры, так как это может вызвать повреждение тканей.
- Теперь дают животным восстановиться до начала каких-либо дальнейших процедуры. Время восстановления может отличаться между видами (например, песчанки: ≥ 3 дней, мышей: ≥ 7 дней). Тщательно контролировать состояние животного и дать обезболивающее лечение в следующих дней, если это применимо (например, Мелоксикам, 1 мг / кг послеоперационный и 24 ч после операции).
3. Двусторонняя Трансфер-коробка проекты с использованием холодильников, как условный раздражитель
- Трансфер ящик обучение
- Поместите трансфер ящик (сВыборочная ремонтом или любой коммерческий продукт, например, E10-E15, Coulbourn инструменты) в акустически и электрически экранированный камеры. Коробка содержит два отделения, разделенные барьером. Рассмотрим высоту барьера, как это влияет на поведенческие смещения гоу-ответов. Используйте соответствующие высоты для конкретных видов (например, ~ 2 см для мышей, ~ 3 см для песчанок).
- Чтобы применить ножной шок (США), использовать сетки пол с расстоянием между решеткой для соответствующих видов в рамках расследования 12,15. Всегда следите за тем, ничего не электрически ярлыки отдельные бары (фекалии, волосы, электрод крем).
- После значительного времени восстановления животного (см 2.17), подключите субъекта к записи и стимуляции кабеля предпочтительно без использования краткосрочного анестезии. Попробуйте для покрытия животное полотенцем и осторожно взять животное в руках. Раскройте голову и разъемы животного с другой стороны, и подключить кабели. Разрешить животные привыкают к учебной камере в течение 3 мин до начала каждой сессии.
- За тренировку (1 - 2 в день) применяются между 30 - 90 испытаний. Использование пробные длительностью до 15 сек и между пробные интервалы, которые изменяются случайным образом между 25 - 30 сек.
- Для доставки холодильников для условного раздражения к стимуляции электродов использовать многоканальную стимулятор (например, MCS STG2000). Чтобы получить поведенческие эффекты, не повреждая ткани мозга, применить импульсов (например, 300 мс длина, 100 пакетов в секунду) двухфазных, заряда сбалансированный импульсов (катодной Первый) с длительностью фаз в 200 мкс. Повторите поезда с паузой в 700 мс для продолжительности 4 сек (окно наблюдения).
- Для представления слуховой CS использовать PCI плату аналогового выхода (например, устройства NI PCI-6733). Программирование этих устройств с Matlab гибко контролировать и аппаратно-вызывают системы трансфер-коробки с помощью цифровых выходных линий.
- Маршрут аналоговый выход сигнал гое трансфер-коробка динамики через аудио усилителя.
- Условно поставить ногу-шокировать нас через решетчатый пол. Для оптимального качества записи электрофизиологических, генерировать шок по второй высокого класса многоканальной стимулятора (MCS STG2000).
- Чтобы применить обучение обнаружения присутствует только + стимулы CS. Здесь присутствуют пустые испытания без CS и США перемежаются между испытаний, (~ 10%) для коррекции поведения предвзятое трансфер (см 3.2). Для более сложных задач, обучать животных различать CS + и Cs-стимулов, представленных в той же сессии в случайном порядке.
- Оцените изменения отсека после наступления CS + в критическом временном окне 4 сек (CR) в ответ хита. В испытаниях CS + без ЧР в критическом временном окне (Мисс), немедленно доставить мягкий шок ног для 6 до 10 сек как безусловного раздражителя (США).
Примечание: ритмическая стимуляция CS +, что совпадает с США будет уменьшить усилия обучения для животных ай повысить скорость обучения и производительность ('' задержку против "след" кондиционирования, обсуждение см). - Для цезия испытаний, классифицировать изменения отсека в течение критического временного окна как ложные срабатывания сигнализации, а также применять в США до 10 сек сразу после этого ненадлежащего ЧР. Не применять после США CS-, когда животное остается в отделении (без CR) во время окна критический момент, и классифицировать эту пробную а правильный отказ.
