Abstract
表达了严格的管理不仅是必不可少的每一个活着的有机体，而且要调查细胞模型蛋白质功能的重要策略。因此，最近的研究发明了不同的工具来靶向哺乳动物细胞系，甚至动物模型，包括RNA和抗体干扰蛋白的表达。虽然第一战略在过去的二十年中收集的关注，肽介导穿过细胞膜进入细胞抗体货物的转运，得到少得多的利息。在此出版物中，我们提供了一个详细的协议如何利用在人胚肾细胞，以及在原代海马神经元命名战车的肽载体进行抗体干扰实验和进一步说明在分析蛋白质功能的三维重建的应用。我们的研究结果表明，战车是，可能是由于它的核定位信号，particulaRLY非常适合于目标驻留在体细胞和细胞核蛋白。值得注意的是，将战车初级海马培养时，试剂竟然是出奇地好，通过分离的神经元接受。
Introduction
蛋白表达的严格控制是必不可少的每一个生物体指挥自身的发展，以及对环境的信号作出反应。因此，各种机制的许多已在进化过程中发明了精确地调节由该应用编码各蛋白的表达水平。 20000个基因在其生命中的任何给定时间存在于任何真核细胞。发生在蛋白质生产的不同阶段，调节机制的范围从染色质结构，转录和RNA的管理处理，以的翻译后蛋白质修饰，转运和降解的方向。
因此，并不奇怪，在潜在的分子机械和改变蛋白质表达水平的故障已经与不同的疾病，如癌症或智障相关联。的确，看着神经元的发育和哺乳动物大脑功能的优秀的复杂性，森西这些复杂的系统的拉了一改建中蛋白表达表现在以下几个知名知识分子的赤字包括老年痴呆和帕金森病（AD和PD），以及自闭症谱系障碍（ASD）之类的脆性X综合征（FXS）。后者疾病的特征在于多种蛋白，这是由于单个翻译调节蛋白，FMRP（脆性X智力低下蛋白）1-4的损失广泛错误表达。此外，影响变电荷染色体重排X连锁蛋白A（VCXA），蛋白质，它管理通过修饰mRNA的加帽5 mRNA的稳定性和翻译，最近已经智力缺陷有关，而点突变未在患者确定有认知障碍截至目前6，7，这表明所观察到的精神损伤从改变VCXA表达及其靶prote的失调表达起源插件。在与这些发现，研究调查是否从头与ASD有关的基因的拷贝数变异建立的新基因重复和缺失是ASD 8显著危险因素，从而支持的想法，升高的或降低的蛋白质表达水平可能引起线智力缺陷。
值得注意的是，最近的研究还提供了证据，给定蛋白质的表达水平被精确地调节，以防止其作为高蛋白量的结果聚合几乎没有安全余量9。因此，已经提出，即使是很小的增量是足以诱导疾病如AD和PD 9。虽然各种促进蛋白质表达控制分子机器的显示在这些发现的光线复杂的调节方案，一项研究调查了5000哺乳动物基因10的表达水平证明本质上优选更简约的方案：蛋白质的细胞大量被证明在翻译10的水平主要是调节，从而说明该RNA的可用性管理，主要用来微调蛋白的表达。
研究的目的蛋白质的剂量（POI的），因此不仅是组成的蛋白质的内源功能的理解重要的，但也对许多疾病的调查和疗法的发展。因此，过去的十年里，利用RNA干扰来操纵POI用量几种策略的推进。虽然RNA干扰被广泛用于研究蛋白质的功能，并且即使在临床试验中被用于治疗癌症或眼疾病以及追求患者11-13抗病毒治疗，一些困难可能出现可能使战略是不可能的。例如，该种子序列，其中通过同源驱动击倒是对比试验BLE短，因此促进脱靶效应。由于高效的序列是罕见的，需要在数千的选项（在14中综述）被发现，确定适当的序列可以是费时和昂贵的，但结果仍可能会令人失望。
另一种策略是直接针对被抗体的POI。这里，我们说明了使用蛋白质载体战车（由Active Motif的制造）以降低细胞蛋白的可用性，和三维重建的就业研究蛋白质功能下列击倒。
战车，本身2.8 kDa的肽的活性基序，是用来梭肽，蛋白质和抗体穿过哺乳动物细胞15的细胞膜。与POI的肽相关联通过形成利用疏水相互作用，由此战车-POI络合物非共价地偶联的大分子复合物内化到细胞中内体-INDependent方式。重要的是，战车被指示为既不影响穿梭蛋白的细胞内定位，也发挥细胞毒性作用或影响其货物15的生物学活性。
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Protocol
