Summary
Shuttle-box apprendimento evitamento è ben consolidata in neuroscienze comportamentali. Questo protocollo descrive come navetta-box di apprendimento nei roditori può essere combinata con microstimolazione site-specific elettrica intracorticale (ICMS) e croniche simultanea nelle registrazioni vivo come strumento per studiare molteplici aspetti dell'apprendimento e della percezione.
Abstract
Apprendimento Shuttle-box evasione è un metodo consolidato in neuroscienze comportamentali e sperimentali messe a punto sono stati tradizionalmente su misura; l'attrezzatura necessaria è ora disponibile da diverse società commerciali. Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata di una navetta-box evitare paradigma di apprendimento nei due sensi nei roditori (gerbilli qui Mongolia; Meriones unguiculatus) in combinazione con microstimolazione site-specific elettrica intracorticale (ICMS) e simultanee elettrofisiologici vivo registrazioni croniche in. Il protocollo dettagliato è applicabile per studiare molteplici aspetti del comportamento di apprendimento e la percezione di diverse specie di roditori.
ICMS site-specific dei circuiti corticali uditive come stimoli condizionati qui viene utilizzato come strumento per testare la rilevanza percettiva di specifici afferenti, efferenti e connessioni intracorticali. Pattern di attivazione distinti possono essere evocati da utilizzando diversi arr elettrodi di stimolazioneays per, ICMS strato dipendenti locali o siti distanti ICMS. Utilizzando analisi comportamentale di rilevamento del segnale si può determinare quale strategia stimolazione è più efficace per suscitare un segnale comportamentale rilevabile e saliente. Inoltre, multicanale registrazioni parallele utilizzando diversi modelli di elettrodi (elettrodi di superficie, elettrodi di profondità, etc.) consentono di indagare osservabili neuronali nel corso tempo di tali processi di apprendimento. Esso verrà discusso come i cambiamenti del design comportamentale può aumentare la complessità cognitiva (ad esempio il rilevamento, la discriminazione, l'apprendimento di inversione).
Introduction
Un obiettivo fondamentale di neuroscienza comportamentale è di stabilire legami specifici tra neuronali proprietà strutturali e funzionali, l'apprendimento, e la percezione. Attività neurale associata con la percezione e l'apprendimento può essere studiato dalla registrazione elettrofisiologica dei potenziali d'azione e potenziali di campo locale in diverse strutture cerebrali in più siti. Mentre registrazioni elettrofisiologiche forniscono associazioni correlativi tra l'attività e il comportamento neuronale, microstimolazione diretta elettrica intracorticale (ICMS) da oltre un secolo è stato il metodo più diretto per i rapporti di prova causali delle popolazioni di neuroni eccitati e dei loro effetti sul comportamento e percettivi 1 - 3. Molti studi hanno dimostrato che gli animali sono in grado di fare uso di varie proprietà spaziali e temporali di stimoli elettrici in compiti percettivi seconda del sito di stimolazione entro per esempio retinotopica 4, tonotopic 5, o somatotopica 6 regioni della corteccia. Propagazione di attività elettricamente evocata nella corteccia è determinato principalmente dalla disposizione delle fibre assonali e la loro connettività sinaptica distribuito 2 che, nella corteccia, è chiaramente layer-7 dipendenti. L'attivazione polisinaptici risultante evocata dalla ICMS è ormai molto più diffuso di effetti diretti della 2,8,9 campo elettrico. Questo spiega perché le soglie di effetti percettivi indotte da microstimolazione intracorticale possono essere fortemente dipendente dal livello di 8,10,11 e il sito-dipendente 9. Uno studio recente ha dimostrato in dettaglio che la stimolazione di strati superiori ha prodotto più diffusa attivazione di circuiti corticocorticali in strati principalmente supragranular, mentre la stimolazione di strati più profondi della corteccia risultato in una focale, corticoefferent ricorrente intracolumnar attivazione. Esperimenti comportamentali parallele rivelato che quest'ultimo ha di gran lunga inferiore thr rilevamento percettivoesholds 8. Pertanto, il vantaggio di site-specific ICMS stimoli come condizionato è stato sfruttato in combinazione con registrazioni elettrofisiologiche di mettere in relazione causale specifiche attivazioni circuiti corticali 8 a misure comportamentali di apprendimento e percezione nella shuttle-box.
La navetta-box paradigma a due vie è un apparecchio da laboratorio consolidata per studiare elusione apprendimento 12. Una navetta-scatola è composta da 2 vani separati da un ostacolo o di porta. Un stimolo condizionato (CS) che è rappresentato da un segnale adatto come una luce o il suono, è potenzialmente seguito da uno stimolo incondizionato avversivo (US), come ad esempio uno shock piedi su un pavimento griglia metallica. I soggetti possono imparare ad evitare USA da spola da un compartimento shuttle-box all'altra in risposta al CS. Apprendimento Shuttle-box comporta una sequenza di fasi di apprendimento distinguibili 13,14: In primo luogo,soggetti imparano a prevedere gli Stati Uniti dal CS dal condizionamento classico e di fuggire dagli Stati Uniti dal condizionamento strumentale, come gli Stati Uniti è terminata sulla spola. In una fase successiva, i soggetti apprendono evitare USA complessivamente da spola in risposta alla prima CS US insorgenza (reazione evitamento). In generale, l'apprendimento di navetta-box coinvolge condizionamento classico, condizionamento strumentale, così come un comportamento goal-directed seconda fase 14 di apprendimento.