Примечание: Важно отметить, что ноги шокировать США всегда выключен, когда животные меняет отсек в ответ на это (Escape). Используйте больше критических временных окон для цезия испытаний, например, если повторяющиеся условного раздражения используются, хотя это будет налагать более консервативный критерий обучения, как это дает более высокую усилий со стороны животного ингибировать CR. - Для эффективного объединения CS и США регулировать ударную прочность в умеренном диапазоне, чтобы быть отвращение, но не болезненным. Оптимальное ПервоСила тока л отличается между видами (например, 50 мкА для мышей, 200 мкА для песчанок). Поэтому, пожалуйста, см следующие две пули для дальнейших технических деталей:
- Индивидуально адаптировать ударная прочность в первой тренировке, начиная с мягких амплитуд (~ 200 мкА для песчанок). Если сила ног ударной это слишком низко, бежать задержки джиттера и связь между CS и США не является оптимальным.
- Всегда обращайте внимание, если животные начинают напевать и заморозить в ответ на CS. В этом случае сила Footshock слишком высока. Это условный рефлекс страха мешает избегания обучения.
- Тщательно определить управляющие задержки. Увеличьте ног Ударная прочность шаг за шагом, если побег задержки больше чем на 2 сек после первых 20 испытаний. Проверка после каждой тренировки, если животное находится под контролем ударной, т.е., это показывает, избежать задержек значительно ниже 2 сек.
Примечание: Тем не менее, во избежание увеличения ногушокировать силы слишком быстро, так как поведенческая стратегия весьма напряженном животное может вернуться к чистой ответов эвакуации. Поэтому внимательно наблюдать за поведением и особенно задержки отклика при регулировке амплитуды США. Для примера рис 3E. - Если животное показывает CR, немедленно прекратить презентацию CS. Это очень важно для армирования реакции избегания.
- Если животные приобрели стратегию уклонения, т.е. показать соответствующий CR ко всем CS, изменять параметры (амплитуду холодильников, продолжительность фаз, частоты повторения и т.д.) для выполнения психометрических анализов. Применить изменения параметрического CS в блочного моды с США спаривания, которые, однако, будут вызывать обучение и адаптацию.
- Чтобы избежать этого, начните с 15 до 30 испытаний оригинального обучения, а затем случайно пересыпать вариации CS без США в качестве тестовых испытаний между регулярными испытаний обучения с оригинальным CS-х. Максимально уSE 25% тестовых испытаний.
- После обучения удалить животное от учебного камеры и тщательно очистить полный ящик перед тренировкой следующего животного. Старайтесь избегать обучение различных видов, в то время в том же окне, а их естественный запах может помешать производительности обучения.
- Анализ подготовки данных
- Запишите все изменения отсек в фазе привыкания.
- Запишите все изменения салоне во время подготовки и разделить на хиты и ложных тревог, бежать ответы (промахи и обратно трансфер после ложной тревоги) и спонтанные intertrial трансфер (ИТС).
- Рассчитать цены на CR CS + и CS- следующим образом: ставки хит = удары / Количество CS + испытаний; ложных тревог = ложных тревог / количество цезия испытаний.
- Получить CR цены сессия мудрый. Тем не менее, для оценки динамики обучения на более высоком временном разрешении, рассчитать CR ставки от коротких блоков одного ряда CS + CS-и испытаний (
- Земля CR ставки в зависимости от сессии или суда блока для оценки динамики обучение ходе и обучения.
- Для количественного определения поведенческой чувствительности независимо от условий эксперимента смещения реакцию животного, получения D 'значения на основе теории обнаружения сигнала 8,9,17.
- Для D 'использовать анализ Z-оценки соответствующих хит и ложных тревог ставок (обучения дискриминация) или пострадавших ставок и (обучение) обнаружения, полученные из обратных стандартизированного функции нормального распределения и вычесть эти Z-баллы. Установить порог критерий обнаружения стимула D '= 1,0, что соответствует уровню сигнала одного стандартного отклонения выше шума. Смотрите рисунок 3 как пример.
- Кроме того определяют Cr- и бежать времени реакции в ответ на различные CS путем измерения времени между началом CS и поведенческой реакции (полное отделениеизменение).
- Получить более подробную поведенческий анализ от видеосъемку поведение трансфер ящик. Добиться временного синхронизации между видео и записи систем путем записи импульсов запуска от челночной коробке или системы стимулирования на аудио следа видео. Анализ видео позволяет ослов внимания и ориентирующих ответов животного, предшествующего CR.
