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Behavior

कृंतक मस्तिष्क Microinjection आण्विक Substrates प्रेरित व्यवहार का अध्ययन करने के लिए

doi: 10.3791/53018 Published: September 16, 2015

Protocol

पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं वर्जीनिया कॉमनवेल्थ विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) ने मंजूरी दे दी है और प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच गाइड का पालन किया गया है।

सर्जरी से पहले और microinjection को औजार की 1. तैयारी

  1. सामग्री तैयार करने के लिए सेट करें:
    1. 26 जी प्रवेशनी ट्यूबिंग, 33 जी गवाक्ष तार, 33 जी microinjection सुई ट्यूबिंग, microinjector प्लास्टिक टयूबिंग (PE20 या समकक्ष), दो मध्यम वजन सीधे hemostats, प्रयोगशाला टेप, शासक, स्थायी मार्कर, 70% इथेनॉल प्राप्त करते हैं (वी / वी), भंडारण छोटी शीशियों (जैसे, 20 मिलीलीटर कांच जगमगाहट), सुपर गोंद, नावों तौलना, और रोटरी उपकरण एक गैर भारी शुल्क कट-ऑफ डिस्क के साथ सुसज्जित है।
      नोट: यह उपकरण उठ का पट्टियों या टेप का उपयोग कर एक विंदुक टिप बॉक्स करने के लिए रोटरी उपकरण की सुरक्षा, सहायक है। आंखों की सुरक्षा पहने हुए एक रोटरी उपकरण का उपयोग करते समय चोट से बचने के लिए महत्वपूर्ण है।
    2. एक टुकड़ा देतेबेंच के लिए प्रयोगशाला या आटोक्लेव टेप की।
  2. Cannulae की तैयारी:
    नोट: कम से कम दो cannulae एक द्विपक्षीय इंजेक्शन के लिए चूहा प्रति आवश्यक हैं। एक अतिरिक्त प्रवेशनी बाद में एक चरण में इस्तेमाल किया जाएगा।
    1. अंकन और काटने की प्रक्रिया के दौरान झुकने से बचने के लिए पर्याप्त लंबाई की प्रवेशनी ट्यूबिंग के एक वर्ग का मोल।
    2. एक ठीक इत्तला दे दी पेन का उपयोग कर कदम 1.1.2 से टेप पर एक 15 मिमी संदर्भ लाइन ड्रा। यह एक तेज स्थायी मार्कर का उपयोग ट्यूबिंग पर अनुक्रमिक 15 मिमी वर्गों के अंकन के लिए एक गाइड के रूप में काम करेगा।
    3. ट्यूबिंग पायदान क्रम में रोटरी उपकरण की धीमी कताई कट-ऑफ डिस्क को चिह्नित अंक पर, प्रवेशनी ट्यूबिंग स्पर्श करें। प्रवेशनी घुमाएँ 180˚ और ट्यूबिंग के विपरीत पक्ष निशान। यह रोड़ा पैदा हो सकती है, क्योंकि पूरी तरह से ट्यूबिंग के माध्यम से कटौती न करें।
    4. तेजी से ~ 15 मिमी वर्गों में इसे तोड़ने के लिए आदेश में ट्यूबिंग मोड़।
    5. कट ऑफ के लिए सीधा प्रवेशनी से प्रत्येक में कटौती अंत पकड़ोअंगूठे और तर्जनी के बीच डिस्क। कट ऑफ डिस्क (यानी, नहीं धार) की बड़ी आगे की सतह के लिए टिप को छू जबकि प्रवेशनी ट्यूबिंग घुमाएँ। यह एक पा टिप उत्पन्न होगा। नोट: यह है कि दूर एक साइट इंजेक्शन उपज सकता है के लिए, प्रवेशनी झुकना नहीं है।
    6. बीस जिस्ता कागज एक 26 जी beveled सुई (भूरे रंग हब) के साथ प्रवेशनी के दोनों सिरों सभी burrs हटा दिया गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए और प्रवेशनी अबाधित है।
    7. ~ कटौती प्रवेशनी के माध्यम से 35 मिमी कोई आंतरिक अवरोधों देखते हैं कि सत्यापित करने के लिए गवाक्ष तार काट का एक नमूना गुजरती हैं।
    8. व्यक्तिगत रूप से unclamped hemostats का उपयोग कर प्रत्येक प्रवेशनी उठाओ और यह लंबाई में वास्तव में 14 मिमी है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक शासक के साथ प्रत्येक पूरा प्रवेशनी उपाय।
  3. Obturators की तैयारी:
    1. एक प्रवेशनी मध्यम वजन, सीधे hemostats के साथ लगभग आधा लंबाई दबाना। बेंच पर बंद hemostat निर्धारित करना। प्रवेशनी बेंच के लिए खड़ा होना चाहिए।
      नोट: इस प्रवेशनीयह संभावना तुला हुआ है, के रूप में बंद कर दिया hemostats द्वारा आयोजित किए जाने के बाद सर्जरी में इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए।
    2. यह बेंच तक पहुँच गया है जब तक प्रवेशनी में गवाक्ष तार के एक छोर फ़ीड। एक गड़गड़ाहट बेंच तक पहुँचने से रोकने नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रवेशनी में तार उछाल;। यानी, प्रवेशनी के नीचे तक पहुंच गया। Clogging और अतिरिक्त ऊतक scarring रोकने जाएगा उचित गवाक्ष लंबाई।
    3. बेंड गवाक्ष और बेंच के बीच संपर्क बनाए रखते हुए एक ~ 30˚ कोण हासिल की है, जब तक उंगलियों के साथ बन्द रखो द्वारा तार। मोड़ के कोण यह सिर की टोपी के साथ बहा देता है, और अतिरिक्त यह कठिन चूहे को दूर करने के लिए कर रही है, आगे का सामना कर रहा है कि इस तरह की है कि सुनिश्चित करें।
    4. Cannulae से तार हटाने के लिए और छोटे विकर्ण कटर (तार कटर) के साथ मोड़ से ~ 2.5 मिमी पर अतिरिक्त हिस्से को काट दिया।
      नोट: प्रत्येक प्रत्यारोपित प्रवेशनी एक गवाक्ष की आवश्यकता के रूप में कम से कम दो obturators, एक द्विपक्षीय इंजेक्शन के लिए चूहा प्रति आवश्यक हो जाएगा। बनानागवाक्ष के माध्यम से एक अतिरिक्त ~ 35˚ मोड़ रास्ते के मध्य में भी पशु से हटाने को रोकने में सहायता मिलेगी। Cannulae और उपयोग करें जब तक 70% इथेनॉल (वी / वी) युक्त अलग शीशियों में obturators (जैसे।, 20 मिलीलीटर कांच जगमगाहट), लेकिन कम से कम हे / एन दोनों की दुकान।
