Summary
シャトルボックス回避学習、行動神経科学においてよく確立されています。このプロトコルは、げっ歯類での学習シャトルボックスは、サイト固有の電気皮質内微小刺激（ICMS）と学習と知覚の複数の側面を研究するためのツールとして、in vivoでの録音での同時慢性と組み合わせることができる方法について説明します。
Abstract
シャトルボックス回避学習は、行動神経科学ではよく確立された方法であると実験のセットアップは、伝統的にカスタムメイドしました。必要な機器は、いくつかの商業企業が利用できるようになりました。サイト固有の電気皮質内微小刺激（ICMS）と同時慢性電気生理学的in vivoでの録音と組み合わせて、（Meriones unguiculatusここスナネズミ）このプロトコルは、げっ歯類でパラダイムを学ぶ双方向シャトルボックス回避の詳細な説明を提供します。詳細なプロトコルが異なる齧歯類における学習行動と知覚の複数の側面を研究するために適用可能です。
ここで条件刺激として聴覚皮質回路の部位特異的ICMSは、特定の求心性、遠心性および皮質内の接続の知覚的関連性をテストするためのツールとして使用されます。別個の活性化パターンは、異なる刺激電極のARRを使用することによって誘発することができローカル、層依存ICMSまたは遠隔ICMSサイトのays。刺激戦略は行動的に検出し、顕著なシグナルを誘発するための最も効果的であると判断することができる行動の信号検出分析を利用します。さらに、異なる電極設計を用いた並列マルチチャンネル・レコーディング（など表面電極、深さ電極は、）は、学習過程の時間経過にわたって神経観測を調査することを可能にします。それは行動の設計の変更が認知複雑（例えば検出、差別、逆転学習）を増加させることができる方法を説明します。
Introduction
行動神経科学の基本的な目的は、神経細胞の構造的および機能的特性、学習、知覚との間の特定のリンクを確立することです。認知と学習に関連する神経活動は、活動電位と、複数のサイトでの様々な脳構造における局所電場電位の電気生理学的記録によって研究することができます。 3 -電気生理学的記録は、一世紀以上のための神経活動と行動との相関関連、直接的な電気皮質内微小刺激（ICMS）を提供するのに対し、ニューロンとその行動と知覚的効果1の励起された集団の因果関係をテストするための最も直接的な方法でした。多くの研究は、動物は、インスタンスの網膜4、tに対して内刺激部位に応じて知覚タスクにおける電気刺激の様々な空間的および時間的特性を利用することができることを実証しています皮質のonotopic 5、または体部位6地域。皮質の電気的誘発活動の伝播は主に軸索繊維と皮質で、明らかに層に依存し7である、彼らの分散型シナプス接続2のレイアウトによって決定されます。 ICMSによって誘発される結果多シナプス活性化は、今後電界2,8,9の直接的影響よりもはるかに広く普及しています。皮質内微小刺激によって誘発される知覚的効果のしきい値が強く層依存8,10,11およびサイトに依存9することができます理由を説明。最近の研究では、皮質の結果のより深い層の刺激活性化intracolumnar焦点、再発corticoefferentにいる間、上位層の刺激は、主にsupragranular層におけるcorticocortical回路のより広範囲の活性化をもたらしたことを詳細に明らかにしました。並列行動実験は、後者がはるかに低い知覚検出THRを有していることが明らかになりましたesholds 8。因果8シャトル・ボックス内の学習と知覚の行動測定に固有の皮質回路の活性化に関連するので、サイト固有のICMSのような条件刺激の利点は、電気生理学的記録との組み合わせで利用されました。
双方向シャトルボックスパラダイムは回避学習12を研究するために十分に確立された実験装置です。シャトルボックスはハードルや戸口で区切られた2区画で構成されています。光や音などの適切な信号によって表される条件刺激（CS）は 、偶発的、嫌悪無条件刺激（米国）が続いているインスタンスのような金属格子床の上に足ショック。被験者は、CSに応じて、他の1つのシャトルボックス区画から往復することにより、米国を回避するために学ぶことができます。シャトルボックス学習は識別可能な学習段階13,14のシーケンス含む：まず、被験者は、古典的条件によって、CSから米国を予測し、米国は往復時に終了されると、インストゥルメンタルコンディショニングによって米国から脱出することを学びます。次の段階では、被験者は米国の発症前のCS（ 回避反応）に応答して往復することによって完全に米国を回避することを学びます。一般的に、シャトルボックス学習は古典的条件、楽器コンディショニング、ならびに相 14 の学習に応じて目標指向行動を伴います。
