Summary
Navette boîte éviter l'apprentissage est bien établi en neuroscience comportementale. Ce protocole décrit comment navette boîte apprentissage chez les rongeurs peut être combiné avec microstimulation site spécifique électrique intracorticale (ICMS) et chronique simultanée dans les enregistrements vivo comme un outil pour étudier plusieurs aspects de l'apprentissage et de la perception.
Abstract
L'apprentissage navette boîte évitement est une méthode bien établie en neurosciences comportementales et expérimentales configurations étaient traditionnellement faites sur mesure; l'équipement nécessaire est maintenant disponible par plusieurs sociétés commerciales. Ce protocole fournit une description détaillée d'une à deux voies navette boîte éviter paradigme d'apprentissage chez les rongeurs (gerbilles de Mongolie ici; Mérion unguiculatus) en combinaison avec microstimulation site spécifique électrique intracorticale (ICMS) et électrophysiologiques enregistrements chroniques simultanées in vivo. Le protocole détaillé est applicable pour étudier plusieurs aspects du comportement de l'apprentissage et de la perception de différentes espèces de rongeurs.
ICMS de circuits corticaux auditifs comme stimuli conditionnés spécifiques à un site est utilisé comme un outil pour tester la pertinence perceptive spécifique afférente, efférente et les connexions intracorticales. Modèles d'activation distinctes peuvent être évoqués en utilisant différents électrode de stimulation arrays pour ICMS locales, couche-dépendant ou des sites éloignés. SGCI En utilisant l'analyse de comportement de détection de signal, on peut déterminer quelle stratégie de stimulation est plus efficace pour induire un signal détectable et comportemental saillant. En outre, les enregistrements multicanaux parallèles utilisant différents modèles d'électrodes (électrodes de surface, des électrodes de profondeur, etc.) permettent d'enquêter observables neuronales au cours du temps de ces processus d'apprentissage. Il sera examiné comment les changements de la conception du comportement peuvent augmenter la complexité cognitive (par exemple, la détection, la discrimination, l'apprentissage d'inversion).
Introduction
Un objectif fondamental de neurosciences comportementales est d'établir des liens spécifiques entre les propriétés structurelles et fonctionnelles neuronales, l'apprentissage et la perception. L'activité neuronale associée à la perception et de l'apprentissage peut être étudiée par enregistrement électrophysiologique des potentiels d'action et les potentiels de champ locaux dans différentes structures cérébrales à plusieurs sites. Alors que les enregistrements électrophysiologiques fournissent associations corrélatifs entre l'activité neuronale et le comportement, microstimulation électrique direct intracorticale (ICMS) depuis plus d'un siècle a été la méthode la plus directe pour les relations tests de causalité de populations de neurones excités et leurs effets sur le comportement et la perception 1 - 3. De nombreuses études ont démontré que les animaux sont capables de faire usage de diverses propriétés spatiales et temporelles des stimuli électriques dans les tâches de perception selon le site de stimulation au sein par exemple rétinotopique 4, tonotopic 5, 6 ou somatotopique régions dans le cortex. La propagation de l'activité électrique évoquée dans le cortex est principalement déterminée par la disposition des fibres axonales et leur connectivité synaptique distribué 2 que, dans le cortex, est clairement dépendant couche 7. L'activation polysynaptique résultante évoquée par ICMS est désormais beaucoup plus répandue que les effets directs de la 2,8,9 de champ électrique. Cela explique pourquoi les seuils d'effets perceptifs suscités par microstimulation intracorticale peuvent être fortement couche dépendant 8,10,11 et dépend du site 9. Une étude récente a démontré en détail que la stimulation des couches supérieures a donné une activation plus large propagation de circuits en couches corticocorticales principalement supragranular, tandis que la stimulation des couches plus profondes de la suite du cortex dans un corticoefferent récurrente focale intracolumnar activation. Expériences comportementales parallèles révélé que ce dernier a beaucoup plus faible Thr de détection perceptiveesholds 8. Par conséquent, l'avantage de site spécifique ICMS stimuli conditionné a été exploité en combinaison avec des enregistrements électrophysiologiques de relier causalement activations de circuits corticaux spécifiques 8 à mesures comportementales de l'apprentissage et de la perception dans la boîte de navette.
Les deux voies navette boîte paradigme est un appareil de laboratoire bien établi pour étudier l'évitement apprentissage 12. Une boîte de navette se compose de 2 compartiments séparés par un obstacle ou une porte. Un stimulus conditionné (CS) qui est représenté par un signal approprié comme une lumière ou le son, est contingente suivie par un stimulus aversif inconditionnel (US), comme par exemple un choc de pied sur un plancher de grille métallique. Les sujets peuvent apprendre à éviter les Etats-Unis par la navette d'un compartiment navette case à l'autre en réponse à la CS. Navette case apprentissage implique une séquence de phases d'apprentissage distinctes 13,14: d'abord,les sujets apprennent à prédire les États-Unis à partir du CS par conditionnement classique et d'échapper à l'US par conditionnement instrumental, comme les États-Unis se termine sur la navette. Dans une prochaine phase, les sujets apprennent à éviter les Etats-Unis tout en faisant la navette en réponse à la CS devant nous apparition (réaction d'évitement). Généralement, navette boîte apprentissage implique le conditionnement classique, conditionnement instrumental, ainsi que le comportement orienté vers un but en fonction de la phase 14 d'apprentissage.
