Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.
Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.
Rodents and humans respond in remarkably similar ways to behaviorally relevant stimuli1-3. This suggests that rodents are appropriate subjects for elucidating the molecular substrates of behavior and complex psychiatric conditions4. Understanding the molecular substrates of complex behavioral processes, such as motivation, frequently requires brain microinjection. Both the brain microinjection technique and a primary motivation assay will be presented here. Rats will be used as subjects, but these procedures can readily be adapted to well-handled mice. Included herein are procedures for the manufacture of the required cannulae, obturators (dummy cannulae or stylets), and microinjectors. The method presented is significantly more flexible and more cost-efficient than prefabricated implements. This flexibility will prove valuable when optimizing conditions. Importantly, because the microinjection procedure can be used to test a myriad of hypotheses; the techniques presented here should be broadly applicable. For example, receptor ligands can be microinjected to understand neurochemistry3,5,6; cell-permeable peptides and small-molecules can be microinjected to understand intracellular signaling pathways7-10; toxins, ion channel blockers, or antagonist cocktails can be microinjected to understand circuitry1,11,12.
While the generic protocol presented here can be readily adapted by the user for their particular needs, the procedure is particularly well suited for behavioral assays since microinjection occurs in awake rodents that are only under mild hand restraint. No anesthesia or special restraints are required. This is possible because the brain itself lacks pain sensation. However, if anesthesia is not used, microinjection must occur through cannulae that were previously stereotaxically implanted. This is because nociceptors are present on the scalp, meninges,13 which are the membranes surrounding the brain, and the periosteum,14 which is the membrane covering the skull. It should be noted that microinjection under anesthesia is sometimes desirable. One example is when the virus is being injected, and one may wish to inject virus directly through either stainless steal needles15 or glass pipettes because this can reduce tissue damage and improve transduction efficiency.16,17 The microinjectors described below can be modified for this purpose and suggestions on how to do this can be found in the Discussion. Because other JoVE articles have demonstrated stereotaxic brain cannula implantation,18-20 these procedures will not be covered here.
We present these microinjection procedures together with an assay that quantifies motivation. Several rodent models of motivated behavior are currently in use, such as the runway box and barrier scaling. Here, we describe how to use an operant progressive ratio schedule of reinforcement to quantify motivation where operant responding is being maintained by a reinforcer. Responding on the progressive ratio is responsive to reinforcer magnitude.21,22 Accordingly, this assay is routinely used as a proxy for motivation and/or reinforcing efficacy. 21,23-30 Because several excellent reviews have covered this topic in detail,21,24 we will focus mainly on practical concerns.
Tillvägagångssättet som presenteras här är ett effektivt sätt att tillverka mikroinjektion kanyler och microinjectors som kommer att hjälpa att belysa molekylära substrat av motiverat beteende. Denna metod har flera fördelar. Först genom att tillverka sina egna implantat och microinjectors, nya experimentella parametrar kan snabbt optimeras, dvs behöver man inte vänta på skräddarsydda komponenter att komma fram. För det andra, på grund av den lilla diametern hos kanylen, fler kanyler kan samtidigt implanteras. Detta förkortar krävs kirurgisk tid, vilket kan förbättra överlevnadsförmåga, och tillåter också flera implantat per djur. För det tredje, den programvara som används för att styra operant kammare rymmer lätt progressiva förhållandet scheman sedan ett fast förhållande paradigm snabbt kan omvandlas till en progressiv förhållande paradigm genom att helt enkelt applicera en händelse övergångsparameterlista som innehåller den önskade förstärkningsschema.
Att varai stort sett bra, var en generisk mikroinjektion förfarande presenteras som bör vara brett tillämpbar för mikroinjektion av nästan alla reagens för närvarande finns. Därför räknar vi med att denna teknik kommer att fortsätta att vara av liknande hög användbarhet i framtiden med mindre modifiering. Genom att bara ändra några variabler, kan tillämpas denna inställning till ett stort antal reagens. Parametrar som oftast skulle manipuleras innefattar den längd som microinjector skjuter ut från kanylen, injektionsvolym, och injektionshastighet. Till exempel kan en vill injektorn att skjuta ut längre från kanylens spets för att undvika gliaceller ärr som typiskt bildas runt kroniska implantat. Dessutom kan man önska att injicera en större volym. För striatala virusmikroinjektioner, är en volym av 1 mikroliter användes typiskt och denna volym är typiskt injiceras under en längre tidsperiod (ofta 7-10 min plus tre – tio minuter extra diffusionstid) jämfört med denna användningd för farmakologiska reagenser (typiskt 0,3 – 0,5 mikroliter över 2 – 3 min plus 1 – 3 min ytterligare diffusionstid). Användaren bör konsultera litteraturen och / eller empiriskt bestämma parametrarna bäst lämpade för deras behov. Oavsett, är framgången för detta förfarande kritiskt beroende av 4 variabler: 1) kanyllängd, 2) microinjector längd, 3) Kvaliteten på microinjector spraymönster, och 4) systemets funktionsduglighet före injektion. Eftersom mikroinjektion läge är beroende av det djup som microinjector skjuter ut från kanylen, är det absolut nödvändigt att både kanyler (steg 1.2.8) och microinjector längd (efter-böjning, steg 2.2.1) är båda exakt känd och likformig mellan alla ämnen . Detta kan enkelt styras med lätt avvisa alla redskap som inte är önskad längd vid den slutliga re-mätning. Dessutom kan injektionen plats endast förutsägas om den inträffar omedelbart nedanför styr kanylen. Således någon mikroinjektor som does inte spraya en lång, fin ström vid provning (steg 2.4.6) bör förkastas. En kvalitet injektion är också relaterad till integritet systemet före injektion. Om efter doseringen allt vatten från injektorn (före fyllning med reagens) flera fläckar observeras på laboratorie torka, sedan en läcka måste åtgärdas (Notera på steg 2.4.8). Vidare, om bubblan (steg 2.4.9) som separerar läkemedlet från vattnet i PE20 slangen inte är en, enda bubbla (efter fyllning microinjector med reagens), då injektorn är delvis igensatt. Denna täppa kan antingen förhindra eller avleda injektionen. Även detta kan lätt åtgärdas (Obs på steg 2.4.8).
