Abstract
タンパク質発現の厳格な管理は、生きているすべての生物に不可欠なだけでなく、細胞モデルにおけるタンパク質の機能を調査するための重要な戦略だけではありません。したがって、最近の研究は、RNAおよび抗体干渉を含む哺乳動物細胞系、あるいは動物モデルにおいて、タンパク質の発現を標的とするさまざまなツールを発明しました。最初の戦略は、過去20年間に多くの注目を集めているが、細胞膜を横切って細胞に抗体貨物の転位を媒介するペプチドは、はるかに少ない関心を得ました。この公報では、抗体の干渉実験を行うために、ヒト胚性腎細胞ならびに初代海馬ニューロンにおけるチャリオットという名前のペプチドキャリアを利用し、さらにタンパク質の機能を解析する際に3次元再構成の適用を説明するためにどのように詳細なプロトコルを提供します。我々の調査結果は、チャリオットはparticula、おそらく、その核局在化シグナルによるものであることを示唆していますRLY相馬と核内に存在するタンパク質を標的とするためによく適しています。初代海馬培養にチャリオットを適用する際に注目すべき、試薬は驚くほどよく解離したニューロンによって受け入れられるようになりました。
Introduction
すべての生物が独自の開発を指揮するだけでなく、環境シグナルに反応するためのタンパク質発現の厳密な制御が不可欠です。したがって、機構の多くは、正確にアプリケーションによってコードされる各タンパク質の発現量を調節するために進化の過程で発明されました。 2万遺伝子は、その寿命の任意の時点で任意の真核生物の細胞内に存在します。タンパク質生産のさまざまな段階で行われて、調節機構は、翻訳後タンパク質修飾、輸送及び劣化の方向に取り扱うクロマチン構造、転写およびRNAの管理の範囲です。
基礎となる分子機械と変化したタンパク質の発現レベルの機能不全は、癌や知的障害などの多様な疾患と関連していることは驚くべきことではありません。実際、神経発達および哺乳動物の脳機能の優れた複雑さを見て、センシタンパク質の発現の変化にこれらの高度なシステムのtivityは、脆弱X症候群（FXS）のようないくつかのよく知られている知的アルツハイマー病やパーキンソン病（ADおよびPD）などの赤字だけでなく、自閉症スペクトラム障害（ASD）となって現れます。後者の疾患は、単一の翻訳調節タンパク質、FMRP（脆弱X精神遅滞タンパク質）1-4の損失に起因する種々のタンパク質の大規模な誤発現によって特徴付けられます。また、変数の充電に影響を与える染色体再配列は、点突然変異が認知障害のある患者で同定されなかった一方で連結されたタンパク質A（VCXA）、5をキャッピングするmRNAを変更することにより、mRNAの安定性および翻訳を管理するタンパク質が、最近では、知的障害と関連しているxは今のところ6、7、観察された精神的な障害が変更されたVCXA式とその標的proteの調節不全の発現に由来することを示唆していますイン。これらの知見と一致して、遺伝子のデノボコピー数の変動がASDに関連しているかどうかを調査する研究では、新規遺伝子重複および欠失は、このように上昇または低下したタンパク質の発現レベルが引き起こす可能性があるという考えを支持し、ASD 8のための重要な危険因子である確立しました知的障害。
注目すべきことに、最近の研究は、さらに、所定のタンパク質の発現量を正確にほとんど安全マージン9と高タンパク質量の結果としての凝集を防止するように調節されるという証拠を提供しました。したがって、小さな増分は、ADおよびPD 9のような疾患を誘発するのに十分であることが提案されています。タンパク質の発現制御に貢献する分子機械の様々なこれらの知見に照らして、複雑なレギュレーション方式を示唆しているが、5,000以上の哺乳動物遺伝子の発現レベルを調査する研究が10ということを実証しました性質がより倹約スキームを好ん：タンパク質の細胞存在量は、主に翻訳10のレベルで調節されることが示された、このようにRNAの可用性の管理は、主に微調整タンパク質発現に役立つことを説明します。
目的のタンパク質の用量を学ぶ（ランドマーク）は、したがってのみタンパク質の内因性機能の理解に重要なだけでなく、多くの疾患の調査と治療法の開発にではありません。このように、最後の数十年は、POIの投与量を操作するためにRNA干渉を用いて、いくつかの戦略の進歩を見てきました。 RNA干渉は、広くタンパク質機能を研究するために使用され、さらには癌または眼疾患を治療するだけでなく、患者11から13に抗ウイルス療法を追求するために臨床試験に適用されているが、いくつかの困難が不可能な戦略をレンダリングする可能性があります発生する可能性があります。例えば、相同性によってノックダウンを駆動シード配列は、comparaありますしたがって、オフターゲット効果を促進し、BLE短いです。高効率の配列はまれであり、（14に概説されている）オプションの数千人の中から発見される必要があるので、右の配列を同定することは、時間とコストがかかることができますが、結果はまだ失望してもよいです。