シャトルボックスプロシージャを簡単にセットアップし、一般的にいくつかの毎日のトレーニングセッション15の後に強固な行動を生成することができます- 17。単純な回避コンディショニング（検出）に加えて、シャトルボックスは、さらに移動/ NOGOパラダイムを使用することによって刺激識別を研究するために使用することができます。ここでは、動物は（動作を行って、反対側のコンパートメントにシャトル） 条件反応（CR）によって米国を回避するために訓練されているに応じて<強い>（現在のコンパートメントに滞在しない;ないCR）（CS +）刺激を行くとNOGO行動によってNOGO-刺激（CS-）に応答して神経活動の並列微小刺激と記録を高密度多電極アレイを勉強することを可能にして。成功した学習の基礎となる生理学的メカニズム。シャトルボックス研修、ICMSと並列電気の成功の組み合わせのための基本的なされているいくつかの技術的な詳細は、説明されます。
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Protocol
この仕事で提示すべての実験は、実験動物の保護のためにドイツの法律で定義された倫理基準に一致して実施しました。実験は、ザクセン・アンハルト州の状態の倫理委員会によって承認されました。
1.カスタムメイド微小刺激と記録するためのマルチチャネル電極アレイの
- カスタムメイド微小刺激配列
- ICMSを提供するために、3センチ、長テフロン絶縁ステンレス鋼線（絶縁されたØ= 50μm）を用いて、所望の空間デザイン（2チャンネルのここでの横方向の配列）で刺激電極を準備します。 図2を参照してください 。
- オスのピン方式（1.25 mmピッチ）への配線の一方の端を圧着します。
- （0.1654ミリメートルピッチ）のワイヤを案内する2垂直配向電子顕微鏡オブジェクトホルダーグリッド（〜5ミリメートルグリッドの距離）を介して垂直に〜0.5mm以上〜0.7ミリメートルの電極間距離のパス配線と2チャンネルアレイの場合。
- プラグハウジングにオスのピンを入れてください。
- 電解液（例えば、0.9％塩化ナトリウム）と皿に電極を入れ、それぞれのインピーダンス測定装置（ 例えば 、FHCインピーダンスコンディショニングモジュール）で、各チャンネルのインピーダンスを測定します。 100〜500kΩの範囲のインピーダンスを目指します。
- インピーダンスが高すぎる場合、それを低下させるためにチャネルを介して短絡電流（1秒、1 mA）を配信します。再びインピーダンスを確認してください。
- カスタムメイドの高分解能マルチチャンネル記録アレイ
注：このプロトコルは、皮質脳波（ECOG）のデータを記録するための表面アレイの製造を説明しています。しかし、設計は、それぞれの研究の質問（深度記録など）の要件を満たすように調整することができます。高解像度マルチチャンネルアレイは釜ですテフロン絶縁ステンレス鋼線（絶縁されたØ= 50ミクロン）によるtは男性のピン方式（1.25 mmピッチ）に圧着。- 表面電極アレイのために、2つ用意し、電子顕微鏡オブジェクトホルダーグリッドの3×6行列を通じて18のワイヤを案内します。
- 歯科アクリルとグリッド間の配線の6×3の構成を埋め込み、プラグハウジングにピンを置きます。
- 手持ちドリルに取り付けられた粉砕機を使用して長方形のブロックに歯科アクリルを挽きます。
- すべてのチャネルのインピーダンスをチェックします（1.1.6を参照）100の範囲である - 500kΩの。
- 移植前皮質表面の凸部に一致するように配列の研削面（ステップ2を参照）。
慢性使用のための麻酔モンゴルHerbilsにおける聴覚皮質への配列の2外科的移植
- 計画されているすべての必要な実験の手順を実行するための正式な承認を保持します。アプロを着用priate防護服（コート、滅菌手袋、手術用マスク、フード）。
- 成人男性スナネズミ（Meriones unguiculatus）または他のげっ歯類を使用してください。滅菌し、十分に特定された手術器具を使用し、必ず保護手袋とコートを着用し。
- スナネズミの場合には、0.9％滅菌塩化ナトリウム溶液で希釈したケタミン（100mg / kg）およびキシラジン（5mg / kg）の混合物の腹腔内注射で動物を麻酔し。 10：1：9の比で塩化ナトリウム（0.9％）：キシラジン：0.6ミリリットル/ケタミンの混合物を合成する時/ kgを注入することによって維持します。
- 直腸プローブのフィードバックシステムによって37℃の体温を維持するための加熱板上で動物を置き（例えば、ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ）。
- interoccipital、頭頂、および側頭骨をカバーする毛を剃ります。無菌的に（ 例えば 、ベタジンまたはNolvasan、70％のアルコールスクラブ3回を交互に）効果的な消毒剤で切開部位を準備します。 PR眼軟膏による乾燥に対してotect目。
- 頭蓋interoccipitalをカバーする皮膚、頭頂、およびメスを用いて正面骨を切り取り、ゆっくりと骨の表面にドリルを移動させることにより、骨膜を削除します。
- マウント後にヘッドを妨げないように、できるだけ横として反対頭頂および前頭骨に小さな穴を開けます。今しっかりと穴に約1mmの直径を有する2つの骨ネジをねじ込みます。それは後に電気刺激のための共通の基準とグランドと同様に、リターン電極として使用されるように頭頂ネジは、硬膜に良好な接触があることを確認してください。