1.股票方案
- 重悬在无菌小时冻干活性基序粉末2 O至2微克/微升的最终浓度。仔细挖掘混合。
- 制备小等分试样（ 例如，每12微升，2微升被每个反应需要）并将其存储在-20℃。
2.细胞的制备
- 种子哺乳动物细胞如24孔板于500μl生长培养基包括抗生素对HEK293细胞或原代神经元。
注意：当使用神经元，种子细胞以低密度并且仅使用24孔板的两个中间行。因此，每口井将有一个空的对应孵化（步骤4.2）时怀有网上平台。当处理的神经元，始终确保细胞没有保持孵化器外超过几分钟。 - 培养的细胞在适当的条件（加湿5％CO 2和37℃），直到细胞是应用程式。 50％汇合。
注意：如果使用的神经元， 培养细胞，直到所需的发育阶段达到并改变应用程序。介质的25-50％，每周两次。介质：Neurobasal培养基（含有1x B27，5mM的L-谷氨酰胺和1x青霉素和链霉素;与参考16进行比较）。
3.战车复杂地层
- 每个反应，稀释分别POI的或相应的抗体，以及作为对照蛋白或对照抗体的0.1-2微克，在50μlPBS中。
注：该技术也适用于由预先绑定第一和第二抗体（CP'代表结果“， 图1）的大分子复合物。混合和旋转。 - 对于每个样品，以避免战车的自缔合使用单独的试管稀释在50μlPBS中的2微升战车原液。混合和旋转。
- 用移液管转移稀释的POI或抗体（步骤3.1）的战车稀释婷。混合和旋转。
- 孵育在室温下该混合物30分钟（战车-POI络合物将形成）。
4.转染细胞
- 稀释战车配合于100μl预热的生长培养基中（37℃，无添加剂）（步骤3.4）。除去培养基并洗一次使用预热的1×PBS中的细胞。
注：当使用神经元，不丢弃介质，它会被重复使用。保持在37℃。对于洗涤，使用含有0.5毫米氯化镁2和氯化钙 PBS。
建议：保持中等井空，同时培养板（步骤4.5）。 - 应用战车络合物溶液（步骤4.1）至细胞中并轻轻摇动细胞以确保均匀的溶液分布。生长的标准条件（步骤2.2）下的细胞1小时。添加血清的10％的最终浓度。当使用神经元， 从步骤4.1中添加介质。生长细胞为1至2小时。
注意：最佳孵育时间取决于大小和货物的性质，可能需要根据经验调整。以下建议可以作为一个准则：对于肽，1小时通常是足够的，对于蛋白质被推荐1-2小时，对抗体2小时，并为神经元的转染抗体4小时。 - 流程细胞分析如常。请注意：该技术是用固定的协议以及现场成像实验兼容。
5.成像
- 使用激光扫描显微镜，使用大约0.25-0.5微米的距离取细胞和/或感兴趣的细胞区室的Z轴堆叠。精确的层距离取决于要重建所述结构的尺寸和需要被单独地确定。
6.重建
- 在下面的步骤，使用Esc键底部选择和导航，CNTR之间切换通过单击以选中多个对象O.ñ他们和Shift键削减对象（CP。步骤6.10）。
- 打开了Imaris的LSM-文件。
- 使用显示器调整为每个通道，对比照片，直到最亮的结构达到饱和。请注意，本次调整不会影响面施工，它只会帮助实验者在阈值图像。
- 点击添加新曲面图标。一个向导将打开。
- 选择：段唯一的兴趣的一个区域。继续进行下一步骤。
- 调整选择框的边缘，以适应您感兴趣的对象。请记住图像具有3个维度，而且选择必须在z平面和调整。如果选择框的矩形形状应该没有正确的感兴趣的对象相匹配，将对象和/或放大的方块，直至所有所需的结构被嵌入。不需要的对象可能会稍后删除（CP。步骤6.10）。继续。
- 选择合适的通道annel。外围应用详细程度或球体直径应设置为与正在重建结构。根据信号的特性，可以使用任一绝对强度或局部对比度。一般情况下，局部对比度适用于扩散信号更好。在任何情况下，该设置需要分别为每个感兴趣的信号或结构，分别进行调整。
- 使用阈值工具，重建的感兴趣结构。
- 通过点击绿色箭头底完成重建。
- 通过使用铅笔工具切割并根据需要去除表面进一步调整的对象。它是唯一可能在南北方向上切断，因此，倾斜图像，以切割所需的对象。
- 通过选择统计，详细统计数据和平均值获得每个表面体积，面积测量和强度。