4. В Vivo электрофизиологических методов в изучении животных
- Электрофизиологические записи во время обучения
- Во время обучения, записи электрофизиологических сигналов (например, с описанными ЭГ-массивов) из нескольких электродов монополярно против общего задания / заземляющего электрода.
- Кормовые сигналы от всех электродов в усилителе headstage либо подключен непосредственно или через короткий адаптер в разъемы головы.
- Подключите headstage к основному усилителю через упряжи тонких, гибких кабелей, завернутыйметаллической сеткой, чтобы защитить его от повреждений, кусая животных.
Примечание: Механическое напряжение в жгуте проводов может быть освобожден от дальнейшего весной разрешений свободное движение и вращение животного в поле. Идеально является использование поворотной и моторизованной поворотным. Тем не менее, для слуховых экспериментов разместить поворотный пределами сурдокамере или звук оградить его с пеной для уменьшения высоких частот слуховой шум, производимый его двигателя. - Использование предусилитель в экранированной коробке для увеличения отношения сигнал-шум и полосовой фильтр сигнала в требуемом диапазоне частот.
- Примеры данных на более чем 1 кГц частотой дискретизации (для местных полевых записей потенциальных) и по меньшей мере 40 кГц (для действий потенциальных записей) и хранить на ПК для автономного анализа. Используйте подходящие настройки фильтра для обоих типов (например, 2 - 300 Гц для потенциала локального поля; 300 - 4000 Гц для потенциалов действия).
- Внимательно проверьте качество записи перед началом тне дождь (нет шума или движения артефакты). Применение онлайн FFT-фильтра к сигналу, чтобы определить амплитуду шума 50 Гц. При необходимости дважды проверьте все соединения между разъемом головки, адаптеры, в headstages, жгут, и усилители.
- Для уменьшения артефактов в записанных данных вызванных электрической стимуляцией использовать процедуру интерполяции реконструировать все точки данных, пострадавших от артефакта 1 мс, прежде чем до ~ 5 мс после начала каждого импульса. Для этого вставьте нули между непораженных точек, и применять симметричный КИХ-фильтр, который минимизирует средние квадратных ошибки между интерполированных точек и их идеальных ценностей (функция interp.m Matlab в). Применить эту процедуру к исходному сигналу, отдельно в каждом канале до дальнейшего анализа 9.
- Технические детали параллельно трансфер ящика обучения, ICMS и записи
- В общем, убедитесь, что животные чувствуют себя комфортно в коробке surroundiнг. Дайте животным свободно двигаться и достигать все углы коробки. Достаточное время для привыкания день до первой тренировки (20 мин) и до каждой сессии (3 мин) является полезным.
- После любого хирургического лечения, позволяют животному достаточно времени, чтобы восстановиться в том числе лекарства, если это необходимо (см выше 2.17) и начать обучать животное только, если животные не проявляют никаких типичные признаки страдают или боли (закрытые глаза, вялой фенотип, грязный мех 20).
- Обеспечить надлежащее электрического заземления решетчатый пол. Контуры заземления между системой записи, трансфер-поле и животного следует избегать. Заземление животное только через его общий заземляющий электрод, оставив gridfloor с плавающей напряжения.
- Подключите многоканальный стимулятор (MCS STG2000) в головной разъем имплантированного массива стимуляции электрода через отдельные линии моторизованной поворотным.
- Используйте общий заземляющий электрод записи, как на землю или вернуть электрод для ICMS, а также.
5. Гистологический анализ электродных позиций
- После полного обучающего набора, управлять для стабильного положения массива стимуляции электрода гистологического анализа.
- Анестезировать животных с внутрибрюшинной инъекции смеси кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (5 мг / кг), разведенного в 0,9% стерильного хлорида натрия-. Затем нанесите монополярного катодного тока (30 мкА в течение 60 сек) доставлено по всем каналам стимуляции, чтобы получить железа депозит в ткани в месте имплантации 8.
- После этой процедуры, пожертвовать животное соответствующим и утвержденного метода эвтаназии (например, внутрибрюшинного введения передозировки пентобарбитала, 100 мг / кг).
