Summary
Shuttle-box aprendizagem evasão está bem estabelecida em neurociência comportamental. Este protocolo descreve como shuttle-box aprendizagem em roedores pode ser combinado com microstimulation site-specific elétrica intracortical (ICMS) e crônica simultânea em gravações vivo como uma ferramenta para estudar vários aspectos da aprendizagem e percepção.
Abstract
Aprendizagem evasão Shuttle-box é um método bem estabelecido na neurociência e experimentais setups comportamentais foram tradicionalmente feitos sob medida; o equipamento necessário está disponível agora por várias empresas comerciais. Este protocolo fornece uma descrição detalhada de uma de duas vias evitar shuttle-box paradigma de aprendizagem em roedores (gerbilos da Mongólia aqui; Meriones unguiculatus) em combinação com microstimulation site-specific elétrica intracortical (ICMS) e simultâneos crônicas eletrofisiológicos in vivo gravações. O protocolo detalhado é aplicável a estudar vários aspectos do comportamento de aprendizagem ea percepção em diferentes espécies de roedores.
ICMS específicas do local de circuitos corticais auditivas como estímulos condicionados aqui é usado como uma ferramenta para testar a relevância perceptual de aferentes específico, eferentes e conexões intracorticais. Padrões de ativação distintas pode ser evocado, utilizando diferentes arr eletrodo de estimulaçãoays para ICMS, dependente da camada locais ou sites de ICMS distantes. Utilizando análise comportamental detecção do sinal pode ser determinada qual a estratégia de estimulação é mais eficaz para provocar um sinal detectável comportamentalmente e saliente. Além disso, multicanal-gravações paralelas utilizando diversos modelos de eletrodos (eletrodos de superfície, eletrodos de profundidade, etc.) permitem investigar observáveis neuronais ao longo do tempo, destes processos de aprendizagem. Será discutido como as mudanças do projeto comportamental pode aumentar a complexidade cognitiva (por exemplo, detecção, discriminação, aprendizagem reversa).
Introduction
Um objectivo fundamental da neurociência comportamental é estabelecer ligações específicas entre as propriedades estruturais e funcionais neuronais, aprendizagem e percepção. Atividade neural associada com a percepção e aprendizagem pode ser estudada pela gravação eletrofisiológico dos potenciais de ação e potenciais de campo locais em várias estruturas cerebrais em vários locais. Considerando registros eletrofisiológicos fornecer associações correlativas entre a atividade eo comportamento neural, microstimulation elétrica direta intracortical (ICMS) por mais de um século tem sido o método mais direto para as relações causais testes de populações de neurônios excitados e seus efeitos comportamentais e perceptivas 1 - 3. Muitos estudos têm demonstrado que os animais são capazes de fazer uso de várias propriedades espaciais e temporais de estímulos eléctricos em tarefas perceptivas, dependendo do local dentro de estimulação por exemplo retinotópica 4, tonotopic 5, 6 ou somatotópica regiões no córtex. Propagação da actividade eléctrica evocada no córtex é determinada principalmente pela disposição das fibras axonais e a sua conectividade synaptic distribuído 2 que, no córtex, é claramente dependente da camada 7. A ativação resultante polysynaptic evocada pelo ICMS é doravante muito mais difundida do que efeitos diretos do 2,8,9 campo elétrico. Isso explica por que os limiares de efeitos perceptivos induzidos pelo microstimulation intracortical pode ser fortemente camadas dependente 8,10,11 e 9-dependente site. Um estudo recente demonstrou em detalhes que a estimulação de camadas superiores rendeu mais ativação generalizada de circuitos corticocortical em camadas principalmente supragranular, enquanto a estimulação de camadas mais profundas do córtex resultado em um corticoefferent recorrente focal intracolumnar ativação. Experimentos comportamentais paralelas revelou que este último tem muito mais baixo thr detecção perceptualesholds 8. Portanto, a vantagem de site-specific ICMS como estímulos condicionados foi explorada em associação com registros eletrofisiológicos para relacionar causalmente ativações de circuitos corticais específicas 8 a medidas comportamentais de aprendizagem e percepção em shuttle-box.
O bidirecional shuttle-box paradigma é um aparelho de laboratório bem estabelecido para estudar aprendizagem evasão 12. Um shuttle-box é composto por 2 compartimentos separados por um obstáculo ou um pórtico. Um estímulo condicionado (CS) que está representada por um sinal adequado, como uma luz ou de som, é contingente, seguido por um estímulo não condicionado aversivo (EUA), como por exemplo, um choque no pé ao longo de um chão de grade de metal. Os indivíduos podem aprender a evitar os EUA por vaivém de um compartimento shuttle-box para o outro em resposta ao CS. Aprendizagem Shuttle-box envolve uma seqüência de fases de aprendizagem distintas 13,14: Em primeiro lugar,assuntos aprender a prever os EUA a partir do CS por condicionamento clássico e para escapar de os EUA por condicionamento instrumental, como os EUA é encerrado mediante vaivém. Numa fase seguinte, o indivíduo aprende a evitar completamente os EUA por vaivém, em resposta ao CS antes do início dos EUA (reacção de evasão). Geralmente, a aprendizagem shuttle-box envolve o condicionamento clássico, condicionamento instrumental, bem como o comportamento goal-directed dependendo aprendizagem fase 14.
O procedimento shuttle-box pode ser configurado facilmente e geralmente produz um comportamento robusto após algumas sessões diárias de treinamento 15 - 17. Além de simples evasão condicionado (detecção), shuttle-box pode ser ainda utilizado para estudar a discriminação estímulo empregando paradigmas go / Nogo. Aqui, os animais são treinados para evitar os EUA por uma resposta condicionada (CR) (ir comportamento; shuttle para o compartimento oposto), em resposta a um <forte> ir-estímulo (CS +) e pelo comportamento Nogo (permanecer no compartimento de corrente, sem CR), em resposta a um Nogo-estímulo (CS-) microestimulação paralela e gravação de actividade neural com matrizes multieletrodo de alta densidade permitem estudar. os mecanismos fisiológicos subjacentes aprendizagem bem sucedida. Vários detalhes técnicos que são fundamentais para as combinações bem sucedidas de formação shuttle-box, ICMS e eletrofisiologia Paralelamente, serão discutidos.