別の戦略は、直接抗体によるPOIを標的とすることです。ここでは、細胞タンパク質の利用可能性を減らすために（アクティブモチーフ社製）タンパク質担体チャリオットの使用を説明し、3次元再構成の雇用はノックダウンを以下のタンパク質の機能を研究します。
チャリオット、自身2.8 kDaのペプチドの活性モチーフは、哺乳動物細胞15の膜を横切ってシャトルペプチド、タンパク質および抗体に使用されます。チャリオット-POIの複合体がエンドソーム-INDに細胞内に内在化されるところ疎水性相互作用を利用した非共有結合した高分子複合体を形成することによりPOIを有するペプチド会合し、ependent方法。重要なことには、チャリオットは往復タンパク質の細胞内局在に影響を与えない、また細胞毒性効果を発揮するか、積荷15の生物学的活性に影響を与えることもないことが示されました。
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Protocol
1.在庫ソリューション
- /μlの終濃度2μgに滅菌H 2 O中で凍結乾燥アクティブモチーフ粉末を再懸濁します。混合するために慎重にタップします。
- （ 例えば、12μlのそれぞれは、2μlの反応ごとに必要とされる）少量のアリコートを調製し、-20℃で保管してください。
細胞の調製
- 抗生物質を含む500μlの増殖培地中で24ウェルプレートに、このようなHEK293細胞または一次ニューロンなどの哺乳動物細胞をシード。
注：ニューロンを使用する場合は、低密度で細胞を播種すると、24ウェルプレートの2つだけ真ん中の行を使用します。各ウェルは、このように、インキュベーション（ステップ4.2）の間にメディアを保有する空の相手を持つことになります。ニューロンを取り扱う際は、常に細胞が数分以上インキュベーターの外に保たれていないことを確認してください。 - 細胞アプリなるまで培養に適切な条件で細胞が（、加湿5％CO 2、37℃）。 50％コンフルエント。
注：ニューロンを使用する場合は、 文化希望の発達段階までの細胞が到達したアプリを変更されています。二回培地の百分の25から50週。ミディアム：Neurobasal培地（1×B27、5 mMのL-グルタミンおよび1×ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む; REF 16と比較）。
3.チャリオット複合体形成
- 反応あたり、50μlのPBSで、それぞれPOIまたは対応する抗体ならびに対照タンパク質、または対照抗体の0.1〜2μgのを薄めます。
注：技術はまた予め結合一次および二次抗体からなる高分子複合体と連携（CP「代表的な結果」、 図1）。混合し、スピン。 - 各サンプルについて、チャリオットの自己会合を避けるために、別々のチューブを使用して50μlのPBSで2μlのチャリオットストック溶液を希釈します。混合し、スピン。
- ピペットでチャリオット希釈に希釈したPOIまたは抗体（ステップ3.1）を転送ティン。混合し、スピン。
- 室温で30分間混合物をインキュベート（チャリオット-POIの複合体が形成されます）。
細胞のトランスフェクション4。
- 100μlの予め温めた成長培地（37℃、無添加）でチャリオット錯体（ステップ3.4）に希釈します。培地を除去し、予め温めた1×PBSを用いて細胞を1回洗浄します。
注：ニューロンを使用する場合は、メディアを破棄することはありません、それが再利用されます。 37°Cで保管してください。洗浄には、0.5のMgCl 2とのCaCl 2を含むPBSを使用しています。
提案：プレート（ステップ4.5）をインキュベートしながら、空のウェルに培地を維持します。 - 細胞へのチャリオット複雑なソリューション（ステップ4.1）を適用し、溶液の均一な分布を確実にするために、細胞を穏やかに揺すります。 1時間の標準的な条件（ステップ2.2）の下で細胞を増殖させます。 10％の最終濃度に血清を加えます。ニューロンを使用する場合、 ステップ4.1からメディアを追加します。 1〜2時間以上細胞を増殖させます。
注記：最適なインキュベーション時間は、貨物の大きさと性質に依存し、経験的に調整される必要があり得ます。次の提案は、ガイドラインとして役立ち得る：ペプチドに関して、1時間で通常は十分である、タンパク質1-2時間、抗体2時間、および抗体4時間と神経細胞のトランスフェクションのために、推奨されています。 - いつものように、分析のためのプロセス細胞。ご注意：技術は、固定プロトコルだけでなく、ライブイメージングを用いた実験と互換性があります。