- Немедленно снять мозг животного и заморозить его в 2-метилбутана охлаждают до -70 ° С в жидком азоте.
- Теперь сократить область интереса на криостатном микротоме в 50 мкм чorizontal разделов.
- Гистология: Нисслю и "берлинская лазурь" -СТАНКИ
- Для идентификации корковых слоев лечения каждый второй кусочек с Нисслю окрашивания. Во-первых, купаться ломтиками 5 мин в 0,05 М натрий буфере ацетата тригидрата (рН 4,0 -4,2).
- Купайтесь ломтики для 5 - 10 мин в 5% ацетата крезил фиолетового. Промыть ломтики с дистиллированной водой.
- Купают ломтики в течение 2 мин последовательно в 0,05 М натрий-ацетатный буфер (тригидрата рН 4,0 - 4,2), а в растворах 50%, 70% и 90% этанола, соответственно.
- Купайтесь ломтики дважды в изопропаноле: 96% этанол (2: 1) в течение 5 мин каждый.
- Наконец, ванну ломтики в Roticlear три раза в течение 5 мин.
- Получить расположение стимуляции каналов, "прусский" Голубой -СТАНКИ любого другого среза, что делает отложение железа вызываемую длинных однофазных токов после опытов видимых.
- Подготовка свежий раствор 1% hexacyanoferrat калия (II), тригидрат К 4[Fe (CN) 6] путем смешивания 2 г K 4 [Fe (CN) 6] в 200 мл 1% -ной HCl.
- Добавить 800 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4).
- Купают срезах мозга в течение 10 мин с дистиллированной водой, а затем в течение 10 мин в растворе hexacyanoferrat.
- Купают ломтики дважды в течение 10 мин в 0,1 М фосфатном буфере и, наконец, в течение 5 мин в дистиллированной воде.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом разделе показан типичный пример трансфер ящика обучения в монгольской песчанки. Этот вопрос был обучен различать сайт ICMS между двумя электродами стимуляции имплантируют 700 мкм друг от друга в слуховой коре (фиг.1 и 2). Стимулирование массивы могут быть настроены в различных пространственных конструкций (рисунок 1). Здесь дискриминация двух сайтов холодильников стало известно, в течение 3 учебных сессий с презентацией 30 CS + и CS- каждый (3А-C). Об этом свидетельствует стабильный значительной разницы ставок CR попадания и ложной тревоги ответов на протяжении 7 последовательных тренировок (рис 3b). Соответственно, г '> 1 в таких сессий (Рис 3C). Быстрый побег задержки по отношению к США являются фундаментальными, так как они отражают эффективную отвращение безусловный ответ. Это может быть гарантировано путем адаптации ног Ударная прочность от 200 &# 181; А на 50 мкА шагов до эвакуации задержек короткие (рис 3 E). Параллельно, электрофизиологические записи с в ЭГ-массива позволяют оценить сайт-специфические паттерны пространственно-временной активации навеянные интракортикальных электрической CS + или CS- на стимулирование сайтов, разделенных ~ 700 мкм (рис 4).