- 内側前頭骨の上に小さなアルミニウム棒を接着し、headholderによって注入中に頭部固定として使用することができます。
- はさみを使用して1つの側に筋側頭を覆っている皮膚を取り除きます。
- 側頭骨への入学を得るために頭筋の背の部分をカット。
- 開頭術（約3ミリメートル×4ミリメートル）のことで聴覚皮質を公開歯科用ドリルを使用して、側頭骨。典型的な血液脳血管署名18,19に基づいて、聴覚皮質の場所を特定します。
- 慎重に刺激電極を脳に移植されている場所で、マイクロメスで硬膜の切開を行います。硬膜涙が根底にある神経網への損傷を禁止するまでゆっくりと表面に沿って移動します。
- マイクロマニピュレータの制御下に刺激配列を挿入します。硬膜外配列は、関心のある領域上に配置されるように、接線方向挿入角度を選択します。挿入角度と位置と刺激の目的としたサイトに応じて、慎重に挿入深さを考慮してください。
- 第二マイクロマニピュレータにより関心領域をカバーする脳表面に良好な接触を持つ硬膜外面記録配列（ここでは聴覚皮質）を配置します。アレイは硬膜をインデントしないように皮質の曲率と一致していることに注意してください。
- 電極アレイとそのプラグインの両方を固定頭蓋骨に歯科アクリルとハウジング。
- 防腐剤、潤滑剤（例えば、KY-ゼリー）と歯科アクリル（例えば、Paladur、ヘレウスUlzer）との緊密な開頭で露光皮質表面を覆います。重合は熱を発生する可能性があることに注意してください。これは組織の損傷を引き起こす可能性があるとして、歯科アクリルおよび皮質表面の任意の接触を防止するために神経網と歯科アクリルの間に十分な潤滑剤を使用してください。
- 今、動物はそれ以上の手順を開始する前に回復することができます。 （：≥3日、マウス：≥7日例えば、スナネズミ）の回復時間は、種間で異なる場合があります。慎重に動物の状態を監視し、該当する場合（例えば、メロキシカム; 1ミリグラム/キログラム術後手術後24時間）、次の日に鎮痛治療を与えます。
条件刺激としてICMSを使用3.双方向シャトルボックスデザイン
- シャトルボックストレーニング
- （Cシャトルボックスを配置します例えば ustomビルドまたは任意の市販製品、音響的および電気的にシールドされたチャンバー内のE10-E15、Coulbournインスツルメンツ）。ボックスはハードルで区切られた2つの区画を含みます。それはゴー応答の行動バイアスに影響を与えるようなハードルの高さを考慮してください。特定の種 （例えば、〜2マウスに対するセンチ、スナネズミ〜3センチ）のための適切な高さを使用してください。
- フットショック（US）を適用するには、調査12,15の下の種のための適切なバー間の距離と格子床を使用しています。常に何が電気的に個々の棒（糞、毛、電極クリーム）をショートカットしないことに注意してください。
- 動物のかなりの回復時間（2.17を参照）した後、好ましくは、任意の短期的な麻酔を使用せずに記録し、刺激ケーブルに件名を接続します。タオルで動物をカバーし、静かに手に動物を取るようにしてください。もう一方の手で動物の頭やコネクタを明らかにし、ケーブルを接続します。 動物は各セッションの開始前に3分間のトレーニング室に慣らすようにします。
- トレーニングセッションごとに90件の試験 - （1 - 2毎日）30との間に適用されます。 30秒 - トライアル最大15秒の持続時間、および25の間でランダムに変化試行間の間隔を使用してください。
- 刺激電極への馴化刺激のためにICMSを提供するためのマルチチャンネル刺激（例えば、MCS STG2000）を使用します。脳組織に損傷を与えることなく、行動の効果を得るためには、200マイクロ秒の位相期間で二相性、電荷バランスのとれたパルス（陰極最初）の（ 例えば、300ミリ秒の長さ、100 PPS）パルス列を適用します。 4秒（観察窓）の期間中、700ミリ秒のポーズで列車を繰り返します。
- 聴覚CSを提示するためのアナログ出力PCIボード（例えば、NI PCI-6733）を使用します。プログラムMATLABに、これらのデバイスは、柔軟にデジタル出力線を介してシャトルボックスシステムを制御し、ハードウェア・トリガします。
- 目へのルートのアナログ出力信号オーディオアンプを介した電子シャトルボックススピーカー。
- 条件付き格子床を通して足ショック米をお届けします。最適な電気生理学的記録品質を得るには、第二ハイエンドのマルチチャンネル刺激（MCS STG2000）によって衝撃を生成します。
- 検出トレーニング存在する唯一のCS +刺激を適用します。ここでは、CSおよび米国のない存在のブランク試験は（3.2参照）にバイアスされ、シャトルの動作を補正するための試験試験（〜10％）の間に散在。より厳しいタスクでは、CS +とランダム化されたために、同じセッションでのCS-刺激を区別する動物を訓練します。
- ヒット応答として 4秒（CR）の重要な時間ウィンドウ内のCS +発症後の区画の変更を分類します。重要な時間ウィンドウ（ ミス ）で、CRのないCS +試験では、直ちに無条件刺激（米国）のような6〜10秒間穏やかな足ショックを与えます。