La procédure de navette-boîte peut être mis en place facilement et produit généralement un comportement robuste après quelques séances d'entraînement quotidiennes de 15 - 17. En plus d'un simple conditionnement d'évitement (de détection), la boîte de navette peut encore être utilisé pour étudier la discrimination de relance en employant paradigmes Go / NoGo. Ici, les animaux sont formés pour éviter aux États-Unis par une réponse conditionnée (CR) (aller comportement; navette dans compartiment opposé) en réponse à une <strong> go-stimulus (CS +) et par le comportement de Nogo (rester dans le compartiment de courant, pas de CR) en réponse à une Nogo-stimulus (CS) microstimulation parallèle et l'enregistrement de l'activité neuronale avec des tableaux de multiélectrodes haute densité permettra d'étudier. les mécanismes physiologiques sous-jacents apprentissage réussi. Plusieurs détails techniques qui sont fondamentales pour les combinaisons de formation réussie navette-box, ICMS et l'électrophysiologie parallèle, seront discutés.
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Protocol
Toutes les expériences présentées dans cet ouvrage ont été réalisés en accord avec les normes éthiques définies par le droit allemand pour la protection des animaux de laboratoire. Des expériences ont été approuvés par le comité d'éthique de l'Etat de Saxe-Anhalt.
1. Sur mesure multicanaux électrodes tableaux pour microstimulation et enregistrement
- Réseau de microstimulation sur mesure
- Pour délivrer ICMS, préparer des électrodes de stimulation dans la conception spatiale souhaitée (tableau ici latéral de 2 canaux) à l'aide de longs fils de 3 cm en acier inoxydable isolé au téflon (Ø avec isolation = 50 um). Voir la Figure 2.
- Sertir une extrémité des fils à un système de broches mâles (1,25 mm de hauteur).
- Pour un tableau à 2 canaux avec ~ 0,5 mm ou ~ fils de 0,7 mm de passe à distance de l'électrode perpendiculairement à travers deux microscopie électronique grilles objet porte-alignés verticalement (distance de grilles ~ 5 mm) guidant les fils (0,1654 mm Pitch).
- Mettre broches mâles dans le logement de fiche.
- Mettez l'électrode dans un plat avec une solution électrolytique (par exemple, le chlorure de sodium à 0,9%) et de mesurer l'impédance de chaque canal d'un dispositif de mesure d'impédance respective (par ex., FHC Impédance conditionné Module). Viser à impédances dans la gamme de 100 à 500 kQ.
- Si l'impédance est trop élevée, de livrer à court courant électrique (1 sec, 1 mA) à travers les canaux pour l'abaisser. Vérifiez impédance nouveau.
- Haute résolution tableaux d'enregistrement multicanal sur mesure
Remarque: ce protocole décrit la fabrication de réseaux de surface pour l'enregistrement électrocorticogramme ECOG () des données. Cependant, les conceptions peuvent être adaptées pour répondre aux exigences de la question de recherche respectifs (enregistrements de profondeur, etc.). Réseaux multicanaux haute résolution sont Built par des fils en acier inoxydable isolé au téflon (Ø avec isolation = 50 um) sertie sur un système de points mâle (1,25 mm de hauteur).- Pour réseaux d'électrodes de surface, guidage 18 fils à travers une matrice de deux préparés microscopie électronique grilles objet porte-3 x 6.
- Incluez la disposition 6 x 3 des fils entre les grilles à l'acrylique dentaire et de mettre des épingles dans le boîtier de connecteur.
- Moudre le acrylique dentaire dans un bloc rectangulaire en utilisant meuleuse attaché à une perceuse à main.
- Vérifiez que l'impédance de tous les canaux (voir 1.1.6) est dans la gamme entre 100 - 500 kQ.
- Avant l'implantation (voir étape 2) de surface de la mouture des tableaux pour correspondre à la convexité de la surface corticale.
2. implantation chirurgicale de tableaux dans cortex auditif chez Herbils mongols anesthésié pour une utilisation chronique
- Maintenez l'approbation officielle pour exécuter toutes les étapes expérimentales nécessaires qui sont prévues. Porter Approdes vêtements de protection échéant (manteau, des gants stériles, masque chirurgical, cagoule).
- Utilisez gerbilles mâles adultes Mongolie (Meriones unguiculatus) ou d'autres espèces de rongeurs. Porter des gants et une blouse et toujours utiliser des outils chirurgicaux stérilisés et bien identifiés.
- En cas de gerbilles, anesthésier les animaux par une injection ip d'un mélange de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (5 mg / kg) dilué dans une solution à 0,9% de chlorure de sodium stérile. Maintenir par perfusion de 0,6 ml / h / kg d'une composition de mélange de kétamine: xylazine: chlorure de sodium (0,9%) dans le rapport de 9: 1: 10.
- Placez l'animal sur une plaque de chauffage pour maintenir la température du corps à 37 ° C par un système de rétroaction de la sonde rectale (par exemple, World Precision Instruments).
- Rasez la fourrure couvrant interoccipital, pariétal, et os temporaux. De façon aseptique, préparer le site de l'incision d'un désinfectant efficace (par ex., En alternance ou Betadine Nolvasan et 70% d'alcool gommages 3 fois). Protect yeux contre le dessèchement par pommade oculaire.
- Couper la peau crânienne couvrant la interoccipital, pariétal et frontal os à l'aide d'un scalpel et enlever le périoste en déplaçant doucement un forage sur la surface de l'os.
- Percez des petits trous dans le pariétal controlatéral et os frontal que latéral que possible pour ne pas entraver monter la tête plus tard. Maintenant visser deux vis à os avec un diamètre d'environ 1 mm serré dans les trous. Veiller à ce que la vis pariétale a un bon contact à la dure, car il sera utilisé comme référence commune et le sol, ainsi que l'électrode de retour pour la stimulation électrique plus tard.