Рисунок 1. Электродные конструкций массива. (А) Глубина массив (2 х 1) для интракортикальных микростимуляции на двух разных сайтах в коре головного мозга. Электроды расположены в межэлектродном расстоянии ~ 700 мкм. Другие пространственные конструкции может позволить слой-зависимой местного ICMS в различных корковых глубины или боковых массивов со стимуляцией участков вдоль определенной оси кортикальной тканью, как, например, tonotopic градиент слуховой коре 8. (Б) Эпидуральное surfaCE массив (3 х 6) для записи ЭГ в высоким пространственным разрешением. Электроды были изготовлены из проволоки из нержавеющей стали (Ø 256 мкм), расположенных в матрице 3х6 с межэлектродном расстоянии ~ 600 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Позиционирование имплантированных стимуляции и регистрирующих электродов. (A) пара из двух электродов стимуляции (рис 1А) S1 (темно-зеленый) и S2 (светло-зеленый) имплантируют в глубине правого первичной слуховой области А.И. близко к его входной слой IV. Советы электрод может быть расположен вдоль оси рострокаудального (хвостовой электрода S1, S2 ростральная электрод) с межэлектродном расстоянии ~ 700 мкм. Запись 3 х 6 ЭГМассив (межэлектродное расстояние 600 мкм) в центре эпидурально над правым AI. (Б) Нисслю окрашенных горизонтальное сечение соответствующего участка мозга после экспериментальная процедура показывает два небольших поражений (стрелки), которые были вызваны кончиков двух имплантированных электродов стимуляции с указанием их местоположения в пределах височной коры. Положение может быть дополнительно оценены "ферроцинсодержащего" окрашивания. Эта цифра была изменена с Deliano др., 2009 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Трансфер-коробка подготовка и анализ данных из одного отдельного животного. (А) Схемы на право описать дизайн задач для CS + и Cs-испытания в двух направлениях трансфер ящика discriminatiна задачи и поведенческих результатов. кривые (B), обучения на графике как хит и ложных тревог ставок отдельных учебных занятий. Существенные различия между попаданием и ложных тревог отмечены звездочками (тест Игры Howell, р <0,05). (С) Чувствительность индекса D '> 1 (см 3.2.7) может быть использован в качестве критерия порога для успешного дискриминации. (D ) Мониторинг спонтанных переходов на этапе привыкания обычно показывают уменьшение на заседаниях. (Е) задержки ответа во время испытания + CS построены для индивидуальных испытаний более всех учебных сессий. Все ответы с задержками ниже 6 сек соответствуют успешных ответов хит. Обратите внимание на длинные задержки эвакуации в первой половине первой сессии. После увеличения подножия ударные силы эвакуации задержки снизился ниже 2 с после начала американской указанием достаточного контроля шок. Гистограммы (справа) на вставка задержки реагирования являются bimodаль соответствующих ударить ответов (<6 сек) и избежать ответов. (6 - 8 сек) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Параллельное электрофизиологические запись в обучении животного. (А) Типичный пример электрически вызванных потенциалов (ЕЭП) с одного животного в среднем по CS + испытаний в одной сессии обучения. Данные были записаны с ECOG-массива. На рисунке сравнивает EEP след раньше (черный) и после (красный) удаления одиночных импульсов артефактов стимулирования. Подробная информация о артефакт сокращения см раздел 4.1.7. Раннее известный отрицательный пик можно увидеть на задержки 20 мс (N20). (Б) Дальнейший анализ пространственных распределений амплитуды N20 в ответ на CS + при Тон Ростральные стимуляции электрод (вверху) и в CS- в хвостовой стимуляции электрода (нижней) выявить пространственное разрешение вызванных государств на протяжении слуховой коры. Анатомические направлениях относительно регистрирующей указаны стрелками (д, спинной C, хвостового; л, боковая; м, медиальный, R, ростральной; v, брюшная). Эта цифра была изменена с Deliano др., 2009 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает метод одновременных сайт-специфические ICMS и многоканальных электрофизиологических записей в обучении животного с помощью двусторонней отвращение футов шок системы контролируется трансфер ящик. Протокол подчеркивает технических ключевых понятий для такой комбинации и указывает на важность заземления животное только через его общий заземляющий электрод, оставив gridfloor с плавающей напряжения. Вот, слуховые обучения трансфер ящик был применен к монгольских песчанок, как обучение, связанные с пластиковых реорганизаций слуховой коры у этих животных были изучены 8,12,14,15,21,22. Тем не менее, описанный протокол может быть адаптирована с незначительными изменениями в других видов грызунов, как, например, у мышей 16. В этом отношении важно, чтобы рассмотреть видоспецифичны приспособления, касающиеся времени восстановления после операции (2.17), высота барьера (2.1.1), и ноги-ударной чувствительности отдельных животных, которые могут быть HigHLY переменная (3.1.3-3.1.6).
