TiO का प्रयोग जलीय वातावरण में प्रोटीन और कोशिकाओं Photopatterning<sub> 2</sub> Photocatalysis
Summary
We describe a protocol for modifying cell affinity of a scaffold surface in aqueous environment. The method takes advantage of titanium dioxide photocatalysis to decompose organic film in the photo-irradiated region. We show that it can be used to create microdomains of scaffolding proteins, both ex situ and in situ.
Abstract
टाइटेनियम डाइऑक्साइड की सतह (2 Tio) पर adsorbed जैविक contaminants पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के तहत photocatalysis द्वारा विघटित किया जा सकता है। यहाँ हम स्थानीय स्तर पर सब्सट्रेट सतह की सेल आत्मीयता को बदलने के लिए 2 Tio photocatalysis रोजगार एक उपन्यास प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस प्रयोग के लिए, एक पतली 2 Tio फिल्म धूम में लिपटे एक गिलास coverslip पर था, और 2 Tio सतह बाद में सेल आसंजन को रोकता है जो octadecyltrichlorosilane (ओटीएस) से ली गई एक organosilane monolayer, साथ संशोधित किया गया था। नमूना एक सेल संस्कृति माध्यम में डूबे, और पराबैंगनी प्रकाश एक अष्टकोणीय क्षेत्र के लिए किरणित था ध्यान केंद्रित किया गया। एक neuronal सेल लाइन PC12 कोशिकाओं के नमूने पर चढ़ाया गया है, कोशिकाओं केवल यूवी विकिरणित क्षेत्र पर पालन। हम आगे कोशिकाओं सब्सट्रेट पर बढ़ रहे हैं, तब भी जब यह सतह संशोधन भी यानी, बगल में प्रदर्शन किया जा सकता है। सतह के समुचित संशोधन एक बाह्य मैट्रिक्स पी आवश्यककोलेजन rotein पराबैंगनी विकिरण के समय में मध्यम में उपस्थित होने के लिए। यहां प्रस्तुत तकनीक संभावित संस्कृति के तहत कोशिकाओं coculture सिस्टम के निर्माण या मनमाने ढंग से हेरफेर करने के लिए patterning के अनेक प्रकार की कोशिकाओं में नियोजित किया जा सकता है।
Introduction
सेमीकंडक्टर लिथोग्राफी प्रक्रियाओं और उसके डेरिवेटिव – जैसे फोटोलिथोग्राफी 1,2, इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी 3-6, 7-10 और मुद्रण microcontact के रूप में – अब एक परिभाषित स्थिति और ज्यामिति में रहने वाले कोशिकाओं को विकसित करने के लिए कोशिका जीव विज्ञान में एक स्थापित उपकरण बन गए हैं। patterning विधि एक गैर अनुमोदक पृष्ठभूमि में सेल अनुमोदक कोटिंग की सूक्ष्म द्वीप से मिलकर, microfabricated substrates के उपयोग पर निर्भर करता है। इस तरह के सब्सट्रेट पैटर्न कोशिकाओं के लिए एक टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है। इन प्रौद्योगिकियों हमें कोशिकाओं के आंतरिक गुणों को निकालने के लिए, और सेल आधारित दवा स्क्रीनिंग 11 के throughput बढ़ाने के लिए, एक एकल और बहु-कोशिकीय स्तर पर कोशिकाओं और उनके कार्य करने के लिए इंजीनियर उपन्यास तरीकों प्रदान की है।
टेम्पलेट पैटर्न ज्यामिति यानी, बगल में बदला जा सकता है, तो कोशिकाओं रों पर सुसंस्कृत हैं, जबकि डिग्री के-स्वतंत्रता सेल patterning में काफी वृद्धि होगीurface। वे वातावरण में या शून्य में नमूने प्रक्रिया के बाद से पैटर्न गठन के लिए पारंपरिक तरीकों सीधे, यहां लागू नहीं किया जा सकता है। इसलिए विभिन्न नई सतह संशोधन तकनीकों बस कुछ ही नाम के लिए, photoreactive यौगिकों 12,13 या लेजर पृथक 5,14 पर, जैसे, आधार पर कर रहे हैं, जो प्रस्तावित किया गया है। प्रस्तावित तरीकों अच्छी तरह से चोई एट अल। 16 और नाकानिशी 17 से अधिक हाल ही में। रॉबर्ट एट अल द्वारा 15 समीक्षा की, और कर दिया गया है।
इस लेख में, हम एक टाइटेनियम डाइऑक्साइड पर कार्बनिक अणुओं के photocatalytic अपघटन का लाभ लेता है, जिसमें सीटू सतह संशोधन, (2 TiO) सतह 18,19 के एक उपन्यास प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस विधि में, एक 2 Tio फिल्म कांच सब्सट्रेट और कोशिकाओं इंटरफेस है कि जैविक फिल्म के बीच में डाला जाता है, और जैविक फिल्म स्थानीय स्तर पर पराबैंगनी (यूवी) irradiating से बगल में विघटित किया जाता हैब्याज की एक क्षेत्र (λ <388 एनएम) के लिए प्रकाश। हम नए प्रोटोकॉल बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन और जीवित कोशिकाओं दोनों पूर्व सीटू की और बगल में micropatterns बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 2 Tio सेल संस्कृति प्रयोगों में लागू करने के लिए यह अनुकूल बनाता सुविधाओं, जिनमें से, biocompatible रासायनिक स्थिर, और ऑप्टिकली पारदर्शी है। इस प्रोटोकॉल सेल संस्कृति वातावरण में कोशिका-संस्कृति मचानों को संशोधित करने के लिए एक सामग्री विज्ञान आधारित विकल्प प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारे वर्तमान प्रोटोकॉल में, 2 Tio फिल्म आरएफ मैग्नेट्रान sputtering द्वारा बनाई गई थी। यह हमें reproducibly एक उप-एनएम खुरदरापन के साथ एक photocatalytic 2 Tio फिल्म तैयार करने के लिए अनुमति देता है के बाद से हम जमाव की इस वि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors thank Mr. Kotaro Okubo for the kind assistance with SEM imaging. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science Grant-in-Aid for Basic Research (B) (20310069), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (25880021), and by research grants from the Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation and the Nippon Sheet Glass Foundation for Materials Science and Engineering.