  4. तैयारी और microinjectors का परीक्षण:
    1. ~ 1 मीटर लंबा है कि microinjector सुई ट्यूबिंग का एक टुकड़ा प्राप्त करते हैं।
    2. लंब के रूप में बंद कर दिया सीधे hemostats के साथ microinjector ट्यूबिंग के एक छोर पकड़ो।
    3. Hemostat के कम से कम एक समय के आसपास कसकर यह कुंडली के लिए ट्यूबिंग पर तनाव रखते हुए hemostat ट्विस्ट।
    4. Microinjector ट्यूबिंग के विपरीत, ढीला छोर से 32 मिमी के उपाय और एक दूसरे सीधे, मध्यम वजन hemostat के साथ लंबरूप इस बिंदु समझ और उन्हें बंद करने के लिए। 32 मिमी की तरफ hemostats के साथ microinjector ट्यूबिंग ढीला समाप्त करने के बजाय घाव के तार के साथ hemostat के लिए निकटतम तरफ निकटतम निशान समझ।
    5. बेनट्यूबिंग पर तनाव रखते हुए डी ट्यूबिंग आगे और पीछे यह टूट जाता है जब तक।
      नोट: एक एकल, तेज ऊपर और नीचे मोड़ microinjection वांछित मस्तिष्क क्षेत्र में होता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए वांछनीय है, जो एक कुंद तोड़, उत्पादन होगा।
    6. दोनों सिरों सीधे और अंदर व्यास अबाधित है कि कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के microinjector ट्यूबिंग का निरीक्षण किया।
    7. एक microinjector कॉलर निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि प्रवेशनी ट्यूबिंग मोल।
    8. उपाय और एक स्थायी मार्कर और टेप (कदम 1.1.2) पर तैयार एक 5 मिमी संदर्भ लाइन का उपयोग कर प्रवेशनी ट्यूबिंग का अनुक्रमिक 5 मिमी वर्गों के निशान।
      नोट: प्रत्येक microinjector एक कॉलर की आवश्यकता है। कॉलर microinjector तार का पालन बस लघु cannulae हैं।
    9. ट्यूबिंग पायदान क्रम में रोटरी उपकरण की धीमी कताई कट-ऑफ डिस्क को चिह्नित अंक पर, प्रवेशनी ट्यूबिंग स्पर्श करें। प्रवेशनी घुमाएँ 180˚ और ट्यूबिंग के विपरीत पक्ष निशान। पूरी तरह से काटना ट्यूबिंग रोक देना हो सकता है।
    10. तेज़ी से~ 5 मिमी वर्गों में तोड़ने के क्रम में मोड़ microinjector कॉलर ट्यूबिंग।
    11. Burrs के सबसे हटा दिया गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक 26 जी beveled सुई (भूरे रंग हब) के साथ कॉलर के दोनों सिरों के अंदर व्यास बीस जिस्ता। कुछ छोटे burrs microinjector तार ले लो और इस प्रकार चिपकाने में सहायता करेगा।
    12. ~ प्रत्येक microinjector ट्यूब पर अंत से 2 सेमी एक कॉलर स्लाइड।
    13. एक छोटे से तौलना नाव के कोने में सुपर गोंद का एक छोटा सा पूल बनाएँ।
    14. Microinjector ट्यूब को सुपर गोंद की एक छोटी राशि लागू करने के लिए ~ करने की कटौती 25 मिमी स्क्रैप प्रवेशनी ट्यूबिंग का प्रयोग ~ एक छोर से 5 मिमी। यह microinjection ट्यूब के अंत से ~ 1 मिमी इतना है कि इसके बाद, इस सुपर गोंद मनका के ऊपर कॉलर स्लाइड। गोंद के साथ कॉलर के दोनों सिरों को कवर किया।
      नोट: यह microinjector चारों ओर सीलिंग से प्लास्टिक टयूबिंग को रोकने के रूप में होगा, कॉलर पर सुपर गोंद का एक बड़ा संचय करने से बचें। यह इस कर देगा के रूप में, microinjector टयूबिंग के खुले अंत पर सुपर गोंद हो रहा से बचने के लिए महत्वपूर्ण हैशून्य (गैर इंजेक्शन) की मात्रा को कम करने के लिए संभव के रूप में व्यर्थ microinjector, यह अंत करने के लिए करीब के रूप में कॉलर स्लाइड करने के लिए भी महत्वपूर्ण है।
    15. कॉलर पक्ष के साथ एक और छोटा सा तौलना नाव के बाहर पर पूरा microinjector झुक और 24 घंटे के लिए शुष्क करने की अनुमति देते हैं।
    16. Microinjector प्लास्टिक टयूबिंग की एक ~ 8 सेमी टुकड़ा प्राप्त (PE20 या समकक्ष), 1 बाँझ पानी से भर मिलीलीटर सिरिंज, और 26 जी beveled सुई (भूरे रंग हब)।
    17. ट्यूब पंचर करने के लिए नहीं, यह सुनिश्चित करने सिरिंज और सुई पर कटौती ट्यूबिंग स्लाइड करने के लिए एक 26 जी (भूरे रंग हब) सुई संलग्न।
    18. सूखे, पूरा microinjector की कॉलर अंत से अधिक प्लास्टिक टयूबिंग स्लाइड।
    19. प्रत्यक्षता के लिए परीक्षण करने के लिए पानी से भरे सिरिंज सवार निचोड़।
      नोट: जल बहुत दूर है और सीधे microinjector टिप के बाहर स्प्रे करना चाहिए। धारा सीधे नहीं है, तो इंजेक्शन स्थान सही नहीं होगा। एक बग़ल में या फैलाना स्प्रे का स्रोत एक गरीब तोड़ (कदम 1.4.5) है। एक microinjector चाहिए कोईस्प्रे बग़ल में या फैलाना है यदि T इस्तेमाल किया जाएगा। यह microinjector या सुई रोकना सकता के रूप में खारा, नहीं किया जाना चाहिए।
    20. Microinjector से पानी निकालने के लिए वापस क्रम में सिरिंज खींचो। उदाहरण के लिए, एक 20 मिलीलीटर कांच जगमगाहट शीशी, एक सूखी, सीलबंद शीशी में स्टोर।
      नोट: Microinjectors सबसे सुपर glues के साथ निर्माण, 31 के बाद autoclaved जा सकता है लेकिन इस अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए। वैकल्पिक नसबंदी तकनीक एथिलीन ऑक्साइड और गामा विकिरण शामिल हैं।