- Coller une petite barre d'aluminium en dedans sur les os frontaux et l'utiliser comme tête de fixation lors de l'implantation d'un headholder.
- Enlever la peau couvrant musculus temporal sur un côté à l'aide de ciseaux.
- Coupez la partie dorsale du muscle temporal d'obtenir l'admission à l'os temporal.
- Exposer cortex auditif par craniotomie (~ 3 mm x 4 mm)l'os temporal en utilisant une fraise de dentiste. Identifier l'emplacement du cortex auditif sur la base de la signature typique hémato-encéphalique 18,19 récipient.
- Faire avec précaution une incision de la dure-mère avec un micro scalpel à l'endroit où l'électrode de stimulation est implantée dans le cerveau. Déplacez doucement le long de la surface jusqu'à ce que les larmes de Dura interdisent d'endommager le neuropile sous-jacent.
- Insérez tableau de stimulation sous le contrôle de micromanipulateur. Choisir un angle d'insertion tangentielle pour permettre à la matrice épidurale à être placée sur la région d'intérêt. En fonction de l'angle et la position d'insertion et le site de stimulation visant, examiner attentivement la profondeur d'insertion.
- Placer la matrice d'enregistrement à surface épidurale avec un bon contact de la surface du cerveau qui couvre la région d'intérêt (ici de cortex auditif) par un deuxième micromanipulateur. Veillez à ce que le tableau correspond à la courbure du cortex pour ne pas mettre en retrait la dure-mère.
- Fixer les deux réseaux d'électrodes et leur priseboîtiers avec acrylique dentaire au crâne.
- Couverture exposé surface corticale avec un lubrifiant antiseptique (par exemple, KY-Jelly) et proche craniotomie avec de l'acrylique dentaire (par exemple, Paladur, Heraeus Ulzer). Gardez à l'esprit que la polymérisation peut produire de la chaleur. Utilisez suffisamment de lubrifiant entre neuropile et acrylique dentaire pour éviter tout contact de l'acrylique dentaire et la surface corticale, car cela pourrait causer des dommages tissulaires.
- Maintenant permettent aux animaux de récupérer avant le début de toute procédure ultérieure. Les temps de récupération peuvent différer entre les espèces (par exemple, les gerbilles: ≥ 3 jours, les souris: ≥ 7 jours). Surveiller attentivement l'état de l'animal et de donner un traitement antalgique dans les jours suivants le cas échéant (par exemple, Meloxicam; 1 mg / kg postopératoire et 24 h après la chirurgie).
3. Deux voies navette-BOX est un concepteur Utilisation ICMS stimulation que Conditionné
- Formation navette boîte
- Placez une boîte de navette (custom-construction ou de tout produit commercial, par exemple, E10-E15, Coulbourn Instruments) dans une chambre acoustique et électrique blindé. La boîte contient deux compartiments séparés par un obstacle. Considérez la hauteur de l'obstacle, car il influence le biais comportemental de Go-réponses. Utilisez hauteurs appropriées pour les espèces spécifiques (par exemple, ~ 2 cm pour les souris, ~ 3 cm pour les gerbilles).
- Pour appliquer le pied-choc (Etats-Unis), utilisez un plancher de grille avec une distance entre les barres appropriées pour les espèces visées par l'enquête 12,15. Prenez toujours soin que rien raccourcis électriquement les barres individuelles (excréments, poils, de la crème de l'électrode).
- Après un temps de récupération considérable de l'animal (voir 2.17), connectez le sujet pour le câble d'enregistrement et de stimulation préférence sans utiliser d'anesthésie de courte durée. Essayez de couvrir l'animal avec une serviette et prendre doucement l'animal dans les mains. Découvrez la tête et des connecteurs de l'animal avec l'autre main et de connecter les câbles. Permettre aux animaux de se habituent à la chambre de formation pendant 3 min avant le début de chaque session.
- Par session de formation (1 - 2 par jour) appliquer entre 30 à 90 essais. Utiliser les durées d'essai de jusqu'à 15 sec, et les intervalles entre les essais qui varient aléatoirement entre 25 - 30 sec.
- Pour délivrer ICMS pour la stimulation conditionné aux électrodes de stimulation utiliser un stimulateur multicanal (par exemple, MCS STG2000). Pour obtenir des effets comportementaux sans endommager les tissus du cerveau, appliquer des trains d'impulsions (par exemple, longueur de 300 ms, 100 pps), des impulsions de charge équilibrée biphasique (première cathodique) d'une durée de phase de 200 ps. Répétez trains avec une pause de 700 ms pour une durée de 4 sec (fenêtre d'observation).
- Pour présenter auditive CS utiliser une carte PCI de sortie analogique (par exemple, NI PCI-6733). Programmer ces appareils avec Matlab pour contrôler de manière flexible et matériel déclencher le système de navette-boîte par les lignes de sortie numériques.
- Acheminer le signal de sortie analogique à THe-navette boîte haut-parleurs via un amplificateur audio.
- Conditionnellement dégager le pied-chocs américain à travers un plancher de grille. Pour une qualité optimale d'enregistrement électrophysiologique, générer le choc par un second haut de gamme multicanal stimulateur (MCS STG2000).
- Pour appliquer la formation de détection présente seulement + stimuli CS. Ici, présents essais en blanc sans CS et US intercalés entre les essais de test (~ 10%) pour corriger un comportement de navette biaisé (voir 3.2). Pour une tâche plus exigeante, dresser des animaux pour discriminer entre CS + et CS-stimuli présentés dans la même session dans un ordre aléatoire.