La procedura di shuttle-box può essere installato facilmente e in generale produce un comportamento affidabile dopo alcune sedute di allenamento giornaliere di 15 - 17. Oltre alla semplice evasione condizionata (rilevamento), lo shuttle-box può essere ulteriormente utilizzato per studiare la discriminazione stimolo impiegando paradigmi go / Nogo. Qui, gli animali sono addestrati per evitare USA da una risposta condizionata (CR) (go comportamento; navetta nel vano opposta) in risposta ad un <strong> go-stimolo (CS +) e da comportamenti nogo (rimanere nel vano corrente, senza CR) in risposta ad una di Nogo-stimolo (CS) microstimolazione parallelo e la registrazione di attività neurale con gli array multielettrodico alta densità permetterà di studiare. i meccanismi fisiologici alla base di apprendimento di successo. Numerosi dettagli tecnici che sono fondamentali per le combinazioni di successo della formazione di navetta-box, ICMS e elettrofisiologia parallelo, saranno discussi.
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Protocol
Tutti gli esperimenti presentati in questo lavoro sono state condotte in accordo con gli standard etici definiti dalla legge tedesca per la protezione degli animali da esperimento. Gli esperimenti sono stati approvati dal comitato etico dello stato della Sassonia-Anhalt.
1. Su misura multicanale Electrode Array per microstimolazione e registrazione
- Matrice microstimolazione su misura
- Per la consegna di ICMS, preparare elettrodi di stimolazione nella progettazione dello spazio desiderato (array laterale qui di 2 canali) con fili a 3 cm di lunghezza Teflon isolati in acciaio inox (Ø con isolamento = 50 micron). Vedere la Figura 2.
- Crimpare un'estremità dei fili ad un sistema perno maschio (mm passo 1.25).
- Per una matrice a 2 canali con ~ 0,5 mm o 0,7 millimetri ~ fili passa distanza elettrodo perpendicolarmente attraverso due griglie di microscopia elettronica Porta oggetti allineati verticalmente (distanza di griglie ~ 5 mm) guida i fili (mm passo 0,1654).
- Mettete pin maschio nel corpo del connettore.
- Mettere l'elettrodo in un piatto con la soluzione elettrolitica (ad esempio, 0,9% cloruro di sodio) e misurare l'impedenza di ciascun canale con un rispettivo dispositivo di misura di impedenza (ad es., FHC impedenza condizionata Module). Mirare a impedenze nel 100-500 gamma k.
- Se l'impedenza è troppo alta, fornire corrente elettrica a breve (1 sec, 1 mA) attraverso i canali per abbassarlo. Controllare l'impedenza di nuovo.
- Ad alta risoluzione array di registrazione multicanale su misura
Nota: questo protocollo descrive la produzione di array di superficie per la registrazione di dati electrocorticogram (ECOG). Tuttavia, i disegni possono essere personalizzati per soddisfare le esigenze della rispettiva domanda di ricerca (registrazioni di profondità, ecc.) Array multicanale ad alta risoluzione sono built da cavi in acciaio inox teflon isolamento (Ø con isolamento = 50 micron) aggraffato ad un sistema pin maschio (mm passo 1.25).- Per schiere di elettrodi di superficie, 18 guida i fili attraverso una matrice 3 x 6 di due griglie di microscopia elettronica oggetto porta-preparati.
- Incorporare il 6 x 3 disposizione dei fili tra le griglie con acrilico dentale e mettere perni nel corpo del connettore.
- Macinare l'acrilico dentale in un blocco rettangolare utilizzando smerigliatrice attaccato ad un trapano tenuto in mano.
- Verificare che l'impedenza di tutti i canali (vedi 1.1.6) è nel range tra i 100 - 500 k.
- Prima dell'impianto (vedi punto 2) di superficie frantumazione delle matrici per abbinare la convessità della superficie corticale.
2. impianto chirurgico di array in Auditory Cortex in Herbils mongolo anestetizzati per cronica di utilizzo
- Tenere l'approvazione ufficiale per eseguire tutti i passi necessari sperimentali che sono in programma. Indossare approindumenti protettivi oppor- (cappotto, guanti sterili, mascherina chirurgica, cappa).
- Utilizzare adulti gerbilli maschi della Mongolia (Meriones unguiculatus) o qualsiasi altra specie di roditori. Indossare guanti protettivi e cappotto e sempre utilizzare strumenti chirurgici sterilizzati e ben identificati.
- In caso di gerbilli, anestetizzare animali con una iniezione ip di una miscela di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg) diluito in soluzione sterile di cloruro di sodio allo 0,9%. Mantenere per infusione di 0,6 ml / h / kg di una composizione miscela di ketamina: xilazina: sodio cloruro (0,9%) nel rapporto di 9: 1: 10.
- Posizionare animale su una piastra di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea a 37 ° C da un sistema di feedback sonda rettale (ad esempio, World Precision Instruments).
- Shave pelliccia che copre interoccipital, parietali, temporali e le ossa. Asetticamente preparare il sito di incisione con un disinfettante efficace (ad es., Alternando Betadine o clorexidina e 70% di alcool frega 3 volte). Procchi otect contro asciugatura pomata occhio.
- Tagliare la pelle del cranio che copre il interoccipital, parietali e frontali ossa utilizzando un bisturi e rimuovere periosteum muovendo delicatamente un trapano sulla superficie ossea.
- Piccole perforazioni nel parietale controlaterale e l'osso frontale come laterale possibile per non ostacolare montare la testa in seguito. Ora avvitare due viti ossee con un diametro di circa 1 mm saldamente nei fori. Assicurarsi che la vite parietale ha buon contatto della dura, come sarà utilizzata come riferimento comune e la terra, così come elettrodo di ritorno per la stimolazione elettrica in seguito.