Протокол далее дает подробные разъяснения о том, как на заказ конструкции электродов можно использовать, чтобы стимулировать различные сайты в корковой ткани, приводящие к различным сетевым активаций, как полученные в результате анализа параллельных электрофизиологических многоэлектродной записей 8,23. В зависимости от расстояния электродов можно стимулировать различные регионы, например, топографических карт 9. Применяя слой-зависимой холодильников можно дифференцированно активировать дальних corticocortical проекции приводит к более широкому распространению активации коры путем стимуляции в корковых входные слоев III-IV. Вместо этого, стимуляция кортикофугальный выходные слоев V-VI привело к гораздо более фокусное активации интракортикальных и corticothalamic цепей обратной связи 8. При использовании стимуляции массивы с двумя или более стимулирующих электродов, биполярное ICMS могут быть применены вместо монополярной ICMS. Режим биполярного стимуляция болееэффективно набирает нейрональных волокон, расположенных параллельно концов электродов, предпочтительно в направлении катодного полюса по сравнению с непараллельных волокон 24. Такая конфигурация стимуляции, следовательно, увеличивает направленную специфичность вызванных нейронной сети активаций 8. Эти особые прямые манипуляции корковых sublaminar сети деятельности с использованием холодильников 8,9, до сих пор не было показано какой-либо другой техники 3. В качестве примера силы этого метода, в последнем докладе разгадали вклад кортико-таламокортикальных цепей обратной связи для восприятия, используя обучения обнаружения интракортикальных электрических стимулов 8. Это показывает, что прямое корковых микростимуляции является эффективным и государство-оф-искусство метод причинно ссылка деятельность в указанных нейрональных цепей и поведения 1,3,11,25. По местной электрической стимуляции коры регионов, соответствующие конкретным рельефа карте, как и для инстANCE в tonotopic область в слуховой коре, предметы могут быть обучены передачи обучения парадигм сравнить свойства восприятий, вызываемых центральной электрической или периферической сенсорной стимуляции. Такие эксперименты могут стимулировать разработку стратегий стимулирования для сенсорных корковых neuroprostheses 5,9. Этот протокол также может быть использован в электрической стимуляции других областях мозга, как, например, вентральной области покрышки, чтобы изучить обработку вознаграждение и нейронные основы глубокой стимуляции головного мозга 26. Критический для эффективного микростимуляции несколько технических деталей, которые должны быть рассмотрены на фоне индивидуальной настройки и электродов, используемых. В целом, влияние параметров стимуляции, как стимуляция амплитуды, полярности, ориентации электрода, и т.д., были рассмотрены 11,24. Важным является перенос заряда от электрода. Сопротивление электрода, следовательно, является критическим фактором. Следовательно, убедитесь, что тон импеданс электродов контактов находится в диапазоне кОм до имплантации.
Несколько дополнительных явления образования могут быть изучены путем соответствующего изменения описанной базовой конструкции. Например, дискриминация обучения в отличие от простого обучения обнаружению могут быть исследованы путем введения по меньшей мере, два стимула, которые должны быть связаны с ходу и NoGo ответов, соответственно 14,15. Аналогично обучения образование категория может быть изучен путем объединения с такой дискриминацией парадигмы 12,21. Трансфер-коробка парадигмы также может быть использован для исследования рабочей памяти, поведенческие и когнитивные ингибирование гибкость как например, необходимой для успешного обучения разворота 14,17 или набор передач. Рабочая память может быть оценена путем сравнения 'задержки' и 'след' кондиционирования. В «задержки» кондиционирования 27 КО представлен в течение критического временного окна CS-США без задержки между ДКСFSet и США начала. В "след" кондиционирования, с другой стороны, имеет место задержка в несколько секунд после того, как смещение переходного презентации CS. В отличие от «задержки» кондиционирования Кондиционирование 'след "ставит высокую нагрузку на оперативную память и корковой обработки. Сочетание дискриминационные трансфер-Box обучения парадигмы с анализом пространственно-временных паттернов в продолжающейся ЭГ, является подходящим методом для выявления динамических состояний слуховой коры, связанной с дискриминацией стимула 9 и формирования категории 21. Однако, как трансфер ящик обучение в классическом использоваться как двусторонний избегания задачи, общие концептуальные проблемы с избегания обучения применимы для всех этих поведенческих конструкций; а именно, что успешное реакцию избегания явно предотвращает возникновение стимула, который служит в качестве подкрепления. Аппетитивных арматура, например, путем прямого электрического раздражения среднего мозга вознаграждение схем, имеет только пчелып применяется для челночной коробки обучения в некоторых исследованиях 26. Кроме того, трансфер ящик обучения используется главным образом с видами грызунов и редко применяется в крупных лабораторных животных, как, например, собак.