- Classer une variation du compartiment après le déclenchement CS + à l'intérieur d'une fenêtre temporelle critique de 4 s (CR) en réponse à succès. Dans les essais + CS sans CR dans la fenêtre de temps critique (miss), fournir immédiatement un choc de pied doux pour 6 à 10 sec comme stimulus inconditionnel (US).
Remarque: la stimulation répétitive CS + qui chevauche avec les Etats-Unis permettra de réduire l'effort d'apprentissage pour l'un des animauxnd améliorer la vitesse d'apprentissage et de la performance («retard» par rapport à «trace» conditionné, voir la discussion). - Pour les essais CS-, classer un changement de compartiment au sein de la fenêtre de temps critique de réponse d'alarme comme faux, et d'appliquer les États-Unis pour un maximum de 10 secondes immédiatement après cette CR inapproprié. Ne pas appliquer États-Unis après CS lorsque l'animal reste dans le compartiment (pas CR) pendant la fenêtre de temps critique, et de classer ce procès rejet comme correcte.
Remarque: Il est important, au pied de choc US est toujours éteint, lorsque les animaux changent compartiment en réponse à celle (échappement). Utilisez fenêtres plus critiques de temps pour les essais CS-, par exemple, si la stimulation conditionné répétitif sont utilisés, bien que cela va imposer un critère d'apprentissage plus conservatrice car il accorde plus d'efforts par l'animal pour inhiber la CR. - Pour une association efficace de SC et ajuster la force de choc dans une gamme modérée afin d'être aversif mais pas douloureux. Initia optimalel intensité de courant est différente entre les espèces (par exemple, 50 pA pour les souris, 200 pA pour les gerbilles). Par conséquent, s'il vous plaît voir les deux prochaines balles pour de plus amples détails techniques:
- Adapter individuellement la force de choc dans la première session de formation à partir avec des amplitudes modérées (~ 200 pA pour gerbilles). Si la force de choc de pied, il est trop faible, échapper à la gigue et d'association latences entre CS et des États-Unis ne sont pas optimales.
- Toujours faire attention si les animaux commencent à vocaliser et de geler en réponse à la CS. Dans ce footshock force de cas est trop élevé. Cette réponse de peur conditionnée interfère avec l'apprentissage d'évitement.
- Déterminer avec soin les latences de fuite. Augmenter la force du pied choc étape par étape si latences de fuite sont plus de 2 secondes après les 20 premiers essais. Vérifiez après chaque formation si l'animal est sous contrôle de choc, à savoir, il montre échapper latences considérablement en dessous de 2 sec.
Remarque: Toutefois, éviter d'augmenter piedchoquer force trop rapidement, que la stratégie de comportement d'un animal très stressés peut retomber à des réponses de pure évasion. Par conséquent observer de près le comportement et en particulier les latences de réponse tout en ajustant l'amplitude des États-Unis. Pour un exemple, voir la figure 3E. - Si l'animal montre la CR, arrêtez présentation du CS immédiatement. Ceci est crucial pour le renforcement de la réponse d'évitement.
- Si les animaux ont acquis une stratégie d'évitement, à savoir, montrer CR appropriée à tous les CS, varier les paramètres (ICMS amplitude, la durée de phase, taux de redoublement, etc.) pour effectuer des analyses psychométriques. Appliquer paramétrique variation CS dans un mode par blocs avec US jumelage, qui sera toutefois induire apprentissage et d'adaptation.
- Pour éviter cela, commencer par 15 à 30 essais de la formation initiale, puis au hasard intercaler les variations CS sans nous que des essais de test entre les essais de formation régulières avec l'original de CS. U maximumSE 25% des essais de test.
- Après la formation enlever l'animal de la chambre de formation et nettoyez soigneusement la boîte complète avant la formation de l'animal suivant. Essayez d'éviter la formation de différentes espèces à la fois dans la même boîte, que leur odeur naturelle pourrait interférer avec la performance de la formation.
- L'analyse des données de formation
- Enregistrer toutes les modifications de compartiment dans la phase d'habituation.
- Enregistrer toutes les modifications du compartiment pendant la formation et la diviser en hits et les fausses alarmes, échapper les réponses (de justesse et les navettes de retour après une fausse alarme) et des navettes intertrial spontanées (ITS).
- Calculer les taux CR pour CS + et CS comme suit: taux de succès = HITS / nombre de CS + essais; taux de fausses alarmes = fausses alarmes / nombre d'essais CS-.
- Obtenir des taux CR-séance sage. Toutefois, pour évaluer la dynamique d'apprentissage à une résolution temporelle plus élevée, calculer les taux CR à partir de blocs courts du même nombre de CS + et CS-essais (
- Terrain CR taux en fonction de la session ou le bloc d'essai pour évaluer les progrès de la formation et d'apprentissage dynamique.
- Pour la quantification de la sensibilité du comportement indépendant de la polarisation des conditions expérimentales réponse de l'animal, dériver des valeurs d 'basé sur la théorie de la détection du signal 8,9,17.
- D 'Z-scores de l'utilisation de l'analyse de frapper et de fausses alarmes taux correspondants (discrimination d'apprentissage) ou taux de succès et ITS (apprentissage de détection) dérivée de la inverses d'une fonction de distribution normale standardisée et soustraire ces z-scores. Fixer un critère de seuil pour la détection du stimulus de d '= 1,0, ce qui correspond à une intensité de signal d'un écart type au-dessus du bruit. Voir la figure 3 comme exemple.