- Colla un piccolo bar di alluminio medialmente sulle ossa frontali e usarlo come fissaggio testa durante l'impianto da un headholder.
- Togliere la pelle che copre le Musculus temporale su un lato con le forbici.
- Tagliare la parte dorsale del muscolo temporale per ottenere l'ammissione alla osso temporale.
- Esporre corteccia uditiva da craniotomia (~ 3 mm x 4 mm) didell'osso temporale utilizzando un trapano dentistico. Identificare la posizione della corteccia uditiva in base alla tipica firma ematoencefalica vasi 18,19.
- Con cura un'incisione della dura con un micro bisturi nella posizione in cui l'elettrodo di stimolazione è impiantato nel cervello. Spostare delicatamente lungo la superficie fino alle lacrime della dura di vietare danni al neuropilo sottostante.
- Inserire matrice di stimolazione sotto controllo micromanipolatore. Scegliere un angolo di inserimento tangente per consentire l'array epidurale per essere posizionato sopra la regione di interesse. A seconda angolo di inserimento e la posizione e il sito mirato di stimolazione, considerare attentamente la profondità di inserimento.
- Posizionare la matrice di registrazione superficie epidurale con buon contatto alla superficie del cervello che copre la regione di interesse (corteccia qui uditiva) da una seconda micromanipolatore. Fare attenzione che la matrice corrisponde alla curvatura della corteccia di non rientrare la dura.
- Fissare entrambi gli array di elettrodi e la loro spinacustodie con acrilico dentale al cranio.
- Copertura esposta superficie corticale con un lubrificante antisettico (ad esempio, KY-Jelly) e vicino craniotomia con acrilico dentale (ad esempio, Paladur, Heraeus Ulzer). Tenete a mente che la polimerizzazione può produrre calore. Utilizzare lubrificante sufficiente tra neuropilo e acrilico dentale per evitare qualsiasi contatto dell'acrilico dentale e la superficie corticale, in quanto ciò potrebbe causare danni ai tessuti.
- Ora consentono agli animali di recuperare prima dell'inizio di qualsiasi altro procedimento. I tempi di recupero possono differire tra le specie (ad esempio, gerbilli: ≥ 3 giorni, i topi: ≥ 7 giorni). Monitorare attentamente lo stato dell'animale e un trattamento analgesico nei giorni successivi se applicabile (ad esempio, meloxicam, 1 mg / kg e postchirurgico 24 ore dopo l'intervento).
3. Due vie Shuttle-box disegni utilizzando ICMS stimolo come Condizionata
- Formazione Shuttle-box
- Posizionare una navetta-box (custom-build o qualsiasi prodotto commerciale, ad esempio, E10-E15, Coulbourn Instruments) in una camera acusticamente ed elettricamente schermato. La scatola contiene due compartimenti separati da una transenna. Considerare l'altezza del ostacolo in quanto influenza la polarizzazione del comportamento di go-risposte. Utilizzare altezze adeguate per le specie specifiche (ad esempio, ~ 2 cm per topi, ~ 3 cm per gerbilli).
- Per applicare il piede-shock (US), utilizzare un pavimento griglia con una distanza tra le barre appropriate per le specie in esame 12,15. Fare sempre attenzione che nulla Scorciatoie elettricamente le singole barre (feci, capelli, crema elettrodo).
- Dopo un tempo considerevole recupero dell'animale (vedi 2.17), collegare il soggetto al cavo registrazione e stimolazione preferibilmente senza impiegare anestesia breve termine. Cercare di coprire l'animale con un asciugamano e prendere delicatamente l'animale in mano. Scoprire la testa e connettori dell'animale con l'altra mano e collegare i cavi. Lasciare gli animali a abituano alla camera di formazione per 3 minuti prima dell'inizio di ogni sessione.
- Per allenamento (1-2 al giorno) si applicano tra 30-90 prove. Durate uso di prova di fino a 15 sec, e gli intervalli tra le prove che variano in modo casuale tra il 25 - 30 sec.
- Per la consegna di ICMS per la stimolazione condizionato agli elettrodi di stimolazione utilizzare uno stimolatore multicanale (ad esempio, MCS STG2000). Per ottenere effetti comportamentali senza danneggiare il tessuto cerebrale, applicare treni di impulsi (ad esempio, 300 ms lunghezza, 100 pps) di impulsi, carica-equilibrato bifasica (catodica prima) con una durata della fase di 200 ms. Ripetere treni con una pausa di 700 ms per una durata di 4 sec (finestra di osservazione).
- Per la presentazione uditiva CS utilizzare una scheda PCI uscita analogica (ad esempio, NI PCI-6733). Programmare questi dispositivi con Matlab per controllare in modo flessibile e hardware innescare il sistema di navetta-box attraverso le linee di uscita digitali.
- Far passare il segnale di uscita analogico a the navetta-box altoparlanti tramite un amplificatore audio.
- Condizionale consegnare il piede-shock degli Stati Uniti attraverso un piano griglia. Per ottimale qualità di registrazione elettrofisiologica, generare la scossa da una seconda fascia alta multicanale stimolatore (MCS STG2000).
- Per applicare la formazione di rilevamento presenti solo gli stimoli CS +. Qui, presenti le prove in bianco, senza CS e US intercalati tra le prove di laboratorio (~ 10%) per correggere un comportamento navetta di parte (vedi 3.2). Per un compito più impegnativo, addestrare gli animali per discriminare tra CS + e CS-stimoli presentati nella stessa sessione in ordine casuale.