Кроме того, с электрофизиологического анализа, трансфер ящик обучение может быть дополнительно в сочетании с фармакологическими препаратами 8,17, техники поражения 15, 28, микродиализа или оптогенетика. Особенно сочетание нашего протокола с optogenetic инструментов, либо вирусной инфекцией модельной системы (например, монгольских песчанок), или генетически модифицированных животных, как мыши, позволит увеличить в частности, клеточный специфичностью подтипа искусственного нейронного активации том числе коры ингибирование, который не доступен с помощью холодильников 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Работа была поддержана грантами от Deustche Forschungsgemeinschaft DFG и Лейбница Института нейробиологии. Мы благодарим Марию-Марина Zempeltzi и Катрин OHL для оказания технической помощи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-insulated stainless steel wire | California Fine Wire | diam. 50µm w/ isolation | |
| Pin connector system | Molex Holding GmbH | 510470200 | 1.25 mm pitch PicoBlade |
| TEM grid Quantifoil | Science Services | EQ225-N27 | |
| Dental acrylic Paladur | Heraeus Kulzer | 64707938 | |
| Hand-held drill OmniDrill35 | WPI | 503599 | |
| Ketamine 500mg/10ml | Ratiopharm GmbH | 7538837 | |
| Rompun 2%, 25ml | Bayer Vital GmbH | 5066.0 | |
| Sodium-Chloride 0.9%, 10ml | B.Braun AG | PRID00000772 | |
| Lubricant KY-Jelly | Johnson & Johnson | ||
| Shuttle-box E10-E15 | Coulbourn Instruments | H10-11M-SC | |
| Stimulus generator MCS STG 2000 | Multichannel Systems | ||
| Plexon Headstage cable 32V-G20 | Plexon Inc. | HSC/32v-G20 | |
| Plexon Headstage 32V-G20 | Plexon Inc. | HST/32v-G20 | |
| PBX preamplifier 32 channels | Plexon Inc. | 32PBX box | |
| Multichannel Acquisition System | Plexon Inc. | MAP 32/HLK2 | |
| Cryostate CM3050 S | Leica Microsystems GmbH | ||
| Signal processing Card Ni-Daq | National Instruments | ||
| Lab StandardTM Stereotaxic Instruments | Stoelting Co. | ||
| Audio attenator g.pah | g.pah Guger technologies | ||
| Cresyl violet acetate | Roth GmbH | 7651.2 | |
| Roticlear | Roth GmbH | A538.1 | |
| Sodium acetate trihydrate | Roth GmbH | 6779.1 | |
| Potassium hexacyanoferrat(II) trihydrate | Roth GmbH | 7974.2 | |
| Di-sodium hydrogen phospahte dihydrate | Merck | 1,065,801,000 | |
| ICM Impedance Conditioning Module | FHC | 55-70-0 | |
| Animal Temperarture Controler | World Precision Instruments | ATC2000 |
References
- Cohen, M. R., Newsome, W. T. What electrical microstimulation has revealed about the neural basis of cognition. Current Opinion in Neurobiology. 14 (2), 169-177 (2004).
- Histed, M. H., Bonin, V., Reid, R. C. Direct activation of sparse, distributed populations of cortical neurons by electrical microstimulation. Neuron. 63 (4), 508-522 (2009).
- Histed, M. H., Ni, A. M., Maunsell, J. H. R. Insights into cortical mechanisms of behavior from microstimulation experiments. Progress in Neurobiology. 103, 115-130 (2013).
- Bradley, D. C., et al. Visuotopic mapping through a multichannel stimulating implant in primate V1. Journal of Neurophysiology. 93, 1659-1670 (2005).
- Scheich, H., Breindl, A. An Animal Model of Auditory Cortex Prostheses. Audiology and Neurootology. 7 (3), 191-194 (2002).
- Romo, R., Hernández, A., Zainos, A., Salinas, E. Somatosensory discrimination based on cortical microstimulation. Nature. 392, 387-390 (1998).
- Douglas, R. J., Martin, K. A. C. Recurrent neuronal circuits in the neocortex. Current Biology. 17 (13), 496-500 (2004).