2. के लिए तैयारी और प्रदर्शन microinjections

  1. पूरा microinjectors प्राप्त करते हैं, microinjector प्लास्टिक टयूबिंग (PE20 या समकक्ष), microinjection पंप, छोटे दो तौलना नावों, बाँझ पानी, 70% इथेनॉल (वी / वी), एसीटोन, एक कुंद सुई (25 ग्राम) के साथ दो gastight 1 μl कांच सीरिंज, कपास लकड़ी applicators, स्पेयर obturators, 1 मिलीलीटर सिरिंज इत्तला दे दी, 26 जी (भूरे रंग हब) सुई, छोटे घुमावदार संदंश (शैली # 7 की सिफारिश की है), और प्रयोगशाला डब्ल्यूIPES।
  2. इंजेक्शन के लिए microinjectors की तैयारी:
    1. दोनों के बीच कोण ~ 95˚ है कि इतनी बेंड 15 मिमी कॉलर के अंत विपरीत से microinjector पूरा किया।
      नोट: एक सटीक मोड़ स्थान सटीक इंजेक्शन स्थान के लिए आवश्यक है। # 7 संदंश का प्रयोग (या समान) microinjector हड़पने के लिए और ऊपर की तरफ झुकने के लिए उपयोगी है। हमेशा microinjections प्रदर्शन से पहले लंबाई फिर से उपाय।
    2. Microinjector कॉलर पर प्लास्टिक टयूबिंग (PE20) करने के लिए ~ 70 सेमी और स्लाइड कट।
      नोट: दो अलग अलग समाधान इंजेक्शन लगाने के लिए, खासकर जब इंजेक्शन पूरा जब microinjector और ढीली अंत दोनों के पास एक प्लास्टिक ट्यूब को टेप टैब जोड़ने से उपयोगी है। वे इंजेक्शन के दौरान बोझिल बन के रूप में टैब्स दोनों ट्यूबों के लिए सिफारिश नहीं कर रहे।
  3. Microinjections के लिए पंप की तैयारी:
    1. पंप पर पावर।
    2. Microinjection सुई का व्यास, वांछित अर्क दर निर्धारित करें, और इंजेक्शन की मात्रा लक्ष्य।
      नोट: आसव चूहाई और इंजेक्शन की मात्रा प्रयोगात्मक मांग पर निर्भर है। इस चर्चा में पर सविस्तार है। कुछ पंपों सिरिंज टेबल पहले से लोड है। यदि नहीं, तो एक सिरिंज तालिका निर्माण वेबसाइट (ओं) पर पाया जा सकता है।
    3. एक सटीक मात्रा स्वचालित रूप से दिया जाता है, ताकि 'मात्रा' के लिए पंप मोड सेट करें। 'पंप' मोड के बजाय चुना जाता है, प्रयोगकर्ता मैन्युअल पंप बंद कर देना चाहिए।
    4. सिरिंज इंजेक्शन की मात्रा के अलावा एक अतिरिक्त 0.2 μl को भरने के लिए अनुमति देने के लिए पंप backstop समायोजित करें।
  4. इंजेक्शन के लिए microinjection सिरिंज और microinjector की तैयारी:
    1. Microinjection पंप के रैक में प्रत्येक gastight microinjection सिरिंज ताला।
    2. नाव का वजन और धीरे आंतरिक तार चिकना करने के लिए सवार स्पंदन एक छोटी सी में निहित बाँझ पानी में gastight सिरिंज की नोक रखें। समान रूप से पानी के साथ भरने के लिए पंप पर backstop सवार खींच।
    3. सह है कि PE20 ट्यूबिंग स्लाइडबाँझ पानी से भर जाता है कि एक 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी एक 26 जी (भूरे रंग हब) सुई पर (2.2 कदम में) microinjector को nnected। Microinjector के माध्यम से बाँझ पानी स्प्रे, और स्प्रे पैटर्न और दूरी का निरीक्षण किया।
      नोट: जल बहुत दूर है और सीधे microinjector टिप के बाहर स्प्रे करना चाहिए। धारा सीधे नहीं है, तो इंजेक्शन स्थान सही नहीं होगा।
    4. एक बाँझ क्षेत्र पर निष्फल microinjector रखें।
    5. यह भी सुई से क्षतिग्रस्त क्षेत्र के नीचे ट्यूबिंग में कटौती करते हुए बाहर से पानी टपकता को रोकने के लिए ईमानदार microinjector ट्यूबिंग रखते हुए सुई के बंद ट्यूबिंग स्लाइड।
    6. सुई पर (जो कि microinjector से जुड़ा है) सुई के अंत पर एक छोटी बूंद बनाने के लिए और पानी से भरे PE20 ट्यूबिंग स्लाइड करने के लिए थोड़ा आगे microinjection सिरिंज सवार धक्का।
      नोट: इस पर फार्म सकता है कि एक रोकना बेदखल कर सकता है कि उचित backpressure की अनुमति देगा एक तरल करने वाली तरल कनेक्शन पैदा करेगाmicroinjector की नोक।
    7. नमूना लोड करने के लिए तैयार है और कोई निशान इथेनॉल microinjector में रहता है यह सुनिश्चित करने के लिए पूरी तरह से तत्पर सवार धक्का।
    8. एक साफ प्रयोगशाला में microinjector की नोक पर गठित कई बार पोंछ गया है कि छोटी बूंद पानी को छू द्वारा लीक के लिए सेटअप की जाँच करें।
  5. नोट: प्रयोगशाला में छू जब पोंछ, केवल एक गीली जगह फार्म चाहिए। अधिक बूँदें देखते हैं, तो सिस्टम में एक दरार है।
  6. सुपर गोंद आवेदन (चरण 1.4.14) को नियंत्रित करने से और तेज कैंची या एक रेजर ब्लेड PE20 ट्यूबिंग किसी तरह के संबंध से निकाल दिया जाता है कि किसी भी समय के साथ PE20 ट्यूबिंग trimming द्वारा लीक से बचें। इसके अतिरिक्त, दोहराने रिसाव उपाय करने 2.4.8 के माध्यम से 2.4.3 कदम।
  7. 0.2 μl वापस सिरिंज सवार खींच; PE20 ट्यूबिंग / microinjector में बाँझ पानी और समाधान के बीच एक बुलबुला पैदा इंजेक्शन जा।
  8. नोट: यह बुलबुला injectate के कमजोर पड़ने, पानी के संक्रमण से बचाता है, और अनुमति देता हैइंजेक्शन प्रक्रिया की निगरानी के लिए यह इंजेक्शन के दौरान चाल होगी। एक एकल, ठोस बुलबुला उत्पादन किया जाना चाहिए। यह टूट गया है, तो एक रिसाव मौजूद है या microinjector टिप अवरोधित है; उस कदम 2.4.8 (और साथ नोट) का संकेत दोहराया जाना चाहिए।
  9. अभिकर्मक में microinjector इंजेक्ट करने के लिए जगह है और धीरे धीरे backstop के लिए सिरिंज सवार खींच।
  10. इंजेक्शन के लिए पशु की तैयारी:
  11. प्रयोगकर्ता की छाती के खिलाफ चूहे की छाती पकड़ो। 70% इथेनॉल में भिगो एक कपास applicator के साथ cannulae के आसपास के क्षेत्र को साफ करें (वी / वी)।
  12. नोट: समुचित से निपटने के साथ, चूहों धीरे एक cupped हाथ में रोका जा सकता है। अन्यथा, scruffing आवश्यक हो सकता है।
  13. 70% इथेनॉल के साथ तौलना नाव में छोटे संदंश और जगह का उपयोग obturators निकालें (वी / वी)।
  14. इंजेक्शन प्रदर्शन:
  15. प्रवेशनी में भरा microinjector (कदम 2.4.10) रखें। Microinjection पंप और मॉनिटर बुलबुला आंदोलन पर प्रेस शुरू।
  16. नोट: यह माY microinjectors उठा नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए प्रकाश दबाव लागू करने के लिए आवश्यक हो। बुलबुला (कदम 2.4.9 में गठित) समान रूप से अग्रिम और microinjector में प्रवेश पूरी तरह से करना चाहिए।
  17. प्रवेशनी से microinjectors निकालें और इंजेक्शन पूरा हो गया है और बाद इंजेक्शन प्रसार अवधि बीत चुका है एक बार, obturators जगह।
  18. नोट: विशिष्ट बाद इंजेक्शन प्रसार गुना 2 हैं - औषधीय अभिकर्मकों के लिए 4 मिनट, और 2 - वायरस के लिए 10 मिनट। पोस्ट अर्क अवधि के दौरान में microinjector छोड़कर cannulae वापस ऊपर refluxing बजाय ऊतक में diffusing से injectate रोकता है। इथेनॉल से भरे तौलना नाव की तरफ प्लेस obturators इथेनॉल प्रवेशनी में reinserting पहले पलायन करने की अनुमति देने के लिए।

