Photopatterning Proteiner og celler i vandig miljø Bruke TiO<sub> 2</sub> Photocatalysis
Summary
We describe a protocol for modifying cell affinity of a scaffold surface in aqueous environment. The method takes advantage of titanium dioxide photocatalysis to decompose organic film in the photo-irradiated region. We show that it can be used to create microdomains of scaffolding proteins, both ex situ and in situ.
Abstract
Organiske forurensninger som er adsorbert på overflaten av titandioksyd (TiO2) kan dekomponeres ved fotokata under ultrafiolett lys (UV). Her beskriver vi en roman protokoll ansette TiO 2 photocatalysis til lokalt endre celle affinitet av underlaget overflaten. For dette forsøk ble en tynn film var TiO 2 frese-belagt på et dekkglass, og TiO 2 flaten ble deretter modifisert med et organosilan monolag avledet fra octadecyltrichlorosilane (OTS), som hemmer celleadhesjon. Prøven ble neddykket i et cellekulturmedium, og fokusert UV-lys ble bestrålt til en åttekantet område. Når en neuronal cellelinje PC12-celler ble sådd ut på prøven, cellene klebet bare på den UV-bestrålte området. Vi viser videre at denne overflatemodifikasjon kan også utføres in situ, det vil si, selv når cellene vokser på substratet. Riktig modifisering av overflaten kreves en ekstracellulær matriks protein kollagen som kan være tilstede i mediet ved UV-bestråling. Teknikken som presenteres her kan potensielt benyttes i mønstrings flere celletyper for å konstruere coculture systemer eller å vilkårlig manipulere celler i henhold til kulturen.
Introduction
Semiconductor litografi prosesser og dets derivater – for eksempel fotolitografi 1,2, elektronstråle litografi 3-6, og mikro utskrift 7-10 – har nå blitt et etablert verktøy i cellebiologi å vokse levende celler i en definert posisjon og geometri. Mønstringen Metoden baserer seg på bruk av microfabricated substrater, bestående av mikro-øya celle ettergivende belegg i en ikke-permissive bakgrunn. Et slikt substrat tjener som en mal for å mønster cellene. Disse teknologier har gitt oss de nye metoder for å konstruere celler og deres funksjon ved et en- og flercellenivå, for å trekke ut de iboende egenskapene til cellene, og for å øke gjennomstrømningen av cellebasert medikament screening 11.
Graden-av-frihet i celle mønster ville øke hvis malen mønsteret geometrien kan bli endret in situ, dvs. mens cellene dyrkes på surface. De konvensjonelle metoder for mønsterdannelse kan ikke direkte brukes her, siden de behandle prøvene i atmosfære eller i vakuum. Derfor ulike nye overflate modifikasjon teknikker har blitt foreslått, som er basert på, for eksempel, på fotoreaktive forbindelser 12,13 eller laser ablasjon 5,14, bare for å nevne noen. De foreslåtte metoder har blitt pent anmeldt av Robertus et al. 15, og mer nylig av Choi et al. 16 og ved Nakanishi 17.
Her i denne artikkelen beskriver vi en ny protokoll av in-situ overflatemodifisering, som tar fordel av fotokatalytisk nedbrytning av organiske molekyler på en titandioksid (TiO 2) overflate 18,19. I denne fremgangsmåten blir et TiO 2 film lagt inn mellom glasset underlaget og den organiske film som grensesnitt cellene, og den organiske film brytes ned in situ ved lokal bestråling av ultrafiolett (UV)lys til en region av interesse (λ <388 nm). Vi viser at den nye protokoll kan benyttes for å lage micropatterns av ekstracellulære matriksproteiner og levende celler både ex situ og in situ. TiO 2 er biokompatible, kjemisk stabilt, og optisk transparent, egenskaper som gjør det vennlig å innføre i cellekultur eksperimenter. Denne protokollen gir en materialvitenskap-basert alternativ for å endre cellekultur stillasene i celle-kultur miljø.
Protocol
Representative Results
Discussion
I vår nåværende protokollen, ble TiO 2 film dannet av RF-magnetronsputring. Vi foretrekker denne metoden for deponering, siden det gjør det mulig å fremstille reproduserbart en fotokatalytisk TiO 2 film med en sub-nm ruhet. Selv frese deponering prosesser er kjent for materialer forskere og elektroniske ingeniører, kan det ikke være ganske tilgjengelig for biologer. I så fall ville spin-belagte TiO 2 film være et alternativt valg 23. I denne fremgangsmåten blir TiO <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors thank Mr. Kotaro Okubo for the kind assistance with SEM imaging. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science Grant-in-Aid for Basic Research (B) (20310069), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (25880021), and by research grants from the Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation and the Nippon Sheet Glass Foundation for Materials Science and Engineering.