5.イメージング
- レーザ走査顕微鏡を使用して、約0.25〜0.5ミクロンの距離を用いて細胞および/または対象の細胞区画のZスタックを取ります。正確な層の距離を再構成する構造体の大きさに依存し、個別に決定する必要があります。
6.復興
- 次の手順では、Oをクリックすることで、複数のオブジェクトを選択するために選択して移動し、CNTRを切り替えるには、Escキー底を使用nはそれらとシフトキーは、オブジェクト（CPを。6.10ステップ）を切断します。
- IMARISでLSM-ファイルを開きます。
- 明るい構造が飽和状態に達するまで、各チャンネルの表示調整を使用して、画像をコントラスト。この調整は、表面の構造に影響を与えないだろう、それが唯一の画像を閾値に実験者を支援するために提供していますのでご注意ください。
- 新しいサーフェスを追加アイコンをクリックします。ウィザードが開きます。
- 選択：セグメント関心の領域のみ。次のステップに進みます。
- 興味のある対象物に合わせて選択ボックスの余白を調整します。画像は、3次元を持っており、選択は同様にz平面で調整する必要があることをことを心に留めておいてください。選択ボックスの長方形の形状を適切に関心のオブジェクトと一致していなければならない場合は、オブジェクトをオンおよび/または必要なすべての構造が埋め込まれるまでボックスを拡大。望ましくないオブジェクトは、（CP。ステップ6.10）に、後に除去することができます。進みます。
- 適切なCHを選択annel。表面積の詳細レベルや球の直径は、再構成されている構造と一致するように設定する必要があります。信号特性に応じて、絶対強度または局所的なコントラストのいずれかを使用することができます。一般的に、局所的なコントラストは、拡散信号のためのより良い動作します。いずれの場合も、設定がそれぞれ、各注目信号または構造のために個別に調整する必要があります。
- しきい値処理ツールを用いて、関心の構造を再構築します。
- 緑の矢印の下のをクリックして再構築を完了します。
- カットし、必要に応じて表面を除去するために、鉛筆ツールを使って、別の目的を調整します。所望の物体を切断するために、画像を、従って、南北方向に切断傾斜することのみが可能です。
- 統計、詳細な統計情報、および平均値を選択することで、ボリューム、面積と各サーフェスの強度の測定値を得ます。
- （CP。 図2E色分けされた統計情報を観察するには（オプションの手順） F）は 、対応する表面の色]タブを選択し、代わりに「基本」の「統計符号化」をマークします。いくつかのオプションが表示されます。
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Representative Results
以下の段落では、チャリオット試薬と抗体の干渉を用いて、POI（16、17を参照してください詳細についてはSimiate、）の機能的ノックダウンを示す典型的な結果が提示されています。所見はSimiateの減少発現は転写活性を損ない、および、用量依存的に、高い抗体量（> 1μgの抗体）が適用されている場合は99％以上の死亡率で最高潮に達する、アポトーシスを誘導することを実証している（これらの発見は、以前に掲載されました16）。ここでは、詳細に使用される技術とプロトコルを提供し、さらに一次培養物中で解離海馬ニューロンをトランスフェクトするために使用することができる方法チャリオット試薬実証します。
これらの抗体は、処置の間に機能的なままである場合、チャリオットのペプチドは、特に、抗体の効率的なシャトリングを可能とするかどうかを調べるために、我々は、FLAGを発現しHEK293細胞で24時間-Simiate、その後チャリオットを利用する細胞はrbαSimiate-gtαrbAlexa568高分子（ 図1）に結合トランスフェクトしました。 FLAG-Simiate構築物よくHEK293細胞によって発現され、細胞体、ならびにこれらの細胞の核（ 図1A）に局在されます。ここで、FLAG-Simiateクラスタは大幅に（ 図1B）、それによって核内での内因性Simiateの斑点分布をミラーリング。
細胞膜を横切って往復抗体複合体は、（赤、赤の矢印で図1A）群集に表示されますが、FLAG-SimiateとrbαSimiate-gtαrbAlexa568高分子の深遠な共局在化（ 図1Bで示されるように放出された抗体は、具体的にFLAG-Simiateを検出します、黄色、黄色の矢印で）。ノートのように、実験だけでなく、抗体はチャリオット媒介中に機能していることを示しています膜通路が、彼らはまた、核に入ることができること。その大きさは、拡散による核に着手から抗体を除外しているので、チャリオット自体に存在する核局在シグナルが核にrbαSimiate-gtαrbAlexa568高分子の移行を促進する可能性があります。実際、抗体の集合体は、核区画（ 図1B、赤矢印）、それぞれ、またはその中に観察されます。
