Photopatterning proteiner och celler i vattenmiljö Använda TiO<sub> 2</sub> Fotokatalys
Summary
We describe a protocol for modifying cell affinity of a scaffold surface in aqueous environment. The method takes advantage of titanium dioxide photocatalysis to decompose organic film in the photo-irradiated region. We show that it can be used to create microdomains of scaffolding proteins, both ex situ and in situ.
Abstract
Organiska föroreningar som adsorberats på ytan av titandioxid (TiOj 2) kan sönderdelas genom fotokatalys under ultraviolett (UV) ljus. Här beskriver vi ett nytt protokoll som använder TiOj 2 fotokatalys för att lokalt förändra cellaffinitet av substratytan. För detta experiment en tunn TiO 2 filmen var sputter-belagd på ett täckglas, och TiO 2 yta ändrades sedan med en organosilan monoskikt härlett från octadecyltrichlorosilane (OTS), vilket inhiberar celladhesion. Provet nedsänktes i ett cellodlingsmedium, och fokuserade UV-ljus bestrålades till en oktagonal regionen. När en neuronal cellinje PC12-celler ströks ut på provet, celler vidhäftade endast på UV-bestrålade området. Vi visar vidare att denna ytmodifiering kan också utföras in situ, dvs även när celler växer på substratet. Korrekt modifiering av ytan krävs en extracellulär matris protein kollagen för att vara närvarande i mediet vid tiden för UV-bestrålning. Tekniken som presenteras här kan potentiellt användas i mönstrings flera celltyper för att konstruera coculture system eller godtyckligt manipulera celler under odling.
Introduction
Halvledarlitografi processer och dess derivat – såsom fotolitografi 1,2, elektronstrålelitografi 3-6, och mikrokontakt utskrift 7-10 – har nu blivit en etablerad verktyg i cellbiologi att växa levande celler i en definierad position och geometri. Mönstringen metod förlitar sig på användningen av mikrofabricerade substrat, som består av mikro ön cell permissiv beläggning i en icke-permissiv bakgrund. Sådana substrat fungerar som en mall för att mönstra cellerna. Dessa tekniker har gett oss de nya metoderna för att modifiera celler och deras funktion vid en enkel- och multi-cellulär nivå, för att extrahera de inneboende egenskaperna hos celler, och för att öka genomströmningen av cellbaserade läkemedelsscreening 11.
Graden frihets i cell mönstring skulle i hög grad öka om att mallmönster geometri skulle kunna ändras på plats, det vill säga, medan celler odlas på Surface. De konventionella metoderna för mönsterbildning kan inte tillämpas direkt här, eftersom de behandlar samplen i atmosfär eller i vakuum. Därför olika nya ytmodifieringstekniker har föreslagits, som bygger, till exempel på fotoreaktiva föreningar 12,13 eller laserablation 5,14, bara för att nämna några. De föreslagna metoderna har varit snyggt granskats av Robertus et al. 15, och mer nyligen av et al. Choi 16 och Nakanishi 17.
Här i den här artikeln beskriver vi en ny protokoll in situ ytmodifieringen, som drar fördel av fotokatalytiska nedbrytning av organiska molekyler på en titandioxid (TiO 2) yta 18,19. I denna metod används en TiO 2 film införd mellan glassubstratet och den organiska filmen som samverkar cellerna, och den organiska filmen sönderdelas in situ genom lokalt bestrålning ultraviolett (UV)ljus till ett område av intresse (λ <388 nm). Vi visar att det nya protokollet kan användas för att skapa micropatterns av extracellulära matrixproteiner och levande celler både ex situ och in situ. TiO 2 är biokompatibla, kemiskt stabil och optiskt transparent, funktioner som gör det vänliga att införa i cellkulturförsök. Detta protokoll ger en materialvetenskap baserat alternativ för att modifiera cellkultur ställningar i cellkultur miljö.
Protocol
Representative Results
Discussion
I vårt nuvarande protokollet, var TiO 2 film bildad av RF-magnetronförstoftning. Vi föredrar denna metod för avsättning eftersom det ger oss möjlighet att reproducerbart framställa ett fotokatalytiskt TiO 2 film med en sub-nm råhet. Även sputtering processer är välkända för materialforskare och elektronikingenjörer, kan det inte vara helt tillgänglig för biologer. I så fall skulle spinnbelades TiO 2-film vara ett alternativt val 23. I denna metod, är TiO <sub…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors thank Mr. Kotaro Okubo for the kind assistance with SEM imaging. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science Grant-in-Aid for Basic Research (B) (20310069), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (25880021), and by research grants from the Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation and the Nippon Sheet Glass Foundation for Materials Science and Engineering.
