Photopatterning Proteiner og celler i vandigt miljø Brug TiO<sub> 2</sub> Photocatalysis
Summary
We describe a protocol for modifying cell affinity of a scaffold surface in aqueous environment. The method takes advantage of titanium dioxide photocatalysis to decompose organic film in the photo-irradiated region. We show that it can be used to create microdomains of scaffolding proteins, both ex situ and in situ.
Abstract
Organiske forureninger adsorberet på overfladen af titandioxid (TiO2) kan nedbrydes ved fotokatalyse under ultraviolet (UV) lys. Her beskriver vi en ny protokol anvender TiO2 fotokatalyse lokalt ændrer celle affinitet substratoverfladen. Til dette forsøg, en tynd TiO2 film blev Katodeforstøvningscoatet på et dækglas, og TiO 2 overfladen blev efterfølgende modificeret med en organosilan monolag afledt af octadecyltrichlorsilan (OTS), som inhiberer celleadhæsion. Prøven blev nedsænket i et celledyrkningsmedium, og fokuseret UV-lys blev bestrålet til et ottekantet region. Når en neuronal cellelinje PC12-celler blev udpladet på prøven, celler klæbet kun på UV-bestrålet område. Vi viser endvidere, at denne overflademodifikation kan også udføres in situ, dvs., selv når cellerne vokser på substratet. Korrekt modifikation af overfladen kræves en ekstracellulær matrix protein collagen til stede i mediet på tidspunktet for UV-bestråling. Teknikken præsenteres her kan potentielt anvendes i mønstergivende flere celletyper til konstruktion cokultur eller til vilkårligt manipulere celler under kultur.
Introduction
Halvlederlitografi processer og dets derivater – såsom fotolitografi 1,2, elektron-litografi 3-6, og mikrokontakt-printing 7-10 – er nu blevet en etableret redskab i cellebiologi til at vokse levende celler i en defineret position og geometri. Den mønsterdannelse Fremgangsmåden er baseret på anvendelsen af mikrofabrikerede substrater, der består af mikro-ø-celle permissiv belægning på en ikke-permissiv baggrund. Sådant substrat tjener som skabelon til mønster cellerne. Disse teknologier har givet os de nye metoder til at ingeniør celler og deres funktion på en enkelt- og multi-cellulært niveau, at udtrække de iboende egenskaber celler, og øge omsætningen af cellebaserede lægemiddel-screening 11.
Graden-of-frihed i celle mønster vil i høj grad øge hvis skabelonen mønster geometri kan ændres på stedet, dvs mens celler dyrkes på sverflade. De konventionelle fremgangsmåder til mønsterdannelse kan ikke anvendes direkte her, idet de behandler prøver i atmosfæren eller i vakuum. Er blevet foreslået derfor forskellige nye overflade modifikation, som er baseret fx på fotoreaktive forbindelser 12,13 eller laser ablation 5,14, bare for at nævne nogle få. De foreslåede metoder er blevet pænt gennemgået af Robertus et al. 15, og for nylig af Choi et al. 16 og af Nakanishi 17.
Her i denne artikel beskriver vi en ny protokol in-situ overfladebehandling, der udnytter fotokatalytisk nedbrydning af organiske molekyler på en titaniumdioxid (TiO2) overflade 18,19. I denne fremgangsmåde indsættes et TiO 2 film mellem glassubstratet og den organiske film, grænseflader cellerne, og den organiske film nedbrydes in situ ved lokalt at bestråle ultraviolet (UV)lys til et område af interesse (λ <388 nm). Vi viser, at den nye protokol kan bruges til at oprette micropatterns af ekstracellulære matrix proteiner og levende celler både ex situ og in situ. TiO 2 er biokompatibel, kemisk stabil og optisk transparente, i hvilken forbindelse gør det egnet til at indføre i celle-kultur eksperimenter. Denne protokol giver en materialevidenskab-baserede alternativ til at modificere celle-kultur stilladser i celle-kultur miljø.
Protocol
Representative Results
Discussion
I vores nuværende protokol blev TiO2 film dannet af RF-magnetronforstøvning. Vi går ind for denne metode til deponering, da det giver os mulighed for reproducerbart udarbejde en fotokatalytisk TiO2 film med en sub-nm ruhed. Selvom sputterbelægning processer er velkendte for materialer forskere og elektroniske ingeniører, kan det ikke være helt tilgængelig for biologer. I så fald ville spin-coated TiO2 film være et alternativ valg 23. Ved denne fremgangsmåde er TiO <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors thank Mr. Kotaro Okubo for the kind assistance with SEM imaging. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science Grant-in-Aid for Basic Research (B) (20310069), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (25880021), and by research grants from the Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation and the Nippon Sheet Glass Foundation for Materials Science and Engineering.