- Happel, M. F. K., Deliano, M., Handschuh, J., Ohl, F. W. Dopamine-modulated recurrent corticoefferent feedback in primary sensory cortex promotes detection of behaviorally relevant stimuli. The Journal of Neuroscience. 34 (4), 1234-1247 (2014).
- Deliano, M., Scheich, H., Ohl, F. W. Auditory cortical activity after intracortical microstimulation and its role for sensory processing and learning. The Journal of Neuroscience. 29 (50), 15898-15909 (2009).
- DeYoe, E. A., Lewine, J. D., Doty, R. W. Laminar variation in threshold for detection of electrical excitation of striate cortex by macaques. Journal of Neurophysiology. 94 (5), 3443-3450 (2005).
- Tehovnik, E. J., Slocum, W. M., Schiller, P. H. Delaying visually guided saccades by microstimulation of macaque V1: spatial properties of delay fields. The European Journal of Neuroscience. 22 (10), 2635-2643 (2005).
- Wetzel, W., Wagner, T., Ohl, F. W., Scheich, H. Categorical discrimination of direction in frequency-modulated tones by Mongolian gerbils. Behavioural Brain Research. 91, 29-39 (1998).
- Cain, C. K., LeDoux, J. E. Escape from fear: a detailed behavioral analysis of two atypical responses reinforced by CS termination. Journal of Experimental Psychology. Animal behavior processes. 33, 451-463 (2007).
- Stark, H., Rothe, T., Deliano, M., Scheich, H. Dynamics of cortical theta activity correlates with stages of auditory avoidance strategy formation in a shuttle-box. Neuroscience. 151, 467-475 (2008).
- Ohl, F. W., Wetzel, W., Wagner, T., Rech, A., Scheich, H. Bilateral ablation of auditory cortex in Mongolian gerbil affects discrimination of frequency modulated tones but not of pure tones. Learning & Memory. 6 (4), 347-362 (1999).
- Kurt, S., Ehret, G. Auditory discrimination learning and knowledge transfer in mice depends on task difficulty. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8481-8485 (2010).
- Happel, M. F. K., et al. Enhanced cognitive flexibility in reversal learning induced by removal of the extracellular matrix in auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2800-2805 (2014).
- Thomas, H., Tillein, J., Heil, P., Scheich, H. Functional organization of auditory cortex in the mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). I. Electrophysiological mapping of frequency representation and distinction of fields. The European journal of neuroscience. 5, 882-897 (1993).
- Budinger, E., Heil, P., Scheich, H. Functional organization of auditory cortex in the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). III. Anatomical subdivisions and corticocortical connections. European Journal of Neuroscience. 12, 2425-2451 (2000).
- Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
- Ohl, F. W., Scheich, H., Freeman, W. J. Change in pattern of ongoing cortical activity with auditory category learning. Nature. 412 (6848), 733-736 (2001).
- Scheich, H., et al. Behavioral semantics of learning and crossmodal processing in auditory cortex: the semantic processor concept. Hearing Research. 271 (1-2), 3-15 (2011).
- Happel, M. F. K., Jeschke, M., Ohl, F. W. Spectral integration in primary auditory cortex attributable to temporally precise convergence of thalamocortical and intracortical input. The Journal of Neuroscience. 30 (33), 11114-11127 (2010).
- Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Research. 98, 417-440 (1975).
- Clark, K. L., Armstrong, K. M., Moore, T. Probing neural circuitry and function with electrical microstimulation. Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 278 (1709), 1121-1130 (2011).
- Ilango, A., Shumake, J., Wetzel, W., Scheich, H., Ohl, F. W. Electrical stimulation of lateral habenula during learning: frequency-dependent effects on acquisition but not retrieval of a two-way active avoidance response. PloS one. 8 (6), e65684 (2013).
- Weible, A. P., McEchron, M. D., Disterhoft, J. F. Cortical involvement in acquisition and extinction of trace eyeblink conditioning. Behavioral Neuroscience. 114, 1058-1067 (2000).
- Rothe, T., Deliano, M., Scheich, H., Stark, H. Segregation of task-relevant conditioned stimuli from background stimuli by associative learning. Brain Research. 1297, 143-159 (2009).
