Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.
Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.
Rodents and humans respond in remarkably similar ways to behaviorally relevant stimuli1-3. This suggests that rodents are appropriate subjects for elucidating the molecular substrates of behavior and complex psychiatric conditions4. Understanding the molecular substrates of complex behavioral processes, such as motivation, frequently requires brain microinjection. Both the brain microinjection technique and a primary motivation assay will be presented here. Rats will be used as subjects, but these procedures can readily be adapted to well-handled mice. Included herein are procedures for the manufacture of the required cannulae, obturators (dummy cannulae or stylets), and microinjectors. The method presented is significantly more flexible and more cost-efficient than prefabricated implements. This flexibility will prove valuable when optimizing conditions. Importantly, because the microinjection procedure can be used to test a myriad of hypotheses; the techniques presented here should be broadly applicable. For example, receptor ligands can be microinjected to understand neurochemistry3,5,6; cell-permeable peptides and small-molecules can be microinjected to understand intracellular signaling pathways7-10; toxins, ion channel blockers, or antagonist cocktails can be microinjected to understand circuitry1,11,12.
While the generic protocol presented here can be readily adapted by the user for their particular needs, the procedure is particularly well suited for behavioral assays since microinjection occurs in awake rodents that are only under mild hand restraint. No anesthesia or special restraints are required. This is possible because the brain itself lacks pain sensation. However, if anesthesia is not used, microinjection must occur through cannulae that were previously stereotaxically implanted. This is because nociceptors are present on the scalp, meninges,13 which are the membranes surrounding the brain, and the periosteum,14 which is the membrane covering the skull. It should be noted that microinjection under anesthesia is sometimes desirable. One example is when the virus is being injected, and one may wish to inject virus directly through either stainless steal needles15 or glass pipettes because this can reduce tissue damage and improve transduction efficiency.16,17 The microinjectors described below can be modified for this purpose and suggestions on how to do this can be found in the Discussion. Because other JoVE articles have demonstrated stereotaxic brain cannula implantation,18-20 these procedures will not be covered here.
We present these microinjection procedures together with an assay that quantifies motivation. Several rodent models of motivated behavior are currently in use, such as the runway box and barrier scaling. Here, we describe how to use an operant progressive ratio schedule of reinforcement to quantify motivation where operant responding is being maintained by a reinforcer. Responding on the progressive ratio is responsive to reinforcer magnitude.21,22 Accordingly, this assay is routinely used as a proxy for motivation and/or reinforcing efficacy. 21,23-30 Because several excellent reviews have covered this topic in detail,21,24 we will focus mainly on practical concerns.
여기에 제시된 방법은 마이크로 인젝션 캐뉼라 및 동기 동작의 분자 기판을 밝히는데 도움이 될 microinjectors를 제조하는 효율적인 수단이다. 이 방법은 몇 가지 장점을 제공한다. 첫째, 자신의 임플란트와 microinjectors을 제조하여, 새로운 실험 매개 변수를 신속하게 최적화 할 수있다, 즉, 하나가 도착하기를 맞춤 제작 한 부품을 기다릴 필요가 없습니다. 둘째, 정맥의 작은 직경으로 인해, 더 캐뉼라를 동시에 주입 할 수있다. 이것은 생존을 향상시킬 수 있습니다 필요한 수술 시간을 단축하고, 또한 동물 당 여러 개의 임플란트를 할 수 있습니다. 고정비 패러다임 빠르게 단순히 원하는 보강 일정 포함 된 이벤트 전이 파라미터리스트를 적용하여 프로그레시브 비율 패러다임으로 전환 될 수 있기 때문에, 셋째, 조건화 챔버를 제어하는데 사용되는 소프트웨어를 용이 프로그레시브 비 스케줄을 수용한다.