Materials
| Glass coverslip | Warner Instruments | CS-15R15 | 15 mm, #1.5 thickness |
| Diamond scriber | Ogura Jewel Industry | D-Point Pen | |
| RF sputtering system | ANELVA | SPC350 | |
| TiO2 sputtering target | Kojundo Chemical Lab | Titanium (IV) oxide, target | Purity, 99.9% |
| Plasma reactor | Yamato | PR301 | |
| n-octadecyltrichlorosilane (OTS) |
Aldrich | 104817 | |
| Toluene | Wako | 204-01866 | |
| Tissue-culture dish (35 mm) | Greiner | 627160 | |
| Tissue-culture dish (60 mm) | BD Falcon | 353002 | |
| Type-IV collagen | Nitta Gelatin | Cellmatrix Type IV | |
| D-PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | Heat-inactivate and pass through a 0.22 mm filter before use |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | Pass through a 0.22 mm filter before use |
| Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai tesque | 26253-84 | |
| 7S nerve growth factor (NGF) | Alomone Labs | N-130 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Dojindo | N001 | Stock solution in 0.5 M |
| TiO2 nanoparticle | Tayca | TKD-701 |
References
- Hughes, M. A., Brennan, P. M., Bunting, A. S., Shipston, M. J., Murray, A. F. Cell Patterning on Photolithographically Defined Parylene-C: SiO2 Substrates. J. Vis. Exp. (85), e50929 (2014).
- Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled Outgrowth of Dissociated Neurons on Patterned Substrates. J. Neurosci. 8, 4098-4120 (1988).
- Pensen, D., Heinz, W. F., Werbin, J. L., Hoh, J. H., Haviland, D. B. Electron Beam Patterning of Fibronectin Nanodots that Support Focal Adhesion Formation. Soft Matter. 3, 1280-1284 (2007).
- Tanii, T., et al. Application of Organosilane Monolayer Template to Quantitative Evaluation of Cancer Cell Adhesive Ability. Jpn. J. Appl. Phys. 50, 06GL01 (2011).
- Yamamoto, H., et al. In-Situ Guidance of Individual Neuronal Processes by Wet Femtosecond Laser Processing of Self-Assembled Monolayers. Appl. Phys. Lett. 99, 163701-1610 (2011).
- Yamamoto, H., et al. Differential Neurite Outgrowth is Required for Axon Specification by Cultured Hippocampal Neurons. J. Neurochem. 123, 904-910 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
- Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).
- Singhvi, R., et al. Engineering Cell Shape and Function. Science. 264, 696-698 (1126).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
- Degot, S., et al. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects using Micropatterned Cells. J. Vis. Exp. (46), e2514 (2010).
- Nakanishi, J., et al. Photoactivation of a Substrate for Cell Adhesion under Standard Fluorescence Microscopes. J. Am. Chem. Soc. 126, 16314-16315 (2004).
- Kim, M., et al. Addressable Micropatterning of Multiple Proteins and Cells by Microscope Projection Photolithography Based on a Protein Friendly Photoresist. Langmuir. 26, 12112-12118 (2010).
- Deka, G., Okano, K., Kao, F. -. J. Dynamic Photopatterning of Cells In Situ by Q-Switched Neodymium-Doped Yttrium Ortho-Vanadate. Laser. J. Biomed. Opt. 19, 011012 (2014).
- Robertus, J., Browne, W. R., Feringa, B. L. Dynamic Control over Cell Adhesive Properties using Molecular-Based Surface Engineering Strategies. Chem. Soc. Rev. 39, 354-378 (2010).
- Choi, I., Yeo, W. -. S. Self-Assembled Monolayers with Dynamicity Stemming from (Bio)chemical Conversions: From Construction to Application. ChemPhysChem. 14, 55-69 (2013).
- Nakanishi, J. Switchable Substrates for Analyzing and Engineering Cellular Functions. Chem. Asian J. 9, 406-417 (2014).
- Yamamoto, H., et al. In Situ Modification of Cell-Culture Scaffolds by Photocatalytic Decomposition of Organosilane Monolayers. Biofabrication. 6, 035021 (2014).
- Sekine, K., Yamamoto, H., Kono, S., Ikeda, T., Kuroda, A., Tanii, T. Surface Modification of Cell Scaffold in Aqueous Solution using TiO2 Photocatalysis and Linker Protein L2 for Patterning Primary Neurons. e-J. Surf. Sci. Nanotech. 13, 213-218 (2015).
- Arima, Y., Iwata, H. Effects of Surface Functional Groups on Protein Adsorption and Subsequent Cell Adhesion using Self-Assembled Monolayers. J. Mater. Chem. 17, 4079-4087 (2007).
- Fujishima, A., Zhang, X., Tryk, D. A. TiO2 Photocatalysis and Related Surface Phenomena. Surf. Sci. Rep. 63, 515-582 (2008).
- Sigal, G. B., Mrksich, M., Whitesides, G. M. Effect of Surface Wettability on the Adsorption of Proteins and Detergents. J. Am. Chem. Soc. 120, 3464-3473 (1998).
- Zhang, X., et al. A Transparent and Photo-Patternable Superhydrophobic Film. Chem. Commun. 2007, 4949-4951 (1039).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing Hippocampal Neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