注：繰り返しのCS +刺激米国と重なっ動物aの学習の労力を削減しますND（「トレース」コンディショニング対「遅延」、議論を参照）学習速度とパフォーマンスを向上させます。 - CS-試験のために、重要な時間ウィンドウなどの誤警報応答内の区画の変更を分類し、すぐにこの不適切なCRの後に最大10秒間、米国を適用します。動物は重要な時間ウィンドウの間にコンパートメント（なしCR）にとどまるときCS-後に米国を適用し、 適切な拒絶としてこの試験を分類しないでください。
注：動物はそれに対応して区画を変更したときに重要なことに、足ショックUSには常に（ エスケープ ）、オフになっています。それは、CRを阻害する動物による高い努力を与えるとして、これはより保守的な学習基準を課しますが、繰り返しの馴化刺激が使用されている場合、CS-試験、 例えば、より長いため、重要な時間ウィンドウを使用してください。 - CSと米国の効果的な関連性のために嫌悪が、痛くないようにするために、適度な範囲の衝撃強さを調整します。最適なイニシアL現在の強さは、 種 （例えば、マウスの場合50μA、スナネズミのために200μA）との間で異なります。したがって、さらなる技術的な詳細については、次の2つの項目を参照してください。
- 個別に軽度の振幅（スナネズミのための〜200μA）で始まる最初のトレーニングセッションで衝撃強度を適応させます。足の衝撃強度は、それが低すぎる場合には、CSと米国との間でレイテンシジッタとの関連を逃れる最適ではありません。
- 動物が発声すると、CSに対応してフリーズする場合は、常に注意を払います。この場合、フットショック強度が高すぎます。このエアコン恐怖反応は回避学習を妨げます。
- 慎重に脱出待ち時間を決定します。ステップバイステップの脱出待ち時間は、最初の20の試験後の2秒より長い場合、フットショック強度を高めます。動物がショック制御下にある場合は、すべての訓練の後を確認し、 すなわち、それはかなり2秒未満に脱出レイテンシを示しています。
注：ただし、足を上げるために避けます高応力動物の行動戦略は純粋なエスケープ応答にフォールバックすることができますように、あまりにも急速に強さに衝撃を与えます。米国の振幅を調整しつつ密接に行動し、特に反応潜時を観察します。例えば、 図3Eを参照してください 。 - 動物がCRを示した場合は、すぐにCSのプレゼンテーションを停止します。これは回避反応の強化のために重要です。
- 動物が回避すべてCSに戦略、 すなわち、ショー、適切なCRを取得した場合、心理分析を実行するためのパラメータ（ICMS振幅、位相の持続時間、繰り返し率など）を変化させます。しかし、学習や適応を誘発する米国のペアリングとブロックごとの方法でパラメトリックCS変動を適用します。
- これを避けるために、元のトレーニングの15〜30の試験を開始した後、ランダムに元のCSのとの定期的な訓練試行間のテスト試験として米国ずにCSの変動をまき散らします。最大限のuテスト試行のSE 25％。
- トレーニングの後、トレーニング室から動物を削除して、慎重に次の動物の訓練の前に完全なボックスを清掃してください。彼らの自然な香りがトレーニングパフォーマンスに影響を及ぼす可能性があるため、同じボックスで一度に異なる種を訓練しないようにしてください。
- トレーニングデータの分析
- 馴化相のすべての区画の変更を記録します。
- （ITS）応答（ミスとバックシャトル誤警報後）と自発的な試行間のシャトルを逃れ、トレーニング中のすべての区画の変更を記録し、ヒットと誤報に分けます。
- 次のように、CS +とCS-のためのCR率計算：ヒット率=ヒット/ CS +試行数を、誤警報率=誤警報/ CS-試行回数。
- セッションごとのCR率を取得します。しかしながら、より高い時間分解能での学習動態を評価するために、CS +と同じ数の短いブロックとCS-試験（CRから速度を計算
- トレーニングの進捗状況や学習動態を評価するためのセッションまたは試用ブロックの関数としてプロットCR率。
- 動物の応答をバイアス実験条件の独立行動感度の定量化のために、信号検出理論8,9,17に基づいて、D 'の値を導出します。
- 対応するヒットと偽警報率（弁別学習）または、これらのZスコアを標準化された正規分布関数の逆由来レートやITS（検出学習を）ヒットし、減算のD '分析用Zスコアについて。ノイズ上記の1標準偏差の信号強度に対応するD '= 1.0の刺激検出のための閾値基準を設定します。 例として図3を参照してください 。
- さらにCR-を決定し、（CSの発症および行動応答までの時間を測定することにより、完全なコンパートメントを異なるCSに応答して、反応時間を逃れます変化します）。
- シャトルボックスの動作をビデオテープに録画からより詳細な行動分析を取得します。ビデオの音声トレース上シャトルボックスまたは刺激システムからのトリガパルスを記録することにより、映像と記録システムの間の時間的同期を達成。ビデオ分析では、CRの前の動物のロバの注目と配向応答することができます。
学習動物におけるインビボ電気生理学的手法4.