rbαSimiate-チャリオットは、機能的にHEK293細胞における内因性Simiate（ 図2）を枯渇させるために複合体の使用、我々は、抗体16の2.0μgのを使用して、rbαSimiate結合部位の80％までを標的とすることができることがわかりました。 HEKに単独gtαrbAlexa568抗体を往復しながら、興味深いことに、293細胞は、核スペックルが（ 図2A-C）の外観に明らかな影響を及ぼさなかった、機能的Simiateの損失は、核スペックルを丸み（ 図2D-F </ strong>の、CP 16）の三次元再構成E対（ 図2B、C、F）と、用量依存的な様式で、アポトーシスを誘導した （ 図3、CP 16）によって示されるように。
神経細胞は、毒性効果に非常に敏感であることを考えると、我々はまた、一次海馬培養（ 図4）技術が適用されます。細胞の完全性を分析するために、TUNELアッセイおよびMAP2染色を使用して、我々は治療、CPの1 + 4時間後にモックまたは未処置とチャリオット細胞（アプリ20-25％のTUNEL陽性細胞を比較したニューロンの生存率に影響を及ぼさないことを見出した。4.4 -4.6）。したがって、我々は、神経細胞培養で往復チャリオット媒介する抗体をテストしました。同じアプリケーションスキームに続いて、gtαgpAlexa568抗体集合体は、様々に、彼らは細胞体だけでなく、核（ 図5A）で発生した細胞の約83％に延びて見られました。これらの観察は、さらにbはサポートされています。従ってチャリオット技術が同様に初代海馬ニューロンを解離トランスフェクトするために成功裏に使用され得ることを示すと共に、HEK293細胞で見られる画像を再構築三次元解析（ 図5B）YAと密接。
図1 FLAG-Simiateがチャリオット試薬を用いてHEK293細胞に往復Simiate特異的抗体によって検出される。抗体の干渉実験のために、rbSimiate-gtrbAlexa568抗体は前チャリオット-抗体複合体の形成を予め組み立てました。 A）FLAG標識Simiateを発現するHEK293細胞。 Simiate抗体集合体は、細胞体だけでなく、彼らはFLAG-Simiateと特異的に共局在アプリケーションは、以下の核に入ります。ラウンドドット：チャリオット-rbSimiate-gtrbAlexa568集合体（赤矢印）。 B）箱入り域の高出力倍率FLAG-Simiateとチャリオット媒介Simiate信号（黄色の矢印）の共局在を示す（A）インチ核（赤矢印）でチャリオット抗体集合体の存在に注意してください。スケールバー：10μmです。
HEK293細胞に往復2 Simiate特異的抗体は、チャリオット-gtrbAlexa568（1μgの）で処理された内因性Simiate。A、B）HEK293細胞の細胞機能を妨害する図は、対照としての役割を果たす。チャリオット-gtrbAlexa568の集合が表示されない一方で、赤では、内因性Simiateは、偽色で示されています。アポトーシス細胞は、（青で）TUNELアッセイによって同定されたのに対し、核スペックル、（緑色）マーカータンパク質SC35を用いて標識しました。スペックルボリュームと表面積を示す同じ領域のB）A. Cの箱入りの地域からの核スペックルの復興を）再建色分けされた方法です。 D、E）チャリオット-rbSimiate処理後のHEK293細胞（0.5μgの）。核スペックルのアポトーシス細胞）は、AとB Eに従って同じ領域として示されている）D. Fに箱入りの領域から再構築された原子力スペックルを表示している間、内因性Simiateだけでなく、チャリオット-rbSimiate-gtrbAlexa568集合体は、赤色で示されていますC.について概説すると、スペックルの丸み外観と集計（：IMARISソフトウェアのすべての再構成を）注意してください。 C、F中のスケールバー：2μmです。他のすべてのスケールバー：10μmです。 1）三次元再構成のために、唯一の非アポトーシス細胞を使用しました。
チャリオット-rbSimiate-gtrbAlexa568の図3.高用量は、大量の細胞死を誘導する。HEK293細胞を、チャリオット-gtrbAlexa568またはそれぞれチャリオット-rbSimiate-gtrbAlexa568、（2μgの両方コンプで処理しました lexisの複数形の矢印だけでなく、倍率によって緑色で示され、示されています）。 （青）TUNEL標識は、アポトーシス細胞を同定するために適用されました。スケールバー：10μmです。