- （可选步骤）观察颜色编码的统计数据（CP。 图2E F），选择相应的表面的颜色标签和标记“统计编码'而不是'基地'。几个选项将被显示。
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Representative Results
在下面的段落，显示了POI的功能击倒示范结果使用战车试剂和抗体的干扰呈现（Simiate，进一步的详细信息，请参阅16，17）。的研究结果表明，Simiate的减弱表达损害转录活性，而且，在剂量依赖的方式，诱导细胞凋亡，在超过99％的死亡率达到高潮，如果施加更高的抗体量（> 1微克抗体）（这些发现以前出版16）。在这里，我们现在提出详细使用的技术和协议，并进一步表明试剂如何战车可用于转染原代培养物解离的海马神经元。
为了研究战车肽是否允许抗体的有效穿梭和，特别是如果这些抗体在操作过程中保持工作中，我们表达FLAG-Simiate对在HEK293细胞24小时，并随后转染利用战车细胞耦合rbαSimiate-gtαrbAlexa568大分子（ 图1）。的FLAG-Simiate构建体以及由HEK293细胞表达并定位于胞体以及这些细胞的细胞核中（ 图1A）。这里，FLAG-Simiate簇显著（ 图1B），从而镜像内源性Simiate的细胞核中的斑点分布。
穿过细胞膜穿梭的抗体复合物出现在组合（ 图1A，在红色，红色箭头），但释放的抗体检测FLAG-Simiate具体如由FLAG-Simiate和rbαSimiate-gtαrbAlexa568大分子的深刻共定位（ 图1B ，黄色，黄色箭头）。作为说明，实验不仅证明了抗体在一个战车介导保持工作膜通道，但它们也能进入细胞核。因为它们的大小不包括从着手通过扩散核抗体，它很可能是存在于战车本身的核定位信号便于rbαSimiate-gtαrbAlexa568大分子的易位进入细胞核。事实上，抗体组合也处于或分别在，观察到，核隔室（ 图1B，红色箭头）。
使用rbαSimiate-战车络合物在功能上消耗在HEK293细胞中的内源性Simiate（ 图2）中，我们发现，我们能够定位到rbαSimiate结合位点的80％，使用抗体16 2.0微克。有趣的是，穿梭gtαrbAlexa568抗体独进HEK 293细胞对核斑点（ 图2A-C）的外观没有明显的效果，功能Simiate损失圆角核斑点（ 图2D-F </ strong>下，通过三维重建（ 图2B，C与E，F），并且在以剂量依赖性方式，诱导细胞凋亡（ 图3，厘泊。16）所示的cp 16）。
鉴于神经细胞对毒性作用很敏感，我们也施加在初级海马培养物的技术中（ 图4）。使用TUNEL法和MAP2染色来分析细胞的完整性，我们发现在1 + 4小时的处理，CP的比较之后，或模拟未处理和战车处理的细胞（APP 20-25％TUNEL阳性细胞时神经元的活力无影响。4.4 -4.6）。因此，我们测试介导战车抗体神经细胞穿梭。按照相同的应用方案，gtαgpAlexa568抗体组合，被视为改变在细胞中，在那里它们在胞体以及细胞核（ 图5A）时发生的约83％延伸。这些意见进一步支持B雅三维分析（ 图5B）和密切重新组装在HEK293细胞中看到的图像，一起从而示出的战车技术可以成功地用于转染解离原代海马神经元，以及。
图1. FLAG-Simiate由穿梭成使用战车试剂HEK293细胞Simiate特异性抗体进行检测。对于抗体干扰实验，rbSimiate-gtrbAlexa568抗体之前战车-抗体复合物的形成预组装。 A）HEK293细胞表达的FLAG标签Simiate。 Simiate抗体组合进入胞体以及下述应用，在那里它们与FLAG-Simiate特异性共定位细胞核。圆点：战车rbSimiate-gtrbAlexa568组合（红色箭头）。 B）盒装区域的高功率放大（A）中说明FLAG-Simiate和战车介导的信号Simiate（黄色箭头）的共存。请注意战车抗体组合中核（红色箭头）的存在。比例尺：10微米。