- Classificare un cambiamento vano dall'insorgenza CS + entro una finestra di tempo critico di 4 sec (CR) come risposta positiva. Negli studi + CS senza CR nella finestra temporale critica (miss), consegnare subito una scossa piede delicato per 6-10 secondi come stimolo incondizionato (US).
Nota: ripetitiva stimolazione CS + che si sovrappone con gli Stati Uniti ridurrà lo sforzo di apprendimento per gli animali unnd migliorare la velocità di apprendimento e le prestazioni ('ritardo' rispetto condizionata 'traccia', vedi la discussione). - Per gli studi CS, classificare un cambiamento vano all'interno della finestra di tempo critico di risposta come falso allarme, e si applicano gli Stati Uniti per un massimo di 10 secondi subito dopo CR inadeguato. Non applicare degli Stati Uniti dopo CS quando l'animale rimane nel vano (senza CR) durante la finestra di tempo critico, e classificare questo processo come corretto rifiuto.
Nota: È importante sottolineare che il piede scossa Stati Uniti è sempre spenta, quando gli animali cambiano comparto in risposta ad essa (la fuga). Utilizzare finestre temporali più critici per le prove CS, ad esempio, se sono utilizzati stimolazione ripetitiva condizionata, anche se questo imporrà un criterio di apprendimento più conservatore in quanto offre maggiore sforzo da parte dell'animale di inibire la CR. - Per un efficace associazione di CS e US regolare la forza d'urto in una gamma moderata per essere repulsivo ma non dolorosa. Initia Ottimaleforza attuale l differisce tra le specie (ad esempio, 50 μA per i topi, 200 μA per gerbilli). Pertanto, si prega di consultare i prossimi due proiettili per ulteriori dettagli tecnici:
- Adattare individualmente la forza d'urto nella prima sessione di allenamento inizia con ampiezze lievi (~ 200 μA per gerbilli). Se la forza d'urto del piede è troppo basso, la fuga jitter latenze e associazione tra CS e gli Stati Uniti non è ottimale.
- Prestare sempre attenzione se gli animali iniziano a vocalizzare e di congelare, in risposta al CS. In questa forza footshock caso è troppo alto. Questa risposta di paura condizionata interferisce con l'apprendimento evitamento.
- Determinare attentamente le latenze di fuga. Aumentare la forza d'urto del piede passo-passo se latenze di fuga sono più di 2 secondi dopo le prime 20 prove. Controllare dopo ogni allenamento se l'animale è sotto controllo shock, vale a dire, si vede sfuggire latenze notevolmente al di sotto di 2 sec.
Nota: Tuttavia, evitare di aumentare il piedescossa forza troppo in fretta, come la strategia comportamentale di un animale molto stressato può ripiegare a risposte di fuga puri. Pertanto strettamente osservare il comportamento e in particolare le latenze di risposta mentre si regola l'ampiezza degli USA. Per un esempio vedere la Figura 3E. - Se l'animale mostra la CR, interrompere immediatamente la presentazione del CS. Questo è fondamentale per il rafforzamento della risposta di evitamento.
- Se gli animali hanno acquisito una strategia di evitamento, vale a dire, mostrare a tutti adeguato CR CS, variare parametri (ICMS ampiezza, durata della fase, frequenza di ripetizione ecc) per eseguire le analisi psicometriche. Applicare parametrica variazione CS in modo a blocchi con gli Stati Uniti l'associazione, che però indurrà apprendimento e di adattamento.
- Per evitare questo, inizia con 15 a 30 prove della formazione originale, e quindi in modo casuale intervallare le variazioni CS senza Uniti come prove di laboratorio, tra le prove di formazione regolari con l'originale del CS. Al massimo use 25% di prove di laboratorio.
- Dopo la formazione rimuovere l'animale dalla camera di formazione e pulire accuratamente la scatola completa prima dell'allenamento della prossima animali. Cercate di evitare la formazione di diverse specie in un momento nella stessa scatola, come il loro odore naturale potrebbe interferire con le prestazioni di formazione.
- Analisi dei dati di allenamento
- Registrare tutte le modifiche vano in fase di assuefazione.
- Registrare tutti i cambiamenti vano durante l'allenamento e dividerlo in colpi e falsi allarmi, la fuga risposte (mancate e navette indietro dopo un falso allarme) e navette tra le prove spontanee (ITS).
- Calcolare i tassi di CR per CS + e CS come segue: i tassi di successo = hits / numero di + prove CS; falsi allarmi = falsi allarmi / numero di prove CS.
- Ottenere i tassi di CR session-saggio. Tuttavia, per valutare le dinamiche di apprendimento ad una risoluzione temporale superiore, calcolare i tassi di CR da blocchi più corti dello stesso numero di CS + e sperimentazioni CS- (
- Plot CR tariffe in funzione della sessione o blocco di prova per valutare le dinamiche di formazione di progresso e di apprendimento.
- Per la quantificazione della sensibilità comportamentale indipendente dalle condizioni sperimentali di polarizzazione della risposta dell'animale, ricavare valori d 'basati sulla teoria rilevamento del segnale 8,9,17.
- Per d 'uso analisi Z-score di corrispondenti tassi di successo e falso-allarme (learning discriminazione) o colpiti prezzi e ITS (apprendimento rilevazione) derivati dai inverse di una funzione di distribuzione normale standardizzata e sottrarre queste z-score. Impostare un criterio di soglia per il rilevamento di stimolo d '= 1,0, che corrisponde ad un dosaggio di una deviazione standard sopra il rumore del segnale. Vedere la Figura 3 come esempio.