Ska man vill mikroinjicera medan djuret är i stereotaxic ramen finns tre alternativ. För det första kunde en öka längden på microinjector kragen så att den kan hållas fast av stereotaxic manipulatorn och även sträcka sig tillräckligt långt för att tillåta anslutning till PE20-slang. För det andra, påe kan temporärt implantera en kanyl och använda standard microinjector presenteras här. För det tredje, en kunde använda dras och polerade glaspipetter. 16,17
En betydande begränsning av förfarandet som presenteras här är att det är bäst bedrivs i väl hanteras råttor som är bekanta med förfarandet. Råttor som används för de uppgifter som beskrivs i avsnittet resultat krävs hantering inga speciella rutiner eftersom samma utredare hanteras råttorna dagligen i över två månader. Detta inkluderade daglig observation och manipulering av kirurgiska implantat för minst 2 veckor. Emellertid kan råttor snabbt habituated genom ett antal tekniker som används för att före förpulsen inhibitionsanalysen, som kan påverkas av stress. Dessa särskilda tillvänjning tekniker har varit snyggt detalj tidigare. 43 Förutom dessa förfaranden, är det lämpligt att råttor ska vana vid mikroinjektion förfarande där förkortade microinjectors används during "simulerad" injektioner. Under dessa simulerade injektioner, är det viktigt att microinjector inte sticka in i vävnaden för att begränsa vävnadsskada. Med andra ord bör microinjector böjas inte längre än 14 mm. Sålunda kunde grundlig tillvänjning krävs för optimalt genomförande av denna teknik ses som en begränsning.
Medan flera beteende paradigm finns för att mäta motivation, är den progressiva förhållandet vanligen används för att kvantifiera den ansträngning som motivet är villig att utöva för att få en förstärkare. Den progressiva förhållandet paradigm ger ett mått som kallas brytpunkt, som ofta definieras som det maximala antalet hävarmspressar i det senast avslutade förhållandet,.. Dvs maximal svarar som genererade en förstärkare 21 progressiva förhållandet är känslig för förstärkare storlek. Exempelvis högre kokain (eller sackaros) doser producera en högre brytpunkt och lägre kokain (eller sackaros) doser ge en lägre breakpGemensamma. 21,22 Följaktligen är brytpunkt ett rutinmässigt används proxy för motivation och / eller förstärka effekten. 21,23-26 Eftersom avsikten med brytpunkten är att avgöra när djuret slutar svara, en viktig parameter för den progressiva förhållandet paradigm är sessionslängd. Finita sessionslängder kan sätta en falsk mössa på brytpunkts värderingar och detta kan förvärras av förbehandlingar som onormalt minskar graden av självadministrering eller som ökar efter förstärkning paus. Denna FÖRBRYLLA kan övervinnas genom ett antal tillvägagångssätt,.. T.ex. sessioner som avslutas när djuret har undanhållit att svara med en multipel av den genomsnittliga mellan infusionsintervallet 44 En mer allmänt tillämpade variant av denna metod är att avsluta sessioner en gång svara har undanhållits av vissa empiriskt bestämt värde som hålls konstant över ämnen. Vi har gett metoden för att tillämpa denna metod i steg 4.4.9.11.
The authors have nothing to disclose.
MSB is supported by the Alcohol Beverage Medical Research Foundation, a Center for Translational Research Award (UL1 TR000058), the National Institutes for Alcohol Abuse and Alcoholism (P50 AA022537), and startup funds provided by the Virginia Higher Education Equipment Trust Fund and the VCU School of Medicine.
Cannula Tubing | Amazon Supply/ Small Parts | HTXX-26T-60 | 26 gauge, Hypotube S/S 316-TW 26GA |
Obturator | Amazon Supply/ Small Parts | GWXX-0080-30-05 | 33 gauge, Wire S/S 316LVM 0.008 IN |
Microinjector Wire | MicroGroup | 33RW 304 | 33 gauge |
Super Glue | Loctite | 3924AC | Liquid, Non-gel, can be autoclaved |
Microinjector Plastic Tubing | Becton Dickson | 427406 | PE20 |
Medium Weight Hemostats | World Precision Instruments | 501241-G | |
Ruler | Fisher | 09-016 | 150 mm |
#7 Forceps | Stoelting | 52100-77 | Dumont, Dumostar |
Rotary Tool | Dremmel | 285 | Two-speeds |
Cut-off Disc | McMaster Carr | 3602 | 15/16" x 0.025" |
Microinjection Pump | Harvard Apparatus | PhD 2000 | |
1 ul Glass Syringe | Hamilton | 7001KH | Needle Style: 25s/2.75"/3 |
Cotton Tipped Applicator | Fisher | 23-400-101 | |
Lab Wipes | Kimwipes | 34133 | |
Operant Software | Coulbourn | Graphic State | |
Operant Chambers | Coulborun | Habitest |