图穿梭到HEK293细胞2. Simiate特异性抗体干扰内源性Simiate。A的细胞功能 ，B）和战车-gtrbAlexa568处理的HEK293细胞（1微克）作为对照。在红色，内源性Simiate显示假色，而不会显示战车gtrbAlexa568组合。核斑点分别使用标记蛋白SC35（绿色）标记的，而凋亡细胞用TUNEL法（蓝色）标识。 B）从A. C中的盒装区），同一地区的重建核斑点斑点说明体积和表面积重建在一个颜色编码的方式。 D，E）HEK293细胞以下战车rbSimiate治疗（0.5微克）。内源性Simiate以及战车rbSimiate-gtrbAlexa568组合显示为红色，而核斑点和凋亡细胞是根据A和B.电子显示）在D f从盒装的地区重建）核斑点同一区域显示为概述了C.请注意斑点的弧形外观和聚集（所有重建：了Imaris软件）。比例尺在C，F：2微米。所有其他比例尺：10μm以下。 1）为三维重建，只使用了非凋亡的细胞。
图3.高剂量战车rbSimiate-gtrbAlexa568的诱导大量细胞死亡。HEK293细胞用2分别战车gtrbAlexa568或战车rbSimiate-gtrbAlexa568，微克（包括补偿处理箭头以及放大倍率显示为绿色，并表示LEXES）。 TUNEL标记（蓝色）施加到鉴别凋亡细胞。比例尺：10微米。
图4.战车是没有毒性原代海马神经元。AB）DIV在协议为抗体穿梭（1 + 4小时，CP概述7元要么模拟处理（介质A）或经受战车试剂（B）中。 4.4-4.6）。而SC-35，核斑点标记蛋白，服务标记转录和剪接机制，TUNEL染色应用于识别凋亡细胞（绿色箭头）。 C）未经处理和治疗战车16/17 DIV神经元。 MAP2染色施加到可视化的树突树。比例尺：10μm以下。
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图5.战车介导转与神经元的文化兼容。A）从DIV 5.图片代表初级海马神经元显示了使用激光扫描显微镜（激光扫描显微镜710，蔡司）采取栈Z-预测。比例尺：10微米。请注意在细胞核战车-gtgpAlexa568络合物（红色）的发生和细胞的体细胞。在答索马和神经元的树突所示的核以及gtgpAlexa568组合的B）的三维重建（了Imaris软件）由灰色点，这是从内源性Simiate贴标签蒸馏水表示。比例尺：10微米。抗体量转：0.25微克。
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Discussion
在这里，我们提出了一个协议，以研究在控制剂量驱动的方式细胞功能的蛋白表达水平的意义。描述该协议允许在各种哺乳动物细胞类型，包括海马神经元蛋白表达的微调操作，从而促进细胞水平上的蛋白质功能的详细研究。
虽然RNA干扰表示公知的策略来下调的POI，它有它的缺点（CP 14）。不仅是高度特异性的和有效的序列的识别可能是昂贵和费时的，而且还因为毒性RNA构建体的堆积，核出口机械的超负荷以及饱和的细胞内转录生物合成可能导致不可预知的结果内源性RNA干扰的处理系统可能会导致脱靶效应或低效率。此外，大量的外源性RNAi载体的可能诱发UNSpecific效果好，扰乱细胞的动态平衡。
抗体，另一方面，需要通过内源性机械没有进一步的处理，一旦他们进入细胞，并立即生效，从而支持不仅节省时间的实验，但也直接细胞过程的调查。虽然它们可以具有非特异性的脱靶效应，也可用数量增加充分表征和高度特异性的抗体，使该替代值得一个想法。由于大分子复合物的递送到细胞中是一个重大的障碍，不同的转染技术已在近几年中开发，包括肽R8和azoR8 18以及微球19介导的穿梭。而R8和azoR8分别表示同样的行为，以战车18，发现微球需要24小时摄取19，这是相当长的时间比战车介导的纪念品brane通道和可能更快地学习和剂量依赖性细胞反应时造成困难。
值得注意的是，战车技术原来是适用于初级海马培养物，这对治疗非常敏感和困难的转染。到目前为止，战车载体已被用来分析在初级成骨细胞培养20蛋白质的功能，以及在神经母细胞瘤，神经胶质瘤细胞系的NG108-15 21，小鸡背根神经节培养物21，或在PC12细胞22，其从神经起源波峰，但没有在从中枢神经系统中的细胞培养物的任何应用程序的报告可爱好。由于传统的转染试剂，例如脂质体在这些细胞和病毒转染错综复杂低效，战车可能代表一个有趣的选择。