3. बाद इंजेक्शन क्लीन अप

  1. बाँझ पानी, 70% EtOH, और एसीटोन: एक छोटे से प्रत्येक की शीशी प्राप्त करते हैं।
  2. Microinjector और microinjection सिरिंज सफाई:
    1. कांच सिरिंज निकालेंकांच सिरिंज से पंप सिरिंज रैक और microinjection ट्यूबिंग से एस।
    2. कांच सिरिंज से डिस्कनेक्ट microinjector ट्यूबिंग और एक 26 जी सुई (भूरे रंग हब) के माध्यम से microinjector टयूबिंग के लिए बाँझ पानी से भरा एक 1 मिलीलीटर सिरिंज देते हैं। ~ 0.3 मिलीलीटर निष्कासित करने के लिए आगे 1 मिलीलीटर सिरिंज सवार धक्का। इसके बाद, एक को microinjector की नोक स्पर्श प्रयोगशाला-पोंछ और वापस microinjector के माध्यम से हवा खींच।
      नोट: विवेकपूर्ण समझा यदि microinjector और ट्यूबिंग इसी तरह के प्रयोगों के लिए फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है।
    3. बाँझ पानी में कांच सिरिंज सुई प्लेस और पूरी तरह से वापस सवार आकर्षित। इसके बाद, फ्लश करने के लिए पूरी तरह से तत्पर सवार धक्का। एक प्रयोगशाला में कांच सिरिंज टिप स्पर्श कोई तरल बनी हुई है कि यह सुनिश्चित करने के लिए पोंछे।
    4. बाँझ जल, वायु, 70% EtOH, और एसीटोन निम्न क्रम में साथ दोहराएँ कदम 3.2.3: बाँझ पानी, बाँझ जल, वायु, वायु, 70% EtOH, 70% EtOH, हवा, हवा, एसीटोन, एसीटोन, हवा, हवा। इन सफाई कदम के सभी परफॉर्मिंग microinjection सिरिंज की रक्षा में मदद मिलेगी।
    5. पैकेजिंग में microinjector सिरिंज (एस) की जगह और 0.05 μl को वापस सवार खींच।
      नोट: यह महत्वपूर्ण है, यह किसी भी नमक जमा भंडारण के बाद फार्म चाहिए कि हो सकता है एक अटक सवार को बेदखल करने के लिए धक्का दिया या खींचा जा सवार की अनुमति देता है।

प्रेरणा परख के 4. प्रोग्रामिंग

  1. व्यवस्थापक क्रेडेंशियल्स के साथ ग्राफिक राज्य में प्रवेश करें।
  2. चुनें या प्रासंगिक डेटाबेस बनाने के लिए।
  3. प्रगतिशील अनुपात सुदृढीकरण कार्यक्रम बनाने:
    1. चयन सूचियों> डेटाबेस स्तर सूचियाँ> घटना संक्रमण पैरामीटर सूचियाँ।
    2. चयन 'जोड़ें'। उचित सूची संख्या (एल #) और विवरण दर्ज करें।
    3. 'घटनाक्रम जोड़ें' का चयन करें।
    4. पहले सुदृढीकरण अनुसूची मूल्य दर्ज करें और 'जोड़ें' का चयन करें। दोहराएँ।
      नोट: मान प्रगतिशील अनुपात अनुसूची = 5e (जे * (सुदृढ़कर्ता) + 1 अर्जित) जहां -5 एक सूत्र का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता 7।ठीक से परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए इस समीकरण दर्जी के क्रम में, मूल्य जम्मू अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए या साहित्य से प्राप्त की।
    5. 'चयन के आदेश' बॉक्स के भीतर 'ऑर्डर में' का चयन करें।
    6. 'जब समाप्त हो गया' बॉक्स के भीतर: '____ को = मूल्य पकड़' का चयन करें। अब तक जवाब की उम्मीद से अधिक है कि टेक्स्ट बॉक्स में सुदृढीकरण अनुसूची मान दर्ज करें। सूची समाप्त हो गया है एक बार इस बाद के सभी प्रविष्टियों के लिए आवश्यक प्रयास होगा।
  4. एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का निर्माण:
    नोट: ग्राफिक राज्य से बाहर निकल सकते हैं या तो समय या प्रदर्शन मापदंड के आधार पर कर रहे हैं कि राज्यों की एक श्रृंखला के माध्यम से विषय ले जाता है। उचित रूप से जांच की जा रही परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए '$' के रूप में नीचे चिह्नित सभी असतत और प्रासंगिक संकेतों और मापदंडों सेट करें।
    1. प्रयोग प्रोटोकॉल बनाने> फ़ाइल का चयन करें।
    2. उचित पाठ बॉक्स में वांछित प्रोटोकॉल संख्या और विवरण दर्ज करें। 'राज्य निर्माण' का चयन करें।
    3. और 'फिन - समाप्त राज्य' - 'तैयार राज्य RDY' दोनों के लिए सभी उत्तेजनाओं सेट करें।
    4. 'नए राज्य' का चयन करें और यह 'एस 2 नाम है - पीआर जवाब।
    5. 'नए राज्य' का चयन करें और यह नाम 'एस 3 -। पीआर सुदृढ़कर्ता और क्यू'
    6. 'नए राज्य' का चयन करें और यह नाम 'एस 4 - टाइमआउट'।
    7. हाइलाइट 'एस 1' और इसे नाम 'एस 1 -। Habituation'
      1. जोड़ें का चयन करें 'टाइम जाने के लिए।'
      2. ,। मिनट जैसे उचित समय ($) और इकाइयों ($), दर्ज करें और एस ड्रॉप डाउन बॉक्स से 'एस 2' का चयन करें। डेटाबेस शुरू में बनाया गया था जब समय इकाई '' इकाइयों निर्धारित किया गया था।
        नोट: बनाया समय संक्रमण [$ मिनट के बाद एस 2 के लिए, = 100% पी जाएँ] के लिए इसी तरह पढ़ना चाहिए चित्रा 1 एक बार बनाई गई इस घटना का एक उदाहरण है।
    8. </ राजभाषा>