- En outre déterminer CR- et échapper temps de réaction en réponse à différentes CS en mesurant la période de temps entre le début et CS réponse comportementale (compartiment completchanger).
- Obtenir une analyse plus détaillée du comportement de filmer le comportement navette boîte. Réaliser la synchronisation temporelle entre les systèmes d'enregistrement vidéo et en enregistrant des impulsions de déclenchement de la boîte de navette ou de système de stimulation sur la trace audio de la vidéo. L'analyse vidéo permet d'ânes attention et d'orienter les réponses de l'animal précédant la CR.
4. En Vivo Techniques électrophysiologiques dans l'apprentissage Animaux
- L'enregistrement électrophysiologique pendant la formation
- Pendant la formation, enregistrer des signaux électrophysiologiques (par exemple, avec les ECoG-réseaux décrits) de multiples électrodes monopolarly contre l'électrode de référence commune / sol.
- Signaux d'alimentation de toutes les électrodes dans un amplificateur de headstage soit branché directement ou via un adaptateur court dans les connecteurs de la tête.
- Connectez le headstage à l'amplificateur principal via un harnais de câbles minces, flexibles enveloppépar un métal mesh pour le protéger des dommages causés par les animaux mordre.
Remarque: le stress mécanique dans le faisceau de câbles peut être soulagée par un ressort permettant en outre la libre circulation et la rotation de l'animal dans la boîte. Idéal est l'utilisation d'un pivot orientable et motorisé. Cependant, pour des expériences auditives placent le pivot extérieur de la chambre insonorisée ou le bouclier sain avec mousse pour réduire le bruit haute fréquence auditive produite par son moteur. - Utiliser un préamplificateur dans la zone blindée pour augmenter le rapport signal sur bruit et passe-bande filtrer le signal dans la gamme de fréquences souhaitée.
- Exemples de données à plus de 1 kHz fréquence d'échantillonnage (pour le terrain locale enregistrements potentiels) et au moins 40 kHz (pour les actions enregistrements potentiels) et stocker sur le PC pour l'analyse hors-ligne. Utiliser les paramètres de filtres appropriés pour les deux types (par exemple 2 - 300 Hz pour le potentiel de champ local; 300 - 4000 Hz pour les potentiels d'action).
- Vérifiez soigneusement la qualité de l'enregistrement avant le début de tpleuvoir (pas de bruit ou de mouvement artefacts). Appliquer une FFT-filtre en ligne pour le signal afin de déterminer l'amplitude du bruit à 50 Hz. Si nécessaire vérifiez toutes les connexions entre le connecteur de la tête, les adaptateurs, les headstages, le faisceau de câbles, et les amplificateurs.
- Pour la réduction des artefacts dans les données enregistrées évoqués par stimulation électrique en utilisant une procédure d'interpolation pour reconstruire tous les points de données affectées par l'artefact 1 ms avant jusqu'à environ 5 ms après le début de chaque impulsion. Pour cela, insérez des zéros entre les points de données ne sont pas touchés, et appliquer un filtre FIR symétrique qui minimise les erreurs quadratiques moyennes entre les points interpolés et leurs valeurs idéales (la fonction de interp.m de Matlab). Appliquez cette procédure pour le signal brut, séparément à chaque canal avant une analyse plus approfondie 9.
- Les détails techniques de formation de la boîte de navette parallèle, ICMS, et l'enregistrement
- En général, veiller à ce que les animaux sentent à l'aise dans la boîte surrounding. Permettre à l'animal de se déplacer librement et d'atteindre tous les coins de la boîte. Suffisamment de temps pour habituer un jour avant le premier entraînement (20 min) et avant chaque session (3 min) est bénéfique.
- Après un traitement chirurgical, permettre à l'animal suffisamment de temps pour récupérer, y compris des médicaments si nécessaire (voir ci-dessus 2.17) et commencer à former l'animal que, si les animaux ne présentent pas de signes typiques de souffrir ou de la douleur (les yeux fermés, phénotype léthargique, fourrure miteuse 20).
- Veiller à terre correcte du plancher de la grille. Les boucles de masse entre le système d'enregistrement, la navette-boîte et l'animal doivent être évités. Rez de l'animal uniquement via son électrode de masse commun, laissant le gridfloor à une tension flottante.
- Connectez le stimulateur multicanal (MCS STG2000) au connecteur de la tête de la implantée réseau d'électrodes de stimulation par l'intermédiaire des lignes distinctes du pivotant motorisé.
- Utilisez l'électrode de masse commune de l'enregistrement comme le sol ou l'électrode de retour pour la ICMS, aussi bien.
5. Analyse histologique de positions électrodes
- Suite à l'ensemble complet de formation, pour contrôler la position stable de l'ensemble d'électrodes de stimulation par l'analyse histologique.
- Anesthésier les animaux par une injection ip d'un mélange de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (5 mg / kg) dilué dans 0,9% de chlorure de sodium stérile. Ensuite, appliquez courant cathodique monopolaire (30 uA pour 60 sec) délivré par tous les canaux de stimulation pour obtenir gisement de fer dans le tissu à la position d'implantation 8.
- Suite à cette procédure, sacrifier l'animal par une méthode appropriée et approuvée de l'euthanasie (par exemple injection intrapéritonéale d'une overdose de pentobarbital; 100 mg / kg).
- Retirer le cerveau de l'animal et le congeler immédiatement dans du 2-méthylbutane refroidi à -70 ° C dans de l'azote liquide.