值得注意的是，战车本身观察到定位于核15，大概由于其核定位信号PKKKRKV（CP 23）。与这些观察一致，我们发现，rbαSimiate-gtαrbAlexa568大分子战车介导的转染导致核区室如核斑点的一个明确的标签。事实上，在两者的核，HEK293和原代海马细胞也检测到的控制抗体诸如gtαgpAlexa568。自抗体，特别是在组合，都远远太大通过扩散并走上细胞核因为Simiate本身不包含任何已知的核定位信号，而是进入通过扩散细胞核，它很可能是该战车信号是参与抗体的核定位。可替代地，在较大的蛋白质组合的传输也可以是可能的，虽然这将不能解释gtαgpAlexa568的培养海马神经元的大鼠的核的存在下，作为有这种抗体在这些细胞中没有目标。此外，SINCE战车被发现不与穿梭肽和蛋白质15的自然定位干扰，这些观察结果表明，抗体的表现不同。
事实上，穿梭抗体复合物如战车-rbαSimiate-gtαrbAlexa568（ 图1）或战车-gtαgpAlexa568时（ 图5）穿过细胞膜，他们出现在集群，其中仅溶解，当适当的目标蛋白质，例如内源性Simiate或FLAG-Simiate存在（仅在图1）。使用Chariot在成骨细胞抗体复合物，塞利姆院校观察到同样的效果20。鉴于战车被证明不与肽和蛋白15的定位干扰，这些观察结果表明，战车组装抗体拆卸仅当有一个分子机制，如抗体-靶相互作用，其克服疏水间战车及其抗体货，之间的诉讼，因此，鼓励拆卸。因为抗体比肽或大多数其他蛋白质重，有，由于它们的形状，较大的表面，它们可与战车分子数高关联和/或与战车肽相互作用更牢固，所以这会促进更战车驱动抗体的行为。因此，一个缺乏分解机制，将导致群集外观和抗体货物（ 图5）的核定位。
两者合计，该数据表明，战车特别适合处理驻留在细胞核蛋白质的功能，它是适用于多种哺乳动物细胞类型，包括原代海马神经元。
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Acknowledgments
所提出的工作是由健康研究加拿大学院资助的部分支持/加拿大合作计划，RD的脆性X研究基金会，杰罗姆勒琼基金会RD时，InterdisziplinäresZentrum酒店献给大学埃尔兰根 - 纽伦堡的klinische Forschung到RD和从德意志研究联合会为RD和RE。作者要感谢英格里德曾格与细胞培养技术维修援助以及用于制作pCMV5-FLAG载体可M. Wegner的教授。作者进一步想特别感谢娜佳施罗德在视频拍摄方面有帮助的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chariot | Active Motif | 30025 | store at -20 °C |
| Neurobasal medium | Life technologies | 21103-049 | warm up to 37 °C before using |
| 1x B27 | Life technologies | 17504044 | store at -20 °C |
| L-glutamine | Life technologies | 25030-149 | store at -20 °C |
| Penicillin and Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | store at -20 °C |
| Imaris software | Bitplane | n.a. | expensive, but unmatched |
| Laser Scanning Microscope | Zeiss | n.a. |
References
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