    चित्र 1
    वर्तमान स्थिति 2 (एस 2) राज्य के लिए बाहर निकलना चाहिए जब चित्रा 1. प्रतिनिधि प्रोग्रामिंग उदाहरण # 1। एक समय सीमांकित राज्य सचित्र है इस उदाहरण में, जिसमें मिनट में यहाँ दिखाया $ के एक उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित मूल्य, इंगित करता है।

    1. हाइलाइट 'एस 2 - पीआर जवाब।
      1. चुनें जोड़ें 'घटना जाने के लिए।'
      2. एल $ (जैसे, एल 1) के रूप में पहला पाठ बॉक्स में 4.3 चरण में बनाया गया था कि प्रगतिशील अनुपात अनुसूची युक्त सूची का नाम दर्ज करें, उचित operandum चयन (जैसे।, लीवर या नाक प्रहार) पहले से 'बॉक्स ड्रॉप डाउन, और चयन एस के लिए से S3 'बॉक्स ड्रॉप डाउन।
        नोट: बनाया घटना के लिए इसी तरह पढ़ सकते हैं [1 एल $ अगर - S3 के लिए, सक्रिय जाओ पी = 100%]। पहचानकर्ता 1 - सक्रिय डेटाबेस निर्माण के दौरान नामित किया गया था। इधर, 1 - सक्रियस्विच एक में खामियों को दूर किया operandum करने के लिए बात कर रहा है।
      3. 'समय जाने के लिए जोड़ें' चुनें।
      4. ड्रॉप डाउन बक्से, 'आर' बॉक्स चेक उचित समय और इकाइयों ($) दर्ज करें, और एस के लिए से 'पंख' का चयन करें।
        नोट: बनाया बार की घटना के लिए इसी तरह पढ़ सकते हैं [$ मिनट पंख करने के लिए, पी = 100% जाना अगर आर (चेक)]। इस सेट में सीमा के बाद कि operandum पर कोई गतिविधि नहीं है, तो सत्र समाप्त हो जाएगा कि यह सुनिश्चित करेंगे;। जानवर समय की निर्धारित अवधि के लिए सुदृढ़कर्ता बनती operandum पर जवाब रोक लेता के बाद यानी, सत्र का समय समाप्त होगा।
      5. चुनें जोड़ें 'घटना जाने के लिए।'
      6. 'आर' बॉक्स को चेक पहला पाठ बॉक्स में 1 दर्ज करें, पहले ड्रॉप डाउन बॉक्स से उचित operandum की रिहाई का चयन करें, और एस ड्रॉप डाउन बॉक्स से 'एस 2' का चयन करें।
        नोट: बनाया घटना के लिए इसी तरह पढ़ सकते हैं [आर एस 2 के लिए, $ [1] सक्रिय जाओ पी = 100% के बाद (चेक)]। यह कदम कि operandum की रिहाई पर सुनिश्चित करता हैराज्य इस प्रकार सत्र मध्यांतर सीमा (4.4.9.4), रीसेट फिर से प्रवेश कर रहा है कि, (ऊपर कोष्ठक ने संकेत दिया)। सूची में शामिल प्रगतिशील अनुपात (चरण 4.4.9.2) या बाहर सत्र बार (चरण 4.4.9.4) पूरा हो गया है जब इस बिंदु पर, राज्य बाहर निकल जाएगा। इस प्रकार, operandum सक्रिय हो जाता है कि हर बार, यह प्रगतिशील अनुपात की दिशा में गिना जाता है। । और, operandum निष्क्रिय है कि हर समय, जैसे, लीवर जारी की है या नाक प्रहार से बाहर निकल गया है, सत्र मध्यांतर सीमा (चरण 4.4.9.4) है रीसेट चित्रा 2 'एस 2 के लिए प्रोग्राम सभी बदलाव का प्रतिनिधित्व करता है - जवाब पीआर।। '

    चित्र 2
    चित्रा 2. प्रतिनिधि प्रोग्रामिंग उदाहरण # 2। इधर, राज्य के दो मानदंडों के दोनों पर बाहर निकल गया है। एल $ 4.3 चरण में बनाए प्रगतिशील अनुपात अनुसूची है। अनुसूची पूर्ण करने परआयन, राज्य 3 (S3) राज्य को बाहर निकालता है। इस कसौटी अनुसूची इस राज्य में प्रत्येक reentry पर फिर से शुरुआत करने के बजाय अग्रिम करने के लिए अनुमति देता है जो एक अनुसंधान, जरूरी नहीं है कि ध्यान दें। राज्य में भी '$' मिनट के बाद बाहर निकलने के फिन राज्य के लिए कर सकते हैं। यह जवाब कोई इस विंडो के भीतर होता है, तो सत्र को समाप्त कर देगा, जिसके बाद पूर्व निर्धारित मध्यांतर सीमा है। इस चर्चा में आगे बताया गया है। अन्त में, सत्र मध्यांतर दहलीज हर operandum रिहाई पर कायम है। इस प्रकार, '[1]' operandum की रिहाई को इंगित करता है '1'।