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Protocol
Todos os experimentos apresentados neste trabalho foram conduzidos de acordo com os padrões éticos definidos pela lei alemã para a protecção dos animais experimentais. Os experimentos foram aprovados pelo comitê de ética do Estado da Saxônia-Anhalt.
1. Custom-made Multicanal Eletrodo Arrays para microestimulação e Gravação
- Matriz microstimulation Custom-made
- Para a entrega de ICMS, preparar eletrodos de estimulação no projeto espacial desejado (aqui lateral da matriz 2 canais), utilizando longos fios de aço inoxidável de 3 cm com isolamento de Teflon (Ø com isolamento = 50 mm). Veja a Figura 2.
- Crimp uma das extremidades dos fios para um sistema de pino macho (1,25 mm Passo).
- Para uma gama de 2 canais com ~ 0,5 mm ou 0,7 milímetros ~ fios de passe distância eletrodo perpendicularmente através de microscopia eletrônica de duas grades porta-objeto alinhados verticalmente (distância de grades ~ 5 mm) que orientam os fios (0,1654 milímetro passo).
- Coloque pinos macho no alojamento do obturador.
- Colocar o eléctrodo em um prato com uma solução electrolítica (por exemplo, cloreto de sódio a 0,9%) e medir a impedância de cada canal com um respectivo dispositivo de medição de impedância (por ex., FHC Impedância módulo de condicionamento). Visam impedâncias na faixa de 100 a 500 kW.
- Se a impedância é muito alto, fornecer corrente curto-circuito eléctrico (1 seg, 1 mA) através dos canais para o baixar. Verifique impedância novamente.
- De alta resolução matrizes de gravação multicanal Custom-made
Nota: este protocolo descreve a fabricação de matrizes de superfície para a gravação de dados eletrocorticograma (ECoG). No entanto, os projetos podem ser adaptados para atender as exigências da respectiva questão de pesquisa (gravações de profundidade, etc.). Matrizes multicanal de alta resolução são built por fios de aço inoxidável com isolamento de Teflon (Ø com isolamento = 50 mm) frisado a um sistema de pin masculino (1,25 milímetros pitch).- Para matrizes de eletrodos de superfície, 18 fios orientar através de uma matriz 3 x 6 de microscopia eletrônica de duas grades porta-objeto preparadas.
- Incorporar a disposição 6 x 3 dos fios entre as grades com acrílico dental e colocar pinos na caixa da ficha.
- Moer o acrílico dental em um bloco retangular usando moedor anexado a uma broca de mão.
- Verificar que a impedância de todos os canais (ver 1.1.6) está no intervalo entre 100 - 500 kQ.
- Antes de implantação (ver passo 2) moagem superfície das matrizes para coincidir com a convexidade da superfície cortical.
2. implantação cirúrgica de Arrays em Auditivo Cortex em Herbils mongóis anestesiados para uso crônico
- Segure a aprovação oficial para executar todas as etapas experimentais necessários que são planejadas. Desgaste aproroupas disso proteção (casaco, luvas estéreis, máscara cirúrgica, exaustor).
- Use gerbilos adultos do sexo masculino (Meriones unguiculatus mongóis) ou quaisquer outras espécies de roedores. Usar luvas e casaco e sempre usar instrumentos cirúrgicos esterilizados e bem identificados.
- No caso de roedores, anestesiar os animais com uma injecção ip de uma mistura de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg) diluído em solução de cloreto de sódio a 0,9% estéril. Manter por infusão de 0,6 ml / h / kg de uma composição de mistura de cetamina: xilazina: cloreto de sódio (0,9%) numa proporção de 9: 1: 10.
- Coloque o animal sobre uma placa de aquecimento para manter a temperatura corporal a 37 ° C por um sistema de feedback sonda rectal (por exemplo, instrumentos de precisão mundo).
- Raspar pele cobrindo interoccipital, parietal, e ossos temporais. Assepticamente preparar o local da incisão com um desinfectante eficaz (por exemplo., Alternando Betadine ou Nolvasan e 70% de álcool esfrega 3 vezes). Prolhos otect contra secagem por pomada.
- Corte a pele que cobre o crânio interoccipital, parietal e frontal ossos utilizando um bisturi e remover periósteo delicadamente movendo uma broca sobre a superfície do osso.
- Perfurar pequenos buracos no parietal contralateral e osso frontal como lateral, como possível não impeçam a cabeça depois montar. Agora o parafuso de dois parafusos de osso, com um diâmetro de cerca de 1 mm a firmemente nos orifícios. Certifique-se de que o parafuso parietal tem bom contato com a dura-máter, uma vez que será usado como referência comum e do solo, bem como eletrodo de retorno para a estimulação elétrica mais tarde.
- Cole uma pequena barra de alumínio medial ao longo dos ossos frontais e usá-lo como fixação de cabeça durante a implantação de um headholder.
- Retire a pele que cobre os Musculus temporalis de um lado usando uma tesoura.
- Corte a parte dorsal do músculo temporal para obter a admissão ao osso temporal.
- Expor córtex auditivo por craniotomia (a 3 mm x 4 mm) deosso temporal usando uma broca de dentista. Identificar a localização do córtex auditivo baseado na assinatura típica sangue-cérebro vasos 18,19.
- Cuidadosamente fazer uma incisão da dura-máter com um bisturi micro no local onde o eléctrodo de estimulação é implantado no cérebro. Suavemente mover ao longo da superfície até que as lágrimas dura para proibir o neuropil danos ao subjacente.
- Insira estimulação matriz sob controle micromanipulador. Escolha um ângulo de inserção tangencial para permitir que a matriz epidural para ser colocado ao longo da região de interesse. Dependendo do ângulo de inserção e posição eo site voltado de estimulação, considere cuidadosamente a profundidade de inserção.