Materials
| Glass coverslip | Warner Instruments | CS-15R15 | 15 mm, #1.5 thickness |
| Diamond scriber | Ogura Jewel Industry | D-Point Pen | |
| RF sputtering system | ANELVA | SPC350 | |
| TiO2 sputtering target | Kojundo Chemical Lab | Titanium (IV) oxide, target | Purity, 99.9% |
| Plasma reactor | Yamato | PR301 | |
| n-octadecyltrichlorosilane (OTS) |
Aldrich | 104817 | |
| Toluene | Wako | 204-01866 | |
| Tissue-culture dish (35 mm) | Greiner | 627160 | |
| Tissue-culture dish (60 mm) | BD Falcon | 353002 | |
| Type-IV collagen | Nitta Gelatin | Cellmatrix Type IV | |
| D-PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | Heat-inactivate and pass through a 0.22 mm filter before use |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | Pass through a 0.22 mm filter before use |
| Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai tesque | 26253-84 | |
| 7S nerve growth factor (NGF) | Alomone Labs | N-130 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Dojindo | N001 | Stock solution in 0.5 M |
| TiO2 nanoparticle | Tayca | TKD-701 |
References
- Hughes, M. A., Brennan, P. M., Bunting, A. S., Shipston, M. J., Murray, A. F. Cell Patterning on Photolithographically Defined Parylene-C: SiO2 Substrates. J. Vis. Exp. (85), e50929 (2014).
- Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled Outgrowth of Dissociated Neurons on Patterned Substrates. J. Neurosci. 8, 4098-4120 (1988).
- Pensen, D., Heinz, W. F., Werbin, J. L., Hoh, J. H., Haviland, D. B. Electron Beam Patterning of Fibronectin Nanodots that Support Focal Adhesion Formation. Soft Matter. 3, 1280-1284 (2007).
- Tanii, T., et al. Application of Organosilane Monolayer Template to Quantitative Evaluation of Cancer Cell Adhesive Ability. Jpn. J. Appl. Phys. 50, 06GL01 (2011).
- Yamamoto, H., et al. In-Situ Guidance of Individual Neuronal Processes by Wet Femtosecond Laser Processing of Self-Assembled Monolayers. Appl. Phys. Lett. 99, 163701-1610 (2011).
- Yamamoto, H., et al. Differential Neurite Outgrowth is Required for Axon Specification by Cultured Hippocampal Neurons. J. Neurochem. 123, 904-910 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
- Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).
- Singhvi, R., et al. Engineering Cell Shape and Function. Science. 264, 696-698 (1126).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
- Degot, S., et al. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects using Micropatterned Cells. J. Vis. Exp. (46), e2514 (2010).
- Nakanishi, J., et al. Photoactivation of a Substrate for Cell Adhesion under Standard Fluorescence Microscopes. J. Am. Chem. Soc. 126, 16314-16315 (2004).
- Kim, M., et al. Addressable Micropatterning of Multiple Proteins and Cells by Microscope Projection Photolithography Based on a Protein Friendly Photoresist. Langmuir. 26, 12112-12118 (2010).
- Deka, G., Okano, K., Kao, F. -. J. Dynamic Photopatterning of Cells In Situ by Q-Switched Neodymium-Doped Yttrium Ortho-Vanadate. Laser. J. Biomed. Opt. 19, 011012 (2014).
- Robertus, J., Browne, W. R., Feringa, B. L. Dynamic Control over Cell Adhesive Properties using Molecular-Based Surface Engineering Strategies. Chem. Soc. Rev. 39, 354-378 (2010).
- Choi, I., Yeo, W. -. S. Self-Assembled Monolayers with Dynamicity Stemming from (Bio)chemical Conversions: From Construction to Application. ChemPhysChem. 14, 55-69 (2013).
- Nakanishi, J. Switchable Substrates for Analyzing and Engineering Cellular Functions. Chem. Asian J. 9, 406-417 (2014).
- Yamamoto, H., et al. In Situ Modification of Cell-Culture Scaffolds by Photocatalytic Decomposition of Organosilane Monolayers. Biofabrication. 6, 035021 (2014).
- Sekine, K., Yamamoto, H., Kono, S., Ikeda, T., Kuroda, A., Tanii, T. Surface Modification of Cell Scaffold in Aqueous Solution using TiO2 Photocatalysis and Linker Protein L2 for Patterning Primary Neurons. e-J. Surf. Sci. Nanotech. 13, 213-218 (2015).
- Arima, Y., Iwata, H. Effects of Surface Functional Groups on Protein Adsorption and Subsequent Cell Adhesion using Self-Assembled Monolayers. J. Mater. Chem. 17, 4079-4087 (2007).
- Fujishima, A., Zhang, X., Tryk, D. A. TiO2 Photocatalysis and Related Surface Phenomena. Surf. Sci. Rep. 63, 515-582 (2008).
- Sigal, G. B., Mrksich, M., Whitesides, G. M. Effect of Surface Wettability on the Adsorption of Proteins and Detergents. J. Am. Chem. Soc. 120, 3464-3473 (1998).
- Zhang, X., et al. A Transparent and Photo-Patternable Superhydrophobic Film. Chem. Commun. 2007, 4949-4951 (1039).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing Hippocampal Neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