図4.チャリオットは初代海馬神経細胞に対して毒性ではありません。AB）DIV 7ニューロンはモック（中、A）処置または（1 + 4時間、CPを往復する抗体のためのプロトコルに概説されているようチャリオット試薬（B）に供したどちらか。 4.4から4.6）。 SC-35、核スペックルのマーカータンパク質は、転写およびスプライシング機構を標識するのに役立っているが、TUNEL染色は、アポトーシス細胞（緑の矢印）を同定するために適用しました。 C）未処理とチャリオットはDIV 16/17ニューロンを処理しました。 MAP2染色は、樹状ツリーを視覚化するために適用されました。スケールバー：10ミクロン。
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図5.チャリオット媒介トランスフェクションは、神経細胞培養と互換性があります。A）のdiv 5.画像から代表的な初代海馬ニューロンは、レーザー走査顕微鏡（レーザー走査顕微鏡710、ツァイス）を使用して撮影したスタックのz投影を示しています。スケールバー：10μmです。核内のチャリオット-gtgpAlexa568複合体（赤）の発生や細胞の細胞体に注意してください。 A.相馬ニューロンの樹状突起に示した核だけでなく、gtgpAlexa568集合体のB）三次元再構成（IMARISソフトウェア）は、内因性Simiateのラベリングから蒸留されたグレーのドットで示されています。スケールバー：10μmです。トランスフェクトされた抗体の量：0.25μgの。
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Discussion
ここでは、用量駆動方法で細胞機能を制御するタンパク質の発現レベルの有意性を研究するためのプロトコルを提示します。説明されたプロトコルは、従って、細胞レベルでのタンパク質の機能の詳細な研究を促進する、海馬神経細胞を含む様々な哺乳類細胞型におけるタンパク質発現の微調整操作を可能にします。
RNA干渉は、ランドマークをダウンレギュレートするために、周知の戦略を示しているが、その欠点（CP 14）を有しています。だけでなく、高度に特異的かつ効率的な配列の同定は、コストと時間がかかるだけでなく、細胞内の転写産物の生合成は、有毒なRNA構築物の蓄積、核輸出機械の過負荷と同様に飽和するので、予測できない結果を引き起こす可能性がありすることができます内因性RNAiの処理システムは、オフターゲット効果または非効率をもたらすことができます。また、外因性のRNAiベクターの高い量が案内を誘導することができますpecific効果だけでなく、細胞の恒常性を乱します。
抗体は、他の一方で、即時細胞プロセスの研究を、彼らは、セルを入力した後に、内因性機械によってさらなる処理を必要とせず、すぐに効果的である、このようにだけでなく、時間を節約する実験をサポートする、しかし。彼らは非特異オフターゲット効果を持っているかもしれないが、あまりにも、利用可能な十分に特徴づけおよび高度に特異的な抗体の増加数は思考この代替の価値になります。細胞内への高分子複合体の送達が主要な障害を表すので、異なるトランスフェクション技術は、ペプチドR8とazoR8 18と同様に、微小球19媒介往復を含め、近年で開発されてきました。 R8とazoR8が18をチャリオットと同様に振る舞うことが示されたが、マイクロスフェアは、チャリオット媒介MEMよりもかなり長くなっている、摂取19のために24時間を必要とすることが判明しましたより速く、用量依存性細胞応答研究するブレーン通路や困難を引き起こす可能性があります。
注目すべきことに、チャリオット技術は非常に治療に敏感でトランスフェクトすることが困難である初代海馬培養物に適用可能であることが判明しました。これまで、チャリオットキャリアは神経芽細胞腫、神経膠腫細胞株において、ならびに神経起源NG108-15 21、ニワトリ後根神経節培養物21、またはPC12細胞22には、一次骨芽細胞培養物20中のタンパク質の機能を分析するために使用されています家紋が、中枢神経系由来の細胞培養物中の任意のアプリケーションの報告はまだ用意されています。このようなリポフェクタミンのような伝統的なトランスフェクション試薬は、これらの細胞およびウイルスのトランスフェクション複雑で非効率的であるため、チャリオットは興味深い代替を表している可能性があります。