- Coloque a epidural matriz de gravação da superfície com um bom contacto com a superfície do cérebro que cobre a região de interesse (córtex auditivo aqui) por um segundo micromanipulador. Tome cuidado para que a matriz corresponde à curvatura do córtex para não recuar a dura.
- Fixar ambas as matrizes de eletrodos e seus plugcaixas com acrílico dental no crânio.
- Capa expostos superfície cortical com um lubrificante anti-séptico (por exemplo, KY Jelly-) e perto craniotomia com acrílico dental (por exemplo, Paladur, Heraeus Ulzer). Tenha em mente que a polimerização pode produzir calor. Use lubrificante suficiente entre neuropil e acrílico dental para evitar qualquer contato do acrílico dental ea superfície cortical, pois isso pode causar danos aos tecidos.
- Agora que os animais possam se recuperar antes do início de qualquer procedimento adicional. O tempo de recuperação pode variar entre as espécies (por exemplo, gerbos: ≥3 dias, ratos: ≥ 7 dias). Acompanhar atentamente o estatuto do animal e dar tratamento analgésico nos dias seguintes se for o caso (por exemplo, meloxicam; 1 mg / kg pós-cirúrgica e 24 horas após a cirurgia).
3. Duas vias Designs Shuttle-caixa usando ICMS estímulo como Condicionada
- Formação Shuttle-box
- Coloque um shuttle-box (custom-build ou produtos comerciais, por exemplo, E10-E15, Coulbourn Instruments) em uma câmara acusticamente e eletricamente blindado. A caixa contém dois compartimentos separados por um obstáculo. Considerar a altura do obstáculo, pois influencia o viés comportamental de go-respostas. Use alturas adequadas para espécies específicas (por exemplo, ~ 2 cm para ratos, ~ 3 cm para gerbos).
- Para aplicar o pé-choque (US), use um piso de grade com uma distância entre as barras apropriadas para as espécies sob investigação 12,15. Sempre tomar cuidado para que nada eletricamente Atalhos as barras individuais (fezes, cabelos, eletrodo de creme).
- Depois de um tempo de recuperação considerável do animal (ver 2.17), ligar o sujeito ao cabo de gravação e estimulação de preferência sem a utilização de qualquer anestesia a curto prazo. Tentar cobrir o animal com uma toalha e gentilmente levar o animal em mãos. Descobrir a cabeça e conectores do animal com a outra mão e conecte os cabos. Permitir que os animais se habituam à câmara de treinamento para 3 min antes do início de cada sessão.
- Por sessão de treinamento (1-2 dia) aplicar entre 30-90 ensaios. Durações uso experimental de até 15 segundos, e intervalos inter-julgamento que variam aleatoriamente entre 25 - 30 seg.
- Para a entrega de ICMS para a estimulação condicionada à eletrodos de estimulação usar um estimulador multicanal (por exemplo, MCS STG2000). Para obter efeitos comportamentais, sem danificar o tecido cerebral, aplicar trens de impulsos (por exemplo, 300 ms de comprimento, 100 pps) de bifásicos, pulsos de carga equilibrada (catódicas primeiro) com uma duração de fase de 200 uS. Repita os comboios com uma pausa de 700 ms com uma duração de 4 seg (janela de observação).
- Por apresentar CS auditivo usar uma placa PCI saída analógica (por exemplo, NI PCI-6733). Programar estes dispositivos com Matlab para controlar de forma flexível e hardware de desencadear o sistema de transporte-box através das linhas de saída digital.
- Rota do sinal analógico de saída para the shuttle-box alto-falantes através de um amplificador de áudio.
- Condicionalmente entregar o pé-choque EUA através de um piso de grade. Para óptima qualidade de gravação eletrofisiológico, gerar o choque por um segundo estimulador multicanal high-end (MCS STG2000).
- Para aplicar o treinamento de detecção presente apenas estímulos CS +. Aqui, presentes ensaios em branco sem CS e US intercaladas entre os ensaios de teste (~ 10%) para corrigir o comportamento preconceituoso de transporte (ver 3.2). Para uma tarefa mais exigente, treinar animais para discriminar entre estímulos e CS + CS apresentados na mesma sessão em ordem aleatória.
- Classificar uma mudança compartimento após o início CS + dentro de uma janela de tempo crítico de 4 seg (CR) como uma resposta de acerto. Em ensaios + CS sem CR na janela de tempo crítico (miss), entregar imediatamente um choque pé leve de 6 a 10 seg, como estímulo incondicionado (US).
Nota: estimulação repetitiva CS +, que se sobrepõe com a US irá reduzir o esforço de aprendizagem para o animal umnd melhorar a velocidade de aprendizagem e desempenho («atraso» vs. condicionado 'trace', veja a discussão). - Para ensaios CS-, classificar uma mudança compartimento dentro da janela de tempo crítico resposta de alarme como falsa, e aplicar os EUA por até 10 segundos imediatamente após este CR inadequado. Não aplicar US após CS- quando o animal permanece no compartimento (sem CR) durante a janela de tempo crítico, e classificar este julgamento rejeição como correta.
Nota: É importante ressaltar que o pé chocar EUA está sempre desligado, quando os animais muda compartimento em resposta a ela (escape). Use janelas de tempo mais críticos para ensaios CS, por exemplo, se a estimulação condicionado repetitivo são usados, embora isso vai impor um critério de aprendizagem mais conservadora, uma vez que proporciona maior esforço por parte do animal para inibir o CR. - Para uma associação eficaz de CS e US ajustar a força de choque numa gama de moderada a fim de ser aversivo mas não dolorosa. INICIA Optimall força atual difere entre as espécies (por exemplo, 50 mA para ratos, 200 mA para gerbos). Portanto, por favor, veja as próximas duas balas para mais detalhes técnicos:
- Individualmente adaptar a força de choque na primeira sessão de treinamento começando com amplitudes leves (~ 200 mA para gerbos). Se a força de choque do pé é muito baixo, escapar jitter latências e associação entre CS e dos Estados Unidos não é o ideal.