되려고광범위하게 유용한, 일반적인 미세 주입 절차는 현재 거의 모든 시약의 미세 주입을위한 광범위하게 적용해야한다고 제시했다. 따라서, 우리는이 기술은 약간의 수정과 향후 유사한 높은 유틸리티로 계속 될 것으로 예상하고있다. 단지 약간의 변수를 변경함으로써, 이러한 접근 방법은 시약의 다양한 개수에 적용될 수있다. 가장 일반적으로 조작 할 것이다 매개 변수는 마이크로 인젝터는 정맥 돌출 길이, 사출의 볼륨 및 주입 속도를 포함한다. 예를 들어, 하나의 주사기는 일반적으로 만성 임플란트 주위 아교 흉터 형성을 방지하기 위해 캐뉼라 팁에서 더 돌출 할 수있다. 또한, 하나의 더 큰 부피를 주입해도된다. 그 사용에 비하여 (10 분의 추가 시간 확산 자주 7 – – 10 분 및 3) 선조체 바이러스 microinjections 들어, 1 μL의 부피는 통상적으로 사용되며,이 볼륨은 전형적으로 장기간에 걸쳐 주입하여약리 시약 D (일반적으로 0.3 – 3 분 플러스 1 – – 2 이상 0.5 μL 3 분의 추가 확산 시간). 사용자는 문헌을 참조 및 / 또는 경험적으로 자신의 요구에 가장 적합한 매개 변수를 결정해야한다. 주사 전에 마이크로 인젝터의 분사 패턴의 1) 캐 뉼러의 길이, 2) 마이크로 인젝터 길이, 3)의 품질, 및 4) 시스템 무결성에 관계없이,이 절차의 성공은 4 변수 결정적으로 의존한다. 미세 주입 위치가 마이크로 인젝터는 정맥에서 돌출 깊이에 의존하기 때문에 모두 캐 뉼러 (단계 1.2.8) 및 마이크로 인젝터 길이 (포스트 굽힘, 단계 2.2.1)를 모두 정확하게 모든 주제 사이에 알려진 균일 한 것을,이 필수적이다 . 이것은 쉽게 용이라도 그 최종 재 측정에 필요한 길이 아니다 구현 거부에 의해 제어 될 수있다. 이 가이드 뉼러 바로 아래에 발생하는 경우 또한, 주입 위치 만 예측 될 수있다. 따라서, 어떤 마이크로 인젝터를 미상 그테스트에 긴, 미세 스트림을 뿌리지 S (단계 2.4.6)을 거부해야합니다. 품질 주입은 또한 종래 주입 시스템의 무결성에 관한 것이다. 여러 관광 명소 랩 닦아에서 관찰 된 인젝터에서 모든 물을 분배 후 (전 시약과 충전에) 경우, 누수가 (단계 2.4.8에 대한 참고) 해결 될 필요가있다. PE20 튜브 내의 물에서 약물을 분리 버블 (단계 2.4.9)가없는 한, 하나의 기포 (마이크로 인젝터 시약을 충전 한 후) 인 경우, 또한, 후 분사가 부분적으로 막혀있다. 이 방해하거나 예방 주사를 전환 할 수 중 하나. 이 너무 쉽게 해결 될 수있다 (참고 단계 2.4.8에서).
하나는 세 가지 대안이있는 동물이 고정대에있는 동안 microinject하고자합니다. 첫째, 하나는 정위 매니퓰레이터 의해 단단히 유지되고 또한 PE20 튜브에 연결을 허용하도록 충분히 연장 될 수 있도록 마이크로 인젝터 칼라의 길이를 증가시킬 수있다. 둘째,에전자는 일시적으로 정맥을 이식하고 여기에 제시된 표준 마이크로 인젝터를 사용할 수 있습니다. 셋째, 하나 그린과 광택 유리 피펫 사용할 수 있습니다. (16, 17)
여기에 제시된 방법의 중요한 한계는 최상의 절차에 익숙 잘 처리 래트에서 수행된다는 점이다. 동일한 조사자 2 개월 이상 매일 랫트를 취급하기 때문에 결과 절에 설명 된 데이터에 사용되는 래트 특별한 처리 절차가 필요 없다. 이것은 최소 2 주 동안 외과 임플란트의 매일 관찰 및 조작을 포함했다. 그러나, 래트 급격히 응력에 의해 영향을받을 수 프리 펄스 억제 분석 이전에 사용되는 다양한 기술에 의해 순응된다. 이러한 특수 습관화 기술들이 앞서 상세히 좋게되어있다. (43)이 절차 이외에, 그것은 쥐 단축 microinjectors가 뒤 사용되는 마이크로 인젝션 절차에 순응하는 것이 바람직하다반지 '가짜'주사. 이러한 허위 주사 동안, 마이크로 인젝터가 조직 손상을 제한하기 위하여 조직으로 돌출하지 않는 것이 중요하다. 즉, 마이크로 인젝터가 더 이상 14mm 이상 절곡되어서는 안된다. 따라서, 본 기술의 구현에 필요한 최적의 철저한 습관화는 제한으로 간주 될 수있다.