    1. हाइलाइट 'एस 3 - पीआर सुदृढ़कर्ता और क्यू।'
      1. चयन 'जोड़ें समय जाने के लिए'
      2. एस लटकती बॉक्स करने से 'एस 4' सुदृढ़कर्ता ($) देने, और चयन करने के लिए उचित समय और इकाइयों दर्ज करें।
        नोट: बनाया समय घटना [S4 के लिए, $ सेकंड पी जाने के बाद = 100%] के लिए इसी तरह पढ़ सकते हैं।
    2. हाइलाइट 'एस 4 - मध्यांतर।' 'टाइम' जाने के लिए जोड़ें का चयन करें
    3. एक निष्क्रिय राज्य ($) निम्नलिखित सुदृढ़कर्ता वितरण में बने हुए हैं, और एस लटकती बॉक्स करने से 'एस 2' का चयन करने के लिए उचित समय और इकाइयों दर्ज करें।
      नोट: बनाया समय घटना [एस 2 के लिए, $ सेकंड पी जाने के बाद = 100%] के लिए इसी तरह पढ़ सकते हैं। राज्य 'एस 4 - टाइमआउट' सभी डिजाइन के लिए आवश्यक नहीं किया जा सकता है।
  5. चुनें संकल्प राज्यों।
    नोट: इस प्रोटोकॉल अब चलाने के लिए तैयार है।

Representative Results

यहाँ हम उपरोक्त प्रक्रिया के साथ प्राप्त किया जा सकता है कि परिणाम के उदाहरण देकर स्पष्ट करना। दिखाया पहली वायरल वैक्टर (चित्रा 3) द्वारा ट्रांसफ़ेक्ट है कि एक विशिष्ट क्षेत्र है। सामान्य में, ~ 1 मिमी 3 के एक ट्रांसफ़ेक्ट मात्रा स्ट्रिआटल ऊतकों में प्राप्त की है। ट्रांसफ़ेक्ट क्षेत्र की मात्रा Cavalieri की विधि का उपयोग धारावाहिक वर्गों भर में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, 32 महत्वपूर्ण बात है, ट्रांसफ़ेक्ट मात्रा ऐसे ट्रांसफ़ेक्ट किया जा रहा ऊतक के प्रकार के रूप में कई कारकों पर निर्भर करता है। वायरल सीरोटाइप; प्रमोटर; दर और मात्रा इंजेक्शन; इंजेक्शन के कणों की संख्या; injectate पीएच; और इस तरह mannitol रूप हाईपरोस्मोलर अभिकर्मकों, चाहे वह इस्तेमाल किया गया। 33,34 आमतौर पर, हम 10 मिनट से अधिक 10 से 12 कणों / मिलीलीटर, 1 μl / पक्ष microinject, और obturators की जगह के लिए 7 अतिरिक्त मिनट से पहले अनुमति देते हैं। इसके अतिरिक्त, injectate पीएच 8. अगली चारों ओर आम तौर पर है, हम प्रेरणा या तो transgene अभिव्यक्ति द्वारा चालाकी से किया जा सकता है (चित्रा 4)या औषधीय अभिकर्मक microinjection (चित्रा 5)।

चित्रा 4 में, हम विशेष रूप से डिजाइनर ड्रग्स (DREADDs) द्वारा सक्रिय एक डिजाइनर रिसेप्टर व्यक्त किया। DREADD रिसेप्टर-कोडिंग क्षेत्र एक आंतरिक ribosome प्रविष्टि साइट और एक mCitrine कैसेट के द्वारा किया गया। mCitrine कोशिकाओं के सुविधाजनक दृश्य की अनुमति देता। DREADD heterotrimeric जी प्रोटीन Gαq करने के लिए मिलकर किया गया था। Astrocytes, 28,35 और DREADD खुद को प्रोत्साहित कर सकते हैं Gαq युग्मित DREADD का एक्टिवेशन clozapine-एन-ऑक्साइड (CNO, 3 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) के प्रणालीगत प्रशासन द्वारा सक्रिय किया जा सकता है। 14,22,36 चूहों को प्रशिक्षित किया गया लीवर 3 लीवर प्रेस 60 सन्निहित दिनों से अधिक दैनिक 1 घंटा सत्र के दौरान पीने के लिए एक मौका झुकेंगे जहां इथेनॉल सुदृढीकरण के लिए जवाब। इसके बाद, चूहों संयम के लिए मजबूर कर रहे थे, और नाभिक कोर astrocytes accumbens में Gαq युग्मित DREADDs व्यक्त किया गया। 3 सप्ताह संयम, आत्म-आदमी के लिए प्रेरणा के बाद nister इथेनॉल ब्रेकप्वाइंट द्वारा मापा गया था। नाभिक की 21,27-30 एक्टिवेशन प्रणालीगत CNO प्रशासन के माध्यम से, संयम वाहन की तुलना में बाद इथेनॉल स्वयं प्रशासन को फिर से शुरू करने के लिए चूहों की प्रेरणा की कमी हुई है, कोर astrocytes accumbens। महत्वपूर्ण बात है, CNO बजाय DREADD की हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त किया गया है कि एक समान रूप से प्रशिक्षित पलटन में कोई प्रभाव नहीं पड़ा।

चित्र तीन
Microinjected वायरस से ट्रांसफ़ेक्ट चित्रा 3. प्रतिनिधि उदर स्ट्रिआटल क्षेत्र। इस छवि को नाभिक के क्षेत्र उपरोक्त विधि का पालन करके ट्रांसफ़ेक्ट थे कि astrocytes accumbens दिखाता है। डेटा कॉपीराइट धारक की अनुमति के साथ बुल एट अल। 13 से reprinted कर रहे हैं। विवरण है कि प्रकाशन और साथ पूरक सामग्री में पाया जा सकता है।"खाली> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
स्वयं प्रशासन इथेनॉल के लिए चूहों के चित्रा 4. प्रेरणा नाभिक कोर astrocytes accumbens में। व्यक्त ओवर-वायरस को व्यक्त करने के लिए एक सप्ताह की अनुमति के बाद वायरस microinjected किया गया था और प्रेरणा ब्रेकप्वाइंट के माध्यम से मापा गया था कि एक transgene सक्रिय द्वारा कम हो गया था। ट्रांस्जीन विशेष रूप से डिजाइनर ड्रग्स (DREADDs) द्वारा एक डिजाइनर रिसेप्टर सक्रिय हो गया था व्यक्त किया। एक एक तरह से एनोवा (एफ (2,30) = 3.29, पी = 0.04) एक Scheffé पद अस्थायी द्वारा पता चला है कि इसके बाद clozapine-एन-ऑक्साइड के प्रणालीगत प्रशासन द्वारा DREADD के सक्रियण (CNO, 3 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी ) काफी बजाय डॉ) CNO हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP व्यक्त किया गया है कि एक समान रूप से प्रशिक्षित पलटन में कोई प्रभाव नहीं पड़ा वाहन की तुलना में संयम के बाद स्वयं प्रशासन इथेनॉल के लिए चूहों की प्रेरणा कमEADD। डेटा कॉपीराइट धारक की अनुमति के साथ बुल एट अल। 13 से reprinted कर रहे हैं। विवरण है कि प्रकाशन और साथ पूरक सामग्री में पाया जा सकता है।