- Sempre preste atenção se os animais começam a vocalizar e congelar em resposta ao CS. Neste caso a força choque nas patas é demasiado elevada. Esta resposta de medo condicionada interfere com a aprendizagem de evitação.
- Determinar cuidadosamente as latências de fuga. Aumentar a força de choque do pé passo-a-passo, se as latências de escape são mais de 2 segundos, após os primeiros 20 ensaios. Confira depois de cada treinamento, se o animal está sob controle de choque, ou seja, ele mostra latências de escape consideravelmente abaixo de 2 seg.
Nota: No entanto, evitar a aumentar péchocar força muito rapidamente, como a estratégia comportamental de um animal altamente estressado pode cair de volta para respostas de fuga puros. Portanto observar de perto o comportamento e particularmente as latências de resposta durante o ajuste da amplitude de os EUA. Para um exemplo veja Figura 3E. - Se o animal mostra o CR, pare de apresentação do CS imediatamente. Isto é crucial para o reforço da resposta de esquiva.
- Se os animais tenham adquirido uma estratégia de prevenção, ou seja, mostrar CR adequado a todos CS, variar parâmetros (amplitude, duração da fase de ICMS, taxa de repetição etc.) para realizar análises psicométricas. Aplicar variação paramétrica CS em uma forma por blocos com o emparelhamento dos EUA, que no entanto irá induzir a aprendizagem e adaptação.
- Para evitar isso, começar com 15 a 30 ensaios da formação original, e em seguida, aleatoriamente intercalar as variações CS sem EUA como ensaios de teste entre os ensaios regulares de treinamento com o original de CS. Maximamente uSE 25% dos ensaios de teste.
- Após o treinamento remover o animal da câmara de formação e limpe cuidadosamente a caixa completa antes do treino da próxima animal. Tente evitar a formação de espécies diferentes ao mesmo tempo na mesma caixa, como o seu cheiro natural pode interferir no desempenho do treinamento.
- Análise de dados de treino
- Grave todas as mudanças compartimento na fase de habituação.
- Grave todas as mudanças compartimento durante o treinamento e se dividem em hits e alarmes falsos, escapar as respostas (acidentes e ônibus de volta depois de um alarme falso) e shuttles entre tentativas espontâneas (ITS).
- Calcular as taxas de RC para CS + e CS- as seguintes: Taxa de sucesso = Acessos / Número de Cs + ensaios; taxas de falsos alarmes falsos alarmes = / número de ensaios CS.
- Obter taxas CR sessão-wise. No entanto, para avaliar a dinâmica de aprendizagem a uma resolução temporal maior, calcular as taxas de CR de blocos mais curtos do mesmo número de CS + e ensaios CS- (
- Plot taxas CR em função da sessão ou bloco de ensaio para avaliar a dinâmica de progresso de formação e de aprendizagem.
- Para a quantificação da sensibilidade comportamental independente das condições experimentais de polarização da resposta do animal, derivar valores de d 'baseados na teoria de detecção de sinal 8,9,17.
- Para usar a análise d 'Z-scores de correspondentes taxas de acerto e falso-alarme (aprendizagem discriminação) ou atingidas taxas e ITS (aprendizagem detecção) derivados dos inversos de uma função de distribuição normal padronizada e subtrair esses escores z. Definir um critério de limiar para a detecção de estímulo d '= 1,0, o que corresponde a uma intensidade de sinal de um desvio padrão acima do ruído. Ver figura 3 como exemplo.
- Além disso determinar CR- e escapar tempos de reação em resposta a diferentes CS medindo o período de tempo entre o início dos CS e resposta comportamental (compartimento completoalteração).
- Obter uma análise mais detalhada do comportamento de filmando o comportamento shuttle-box. Conseguir a sincronização temporal entre os sistemas de vídeo e gravação através da gravação de impulsos de disparo do shuttle-box ou sistema de estimulação no traçado de áudio do vídeo. Análise de vídeo permite aos jumentos atenção e orientar as respostas do animal anterior ao CR.
4. Em Técnicas Vivo eletrofisiológicos em aprender Animais
- Gravação eletrofisiológico durante o treinamento
- Durante o treinamento, gravar sinais eletrofisiológicos (por exemplo, com as ECoG-matrizes descritos) a partir de múltiplos eletrodos monopolarly contra o eletrodo de referência comum / chão.
- Sinais para alimentação animal de todos os eletrodos em um amplificador headstage seja conectado diretamente ou através de um pequeno adaptador para os conectores de cabeça.
- Conecte o headstage ao amplificador principal através de um arnês de cabos flexíveis, finas envoltopor uma malha metálica para protegê-la de danos causados por morder os animais.
Nota: O stress mecânico na cablagem pode ser aliviada por uma mola que permite mais a livre circulação e rotação do animal na caixa. Ideal é o uso de um suporte giratório rotativa e motorizado. No entanto, para experiências auditivas colocar o giro fora da câmara à prova de som ou som protegê-lo com espuma para reduzir o ruído acústico de alta frequência produzida pelo seu motor. - Usar um pré-amplificador na caixa blindada para aumentar a relação sinal-ruído e passa-banda filtrar o sinal na gama de frequências desejada.
- Dados de exemplo na frequência de mais de 1 kHz amostragem (para campo locais potenciais gravações) e pelo menos 40 kHz (para uma eventual acção gravações) e armazenar para o PC para análise offline. Use as configurações de filtro adequado para ambos os tipos (por exemplo, 2-300 Hz para o potencial de campo local; 300 - 4.000 Hz para os potenciais de ação).
- Verifique cuidadosamente qualidade da gravação antes do início da tchover (não há barulho ou movimento artefatos). Aplicar um FFT-filtro em linha para o sinal para determinar a amplitude do ruído de 50 Hz. Se necessário verifique todas as conexões entre o conector de cabeça, os adaptadores, os headstages, o feixe de cabos, e os amplificadores.