- 訓練中に電気生理学的記録
- トレーニング中に、複数の電極から共通の基準/接地電極に対してmonopolarly（説明ECOG-配列で、 例えば ）電気生理学的信号を記録。
- ヘッドステージアンプにすべての電極からのフィード信号は、直接またはヘッドコネクタに短いアダプタを介して接続し。
- 包まれた薄い、フレキシブルケーブルのハーネスを介してメインアンプにヘッドステージを接続します金属により動物を噛んによる損傷から保護するためにメッシュ。
注：ケーブルハーネスにおける機械的応力は、さらにボックス内の動物の自由な移動と回転を許容するスプリングによって緩和することができます。理想は、回転可能な電動式スイベルの使用です。しかし、聴覚実験のために、そのモータによって生成される高周波数の聴覚ノイズを低減する泡で防音室や音響シールド外にスイベルを置きます。 - 所望の周波数範囲内の信号対雑音比と帯域通過フィルタ信号を増加させるために、シールドボックス内の前置増幅器を使用します。
- （ローカルフィールドの潜在的なレコーディングのため）以上1 kHzのサンプリング周波数と（活動電位の記録のために）少なくとも40 kHzのサンプル・データとは、オフライン分析のためにPCに保存します。両方のタイプの適切なフィルタ設定を使用します（ 例：2 -ローカルフィールドポテンシャルのための300ヘルツ、300 -活動電位4,000ヘルツ）。
- 慎重トンの開始前に記録の品質をチェック（何のノイズや動きアーチファクト）雨が降っていません。 50 Hzのノイズの振幅を決定するために信号にオンラインFFTフィルタを適用します。必要に応じてヘッドコネクタ間のすべての接続を再確認し、アダプタ、ヘッドステージ、ケーブルハーネス、および増幅器。
- 各パルスの開始後〜5ミリ秒まで1秒前に、アーティファクトの影響を受けるすべてのデータポイントを再構築するために補間手順を使用して電気刺激により誘発される記録されたデータ内のアーティファクトを減少させるために。このため、影響を受けていないデータ・ポイントの間にゼロを挿入し、補間点とその理想値（MATLABのinterp.m機能）との間の平均二乗誤差を最小化し、対称FIRフィルタを適用します。別にさらなる分析9の前に、各チャンネルで、原信号にこの手順を適用します。
- パラレルシャトルボックス研修、ICMS、記録の技術的な詳細
- 一般的に、動物はボックスsurroundiで快適に感じることを確認してくださいNG。動物が自由に移動し、ボックスのすべてのコーナーに到達することを許可します。最初のトレーニング（20分）の前に、各セッションの前日に慣れるのに十分な時間（3分）が有益です。
- 任意の外科的治療の後、動物に十分な時間が必要に応じて薬を含む回復（2.17上記参照）と動物が苦しむや痛み（目を閉じ、無気力表現型、だらしない毛皮のいずれかの典型的な兆候を示さない場合、唯一の動物を訓練するために開始することができます20）。
- 格子床の適切な電気接地を確認してください。記録システム、シャトルボックスと動物との間にグランドループを回避する必要があります。フローティング電圧でgridfloorを残し、唯一の共通接地電極を介して動物を接地してください。
- マルチチャンネル刺激（MCS STG2000）は電動式スイベルの別々のラインを介して移植された刺激電極アレイのヘッドコネクタに接続します。
- グランドとして記録の共通接地電極を使用するか、私のために電極を返しますCMS、同様に。
電極位置の5組織学的解析
- 完全な訓練セットに続いて、組織学的分析による刺激電極アレイの安定した位置をコントロール。
- 0.9％滅菌塩化ナトリウムで希釈したケタミン（100mg / kg）およびキシラジン（5mg / kg）の混合物の腹腔内注射で動物を麻酔し。その後、移植8の位置で組織中の鉄堆積物を得るために、すべての刺激チャネルを介して配信単極カソード電流（60秒間30μA）を適用します。
- この手順に従い、（ペントバルビタールの過剰摂取の例えば腹腔内注射; 100ミリグラム/ kg）を安楽死の適切かつ承認された方法で動物を生け贄に捧げます。
- すぐに動物の脳を削除し、2-メチルブタンでそれを凍結し、液体窒素中で-70℃に冷却しました。
- 今50μmの時間にクリオスタットミクロトーム上で関心領域をカットorizontalセクション。
- 組織学：ニッスルと「プルシアンブルー」-staining
- 皮質層の同定のためのニッスル染色で毎秒のスライスを扱います。最初に、0.05 M酢酸ナトリウム三水和物緩衝液（pH 4.0 -4.2）にスライス5分間浸します。
- 5％酢酸クレシルバイオレットで10分 - 5のためのスライスを入浴。蒸留水でスライスを洗浄します。
- 0.05 M酢酸ナトリウム三水和物緩衝液（pH 4.0 - 4.2）で2分間連続のスライスを入浴、それぞれ50％、70％およびエタノール90％の溶液です。
- イソプロパノール倍のスライスを入浴：96％エタノール（2：1）で5分間ずつ。
- 最後に、5分間Roticlearで3回スライスを浴びます。
- 目に見える実験後に長い単相電流によって誘発される鉄沈着になり、他のすべてのスライスの「紺青」-stainingによる刺激チャネルの位置を取得します。
- K 4 1％のカリウムhexacyanoferrat（II）三水和物の新鮮な溶液を調製します【のFe（CN）6] K 4を2gを混合し[Fe（CN）6]を1％塩酸200ml中。