特に、チャリオット自体はおそらく、核15に局在することが観察されましたその核局在化シグナルPKKKRKV（CP 23）に起因します。これらの観察に沿って、我々はrbαSimiate-gtαrbAlexa568高分子のチャリオット媒介トランスフェクションは、核スペックルのような核区画の明確なラベリングをもたらしたことがわかりました。実際、そのようなgtαgpAlexa568などの対照抗体はまた、HEK293および初代海馬細胞の両方の核で検出されました。群集で特に抗体、以来、拡散によって核を乗り出すはるかに大きすぎるとSimiate自体は任意の既知の核局在化シグナルを含んでいるのではなく、拡散により核に入りませんので、チャリオット信号がに関与している可能性があり抗体の核局在化。これらの細胞におけるこの抗体のためのターゲットが存在しないとして、これは、ラット由来の培養海馬神経細胞の核内にgtαgpAlexa568の存在を説明できないでしょうが別の方法として、より大きなタンパク質の集合体における輸送はまた、可能である可能性があります。また、SINCEチャリオットは、これらの観察は、抗体は異なる挙動を示すことを示唆している、往復ペプチドおよびタンパク質15の自然なローカライズを妨害しないことが判明しました。
細胞膜を横切って（ 図5）などチャリオット-rbαSimiate-gtαrbAlexa568（ 図1）またはチャリオット-gtαgpAlexa568などの抗体複合体を往復するとき確かに、彼らは唯一の溶解クラスタに表示され、そのような内因性SimiateまたはFLAG-Simiateなどの際に適切な標的タンパク質（のみ図1に）存在しています。骨芽細胞にチャリオット抗体複合体を用いて、セリムおよび大学が、同じ効果20を観察しました。チャリオットのペプチドおよびタンパク質15の局在化を妨害しないように実証されたことを考えると、これらの観察は、チャリオットは、抗体は、疎水性相互を克服する抗体-標的相互作用のような分子機構が存在する場合にのみ分解組み立てられたことを示しますチャリオットおよびその抗体の貨物との間の行動は、このように、分解を促進します。抗体は、それらの形状に、大きな表面ペプチドまたは他のほとんどのタンパク質より重く、持っているので、彼らは、よりチャリオットドリブンを促進するであろう、チャリオット分子のより高い数字に関連付けるおよび/またはチャリオットペプチドとより多くの会社を相互作用することができます抗体の挙動。分解機構の欠如は、従って、クラスタ化された外観および抗体貨物（ 図5）の核局在化をもたらします。
まとめると、データは、戦車が特によく、核に存在するタンパク質の機能に対処するのに適していることを示し、それは、初代海馬ニューロンを含む哺乳動物の種々の細胞型に適用可能であること。
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Acknowledgments
提示作業はカナダ衛生研究所からの資金部でサポートされていた/ RDにカナダのパートナーシッププログラムの脆弱X研究財団、RD、大学エアランゲン・ニュルンベルクのInterdisziplinäresZentrumのエリーゼklinische Forschungにジェロームルジューン財団はRDとしますドイツ学術協会からRD及びREへ。著者らは、pCMV5-FLAGベクターを利用可能にするために、細胞培養の維持と技術支援のためのイングリッド・ゼンガーだけでなく、教授M.ウェグナーに感謝したいです。著者はさらに、特にビデオ撮影で役立つサポートのためナジャシュローダーに感謝したいです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chariot | Active Motif | 30025 | store at -20 °C |
| Neurobasal medium | Life technologies | 21103-049 | warm up to 37 °C before using |
| 1x B27 | Life technologies | 17504044 | store at -20 °C |
| L-glutamine | Life technologies | 25030-149 | store at -20 °C |
| Penicillin and Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | store at -20 °C |
| Imaris software | Bitplane | n.a. | expensive, but unmatched |
| Laser Scanning Microscope | Zeiss | n.a. |
References
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