Materials
| Glass coverslip | Warner Instruments | CS-15R15 | 15 mm, #1.5 thickness |
| Diamond scriber | Ogura Jewel Industry | D-Point Pen | |
| RF sputtering system | ANELVA | SPC350 | |
| TiO2 sputtering target | Kojundo Chemical Lab | Titanium (IV) oxide, target | Purity, 99.9% |
| Plasma reactor | Yamato | PR301 | |
| n-octadecyltrichlorosilane (OTS) |
Aldrich | 104817 | |
| Toluene | Wako | 204-01866 | |
| Tissue-culture dish (35 mm) | Greiner | 627160 | |
| Tissue-culture dish (60 mm) | BD Falcon | 353002 | |
| Type-IV collagen | Nitta Gelatin | Cellmatrix Type IV | |
| D-PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | Heat-inactivate and pass through a 0.22 mm filter before use |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | Pass through a 0.22 mm filter before use |
| Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai tesque | 26253-84 | |
| 7S nerve growth factor (NGF) | Alomone Labs | N-130 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Dojindo | N001 | Stock solution in 0.5 M |
| TiO2 nanoparticle | Tayca | TKD-701 |
References
- Hughes, M. A., Brennan, P. M., Bunting, A. S., Shipston, M. J., Murray, A. F. Cell Patterning on Photolithographically Defined Parylene-C: SiO2 Substrates. J. Vis. Exp. (85), e50929 (2014).
- Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled Outgrowth of Dissociated Neurons on Patterned Substrates. J. Neurosci. 8, 4098-4120 (1988).
- Pensen, D., Heinz, W. F., Werbin, J. L., Hoh, J. H., Haviland, D. B. Electron Beam Patterning of Fibronectin Nanodots that Support Focal Adhesion Formation. Soft Matter. 3, 1280-1284 (2007).
- Tanii, T., et al. Application of Organosilane Monolayer Template to Quantitative Evaluation of Cancer Cell Adhesive Ability. Jpn. J. Appl. Phys. 50, 06GL01 (2011).
- Yamamoto, H., et al. In-Situ Guidance of Individual Neuronal Processes by Wet Femtosecond Laser Processing of Self-Assembled Monolayers. Appl. Phys. Lett. 99, 163701-1610 (2011).
- Yamamoto, H., et al. Differential Neurite Outgrowth is Required for Axon Specification by Cultured Hippocampal Neurons. J. Neurochem. 123, 904-910 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
- Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).
- Singhvi, R., et al. Engineering Cell Shape and Function. Science. 264, 696-698 (1126).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
- Degot, S., et al. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects using Micropatterned Cells. J. Vis. Exp. (46), e2514 (2010).
- Nakanishi, J., et al. Photoactivation of a Substrate for Cell Adhesion under Standard Fluorescence Microscopes. J. Am. Chem. Soc. 126, 16314-16315 (2004).
- Kim, M., et al. Addressable Micropatterning of Multiple Proteins and Cells by Microscope Projection Photolithography Based on a Protein Friendly Photoresist. Langmuir. 26, 12112-12118 (2010).
- Deka, G., Okano, K., Kao, F. -. J. Dynamic Photopatterning of Cells In Situ by Q-Switched Neodymium-Doped Yttrium Ortho-Vanadate. Laser. J. Biomed. Opt. 19, 011012 (2014).
- Robertus, J., Browne, W. R., Feringa, B. L. Dynamic Control over Cell Adhesive Properties using Molecular-Based Surface Engineering Strategies. Chem. Soc. Rev. 39, 354-378 (2010).
- Choi, I., Yeo, W. -. S. Self-Assembled Monolayers with Dynamicity Stemming from (Bio)chemical Conversions: From Construction to Application. ChemPhysChem. 14, 55-69 (2013).
- Nakanishi, J. Switchable Substrates for Analyzing and Engineering Cellular Functions. Chem. Asian J. 9, 406-417 (2014).
- Yamamoto, H., et al. In Situ Modification of Cell-Culture Scaffolds by Photocatalytic Decomposition of Organosilane Monolayers. Biofabrication. 6, 035021 (2014).
- Sekine, K., Yamamoto, H., Kono, S., Ikeda, T., Kuroda, A., Tanii, T. Surface Modification of Cell Scaffold in Aqueous Solution using TiO2 Photocatalysis and Linker Protein L2 for Patterning Primary Neurons. e-J. Surf. Sci. Nanotech. 13, 213-218 (2015).
- Arima, Y., Iwata, H. Effects of Surface Functional Groups on Protein Adsorption and Subsequent Cell Adhesion using Self-Assembled Monolayers. J. Mater. Chem. 17, 4079-4087 (2007).
- Fujishima, A., Zhang, X., Tryk, D. A. TiO2 Photocatalysis and Related Surface Phenomena. Surf. Sci. Rep. 63, 515-582 (2008).
- Sigal, G. B., Mrksich, M., Whitesides, G. M. Effect of Surface Wettability on the Adsorption of Proteins and Detergents. J. Am. Chem. Soc. 120, 3464-3473 (1998).
- Zhang, X., et al. A Transparent and Photo-Patternable Superhydrophobic Film. Chem. Commun. 2007, 4949-4951 (1039).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing Hippocampal Neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