- Maintenant, coupez la région d'intérêt sur un microtome de cryostat en 50 h pmorizontal sections.
- Histologie: Nissl et «bleu de Prusse» -staining
- Pour l'identification des couches corticales traiter chaque seconde tranche avec Nissl-coloration. Tout d'abord, se baigner tranches 5 min dans de sodium 0,05 M tampon acétate de trihydrate (pH 4.0 -4.2).
- Baignez tranches pour les 5 - 10 min dans 5% d'acétate de crésyl violet. Rincer tranches avec de l'eau distillée.
- Baigner tranches de 2 min consécutivement dans 0,05 M de tampon d'acétate de sodium trihydrate (pH 4,0 - 4,2), et dans des solutions de 50%, 70% et 90% d'éthanol, respectivement.
- Baigner deux fois dans l'isopropanol tranches: 96% d'éthanol (2: 1) pendant 5 min chacune.
- Enfin, se baigner dans les tranches Roticlear trois fois pendant 5 min.
- Obtenir emplacement des canaux de stimulation par -staining "Prussian Blue" de toute autre tranche qui rend le dépôt de fer évoquée par de longues courants monophasiques après les expériences visibles.
- Préparer une solution fraîche de 1% hexacyanoferrat de potassium (II) trihydrate K 4[Fe (CN) 6] en mélangeant 2 g de K 4 [Fe (CN) 6] dans 200 ml de HCl à 1%.
- Ajouter 800 ml de 0,1 M de tampon phosphate (pH 7,4).
- Baigner tranches de cerveau pendant 10 minutes avec de l'eau distillée, puis pendant 10 minutes dans la solution de hexacyanoferrat.
- Tranches baigner deux fois pendant 10 minutes dans du tampon phosphate 0,1 M et enfin pendant 5 min dans de l'eau distillée.
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Representative Results
Cette section illustre un exemple représentatif de la navette boîte apprentissage dans une gerbille de Mongolie. Le sujet a été formé pour discriminer le site SIGI entre deux électrodes de stimulation implantée 700 pm les unes des autres dans le cortex auditif (figures 1 et 2). Tableaux de stimulation peuvent être personnalisés dans différentes conceptions spatiales (Figure 1). Ici, la discrimination des deux sites du SGCI a été appris dans les 3 sessions de formation avec la présentation de 30 CS + et CS chacun (figure 3A-C). Ceci est indiqué par une différence significative stable des taux de réponses CR hit et fausse alarme dans 7 séances consécutives de formation (figure 3B). En conséquence, d 'est> 1 à ces séances (figure 3C). Latences de fuite rapide vers les Etats-Unis sont essentiels, car ils reflètent une réponse inconditionnée aversif efficace. Cela peut être garanti par l'adaptation de choc la force du pied de 200 &# 181; A dans 50 uA étapes jusqu'à latences de fuite sont courtes (voir Figure 3 E). En parallèle, les enregistrements électrophysiologiques à partir d'un ECoG-gamme permettent d'évaluer les modèles d'activation spatio-temporelle spécifiques au site évoqués par intracorticale électrique CS + ou CS sur les sites de stimulation séparés par ~ 700 um (figure 4).
Figure 1. électrodes conceptions de tableau. (A) tableau de profondeur (2 x 1) pour microstimulation intracorticale sur deux sites différents dans le cortex. Les électrodes sont disposées à une distance interélectrode de ~ 700 um. D'autres conceptions spatiales peuvent permettre couche dépendant ICMS locale dans différentes profondeurs corticales ou barrettes latérales avec des sites de stimulation le long d'un axe spécifique de tissu cortical, comme par exemple le gradient tonotopique du cortex auditif 8. (B) péridurale surfatableau de CE (3 x 6) pour l'enregistrement de la électrocorticogramme à haute résolution spatiale. Des électrodes ont été fabriqués à partir de fils en acier inoxydable (Ø 256 um) disposés dans une matrice de 3x6 avec une distance inter-de ~ 600 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Positionnement de stimulation et d'enregistrement des électrodes implantées. (A) une paire de deux électrodes de stimulation (voir la figure 1A) S1 (vert foncé) et S2 (vert clair) sont implantés dans la profondeur du champ auditif primaire droit AI près de sa couche d'entrée IV. Pointes d'électrodes peuvent être positionnées le long de l'axe rostrocaudal (électrode de caudale S1, S2 rostrale électrode) avec une distance inter-de ~ 700 um. L'enregistrement 3 x 6 ECoGarray (600 um distance inter) est centré épidurale sur le droit AI. (B) Nissl teinté section horizontale de la région du cerveau respective après la procédure expérimentale montre deux petites lésions (flèches), qui ont été causés par les conseils des deux électrodes de stimulation implantées indiquant leur emplacement dans le cortex temporal. La position peut encore être évaluée par coloration "bleu de Prusse». Ce chiffre a été modifié depuis Deliano et al., 2009. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure navette boîte 3. Les données de la formation et de l'analyse d'un animal individuel. (A) Les schémas sur la droite décrire conception de la tâche pour CS + et CS-essais dans les deux sens navette boîte discriminatisur la tâche et les résultats comportementaux. courbes (B) d'apprentissage tracées en tant que succès et de fausses alarmes taux de sessions de formation individuelles. Des différences significatives entre succès et taux de fausses alarmes sont marquées par des astérisques (test Jeux-Howell, p <0,05). Index (C) Sensibilité d '> 1 (voir 3.2.7) peut être utilisé comme critère de seuil de discrimination succès. (D ) La surveillance des passages spontanées pendant la phase d'habituation montrent généralement une baisse de plus de séances. (E) latences de réponse au cours des essais + CS sont tracées pour les essais individuels sur toutes les sessions de formation. Toutes les réponses avec des latences inférieures à 6 sec correspondent aux réponses de coup réussi. Notez les longues latences de fuite dans la première moitié de la première session. Après avoir augmenté le choc de pied latences force d'échappement ont diminué en dessous de 2 secondes