चित्रा 5
चित्रा की खाई जंक्शन ब्लॉकर्स 5. Microinjection संयम के बाद इथेनॉल-प्रशासन के आत्म करने के लिए चूहों की प्रेरणा वृद्धि हुई दो खाई जंक्शन ब्लॉकर्स इथेनॉल-प्रशासन के आत्म करने के लिए चूहों के (ब्रेकप्वाइंट के माध्यम से मापा) प्रेरणा पर उनके प्रभाव के लिए मूल्यांकन किया गया:। Mefloquine और 18- α-glycyrrhetinic एसिड (18-α)। एक दो तरह एनोवा नाभिक में अंतर-जंक्शन ब्लॉकर्स के microinjection कोर संयम के बाद इथेनॉल-प्रशासन के आत्म करने के लिए चूहों की प्रेरणा वृद्धि हुई accumbens पता चला है कि (एफ (3,40) = 5.56, पी = 0.003)। डेटा कॉपीराइट धारक की अनुमति के साथ बुल एट अल। 13 से reprinted कर रहे हैं। विवरण है कि प्रकाशन में पाया जा सकता है औरसाथ पूरक सामग्री।

Discussion

यहाँ प्रस्तुत की प्रक्रिया microinjection cannulae और प्रेरित व्यवहार की आणविक substrates elucidating में सहायता करेगा कि microinjectors निर्माण करने के लिए एक कारगर साधन है। इस विधि के कई लाभ प्रदान करता है। सबसे पहले, एक के अपने प्रत्यारोपण और microinjectors निर्माण से, उपन्यास प्रयोगात्मक मानकों तेजी से अनुकूलित किया जा सकता है, यानी, एक आने के लिए कस्टम मेड घटकों के लिए इंतजार करने की जरूरत नहीं है। दूसरा, प्रवेशनी के छोटे व्यास के कारण अधिक cannulae एक साथ प्रत्यारोपित किया जा सकता है। इस बचे रहने में सुधार कर सकते हैं जो आवश्यक शल्य समय, कम करता है तथा यह भी पशु के प्रति एकाधिक प्रत्यारोपण की अनुमति देता है। एक निश्चित अनुपात प्रतिमान तेजी से बस इच्छित सुदृढीकरण अनुसूची में शामिल है कि एक घटना के लिए संक्रमण पैरामीटर सूची को लागू करने से एक प्रगतिशील अनुपात प्रतिमान के लिए परिवर्तित किया जा सकता है, क्योंकि तीसरा, स्फूर्त कक्षों नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर आसानी से प्रगतिशील अनुपात कार्यक्रम accommodates।

होने के लिएमोटे तौर पर उपयोगी है, एक सामान्य microinjection प्रक्रिया वर्तमान में उपलब्ध लगभग किसी भी अभिकर्मक के microinjection के लिए मोटे तौर पर लागू किया जाना चाहिए कि प्रस्तुत किया गया था। नतीजतन, हम इस तकनीक को मामूली संशोधन के साथ भविष्य में इसी तरह उच्च उपयोगिता का होना जारी रहेगा आशा करते हैं कि। केवल कुछ ही चर बदल रहा है, इस दृष्टिकोण अभिकर्मकों की एक विस्तृत संख्या के लिए लागू किया जा सकता है। सबसे अधिक इस्तेमाल चालाकी से किया जाएगा कि पैरामीटर्स microinjector प्रवेशनी से protrudes कि लंबाई, इंजेक्शन की मात्रा और इंजेक्शन की दर शामिल हैं। उदाहरण के लिए, एक सुई लगानेवाला आम तौर पर पुरानी प्रत्यारोपण के आसपास रूपों कि glial निशान से बचने के लिए प्रवेशनी सिरे से आगे बढ़ाना चाहते हो सकता है। इसके अतिरिक्त, एक एक बड़ी मात्रा इंजेक्षन करने के लिए इच्छा हो सकती है। कि उपयोग की तुलना में (10 मिनट अतिरिक्त प्रसार समय अक्सर 7 - - 10 मिनट प्लस 3) स्ट्रिआटल वायरस microinjections के लिए, 1 μL की मात्रा आम तौर पर इस्तेमाल किया जाता है और इस खंड में आम तौर पर समय की एक लंबी अवधि में इंजेक्ट किया जाता हैऔषधीय अभिकर्मकों के लिए डी (आम तौर पर 0.3 - 3 मिनट प्लस 1 - - 2 से अधिक 0.5 μL 3 मिनट के अतिरिक्त प्रसार समय)। उपयोगकर्ता साहित्य से परामर्श और / या अनुभव से सबसे अच्छा अपनी आवश्यकताओं के लिए उपयुक्त मानकों का निर्धारण करना चाहिए। इंजेक्शन के लिए पहले microinjector स्प्रे पैटर्न का 1) प्रवेशनी लंबाई, 2) microinjector लंबाई, 3) गुणवत्ता, और 4) प्रणाली अखंडता: भले ही, इस प्रक्रिया की सफलता 4 चर पर निर्भर है। Microinjection के स्थान microinjector प्रवेशनी से protrudes कि गहराई पर निर्भर है, क्योंकि दोनों cannulae (चरण 1.2.8) और microinjector लंबाई (पोस्ट झुकने, चरण 2.2.1) दोनों ठीक सभी विषयों के बीच जाना जाता है और एक समान हैं, कि यह जरूरी है । यह आसानी से आसानी से किसी भी है कि अंतिम फिर से मापने पर आवश्यक लंबाई नहीं है लागू खारिज द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। यह गाइड प्रवेशनी नीचे तुरंत होता है, तो इसके अलावा, इंजेक्शन स्थान ही अनुमान लगाया जा सकता है। इस प्रकार, किसी microinjector हरिणी किपरीक्षण पर एक लंबे, ठीक धारा स्प्रे नहीं है (कदम 2.4.6) को खारिज कर दिया जाना चाहिए। एक गुणवत्ता इंजेक्शन भी इंजेक्शन के लिए पहले प्रणाली की अखंडता से संबंधित है। कई स्थानों प्रयोगशाला-पोंछ पर मनाया जाता है इंजेक्टर से सब पानी वितरण के बाद (पूर्व अभिकर्मक के साथ भरने के लिए) है, तो एक रिसाव (चरण 2.4.8 पर ध्यान दें) निवारण किया जाना चाहिए। PE20 ट्यूबिंग में पानी से दवा है कि अलग बुलबुला (चरण 2.4.9) एक नहीं, एक बुलबुला (अभिकर्मक के साथ microinjector भरने के बाद) है, तो आगे, तो इंजेक्टर आंशिक रूप से भरा हुआ है। इस रोकना रोकने या इंजेक्शन हटाने सकता है या तो। यह भी आसानी से remedied किया जा सकता (नोट कदम 2.4.8 पर)।