- Para a redução de artefactos nos dados gravados evocados por estimulação eléctrica usar um procedimento de interpolação para reconstruir todos os pontos de dados afectados pelo artefacto 1 ms antes até ~ 5 ms após o início de cada impulso. Para isso, inserir zeros entre os pontos de dados não afetados, e aplicar um filtro FIR-simétrica que minimiza os erros médios quadrados entre os pontos interpolados e seus valores ideais (função interp.m do Matlab). Aplicar este procedimento para o sinal bruto, separadamente em cada canal antes de uma análise mais aprofundada 9.
- Detalhes técnicos de formação paralela shuttle-box, ICMS, e gravação
- Em geral, assegurar que os animais se sintam confortáveis no surroundi caixang. Permitir que o animal se movimentar e chegar a todos os cantos da caixa. Tempo suficiente para se habituar um dia antes da primeira formação (20 min) e antes de cada sessão (3 minutos) é benéfica.
- Depois de qualquer tratamento cirúrgico, permitir que o tempo suficiente de animais para recuperar incluindo medicação, se necessário (veja acima 2.17) e começar a treinar o animal somente, se os animais não mostram quaisquer sinais típicos de sofrer ou dor (olhos fechados, fenótipo letárgico, pele desalinhado 20).
- Certifique-se de aterramento elétrico adequado do piso grid. Loops de terra entre o sistema de gravação, shuttle-box eo animal deve ser evitado. Aterrar o único animal através do seu eletrodo terra comum, deixando o gridfloor a uma tensão flutuante.
- Conecte o estimulador multicanal (MCS STG2000) ao conector de cabeça do conjunto de eletrodos de estimulação implantado através de linhas separadas do girador motorizado.
- Use o eletrodo terra comum de gravação como o solo ou eletrodo de retorno para o ICMS, bem.
5. Análise histológica de Eletrodo Posições
- Após o conjunto de treino completo, para controlar a posição estável do conjunto de eléctrodos de estimulação por análise histológica.
- Anestesiar os animais com uma injecção ip de uma mistura de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg) diluído em 0,9% de cloreto de sódio estéril. Em seguida, aplicar monopolar corrente catódica (30 mA durante 60 segundos) entregue através de todos os canais de estimulação para obter depósito de ferro no tecido na posição do implante 8.
- Seguindo este procedimento, sacrifício do animal por um método apropriado e aprovado da eutanásia (por exemplo, injecção intraperitoneal de uma sobredose de pentobarbital; 100 mg / kg).
- Remover o cérebro do animal imediatamente e congelá-lo em 2-metilbutano arrefecida a -70 ° C em azoto líquido.
- Agora corte da região de interesse em um micrótomo criostato em 50 mm horizontal seções.
- Histologia: Nissl e "Prussian Blue" -staining
- Para identificação das camadas corticais tratar cada segunda fatia com Nissl-coloração. Em primeiro lugar, tomar banho fatias 5 min em tampão de trihidrato de acetato de sódio 0,05 M (pH 4,0 -4,2).
- Banhem fatias durante 5 - 10 min em 5% de acetato de violeta de cresilo. Enxágüe fatias com água destilada.
- Banhem fatias consecutivamente durante 2 min em tampão de trihidrato de acetato de sódio 0,05 M (pH 4.0 - 4.2), e em soluções de 50%, 70% e 90% de etanol, respectivamente.
- Banhem fatias duas vezes em isopropanol: etanol a 96% (2: 1) durante 5 minutos cada.
- Finalmente, banhar-se em fatias Roticlear três vezes por 5 min.
- Obter localização dos canais de estimulação por -staining "Prussian Blue" de qualquer outra fatia que faz com que a deposição de ferro evocada por longas correntes monofásicas após os experimentos visíveis.
- Prepara-se uma solução fresca de 1% hexacyanoferrat de potássio (II) tri-hidrato de K 4[Fe (CN) 6] por mistura de 2 g de K 4 [Fe (CN) 6] em 200 ml de HCl a 1%.
- Adicionar 800 mL de tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4).
- Banhar-se fatias do cérebro durante 10 minutos com água destilada, e em seguida, durante 10 minutos na solução hexacyanoferrat.
- Banhem fatias duas vezes durante 10 min em tampão fosfato 0,1 M e, finalmente, durante 5 minutos em água destilada.
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Representative Results
Esta seção ilustra um exemplo representativo da aprendizagem shuttle-box em um gerbilo da Mongólia. O assunto foi treinados para discriminar o sítio ICMS entre dois eléctrodos de estimulação implantado 700 uM afastadas uma da outra no córtex auditivo (Figuras 1 e 2). Matrizes de estimulação pode ser personalizado em diversos modelos espaciais (Figura 1). Aqui, a discriminação dos dois locais de ICMS foi aprendido dentro de 3 sessões de treinamento com a apresentação de 30 de CS + e CS- cada (Figura 3A-C). Isto é indicado por uma diferença significativa estável das taxas CR de sucesso e falso alarme respostas ao longo 7 sessões de treino consecutivas (Figura 3B). Correspondentemente, d 'é> 1 nestas sessões (Figura 3C). Latências de fuga rápida para os EUA são fundamentais, pois eles refletem uma resposta incondicionada aversivo eficaz. Isso pode ser garantido através da adaptação força de choque do pé de 200 &# 181; A em 50 mA passos até latências de escape são curtos (ver Figura 3 E). Em paralelo, a partir de registos electrofisiolicos um ECoG-matriz permite avaliar os padrões de activação espaço-temporal site-specific evocadas por intracortical eléctrica + CS CS ou em locais separados por estimulação ~ 700 pM (Figura 4).