- Inoltre determinare CR- e fuggire tempi di reazione in risposta a diverse CS misurando il periodo di tempo tra CS insorgenza e risposta comportamentale (vano completocambiare).
- Ottenere un'analisi più dettagliata del comportamento dal videoregistrando il comportamento shuttle-box. Ottenere la sincronizzazione temporale tra sistemi video e di registrazione registrando impulsi di comando dalla navetta-box o di un sistema di stimolazione sulla traccia audio del video. Analisi video permette di attenzione asini e di orientamento risposte dell'animale precedente CR.
4. Tecniche Vivo elettrofisiologici in Animali Learning
- Registrazione elettrofisiologica durante l'allenamento
- Durante l'addestramento, registrare i segnali elettrofisiologici (ad esempio, con i ECOG-array descritti) da elettrodi multipli monopolarly contro l'elettrodo di riferimento comune / terra.
- Segnali prime di tutti gli elettrodi in un amplificatore headstage o collegati direttamente o tramite un adattatore di breve nei connettori di testa.
- Collegare headstage all'amplificatore principale attraverso un cablaggio di sottili cavi flessibili avvoltoda una maglia metallica per proteggerlo da danni causati da morsi di animali.
Nota: lo stress meccanico nel cablaggio può essere alleviato da una molla che permette ulteriormente la libera circolazione e la rotazione degli animali nella casella. Ideale è l'utilizzo di una parte girevole e girevole motorizzato. Tuttavia, per gli esperimenti uditivi posizionare il girevole all'esterno della camera insonorizzata o schermo sano con schiuma per ridurre il rumore ad alta frequenza acustica prodotta dal suo motore. - Utilizzare un preamplificatore nella casella schermato per aumentare il rapporto segnale-rumore e filtro passa-banda del segnale nella gamma di frequenza desiderata.
- Dati campione a più di 1 kHz frequenza di campionamento (per il campo locale potenziali registrazioni) e almeno 40 kHz (per azione potenziali registrazioni) e conservare al PC per l'analisi offline. Utilizzare le impostazioni dei filtri adatti per entrambi i tipi (ad esempio 2 - 300 Hz per il potenziale campo locale, 300 - 4000 Hz per potenziali d'azione).
- Controllare attentamente la qualità della registrazione prima dell'inizio della tPiove (nessun rumore o artefatti di movimento). Applicare un FFT-filtro in linea per il segnale per determinare l'ampiezza del rumore 50 Hz. Se necessario ricontrollare tutti i collegamenti tra il connettore testa, gli adattatori, i headstages, il cablaggio, e gli amplificatori.
- Per la riduzione di artefatti nei dati registrati evocati da stimolazione elettrica utilizzare un procedimento di interpolazione per ricostruire tutti i punti dati interessati dal manufatto 1 ms prima fino ~ 5 ms dopo l'inizio di ciascun impulso. Per questo, inserire zeri tra i punti dati inalterati, e applicare un filtro FIR-simmetrica che riduce al minimo gli errori medi quadrati tra i punti interpolati ed i loro valori ideali (funzione interp.m di Matlab). Applicare questa procedura per il segnale grezzo, separatamente ciascun canale prima di ulteriori analisi 9.
- Dettagli tecnici di formazione navetta-box parallelo, ICMS, e la registrazione
- In generale, in modo che gli animali sentirsi a proprio agio nella surroundi scatolang. Permettere agli animali di muoversi liberamente e raggiungere tutti gli angoli della scatola. Tempo sufficiente per abituare un giorno prima del primo allenamento (20 min) e prima di ogni sessione (3 min) è benefico.
- Dopo ogni trattamento chirurgico, lasciare il tempo sufficiente animale per recuperare compresi i farmaci, se necessario (vedi sopra 2.17) e iniziare ad allenarsi solo l'animale, se gli animali non mostrano alcun segno tipici di soffrire o di dolore (occhi chiusi, fenotipo letargica, pelliccia trasandato 20).
- Garantire la corretta messa a terra del piano della griglia. Loop di massa tra il sistema di registrazione, shuttle-box e l'animale deve essere evitato. A terra l'animale solo tramite l'elettrodo di un terreno comune, lasciando il gridfloor ad una tensione fluttuante.
- Collegare lo stimolatore multicanale (MCS STG2000) al connettore capo della matrice di elettrodi di stimolazione impiantato attraverso linee separate della girevole motorizzato.
- Utilizzare l'elettrodo di terreno comune della registrazione come terra o elettrodo di ritorno per l'ICMS, pure.
5. Analisi istologica di elettrodi posizioni
- In seguito il set completo di formazione, il controllo per la posizione stabile della matrice di elettrodi di stimolazione mediante analisi istologica.
- Anaesthetize animali con una iniezione ip di una miscela di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg) diluito in 0,9% sterile di sodio cloruro. Quindi applicare corrente catodica monopolare (30 μA per 60 sec) erogata attraverso tutti i canali di stimolazione per ottenere deposito di ferro nel tessuto in corrispondenza della posizione di fissaggio 8.
- Seguendo questa procedura, sacrificare l'animale in modo appropriato e approvato dell'eutanasia (ad esempio iniezione intraperitoneale di una overdose di pentobarbital; 100 mg / kg).
- Rimuovere il cervello dell'animale immediatamente e congelare in 2-metilbutano raffreddata a -70 ° C in azoto liquido.