- 0.1 Mリン酸バッファー（pH 7.4）800 mlを加え。
- hexacyanoferrat溶液中で10分間、次いで蒸留水で10分間、脳切片を浸し、そして。
- 0.1 Mリン酸緩衝液中で10分間、二回のスライスを入浴し、最後に蒸留水で5分間。
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Representative Results
このセクションでは、スナネズミにおけるシャトルボックス学習の代表的な例を示しています。被験者は、二つの刺激電極の間にICMS部位を区別するように訓練された聴覚皮質（ 図1および図2）に互いに離間して700ミクロンの移植。刺激アレイは、異なる空間の設計（ 図1）でカスタマイズすることができます。ここでは、2つのICMSサイトの識別は30 CS +とCS-それぞれ（ 図3A-C）のプレゼンテーションと3トレーニングセッション内で学習されました。これは、連続7トレーニングセッションを通してヒットと誤警報応答のCR率（ 図3B）の安定的な有意差で示されています。それに対応して、D 'は、これらのセッション（ 図3C）に> 1です。彼らは効果的な嫌悪無条件反応を反映しているように、米国に向けクイックエスケープ潜時は、基本的なもの。これは、200から足の衝撃強度を適応させることによって保証することができます＃181; A逃避潜時までの50μAのステップでは、（ 図3のEを参照）短いです。並行して、ECOGアレイからの電気生理学的記録は、〜700ミクロン（ 図4）で区切られた刺激部位で皮質内の電気CS +またはCS-によって誘発される部位特異的な時空間活性化パターンを評価することができます。
1.電極アレイの設計図。皮質の2つの異なるサイトでの皮質内微小刺激のための（A）の深さの配列（2×1）。電極は、〜700ミクロンの電極間距離で配置されています。他の空間デザインは、例えばとして、皮質組織の特定の軸に沿って刺激部位と異なる皮質の深さや横方向の配列で層に依存するローカルICMSのために聴覚皮質8のtonotopic勾配を可能にすることができる。（B）硬膜外surfa高空間分解能での皮質脳波を記録するためのCE配列（3×6）。電極は〜600ミクロンの電極間距離で3x6のマトリクス状に配置されたステンレス鋼線（Ø256ミクロン）から作製した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
移植された刺激と記録電極の図2.ポジショニング。 （A）は、2つの刺激電極対（ 図1A参照）、S1（ダークグリーン）とS2（ライトグリーン）は、その入力層IVに近い右一次聴覚フィールドAIの深さに注入されます。電極先端は〜700ミクロンの電極間距離をrostrocaudal軸（尾側電極S1、吻側電極S2）に沿って配置することができます。 3×6 ECOG記録配列（600ミクロンの電極間距離）が右、AIの上に硬膜外に集中しています。（B）実験手順は、2つの小さな病変（矢印）を示した後、それぞれの脳領域の水平断面をニッスル染色、2移植された刺激電極の先端によって引き起こされました頭皮質内での位置を示します。位置はさらに、「プルシアンブルー」染色により評価することができます。この図は、2009年、。Delianoらから変更されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.シャトルボックス学習データと1個々の動物の分析。右側の（A）的スキーマは、CS +との双方向のシャトルボックスdiscriminatiでCS-試験のためのタスクの設計を記述タスクと行動の結果に。（B）学習曲線は、個々のトレーニングセッションのヒットと誤報率としてプロットしました。ヒット及び誤警報率は、アスタリスクでマークされている間に有意差（ゲーム・ハウエル検定、p <0.05）。（C）感度指数D '> 1（3.2.7を参照）は、正常判定のための閾値基準として用いることができる。（D CSの+の試験中に馴化相の間の自発的な交差の）モニタリング 、一般セッションを超える減少を示す。（E）応答待ち時間は、すべてのトレーニングセッションで個々の試験のためにプロットされています。 6秒以下のレイテンシを持つすべての応答が成功したヒット応答に対応しています。最初のセッションの前半に長いエスケープ潜時に注意してください。足の衝撃強度のエスケープ待ち時間が増加した後、十分な衝撃制御を示す米国の発症後2秒未満に減少しました。応答待ち時間のヒストグラム（右挿入図）bimodされています応答（<6秒）を打つと応答逃れるために、対応するアル。（6から8秒）は、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