Figura 1. Eletrodo projetos matriz. (A) Profundidade de matriz (2 x 1) para microestimulação intracortical em dois locais diferentes em córtex. Os eléctrodos são dispostos a uma distância intereletrodos de ~ 700 pM. Outros projetos espaciais pode permitir dependente da camada de ICMS local em diferentes profundidades corticais ou matrizes laterais com locais de estimulação ao longo de um eixo específico do tecido cortical, como por exemplo o gradiente tonotópica do córtex auditivo 8. (B) Epidural surface matriz (3 x 6) para a gravação de eletrocorticograma em alta resolução espacial. Os eletrodos foram feitas a partir de fios de aço inoxidável (Ø 256 mm) organizados em uma matriz 3x6 com uma distância intereletrodos de ~ 600 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Posicionamento de estimulação e gravação implantados eletrodos. (A) Um par de dois eletrodos de estimulação (ver Figura 1A) S1 (verde escuro) e S2 (verde claro) são implantados na profundidade do campo auditivo primário direito AI perto de sua camada de entrada IV. Dicas de eletrodos pode ser posicionado ao longo do eixo rostrocaudal (S1 eletrodo caudal, rostral S2 eletrodo), com uma distância intereletrodos de ~ 700 mm. A gravação 3 x 6 ECoGarray (distância intereletrodos 600 mm) é centrado epidural durante o AI direita. (B) Nissl-manchado secção horizontal da região do cérebro respectivo após o procedimento experimental mostra duas pequenas lesões (setas), que foram causadas pelas pontas dos dois eletrodos de estimulação implantados indicando sua localização dentro do córtex temporal. A posição pode ser ainda avaliada por "Azul da Prússia" coloração. Este valor foi modificado a partir Deliano et al., 2009. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura dados de treinamento 3. Shuttle-caixa e análise de um animal individual. (A) Schemata à direita descrever projeto tarefa para CS + e ensaios CS em uma de duas vias discriminati shuttle-boxna tarefa e os resultados comportamentais. curvas (B) de Aprendizagem plotados como taxas de acerto e falso-alarme de sessões de treinamento individuais. As diferenças significativas entre as taxas de sucesso e de falso alarme estão marcados por asteriscos (teste de Games-Howell, p <0,05). (C) A sensibilidade do Índice d '> 1 (ver 3.2.7) pode ser usado como critério de limite para a discriminação de sucesso. (D ) Monitorização dos cruzamentos espontâneas durante a fase de habituação geralmente mostram uma diminuição ao longo sessões. (E) latências de resposta durante os ensaios CS + são plotados para os ensaios individuais sobre todas as sessões de treinamento. Todas as respostas com latências abaixo de 6 seg correspondem às respostas ataque bem sucedido. Observe as latências de escape mais longos na primeira metade da primeira sessão. Depois de aumentar as latências força de choque do pé de escape diminuíram abaixo de 2 segundos após o início dos EUA indicando controle choque suficiente. Histogramas (inserir direito) de latências de resposta são bimodal correspondente para acertar as respostas (<6 seg) e escapar respostas. (6-8 seg) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. A gravação eletrofisiológico Paralela em um animal aprendizagem. (A) Exemplo típico de um potencial evocado eletricamente (EEP) a partir de um único animal na média entre CS + ensaios em uma única sessão de treinamento. Os dados foram registrados a partir de um EcoG-array. A figura compara o traço antes EEP (preto) e depois (vermelho) a remoção de artefatos de pulso de estímulo de solteiro. Detalhes de redução de artefato ver secção 4.1.7. O proeminente pico negativo precoce pode ser visto em uma latência de 20 ms (N20). (B) Outras análises das distribuições espaciais da amplitude N20 em resposta a um CS + em tele rostral eléctrodo de estimulação (em cima) e para um CS no eléctrodo de estimulação caudal (inferior) revelam a resolução espacial de estados evocadas em todo o córtex auditivo. Instruções anatómicas relativamente ao agrupamento de gravação estão indicados por setas (d, dorsal; C, caudal; l, lateral; m, medial; r, rostral; v, ventral). Este valor foi modificado a partir Deliano et al., 2009. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve um método de ICMS simultâneas site-specific e registros eletrofisiológicos multi-canal em um animal aprender usando um aversivo pé-choque sistema shuttle-box controlado em dois sentidos. O protocolo enfatiza os principais conceitos técnicos para tal combinação e salienta a importância de fundamentar o animal apenas via sua eletrodo terra comum, deixando o gridfloor a uma tensão flutuante. Aqui, auditiva aprendizagem shuttle-box foi aplicada a gerbilos da Mongólia como reorganizações plásticas relacionadas com a aprendizagem do córtex auditivo destes animais têm sido estudados extensivamente 8,12,14,15,21,22. No entanto, o protocolo descrito pode ser adaptado com pequenas alterações em outras espécies de roedores, como, por exemplo, 16 ratinhos. A este respeito, é importante considerar espécie-específicos adaptações relativas ao tempo de recuperação após a cirurgia (2,17), altura do obstáculo (2.1.1), e sensibilidade pé-choque de animais individuais, o que pode ser highly variável (3.1.3-3.1.6).