- Ora tagliare la regione di interesse su un microtomo criostato in 50 micron hsezioni ORIZZONTALI.
- Istologia: -staining Nissl e "Blu di Prussia"
- Per l'identificazione di strati corticali trattare ogni secondo fetta con Nissl macchia. Innanzitutto, il bagno fette 5 min in 0,05 M tampone sodio acetato triidrato (pH 4.0 -4.2).
- Bagnare le fette per 5 - 10 minuti a 5% di acetato violetto cresolo. Sciacquare fette con acqua distillata.
- Bagnare fette per 2 min consecutivamente 0,05 M tampone sodio acetato triidrato (pH 4.0 - 4.2), e in soluzioni di 50%, 70% e il 90% di etanolo, rispettivamente.
- Bagnare le fette due volte in isopropanolo: 96% etanolo (2: 1) per 5 minuti ciascuno.
- Infine, il bagno fette in Roticlear tre volte per 5 min.
- Ottenere posizione dei canali di stimolazione da "Blu di Prussia" -staining di ogni altra sezione che rende la deposizione di ferro evocata da lunghe correnti monofasici dopo gli esperimenti visibili.
- Preparare una soluzione fresca di 1% hexacyanoferrat potassio (II) triidrato K 4[Fe (CN) 6] miscelando 2 g di K 4 [Fe (CN) 6] in 200 ml di HCl 1%.
- Aggiungere 800 ml di tampone fosfato 0,1 M (pH 7,4).
- Bagnare fette di cervello per 10 minuti con acqua distillata, e poi per 10 min nella soluzione hexacyanoferrat.
- Bagnare fette due volte per 10 min in tampone fosfato 0,1 M e infine per 5 minuti in acqua distillata.
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Representative Results
Questa sezione illustra un esempio rappresentativo di apprendimento shuttle-box in un gerbillo mongolo. Il soggetto è stato addestrato per discriminare il sito ICMS tra due elettrodi di stimolazione impiantato 700 micron uno dall'altro nella corteccia uditiva (figure 1 e 2). Array di stimolazione possono essere personalizzati in diversi modelli spaziali (Figura 1). Qui, la discriminazione dei due siti ICMS è appreso entro 3 allenamenti con la presentazione di 30 CS + e CS-ciascuno (figura 3A-C). Questo è indicato da una differenza significativa stabile dei tassi di CR hit e falso allarme risposte durante 7 allenamenti consecutivi (Figura 3B). Di conseguenza, d 'è> 1 in queste sessioni (Figura 3C). Latenze di fuga rapida verso gli Stati Uniti sono fondamentali, in quanto riflettono una efficace risposta incondizionata avversivo. Questo può essere garantito adattando piedi forza d'urto da 200 &# 181; A 50 μA passi fino latenze di fuga sono brevi (vedi Figura 3 E). In parallelo, registrazioni elettrofisiologiche da un ECoG-array permettono di valutare i pattern di attivazione spaziotemporale site-specific evocati da intracortical elettrica CS + o CS in siti stimolazione separati da ~ 700 micron (Figura 4).
Figura 1. disegni matrice di elettrodi. (A) di matrice Profondità (2 x 1) per microstimolazione intracorticale in due siti diversi nella corteccia. Gli elettrodi sono disposti ad una distanza interelettrodica di ~ 700 micron. Altri disegni spaziali possono consentire ICMS locale strato-dipendente in diverse profondità corticali o array laterali con siti di stimolazione lungo un asse specifico di tessuto corticale, come per esempio il gradiente tonotopic della corteccia uditiva 8. (B) epidurale superfmatrice ce (3 x 6) per la registrazione del electrocorticogram ad alta risoluzione spaziale. Gli elettrodi sono state fatte da filo di acciaio inossidabile (Ø 256 micron) disposti in una matrice 3x6 con una distanza interelettrodica di ~ 600 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Posizionamento di stimolazione e registrazione elettrodi impiantati. (A) Una coppia di due elettrodi di stimolazione (vedere Figura 1A) S1 (verde scuro) e S2 (verde chiaro) vengono impiantati nella profondità del diritto campo uditiva primaria AI vicino al suo livello di input IV. Punte degli elettrodi possono essere posizionati lungo l'asse rostrocaudale (elettrodo caudale S1, S2 rostrale elettrodo) con una distanza interelettrodica di ~ 700 micron. La registrazione 3 x 6 ECoGarray (600 micron distanza interelettrodica) è centrata epidurale sul diritto di AI. (B) Nissl macchiato sezione orizzontale della rispettiva regione del cervello dopo procedura sperimentale mostra due piccole lesioni (frecce), che sono stati causati dalle punte dei due elettrodi di stimolazione impiantati indicando la loro posizione all'interno della corteccia temporale. La posizione può essere ulteriormente valutata dalla "Blu di Prussia" colorazione. Questa cifra è stata modificata da Deliano et al., 2009. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Navetta casella dati formazione e l'analisi di un singolo animale. (A) Gli schemi di destra descrivere progettazione compito per CS + e CS-prove in un due vie shuttle-box discriminatisul compito e risultati comportamentali. curve (B) Learning tracciati come hit e falsi allarmi tassi di allenamenti individuali. Differenze significative tra successo e falsi allarmi sono contrassegnati da un asterisco (test di Games-Howell, p <0,05). (C) Sensibilità indice d '> 1 (vedi 3.2.7) può essere utilizzato come criterio di soglia per la discriminazione di successo. (D ) Il monitoraggio degli incroci spontanei durante la fase di abituazione mostrano generalmente una diminuzione sulle sessioni. (E) latenze di risposta durante gli studi CS + sono tracciate per le prove individuali su tutte le sessioni di allenamento. Tutte le risposte con latenze inferiori a 6 secondi corrispondono a risposte colpo andato a segno. Notare le latenze di fuga più lunghi nella prima metà della prima sessione. Dopo aver aumentato la scossa piede latenze di fuga forza diminuite di sotto del 