एक से तीन विकल्प हैं पशु stereotaxic फ्रेम में है, जबकि microinject करना चाहते हैं। सबसे पहले, एक यह stereotaxic जोड़तोड़ से मजबूती से आयोजित की और भी PE20 ट्यूबिंग के लिए कनेक्शन की अनुमति के लिए काफी दूर तक विस्तार किया जा सकता है कि इस तरह microinjector कॉलर की लंबाई में वृद्धि कर सकता है। दूसरा, परई अस्थायी एक प्रवेशनी प्रत्यारोपण और यहाँ प्रस्तुत मानक microinjector इस्तेमाल कर सकते हैं। तीसरा, एक खींचा और पॉलिश कांच pipettes का उपयोग कर सकता है। 16,17

यहाँ प्रस्तुत की प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण सीमा है कि यह सबसे अच्छा प्रक्रिया से परिचित हैं कि अच्छी तरह से संभाला चूहों में आयोजित किया जाता है। एक ही अन्वेषक 2 महीने के लिए एक दैनिक आधार पर चूहों संभाला क्योंकि परिणाम अनुभाग में वर्णित डेटा के लिए इस्तेमाल किया चूहे कोई विशेष हैंडलिंग प्रक्रियाओं की आवश्यकता है। यह कम से कम 2 सप्ताह के लिए शल्य प्रत्यारोपण के दैनिक अवलोकन और हेरफेर शामिल थे। हालांकि, चूहों तेजी से तनाव से प्रभावित किया जा सकता है, जो पूर्व पल्स निषेध परख करने से पहले करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है कि तकनीक की एक संख्या से आदी जा सकता है। इन विशेष आदी होना तकनीक अच्छी तरह से पहले से विस्तृत किया गया है। 43 इन प्रक्रियाओं के अलावा, यह चूहों छोटा microinjectors डु उपयोग किया जाता है, जहां microinjection प्रक्रिया के आदी हो कि सलाह दी जाती हैरिंग 'दिखावा' इंजेक्शन। इन नकली इंजेक्शन के दौरान, यह microinjector ऊतकों को नुकसान सीमित करने के क्रम में ऊतक में फैलाना नहीं कि महत्वपूर्ण है। दूसरे शब्दों में, microinjector नहीं रह गया है 14 मिमी की तुलना में तुला होना चाहिए। इस प्रकार, इस तकनीक का इष्टतम कार्यान्वयन के लिए आवश्यक पूरी तरह से आदी होना एक सीमा के रूप में देखा जा सकता है।

कई व्यवहार मानदंड प्रेरणा को मापने के लिए मौजूद हैं, प्रगतिशील अनुपात आमतौर पर इस विषय में एक सुदृढ़कर्ता प्राप्त करने के लिए लागू करने के लिए तैयार है कि प्रयास यों इस्तेमाल किया जाता है। प्रगतिशील अनुपात प्रतिमान अक्सर पिछले पूरा अनुपात में लीवर प्रेस की अधिक से अधिक संख्या के रूप में परिभाषित किया गया है जो ब्रेकप्वाइंट के रूप में जाना जाता है एक उपाय है, का उत्पादन;।। यानी, अधिक से अधिक है कि एक सुदृढ़कर्ता उत्पन्न जवाब 21 प्रगतिशील अनुपात परिमाण सुदृढ़कर्ता के प्रति संवेदनशील है। उदाहरण के लिए, उच्च कोकीन (या सूक्रोज) खुराक एक उच्च ब्रेकप्वाइंट और कम कोकीन (या सूक्रोज) खुराक एक कम breakp उपज का उत्पादनoint। 21,22 तदनुसार, ब्रेकप्वाइंट प्रेरणा और / या मजबूत करने प्रभावकारिता के लिए एक नियमित रूप से इस्तेमाल प्रॉक्सी है। 21,23-26 ब्रेकप्वाइंट का इरादा पशु जवाब बंद हो जाता है जब यह निर्धारित करने के लिए है, क्योंकि प्रगतिशील अनुपात प्रतिमान का एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है सत्र की लंबाई। परिमित सत्र लंबाई ब्रेकप्वाइंट मूल्यों पर एक झूठी टोपी रख सकते हैं और यह असामान्य रूप से आत्म-प्रशासन या कि वृद्धि के बाद सुदृढीकरण रोक की दर में कमी है कि पूर्व उपचार द्वारा exacerbated किया जा सकता है। । यह उलझाना दृष्टिकोण के किसी भी नंबर से दूर किया जा सकता है;। उदाहरण के लिए, सत्र पशु औसत अंतर-अर्क अंतराल के कुछ एकाधिक द्वारा जवाब रोक लगाई गई है जब समाप्त कि 44 इस दृष्टिकोण का एक और आमतौर पर लागू किया संस्करण है जवाब एक बार सत्र समाप्त करने के लिए है विषयों भर में लगातार आयोजित किया जाता है कि कुछ अनुभव से निर्धारित मूल्य से रोक दिया गया। हम कदम 4.4.9.11 में इस दृष्टिकोण को लागू करने की विधि प्रदान की है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cannula Tubing Amazon Supply/ Small Parts HTXX-26T-60 26 G, Hypotube S/S 316-TW 26GA
Obturator Amazon Supply/ Small Parts GWXX-0080-30-05 33 gauge, Wire S/S 316LVM 0.008 IN
Microinjector Wire MicroGroup 33RW 304 33 gauge
Super Glue Loctite 3924AC Liquid, Non-gel, can be autoclaved
Microinjector Plastic Tubing Becton Dickson 427406 PE20
Medium Weight Hemostats World Precision Instruments 501241-G
Ruler Fisher 09-016 150 mm
#7 Forceps Stoelting 52100-77 Dumont, Dumostar
Rotary Tool Dremmel 285 Two-speeds
Cut-off Disc McMaster Carr 3602 15/16" x 0.025"
Microinjection Pump Harvard Apparatus PhD 2000
1 ul Glass Syringe Hamilton 7001KH Needle Style: 25s/2.75"/3
Cotton Tipped Applicator Fisher 23-400-101
Lab Wipes Kimwipes 34133
Operant Software Coulbourn Graphic State
Operant Chambers Coulborun Habitest

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References

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कृंतक मस्तिष्क Microinjection आण्विक Substrates प्रेरित व्यवहार का अध्ययन करने के लिए
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Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018, doi:10.3791/53018 (2015).More

Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018, doi:10.3791/53018 (2015).

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