O protocolo dá mais explicações detalhadas sobre como modelos de eletrodos feitos sob medida pode ser usado para estimular diferentes locais no tecido cortical levando a ativações de rede distintos, como decorre da análise de gravações simultâneas multieletrodo eletrofisiológicos 8,23. Dependendo da distância dos eletrodos pode estimular diferentes regiões, por exemplo, mapas topográficos 9. Ao aplicar-dependente camada ICMS é possível activar diferencialmente projecções corticocortical de longo alcance que conduzem à activação mais generalizada do córtex por estimulação de entrada em camadas corticais III-IV. Em vez disso, a estimulação em camadas de saída corticoefferent V-VI levou a uma ativação muito mais focal de intracorticais e corticothalamic circuitos de feedback 8. Ao usar matrizes de estimulação com dois ou mais eletrodos de estimulação, bipolar ICMS pode ser aplicado em vez de monopolar ICMS. Um modo de estimulação bipolar maisrecruta eficazmente fibras neuronais paralelas para as pontas dos eléctrodos, de preferência, na direcção do pólo catódica em comparação com fibras não paralelos 24. Uma tal configuração estimulação, consequentemente, aumenta a especificidade direcional das activações de rede neuronal evocados 8. Estas manipulações particulares diretas de atividades de rede sublaminares corticais usando ICMS 8,9, até agora não foi demonstrado por qualquer outra técnica 3. Como um exemplo do poder deste método, um relatório recente desvendou a contribuição de circuitos de feedback córtico-tálamo-cortical a percepção de aprendizagem usando a detecção de estímulos elétricos intracortical 8. Isso demonstra que microstimulation cortical direta é um método eficaz e state-of-the-art para causalmente atividade link em circuitos neuronais específicos e comportamento 1,3,11,25. Por estimulação elétrica local das regiões corticais que corresponde a características específicas mapa topográfico, como para instAnce uma região tonotópico no córtex auditivo, os indivíduos podem ser treinados em paradigmas de aprendizagem de transferência para comparar propriedades de percepts desencadeados pela estimulação sensorial elétrico ou periférica central. Tais experiências podem estimular o desenvolvimento de estratégias de estimulação para neuropróteses corticais sensoriais 5,9. Este protocolo pode igualmente ser utilizado na estimulação eléctrica de outras áreas do cérebro, como por exemplo a área tegmental ventral, para estudar o processamento recompensa e as bases neuronais de estimulação cerebral profunda 26. Crítica para microstimulation eficazes são vários detalhes técnicos que devem ser considerados no fundo da configuração individual e eletrodos utilizados. Em geral, a influência dos parâmetros de estimulação, como amplitude de estimulação, polaridade, orientação eletrodo, etc., foram revistas 11,24. De importância é a transferência de carga pelo eletrodo. A impedância de um eléctrodo é, portanto, um factor crítico. Por isso, verifique se tele impedância dos contactos de eléctrodos é na gama kQ antes da implantação.
Vários fenômenos adicionais de aprendizagem pode ser estudada pela variação apropriada do projeto básico descrito. Por exemplo, a discriminação aprendizagem em contraste com a simples detecção de aprendizagem pode ser investigada através da introdução de pelo menos dois estímulos que têm de ser associados com GO e Nogo respostas, respectivamente 14,15. Da mesma forma aprendizado formação das categorias pode ser estudado através da combinação de tal discriminação paradigmas 12,21. Paradigmas de Transporte de caixa também pode ser empregue para investigar a memória de trabalho, a inibição comportamental cognitiva e flexibilidade como por exemplo necessário para reversão ser bem sucedida 14,17 aprendizagem ou conjunto deslocamento. A memória de trabalho pode ser avaliada comparando «atraso» e condicionamento "trace". Em «atraso» condicionado 27, o CS é apresentado em toda a janela crítica tempo CS-US sem demora entre CS defset e US início. No condicionamento "traço", por outro lado, existe um atraso de alguns segundos após a compensação de transiente apresentação CS. Em contraste com o 'atraso' condicionado condicionamento "trace" coloca uma carga alta na memória de trabalho e processamento cortical. Combinando paradigmas discriminativos aprendizagem shuttle-box com a análise de padrões espaço-temporais no eletrocorticograma em curso, é um método adequado para identificar estados dinâmicos do córtex auditivo relacionados com a discriminação de estímulo 9 e formação de categoria 21. No entanto, como a formação shuttle-box é usado classicamente como tarefa de esquiva de duas vias, os problemas conceituais gerais com a aprendizagem evasão se aplicam para todos esses modelos comportamentais; a saber, que o comportamento de evitação sucesso explicitamente impede a ocorrência do estímulo que serve como o reforçador. Reforço apetitivo, por exemplo, por estimulação elétrica direta de circuitos de recompensa do cérebro médio, tem apenas abelhan aplicada a shuttle-box aprendizagem em alguns estudos 26. Além disso, a aprendizagem shuttle-box tem sido principalmente utilizado com espécies de roedores e raramente tem sido aplicado em animais de laboratório maiores, como para os cães de instância.
Além da análise eletrofisiológica, a aprendizagem shuttle-box pode ser ainda combinado com intervenção farmacológica 8,17, técnicas de lesão 15, microdialysis 28, ou optogenética. Especialmente a combinação do nosso protocolo com ferramentas optogenetic, quer por infecção viral do sistema de modelo (isto é, gerbilos da Mongólia), ou por animais geneticamente modificados, como ratinhos, permitiria a aumentar, em particular, o subtipo especificidade celular da activação neuronal artificial incluindo cortical inibição, o que não é acessível usando ICMS 3.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O trabalho foi financiado por doações do Deustche Forschungsgemeinschaft DFG eo Instituto Leibniz de Neurobiologia. Agradecemos a Maria-Marina Zempeltzi e Kathrin Ohl para assistência técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-insulated stainless steel wire | California Fine Wire | diam. 50µm w/ isolation | |
| Pin connector system | Molex Holding GmbH | 510470200 | 1.25 mm pitch PicoBlade |
| TEM grid Quantifoil | Science Services | EQ225-N27 | |
| Dental acrylic Paladur | Heraeus Kulzer | 64707938 | |
| Hand-held drill OmniDrill35 | WPI | 503599 | |
| Ketamine 500mg/10ml | Ratiopharm GmbH | 7538837 | |
| Rompun 2%, 25ml | Bayer Vital GmbH | 5066.0 | |
| Sodium-Chloride 0.9%, 10ml | B.Braun AG | PRID00000772 | |
| Lubricant KY-Jelly | Johnson & Johnson | ||
| Shuttle-box E10-E15 | Coulbourn Instruments | H10-11M-SC | |
| Stimulus generator MCS STG 2000 | Multichannel Systems | ||
| Plexon Headstage cable 32V-G20 | Plexon Inc. | HSC/32v-G20 | |
| Plexon Headstage 32V-G20 | Plexon Inc. | HST/32v-G20 | |
| PBX preamplifier 32 channels | Plexon Inc. | 32PBX box | |
| Multichannel Acquisition System | Plexon Inc. | MAP 32/HLK2 | |
| Cryostate CM3050 S | Leica Microsystems GmbH | ||
| Signal processing Card Ni-Daq | National Instruments | ||
| Lab StandardTM Stereotaxic Instruments | Stoelting Co. | ||
| Audio attenator g.pah | g.pah Guger technologies | ||
| Cresyl violet acetate | Roth GmbH | 7651.2 | |
| Roticlear | Roth GmbH | A538.1 | |
| Sodium acetate trihydrate | Roth GmbH | 6779.1 | |
| Potassium hexacyanoferrat(II) trihydrate | Roth GmbH | 7974.2 | |
| Di-sodium hydrogen phospahte dihydrate | Merck | 1,065,801,000 | |
| ICM Impedance Conditioning Module | FHC | 55-70-0 | |
| Animal Temperarture Controler | World Precision Instruments | ATC2000 |
References
- Cohen, M. R., Newsome, W. T. What electrical microstimulation has revealed about the neural basis of cognition. Current Opinion in Neurobiology. 14 (2), 169-177 (2004).