après l'apparition des États-Unis indiquant contrôle de choc suffisante. Histogrammes (en médaillon à droite) de latences de réponse sont bimodal correspondant à frapper réponses (<6 sec) et échapper réponses. (6 - 8 sec) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. enregistrement électrophysiologique parallèle chez un animal d'apprentissage. (A) Un exemple typique d'un potentiel (EEP) évoquée électriquement à partir d'un seul animal en moyenne sur CS + essais en une seule session de formation. Les données ont été enregistrées à partir d'un EcoG-tableau. La figure compare la trace d'EEP avant (noir) et après (rouge) le retrait de simples artefacts impulsion de relance. Détails de la réduction artefact voir la section 4.1.7. Le début du pic négatif de premier plan peut être vu à une latence de 20 ms (N20). (B) Une analyse plus poussée des distributions spatiales de l'amplitude N20 en réponse à un CS + à til Rostral électrode de stimulation (en haut) et à un CS à l'électrode de stimulation caudale (en bas) révéler la résolution spatiale des Etats évoqués tout au long cortex auditif. Les directions anatomiques par rapport à la matrice d'enregistrement sont indiquées par des flèches (d, dorsal; c, caudal; l, latéral, m, r, médiale; rostrale; v, ventral). Ce chiffre a été modifié depuis Deliano et al., 2009. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ce protocole décrit une méthode de ICMS spécifiques au site simultanées et des enregistrements électrophysiologiques multi-canaux à un animal d'apprentissage en utilisant un système boîte de navette contrôlée pied-choc aversif deux sens. Le protocole met l'accent sur des concepts techniques clés pour une telle combinaison et souligne l'importance de la mise à la terre de l'animal uniquement via son électrode de masse commun, laissant le gridfloor à une tension flottante. Ici, auditif navette boîte apprentissage a été appliquée aux gerbilles de Mongolie que les réorganisations en plastique liés à l'apprentissage du cortex auditif chez ces animaux ont été largement étudiés 8,12,14,15,21,22. Néanmoins, le protocole décrit peut être adapté avec des modifications mineures à d'autres espèces de rongeurs, comme par exemple des souris 16. À cet égard, il est important de considérer espèces spécifiques des adaptations concernant les temps de récupération après la chirurgie (2.17), la hauteur de l'obstacle (2.1.1), et la sensibilité pied-choc d'animaux individuels, qui peuvent être HIGhly variable (3.1.3-3.1.6).
Le protocole donne de plus amples explications détaillées sur la façon conceptions d'électrode sur mesure peuvent être utilisés pour stimuler les différents sites dans le tissu cortical menant à des activations de réseau distinctes comme provenant de l'analyse des enregistrements électrophysiologiques multiélectrodes simultanées 8,23. Selon la distance d'électrodes, on peut stimuler différentes régions, par exemple, des cartes topographiques 9. En appliquant couche dépendant ICMS il est possible d'activer de façon différentielle à long terme des projections cortico-corticales conduisant à une activation plus large propagation du cortex par la stimulation dans les couches d'entrée corticales III-IV. Au lieu de cela, la stimulation dans les couches de sortie corticoefferent V-VI a conduit à une activation beaucoup plus focal de circuits de rétroaction intracorticales et corticothalamiques 8. Lors de l'utilisation des tableaux de stimulation avec deux ou plusieurs électrodes de stimulation bipolaire ICMS peut être appliquée à la place de monopolaire ICMS. Un mode de stimulation bipolaire plusrecrute efficacement les fibres neuronales parallèles aux pointes d'électrode, de préférence dans la direction du pôle cathodique par rapport aux fibres non parallèles 24. Une telle configuration de stimulation augmente donc la spécificité directionnelle des activations de réseau neuronal 8 évoqués. Ces manipulations directes particuliers des activités de réseaux d'sublaminar corticaux utilisant ICMS 8,9, ont jusqu'à présent pas été démontré par toute autre technique 3. Comme un exemple de la puissance de cette méthode, un récent rapport démêlé la contribution des circuits de rétroaction cortico-thalamocortical à la perception en utilisant l'apprentissage de détection de stimuli électriques intracorticale 8. Cela démontre que microstimulation corticale directe est une méthode efficace et state-of-the-art à causale entre les activités de liaison dans les circuits neuronaux et le comportement spécifiés 1,3,11,25. Par la stimulation électrique locale des régions corticales correspondant à la carte des caractéristiques topographiques spécifiques, comme pour instAnce une région tonotopique dans le cortex auditif, les sujets peuvent être formés à transfert paradigmes d'apprentissage de comparer les propriétés de percepts induites par la stimulation sensorielle périphérique électrique ou central. Ces expériences pourraient stimuler le développement de stratégies de stimulation pour les neuroprothèses corticales sensorielles 5,9. Ce protocole peut également être utilisé dans la stimulation électrique des autres zones du cerveau, comme par exemple l'aire tegmentale ventrale, pour étudier le traitement de récompense et les bases neuronales de stimulation cérébrale profonde 26. Critique pour microstimulation efficaces sont plusieurs détails techniques qui doivent être considérés sur le fond de la configuration individuelle et des électrodes utilisées. En général, l'influence des paramètres de stimulation, comme l'amplitude de stimulation, la polarité, l'orientation de l'électrode, etc., ont été examinés 11,24. D'importance est le transfert de charge par l'électrode. L'impédance d'une électrode est donc un facteur critique. Par conséquent, vérifiez que til impédance des contacts d'électrode est dans la gamme kQ avant l'implantation.