2 secondi dopo US esordio indicando un sufficiente controllo shock. Istogrammi (riquadro a destra) di latenze di risposta sono bimodal corrispondente a colpire le risposte (<6 sec) e fuggire le risposte. (6-8 sec) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. registrazione elettrofisiologica parallela in un animale di apprendimento. (A) Tipico esempio di potenziale evocato elettricamente (EEP) da un singolo animale attraverso media + prove CS in una singola sessione di allenamento. I dati sono stati registrati da un EcoG-array. Il dato si confronta la traccia EEP prima (nero) e dopo (rosso) la rimozione di singoli manufatti di stimolo di impulsi. Dettagli di riduzione degli artefatti vedere paragrafo 4.1.7. I primi prominente picco negativo può essere visto in una latenza di 20 ms (N20). (B) Ulteriori analisi delle distribuzioni spaziali di ampiezza N20 in risposta ad un CS + ategli rostrale elettrodo di stimolazione (in alto) e ad un CS- all'elettrodo di stimolazione caudale (basso) rivelare la risoluzione spaziale di stati evocati tutta corteccia uditiva. Indicazioni anatomiche relative alla matrice di registrazione sono indicati da frecce (d, dorsale, c, caudale, l, laterale; m, mediale; r, rostrale, v, ventrale). Questa cifra è stata modificata da Deliano et al., 2009. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive un metodo di ICMS simultanei site-specific e registrazioni elettrofisiologiche multicanale in un animale di apprendimento utilizzando un avversivo piede-shock sistema di navetta-box controllato a doppio senso. Il protocollo sottolinea concetti tecnici chiave per tale combinazione e sottolinea l'importanza della messa a terra della animale solo tramite l'elettrodo di un terreno comune, lasciando il gridfloor ad una tensione fluttuante. Qui, uditivo apprendimento navetta-box è stato applicato ai gerbilli della Mongolia come plastica riorganizzazioni di apprendimento legate della corteccia uditiva in questi animali sono stati studiati approfonditamente 8,12,14,15,21,22. Tuttavia, il protocollo descritto può essere adattato con modifiche minime ad altre specie di roditori, come ad esempio 16 topi. A questo proposito è importante considerare specie-specifici adattamenti in materia di tempi di recupero dopo l'intervento chirurgico (2.17), altezza della transenna (2.1.1), e la sensibilità del piede-shock di ciascun animale, che può essere HIGHLY variabili (3.1.3-3.1.6).
Il protocollo dà ulteriore spiegazioni dettagliate su come i disegni di elettrodi su misura possono essere utilizzati per stimolare diversi siti in tessuto corticale che portano alla attivazioni di rete distinte come ricavato dall'analisi di concorrenti registrazioni elettrofisiologiche multielettrodico 8,23. A seconda della distanza degli elettrodi si può stimolare diverse regioni, ad esempio le mappe topografiche 9. Applicando strato dipendente ICMS è possibile attivare differenzialmente lungo raggio proiezioni corticocorticali conducono a più capillare attivazione corticale stimolazione in strati di input corticali III-IV. Invece, la stimolazione a strati uscita corticoefferent V-VI ha portato ad un'attivazione molto più focale di circuiti di feedback intracorticali e corticothalamic 8. Quando si utilizzano matrici di stimolazione con due o più elettrodi di stimolazione, bipolare ICMS può essere applicato anziché monopolare ICMS. Una modalità di stimolazione bipolare piùreclute efficacemente le fibre neuronali parallele alle punte degli elettrodi, preferibilmente in direzione del polo catodico rispetto alle fibre non parallele 24. Tale configurazione stimolazione aumenta quindi la specificità direzionale delle evocati attivazioni neuronali rete 8. Questi particolari manipolazioni dirette di attività della rete sublaminare corticali che utilizzano ICMS 8,9, non sono state finora dimostrato da qualsiasi altra tecnica 3. Come esempio del potere di questo metodo, un recente rapporto svelato il contributo dei circuiti di feedback cortico-talamo-corticale alla percezione mediante l'apprendimento rilevamento di intracorticale stimoli elettrici 8. Ciò dimostra che microstimolazione corticale diretta è un metodo efficace e state-of-the-art di causalmente attività collegamento in circuiti neuronali specifici e comportamenti 1,3,11,25. Con la stimolazione elettrica locale di regioni corticali corrispondenti a mappa specifici elementi topografici, come per instAnce una regione tonotopica nella corteccia uditiva, i soggetti possono essere addestrati in paradigmi di apprendimento di trasferimento di confrontare le proprietà di percezioni indotte da una stimolazione elettrica centrale o periferico sensoriale. Tali esperimenti potrebbero stimolare lo sviluppo di strategie di stimolazione sensoriale per neuroprotesi corticali 5,9. Questo protocollo può essere impiegato anche nella stimolazione elettrica di altre aree del cervello, come per esempio l'area ventrale tegmentale, per studiare l'elaborazione di ricompensa e le basi neuronali della stimolazione cerebrale profonda 26. Critico per microstimolazione efficace sono diversi dettagli tecnici che devono essere considerate sullo sfondo del setup individuale e gli elettrodi utilizzati. In generale, l'influenza di parametri di stimolazione, come la stimolazione di ampiezza, polarità, l'orientamento degli elettrodi, ecc, sono stati rivisti 11,24. Di importanza è il trasferimento di carica dall'elettrodo. L'impedenza di un elettrodo quindi è un fattore critico. Quindi, verificare che tha impedenza dei contatti degli elettrodi è nell'intervallo k prima dell'impianto.