- Histed, M. H., Bonin, V., Reid, R. C. Direct activation of sparse, distributed populations of cortical neurons by electrical microstimulation. Neuron. 63 (4), 508-522 (2009).
- Histed, M. H., Ni, A. M., Maunsell, J. H. R. Insights into cortical mechanisms of behavior from microstimulation experiments. Progress in Neurobiology. 103, 115-130 (2013).
- Bradley, D. C., et al. Visuotopic mapping through a multichannel stimulating implant in primate V1. Journal of Neurophysiology. 93, 1659-1670 (2005).
- Scheich, H., Breindl, A. An Animal Model of Auditory Cortex Prostheses. Audiology and Neurootology. 7 (3), 191-194 (2002).
- Romo, R., Hernández, A., Zainos, A., Salinas, E. Somatosensory discrimination based on cortical microstimulation. Nature. 392, 387-390 (1998).
- Douglas, R. J., Martin, K. A. C. Recurrent neuronal circuits in the neocortex. Current Biology. 17 (13), 496-500 (2004).
- Happel, M. F. K., Deliano, M., Handschuh, J., Ohl, F. W. Dopamine-modulated recurrent corticoefferent feedback in primary sensory cortex promotes detection of behaviorally relevant stimuli. The Journal of Neuroscience. 34 (4), 1234-1247 (2014).
- Deliano, M., Scheich, H., Ohl, F. W. Auditory cortical activity after intracortical microstimulation and its role for sensory processing and learning. The Journal of Neuroscience. 29 (50), 15898-15909 (2009).
- DeYoe, E. A., Lewine, J. D., Doty, R. W. Laminar variation in threshold for detection of electrical excitation of striate cortex by macaques. Journal of Neurophysiology. 94 (5), 3443-3450 (2005).
- Tehovnik, E. J., Slocum, W. M., Schiller, P. H. Delaying visually guided saccades by microstimulation of macaque V1: spatial properties of delay fields. The European Journal of Neuroscience. 22 (10), 2635-2643 (2005).
- Wetzel, W., Wagner, T., Ohl, F. W., Scheich, H. Categorical discrimination of direction in frequency-modulated tones by Mongolian gerbils. Behavioural Brain Research. 91, 29-39 (1998).
- Cain, C. K., LeDoux, J. E. Escape from fear: a detailed behavioral analysis of two atypical responses reinforced by CS termination. Journal of Experimental Psychology. Animal behavior processes. 33, 451-463 (2007).
- Stark, H., Rothe, T., Deliano, M., Scheich, H. Dynamics of cortical theta activity correlates with stages of auditory avoidance strategy formation in a shuttle-box. Neuroscience. 151, 467-475 (2008).
- Ohl, F. W., Wetzel, W., Wagner, T., Rech, A., Scheich, H. Bilateral ablation of auditory cortex in Mongolian gerbil affects discrimination of frequency modulated tones but not of pure tones. Learning & Memory. 6 (4), 347-362 (1999).
- Kurt, S., Ehret, G. Auditory discrimination learning and knowledge transfer in mice depends on task difficulty. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8481-8485 (2010).
- Happel, M. F. K., et al. Enhanced cognitive flexibility in reversal learning induced by removal of the extracellular matrix in auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2800-2805 (2014).
- Thomas, H., Tillein, J., Heil, P., Scheich, H. Functional organization of auditory cortex in the mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). I. Electrophysiological mapping of frequency representation and distinction of fields. The European journal of neuroscience. 5, 882-897 (1993).
- Budinger, E., Heil, P., Scheich, H. Functional organization of auditory cortex in the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). III. Anatomical subdivisions and corticocortical connections. European Journal of Neuroscience. 12, 2425-2451 (2000).
- Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
- Ohl, F. W., Scheich, H., Freeman, W. J. Change in pattern of ongoing cortical activity with auditory category learning. Nature. 412 (6848), 733-736 (2001).
- Scheich, H., et al. Behavioral semantics of learning and crossmodal processing in auditory cortex: the semantic processor concept. Hearing Research. 271 (1-2), 3-15 (2011).
- Happel, M. F. K., Jeschke, M., Ohl, F. W. Spectral integration in primary auditory cortex attributable to temporally precise convergence of thalamocortical and intracortical input. The Journal of Neuroscience. 30 (33), 11114-11127 (2010).
- Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Research. 98, 417-440 (1975).
- Clark, K. L., Armstrong, K. M., Moore, T. Probing neural circuitry and function with electrical microstimulation. Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 278 (1709), 1121-1130 (2011).
- Ilango, A., Shumake, J., Wetzel, W., Scheich, H., Ohl, F. W. Electrical stimulation of lateral habenula during learning: frequency-dependent effects on acquisition but not retrieval of a two-way active avoidance response. PloS one. 8 (6), e65684 (2013).
- Weible, A. P., McEchron, M. D., Disterhoft, J. F. Cortical involvement in acquisition and extinction of trace eyeblink conditioning. Behavioral Neuroscience. 114, 1058-1067 (2000).
- Rothe, T., Deliano, M., Scheich, H., Stark, H. Segregation of task-relevant conditioned stimuli from background stimuli by associative learning. Brain Research. 1297, 143-159 (2009).