Plusieurs phénomènes d'apprentissage supplémentaire peuvent être étudiés par une variation appropriée de la conception de base décrite. Par exemple, la discrimination apprentissage contrairement à l'apprentissage de la simple détection peut être étudiée en introduisant au moins deux stimuli qui doivent être associés avec GO et Nogo réponses, respectivement 14,15. De même l'apprentissage de la formation de la catégorie peut être étudiée en combinant une telle discrimination paradigmes 12,21. Navette boîte paradigmes peuvent également être utilisés pour étudier la mémoire de travail, l'inhibition comportementale et la flexibilité cognitive comme par exemple nécessaires pour inversion réussie apprentissage 14,17 ou définir déplacement. La mémoire de travail peut être évaluée en comparant «retard» et «trace» conditionné. Dans «retard» conditionné 27, le CS est présenté tout au long de la fenêtre de temps CS-US critique sans délai entre CS defset et US apparition. Dans «trace» climatisation, d'autre part, il ya un retard de plusieurs secondes après le décalage de la présentation CS transitoire. Contrairement à «retard» conditionné «trace» conditionné accorde une grande charge sur la mémoire de travail et de traitement cortical. Combinant discriminatoires navette boîte paradigmes d'apprentissage avec l'analyse des tendances spatio-temporelles dans le électrocorticogramme en cours, est une méthode appropriée pour identifier les états dynamiques du cortex auditif lié à la discrimination de relance 9, et la catégorie formation 21. Toutefois, comme la formation navette boîte est classiquement utilisé comme tâche d'évitement dans les deux sens, les problèmes conceptuels généraux avec l'apprentissage d'évitement ne sont valables pour l'ensemble de ces conceptions de comportement; à savoir que le comportement d'évitement réussi empêche explicitement l'apparition du stimulus qui sert de renforcement. Renforcement appétit, par exemple par une stimulation électrique directe des circuits de récompense du mésencéphale, ne dispose que d'abeillen appliqué à faire la navette boîte apprentissage dans certaines études 26. En outre, la navette boîte apprentissage a principalement été utilisé avec des espèces de rongeurs et a été rarement appliquée dans de plus grands animaux de laboratoire, comme pour les chiens d'instance.
Outre l'analyse électrophysiologique, navette boîte apprentissage peut être combiné avec une intervention pharmacologique 8,17, techniques de lésion 15, microdialyse 28, ou optogénétique. Surtout la combinaison de notre protocole avec des outils optogénétiques, soit par une infection virale du système de modèle (c.-à-gerbilles de Mongolie), ou par des animaux génétiquement modifiés, comme les souris, permettrait d'augmenter en particulier la spécificité du sous-type cellulaire de l'activation neuronale artificielle, y compris corticale inhibition, qui ne sont pas accessibles à l'aide ICMS 3.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Acknowledgments
Le travail a été soutenu par des subventions de la Deustche Forschungsgemeinschaft DFG et de la Leibniz-Institut de neurobiologie. Nous remercions Maria-Marina Zempeltzi et Kathrin Ohl pour l'assistance technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-insulated stainless steel wire | California Fine Wire | diam. 50µm w/ isolation | |
| Pin connector system | Molex Holding GmbH | 510470200 | 1.25 mm pitch PicoBlade |
| TEM grid Quantifoil | Science Services | EQ225-N27 | |
| Dental acrylic Paladur | Heraeus Kulzer | 64707938 | |
| Hand-held drill OmniDrill35 | WPI | 503599 | |
| Ketamine 500mg/10ml | Ratiopharm GmbH | 7538837 | |
| Rompun 2%, 25ml | Bayer Vital GmbH | 5066.0 | |
| Sodium-Chloride 0.9%, 10ml | B.Braun AG | PRID00000772 | |
| Lubricant KY-Jelly | Johnson & Johnson | ||
| Shuttle-box E10-E15 | Coulbourn Instruments | H10-11M-SC | |
| Stimulus generator MCS STG 2000 | Multichannel Systems | ||
| Plexon Headstage cable 32V-G20 | Plexon Inc. | HSC/32v-G20 | |
| Plexon Headstage 32V-G20 | Plexon Inc. | HST/32v-G20 | |
| PBX preamplifier 32 channels | Plexon Inc. | 32PBX box | |
| Multichannel Acquisition System | Plexon Inc. | MAP 32/HLK2 | |
| Cryostate CM3050 S | Leica Microsystems GmbH | ||
| Signal processing Card Ni-Daq | National Instruments | ||
| Lab StandardTM Stereotaxic Instruments | Stoelting Co. | ||
| Audio attenator g.pah | g.pah Guger technologies | ||
| Cresyl violet acetate | Roth GmbH | 7651.2 | |
| Roticlear | Roth GmbH | A538.1 | |
| Sodium acetate trihydrate | Roth GmbH | 6779.1 | |
| Potassium hexacyanoferrat(II) trihydrate | Roth GmbH | 7974.2 | |
| Di-sodium hydrogen phospahte dihydrate | Merck | 1,065,801,000 | |
| ICM Impedance Conditioning Module | FHC | 55-70-0 | |
| Animal Temperarture Controler | World Precision Instruments | ATC2000 |
References
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