Materials
| Glass coverslip | Warner Instruments | CS-15R15 | 15 mm, #1.5 thickness |
| Diamond scriber | Ogura Jewel Industry | D-Point Pen | |
| RF sputtering system | ANELVA | SPC350 | |
| TiO2 sputtering target | Kojundo Chemical Lab | Titanium (IV) oxide, target | Purity, 99.9% |
| Plasma reactor | Yamato | PR301 | |
| n-octadecyltrichlorosilane (OTS) |
Aldrich | 104817 | |
| Toluene | Wako | 204-01866 | |
| Tissue-culture dish (35 mm) | Greiner | 627160 | |
| Tissue-culture dish (60 mm) | BD Falcon | 353002 | |
| Type-IV collagen | Nitta Gelatin | Cellmatrix Type IV | |
| D-PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | Heat-inactivate and pass through a 0.22 mm filter before use |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | Pass through a 0.22 mm filter before use |
| Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai tesque | 26253-84 | |
| 7S nerve growth factor (NGF) | Alomone Labs | N-130 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Dojindo | N001 | Stock solution in 0.5 M |
| TiO2 nanoparticle | Tayca | TKD-701 |
References
- Hughes, M. A., Brennan, P. M., Bunting, A. S., Shipston, M. J., Murray, A. F. Cell Patterning on Photolithographically Defined Parylene-C: SiO2 Substrates. J. Vis. Exp. (85), e50929 (2014).
- Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled Outgrowth of Dissociated Neurons on Patterned Substrates. J. Neurosci. 8, 4098-4120 (1988).
- Pensen, D., Heinz, W. F., Werbin, J. L., Hoh, J. H., Haviland, D. B. Electron Beam Patterning of Fibronectin Nanodots that Support Focal Adhesion Formation. Soft Matter. 3, 1280-1284 (2007).
- Tanii, T., et al. Application of Organosilane Monolayer Template to Quantitative Evaluation of Cancer Cell Adhesive Ability. Jpn. J. Appl. Phys. 50, 06GL01 (2011).
- Yamamoto, H., et al. In-Situ Guidance of Individual Neuronal Processes by Wet Femtosecond Laser Processing of Self-Assembled Monolayers. Appl. Phys. Lett. 99, 163701-1610 (2011).
- Yamamoto, H., et al. Differential Neurite Outgrowth is Required for Axon Specification by Cultured Hippocampal Neurons. J. Neurochem. 123, 904-910 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
- Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).
- Singhvi, R., et al. Engineering Cell Shape and Function. Science. 264, 696-698 (1126).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
- Degot, S., et al. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects using Micropatterned Cells. J. Vis. Exp. (46), e2514 (2010).
- Nakanishi, J., et al. Photoactivation of a Substrate for Cell Adhesion under Standard Fluorescence Microscopes. J. Am. Chem. Soc. 126, 16314-16315 (2004).
- Kim, M., et al. Addressable Micropatterning of Multiple Proteins and Cells by Microscope Projection Photolithography Based on a Protein Friendly Photoresist. Langmuir. 26, 12112-12118 (2010).
- Deka, G., Okano, K., Kao, F. -. J. Dynamic Photopatterning of Cells In Situ by Q-Switched Neodymium-Doped Yttrium Ortho-Vanadate. Laser. J. Biomed. Opt. 19, 011012 (2014).
- Robertus, J., Browne, W. R., Feringa, B. L. Dynamic Control over Cell Adhesive Properties using Molecular-Based Surface Engineering Strategies. Chem. Soc. Rev. 39, 354-378 (2010).
- Choi, I., Yeo, W. -. S. Self-Assembled Monolayers with Dynamicity Stemming from (Bio)chemical Conversions: From Construction to Application. ChemPhysChem. 14, 55-69 (2013).
- Nakanishi, J. Switchable Substrates for Analyzing and Engineering Cellular Functions. Chem. Asian J. 9, 406-417 (2014).
- Yamamoto, H., et al. In Situ Modification of Cell-Culture Scaffolds by Photocatalytic Decomposition of Organosilane Monolayers. Biofabrication. 6, 035021 (2014).
- Sekine, K., Yamamoto, H., Kono, S., Ikeda, T., Kuroda, A., Tanii, T. Surface Modification of Cell Scaffold in Aqueous Solution using TiO2 Photocatalysis and Linker Protein L2 for Patterning Primary Neurons. e-J. Surf. Sci. Nanotech. 13, 213-218 (2015).
- Arima, Y., Iwata, H. Effects of Surface Functional Groups on Protein Adsorption and Subsequent Cell Adhesion using Self-Assembled Monolayers. J. Mater. Chem. 17, 4079-4087 (2007).
- Fujishima, A., Zhang, X., Tryk, D. A. TiO2 Photocatalysis and Related Surface Phenomena. Surf. Sci. Rep. 63, 515-582 (2008).
- Sigal, G. B., Mrksich, M., Whitesides, G. M. Effect of Surface Wettability on the Adsorption of Proteins and Detergents. J. Am. Chem. Soc. 120, 3464-3473 (1998).
- Zhang, X., et al. A Transparent and Photo-Patternable Superhydrophobic Film. Chem. Commun. 2007, 4949-4951 (1039).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing Hippocampal Neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