学習動物4.パラレル電気生理学的記録を図。 1匹の動物から（A）電気的に誘発電位（EEP）の典型的な例は、トレーニングの単一のセッションで、CS +試験にわたって平均。データは、ECOG-配列から記録しました。図は、（黒）の前に、シングルパルス刺激アーチファクトの（赤）を除去した後、EEPトレースを比較します。アーチファクト低減の詳細については、セクション4.1.7を参照してください。初期の著名な負のピークは、20ミリ秒（N20）の待ち時間で見ることができます。（B）tでのCS +に対応してN20の振幅の空間分布のさらなる分析彼は刺激電極（上部）吻側および尾側刺激電極（下部）にCS-に聴覚皮質全体に誘発状態の空間分解能を明らかにしました。記録アレイに対して解剖学的方向は矢印で示されている（; C、尾; L、横あり; m、中間; R、吻側; D、背V、腹側）。この図は、2009年、。Delianoらから変更されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、双方向嫌悪フットショック制御シャトルボックスシステムを使用して学習動物における同時部位特異ICMSマルチチャンネル電気生理学的記録の方法を記載します。プロトコルは、このような組み合わせのための技術的な重要な概念を強調し、フローティング電圧でgridfloorを残し、唯一の共通接地電極を介して動物を接地することの重要性を指摘しています。これらの動物における聴覚野の学習に関連したプラスチックの再編成が広く8,12,14,15,21,22研究されているとしてここでは、聴覚シャトルボックス学習はスナネズミに適用しました。それにもかかわらず、記載されたプロトコルは、インスタンスマウス16などの他のげっ歯類に若干の変更と適合させることができます。この点では、回復手術後の時間（2.17）、ハードル（2.1.1）の高さ、HIGすることができます個々の動物の足衝撃感度を、に関する種特異的適応を考慮することが重要ですHLY変数（3.1.3-3.1.6）。
プロトコルは、さらにカスタムメイドの電極設計は、同時電気生理学的多電極記録8,23の分析から導出される個別のネットワークの活性化につながる皮質組織内の異なるサイトを刺 激するために使用することができる方法についての詳細な説明を提供します。電極の距離に応じて、1つは、例えば地形図9のための異なる領域を刺激することができます。層依存ICMSを適用することにより、示差皮質入力レイヤIII-IVにおける刺激による皮質のより広範囲の活性化をもたらす長距離corticocortical突起を活性化することができます。その代わりに、corticoefferent出力層のV-VIでの刺激は、皮質内と皮質視床フィードバック回路8のはるか焦点の活性化につながりました。二つ以上の刺激電極で刺激アレイを使用する場合、バイポーラICMS代わりに単極ICMSを適用することができます。より多くの双極刺激モード効果的に非平行繊維24と比較して、好ましくは、カソード極の方向に、電極先端に平行に走る神経繊維を募集しています。このような刺激構成は、したがって、誘発神経ネットワークアクティベーション8の指向特異性を向上させます。 ICMS 8,9を使用して 、皮質sublaminarネットワーク活動のこれらの特定の直接操作は、これまでの任意の他の技術3で示されていません。この方法のパワーの一例として、最近の報告では皮質内電気刺激8の検出学習を用いた知覚皮質-視床皮質フィードバック回路の寄与を解明しました。これは、直接皮質微小刺激は、指定された神経回路と動作1,3,11,25にリンク活動を因果的にするための効果的かつ最先端の方法であることを示しています。 instのためのような特定の地形の特徴に対応する皮質領域の局所的な電気的刺激によって聴覚皮質にtonotopic領域にンス、被験者は電気中枢または末梢感覚刺激によって誘発される知覚の特性を比較するために、転送学習パラダイムに訓練することができます。このような実験は、感覚皮質neuroprostheses 5,9のための刺激戦略の開発を刺激する可能性があります。このプロトコルはまた、報酬処理及び深部脳刺激26の神経基盤を研究するために、例えば腹側被蓋領域用として、他の脳領域の電気刺激に使用することができます。効果的な微小刺激のためのクリティカルが使用される個々のセットアップや電極の背景に考慮されなければならないいくつかの技術的な詳細です。一般的には、刺激パラメータの影響は、等刺激振幅、極性、電極の向き、同様に、11,24を検討されています。重要なのは、電極による電荷の移動があります。電極のインピーダンスが故に重要な要因です。したがって、そのトンをチェック彼電極コンタクトのインピーダンスは、移植前にkΩの範囲です。
学習のいくつかの付加的な現象を説明する基本的な設計の適切な変化によって研究することができます。例えば、簡単な検出学習とは対照的に学習差別はそれぞれ14,15、外出先やNOGO応答に関連する必要が少なくとも二つの刺激を導入することにより調べることができます。同様に、カテゴリ形成学習は、識別パラダイムを12,21を組み合わせることによって調べることができます。シャトルボックスパラダイムもワーキングメモリ、行動の抑制及び14,17またはセットシフトを学ぶ成功反転に必要なインスタンスのような認知の柔軟性を調査するために使用することができます。ワーキングメモリは、「遅延」と「トレース」調整を比較することによって評価することができます。 「遅延」コンディショニング27では 、CSはCSの間に遅延することなく、重要なのCS-米国時間ウィンドウ全体に提示されていますFSETと米国発症。 「トレース」コンディショニングでは、他の一方で、一過性のCSプレゼンテーションのオフセット後、数秒の遅延があります。 「遅延」コンディショナーとは対照的に「トレース」のコンディショニングは、ワーキングメモリと皮質処理に高い負荷がかかります。現在進行中の皮質脳波における時空間パターンの分析と差別シャトルボックス学習パラダイムを組み合わせることで、刺激弁別9、およびカテゴリの形成21に関連する聴覚皮質の動的状態を識別するための適切な方法です。シャトルボックストレーニングは、古典的に双方向の回避タスクとして使用されているようしかし、回避学習との一般的な概念の問題は、これらの行動の設計のすべてに適用されます。すなわち、その成功回避行動を明示的に補強剤として働く刺激の発生を防止することができます。食欲の補強は、中脳の報酬回路の直接電気刺激によって、例えば、唯一の蜂を持っていますnはいくつかの研究26での学習シャトルボックスに適用されます。また、シャトルボックス学習は主にげっ歯類で使用されており、めったに例えば犬用として、より大きな実験動物に適用されていません。