여러 행동 패러다임 동기를 측정하기 위해 존재하지만, 일반적으로는 비 진보적 피사체 보강제를 수득 발휘 기꺼이 노력을 정량화하는데 사용된다. 누진 비율 패러다임은 종종 최종 완료된 비율 레버 프레스의 최대 수로서 정의되는 브레이크 포인트로 알려진 측정 값을 만들어 낸다.. 즉, 최대 그 보강재를 생성 응답 21 프로그레시브 비가 크기 보강제 민감하다. 예를 들어, 높은 코카인 (또는 수 크로스) 투여 량은 더 높은 브레이크 코카인 및 하부 (또는 수 크로스) 복용 breakp 낮은 수율을 생산OINT. (21, 22) 따라서, 브레이크 포인트는 동기 부여 및 / 또는 보강 효과에 대한 일상적으로 사용하는 프록시입니다. 21,23-26 중단 점의 의도는 동물이 응답하지 않을 때 결정하기 때문에, 진보적 인 비율 패러다임의 중요한 매개 변수입니다 세션 길이. 세션 길이가 유한 한 브레이크 포인트는 거짓 값에 캡을 넣을 수 있으며, 이는 비정상적자가 투여 또는 증가 포스트 보강 일시의 속도를 감소 사전 치료에 의해 악화 될 수있다. .이 혼란은 접근 방법의 수에 의해 극복 될 수있다. 예를 들어, 세션 동물은 평균 간 투여 간격의 일부 복수로 응답을 원천 징수 한 경우 종료 (44)이 방법의 더 일반적으로 적용 변형이 응답 한 번 세션을 종료하는 것입니다 주제에 걸쳐 일정하게 유지된다 일부 경험적으로 결정된 값으로 원천 징수하고. 우리는 단계 4.4.9.11에이 방법을 적용 할 수있는 방법을 제공하고 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
MSB is supported by the Alcohol Beverage Medical Research Foundation, a Center for Translational Research Award (UL1 TR000058), the National Institutes for Alcohol Abuse and Alcoholism (P50 AA022537), and startup funds provided by the Virginia Higher Education Equipment Trust Fund and the VCU School of Medicine.
Cannula Tubing | Amazon Supply/ Small Parts | HTXX-26T-60 | 26 gauge, Hypotube S/S 316-TW 26GA |
Obturator | Amazon Supply/ Small Parts | GWXX-0080-30-05 | 33 gauge, Wire S/S 316LVM 0.008 IN |
Microinjector Wire | MicroGroup | 33RW 304 | 33 gauge |
Super Glue | Loctite | 3924AC | Liquid, Non-gel, can be autoclaved |
Microinjector Plastic Tubing | Becton Dickson | 427406 | PE20 |
Medium Weight Hemostats | World Precision Instruments | 501241-G | |
Ruler | Fisher | 09-016 | 150 mm |
#7 Forceps | Stoelting | 52100-77 | Dumont, Dumostar |
Rotary Tool | Dremmel | 285 | Two-speeds |
Cut-off Disc | McMaster Carr | 3602 | 15/16" x 0.025" |
Microinjection Pump | Harvard Apparatus | PhD 2000 | |
1 ul Glass Syringe | Hamilton | 7001KH | Needle Style: 25s/2.75"/3 |
Cotton Tipped Applicator | Fisher | 23-400-101 | |
Lab Wipes | Kimwipes | 34133 | |
Operant Software | Coulbourn | Graphic State | |
Operant Chambers | Coulborun | Habitest |