Diversi fenomeni aggiuntivi di apprendimento possono essere studiati mediante variazione corrispondente del disegno di base descritto. Ad esempio, la discriminazione imparando a differenza di semplice apprendimento di rilevamento può essere indagato con l'introduzione di almeno due stimoli che devono essere associati con i go e Nogo risposte, rispettivamente, 14,15. Allo stesso modo l'apprendimento categoria formazione può essere studiato mediante la combinazione di tali discriminazioni paradigmi 12,21. Shuttle-box paradigmi possono anche essere impiegati per indagare memoria di lavoro, inibizione comportamentale e flessibilità cognitiva quali ad esempio necessaria per l'inversione di successo imparare 14,17 o spostamento impostato. La memoria di lavoro può essere valutata confrontando 'ritardo' e condizionata 'traccia'. In 'ritardo' condizionata 27, il CS è presentato durante la finestra temporale CS-US critiche senza ritardo tra CSfset e Stati Uniti esordio. Nel condizionamento 'traccia', d'altra parte, vi è un ritardo di alcuni secondi dopo l'offset di presentazione CS transitoria. A differenza di 'ritardo' condizionata condizionata 'traccia' mette un elevato carico sulla memoria di lavoro e di elaborazione corticale. Combining discriminanti paradigmi di apprendimento navetta-box con l'analisi dei modelli spazio-temporali nel electrocorticogram in corso, è un metodo adeguato per identificare stati dinamici di corteccia uditiva relativa alla discriminazione stimoli 9, e la categoria formazione 21. Tuttavia, come la formazione di navetta-box viene utilizzato classicamente come compito di evitare a due vie, i problemi concettuali generali con apprendimento evitamento si applicano per tutti questi disegni comportamentali; vale a dire che il comportamento di evitamento successo impedisce esplicitamente il verificarsi dello stimolo che funge da rinforzo. Rinforzo appetitiva, per esempio attraverso la stimolazione elettrica diretta dei circuiti di ricompensa mesencefalo, ha solo apen applicato alla navetta scatola di apprendimento in alcuni studi 26. Inoltre, l'apprendimento di navetta-box è principalmente stato utilizzato con specie di roditori ed è stata raramente applicata in grandi animali da laboratorio, come per i cani di istanza.
Inoltre con l'analisi elettrofisiologiche, apprendimento navetta-box può essere ulteriormente combinato con un intervento farmacologico 8,17, tecniche di lesioni 15, microdialisi 28 o optogenetics. Soprattutto la combinazione del nostro protocollo con strumenti optogenetic, o di un'infezione virale del sistema modello (ad esempio, gerbilli della Mongolia), o da animali geneticamente modificati, come i topi, consentirebbe di aumentare in particolare il sottotipo specificità cellulare di attivazione neuronale artificiale compresa corticale inibizione, che non è accessibile tramite ICMS 3.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Deustche Forschungsgemeinschaft DFG e il Leibniz-Institut per Neurobiologia. Ringraziamo Maria-Marina Zempeltzi e Kathrin Ohl per l'assistenza tecnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-insulated stainless steel wire | California Fine Wire | diam. 50µm w/ isolation | |
| Pin connector system | Molex Holding GmbH | 510470200 | 1.25 mm pitch PicoBlade |
| TEM grid Quantifoil | Science Services | EQ225-N27 | |
| Dental acrylic Paladur | Heraeus Kulzer | 64707938 | |
| Hand-held drill OmniDrill35 | WPI | 503599 | |
| Ketamine 500mg/10ml | Ratiopharm GmbH | 7538837 | |
| Rompun 2%, 25ml | Bayer Vital GmbH | 5066.0 | |
| Sodium-Chloride 0.9%, 10ml | B.Braun AG | PRID00000772 | |
| Lubricant KY-Jelly | Johnson & Johnson | ||
| Shuttle-box E10-E15 | Coulbourn Instruments | H10-11M-SC | |
| Stimulus generator MCS STG 2000 | Multichannel Systems | ||
| Plexon Headstage cable 32V-G20 | Plexon Inc. | HSC/32v-G20 | |
| Plexon Headstage 32V-G20 | Plexon Inc. | HST/32v-G20 | |
| PBX preamplifier 32 channels | Plexon Inc. | 32PBX box | |
| Multichannel Acquisition System | Plexon Inc. | MAP 32/HLK2 | |
| Cryostate CM3050 S | Leica Microsystems GmbH | ||
| Signal processing Card Ni-Daq | National Instruments | ||
| Lab StandardTM Stereotaxic Instruments | Stoelting Co. | ||
| Audio attenator g.pah | g.pah Guger technologies | ||
| Cresyl violet acetate | Roth GmbH | 7651.2 | |
| Roticlear | Roth GmbH | A538.1 | |
| Sodium acetate trihydrate | Roth GmbH | 6779.1 | |
| Potassium hexacyanoferrat(II) trihydrate | Roth GmbH | 7974.2 | |
| Di-sodium hydrogen phospahte dihydrate | Merck | 1,065,801,000 | |
| ICM Impedance Conditioning Module | FHC | 55-70-0 | |
| Animal Temperarture Controler | World Precision Instruments | ATC2000 |
References
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