電気生理学的解析とに加えて、シャトルボックス学習は、さらに薬理学的介入8,17、病変技術15、微小透析28、または光遺伝学と組み合わせることができます。特に、いずれかのモデル系（すなわち、スナネズミ）のウイルス感染により、または遺伝子改変動物によってoptogeneticツールとのプロトコルの組み合わせは、マウスのように、特に皮質を含む人工ニューロンの活性化の細胞サブタイプ特異性を増大させることが可能になりますICMS 3を使用してアクセスできません阻害。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
仕事はDeustche Forschungsgemeinschaft DFGと神経生物学のためのライプニッツ研究所からの助成金によってサポートされていました。我々は、技術支援のためのマリア・マリーナZempeltziとキャサリンOHLに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-insulated stainless steel wire | California Fine Wire | diam. 50µm w/ isolation | |
| Pin connector system | Molex Holding GmbH | 510470200 | 1.25 mm pitch PicoBlade |
| TEM grid Quantifoil | Science Services | EQ225-N27 | |
| Dental acrylic Paladur | Heraeus Kulzer | 64707938 | |
| Hand-held drill OmniDrill35 | WPI | 503599 | |
| Ketamine 500mg/10ml | Ratiopharm GmbH | 7538837 | |
| Rompun 2%, 25ml | Bayer Vital GmbH | 5066.0 | |
| Sodium-Chloride 0.9%, 10ml | B.Braun AG | PRID00000772 | |
| Lubricant KY-Jelly | Johnson & Johnson | ||
| Shuttle-box E10-E15 | Coulbourn Instruments | H10-11M-SC | |
| Stimulus generator MCS STG 2000 | Multichannel Systems | ||
| Plexon Headstage cable 32V-G20 | Plexon Inc. | HSC/32v-G20 | |
| Plexon Headstage 32V-G20 | Plexon Inc. | HST/32v-G20 | |
| PBX preamplifier 32 channels | Plexon Inc. | 32PBX box | |
| Multichannel Acquisition System | Plexon Inc. | MAP 32/HLK2 | |
| Cryostate CM3050 S | Leica Microsystems GmbH | ||
| Signal processing Card Ni-Daq | National Instruments | ||
| Lab StandardTM Stereotaxic Instruments | Stoelting Co. | ||
| Audio attenator g.pah | g.pah Guger technologies | ||
| Cresyl violet acetate | Roth GmbH | 7651.2 | |
| Roticlear | Roth GmbH | A538.1 | |
| Sodium acetate trihydrate | Roth GmbH | 6779.1 | |
| Potassium hexacyanoferrat(II) trihydrate | Roth GmbH | 7974.2 | |
| Di-sodium hydrogen phospahte dihydrate | Merck | 1,065,801,000 | |
| ICM Impedance Conditioning Module | FHC | 55-70-0 | |
| Animal Temperarture Controler | World Precision Instruments | ATC2000 |
References
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