Abstract
Una gestión estricta de la expresión de proteínas no sólo es esencial para todos los organismos vivos, sino también una estrategia importante para investigar las funciones de proteínas en modelos celulares. Por lo tanto, la investigación reciente inventado diferentes herramientas para dirigir la expresión de proteínas en líneas de células de mamífero o incluso modelos animales, incluyendo ARN y la interferencia de anticuerpos. Mientras que la primera estrategia ha recogido mucho la atención durante las últimas dos décadas, los péptidos que median una translocación de cargas de anticuerpos a través de las membranas celulares y en las células, obtuvieron mucho menos interés. En esta publicación, se proporciona un protocolo detallado cómo utilizar un portador de péptido llamado Chariot en células de riñón de embriones humanos, así como en las neuronas del hipocampo primarias para llevar a cabo experimentos de interferencia de anticuerpos y ilustrar adicionalmente la aplicación de las reconstrucciones en tres dimensiones en el análisis de la función de proteínas. Nuestros hallazgos sugieren que Chariot es, probablemente debido a su señal de localización nuclear, particularly bien adaptado a proteínas diana que residen en el soma y el núcleo. Sorprendentemente, cuando se aplica a cultivos de hipocampo Chariot primarios, el reactivo resultó ser sorprendentemente bien aceptado por las neuronas disociadas.
Introduction
Un control estricto de la expresión de la proteína es esencial para todos los organismos vivos para comandar su propio desarrollo, así como para reaccionar a las señales ambientales. Por lo tanto, una multitud de mecanismos se ha inventado durante la evolución de regular con precisión el nivel de expresión de cada proteína codificada por la aplicación. 20.000 genes existentes en cualquier célula eucariota en un momento dado de su vida. Que tienen lugar en diferentes etapas de la producción de proteínas, los mecanismos de regulación van desde la gestión de la estructura de la cromatina, la transcripción y ARN manipulación a la dirección de las modificaciones posteriores a la traducción de proteínas, el transporte y la degradación.
Por lo tanto, no es sorprendente que el mal funcionamiento de los mecanismos moleculares y los niveles de expresión de proteína alterada subyacente se han asociado con diversas enfermedades como el cáncer o discapacidad intelectual. De hecho, mirando a la complejidad excepcional del desarrollo neuronal y la función del cerebro de los mamíferos, el Sensitividad de estos sistemas sofisticados a alteraciones en la expresión de la proteína se manifiesta en varios déficits intelectuales bien conocidos que incluyen la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson (AD y PD), así como los trastornos del espectro autista (TEA) como el Síndrome X Frágil (SXF). Esta última enfermedad se caracteriza por una extensa misexpression de una variedad de proteínas, que se debe a la pérdida de una sola proteína traducción regulación, FMRP (Frágil proteína Retraso Mental X) 1-4. Proteína Además, reordenamientos cromosómicos que afectan a la carga variable ligada al cromosoma X A (VCXA), una proteína, que administra la estabilidad del ARNm y la traducción mediante la modificación de ARNm de tapado 5, recientemente se han asociado con déficits intelectuales, mientras que las mutaciones puntuales no fueron identificados en pacientes con discapacidad cognitiva a partir de ahora 6, 7, lo que sugiere que los deterioros mentales observados originan a partir de la expresión VCXA alterada y la expresión desregulada de su prote objetivoins. De acuerdo con estos hallazgos, un estudio que investiga si novo copia variaciones en el número de genes que están asociados con TEA estableció que los nuevos genes duplicaciones y deleciones son un factor de riesgo significativo para ASD 8, lo que apoya la idea de que los niveles de proteína de expresión elevados o disminuidos pueden causar déficit intelectual.
Sorprendentemente, las investigaciones recientes proporcionan evidencia adicional de que el nivel de expresión de una proteína dada se ajusta con precisión para evitar su agregación como consecuencia de cantidades elevadas de proteínas casi sin márgenes de seguridad 9. Por lo tanto, se ha propuesto que incluso pequeños incrementos son suficientes para inducir enfermedades tales como AD y PD 9. A pesar de la variedad de los mecanismos moleculares que contribuyen al control de la expresión de proteínas sugiere un esquema de regulación compleja a la luz de estos hallazgos, un estudio que investiga el nivel de expresión de más de 5.000 genes de mamíferos demostró que 10la naturaleza prefiere un esquema más parsimoniosa: La abundancia celular de las proteínas ha demostrado ser regulada principalmente a nivel de la traducción 10, ilustrando así que la gestión de la disponibilidad de ARN sirve principalmente para afinar la expresión de proteínas.
El estudio de la dosis de proteínas de interés (POI), por tanto, no sólo es importante para la comprensión de las funciones endógenas de una proteína, sino también para la investigación de muchas enfermedades y el desarrollo de terapias. Por lo tanto, últimas décadas han visto el avance de varias estrategias utilizando ARN de interferencia para manipular la dosis PDI. Aunque la interferencia de ARN se utiliza ampliamente para estudiar la función de la proteína e incluso está siendo aplicado en los ensayos clínicos para el tratamiento de cáncer o enfermedades oculares, así como para seguir las terapias antivirales en pacientes 11-13, algunos pueden surgir dificultades que podrían hacer que la estrategia imposible. Por ejemplo, la secuencia de semillas, que impulsa la caída por homología es comparativamentebles efectos a corto, por lo tanto, promueven desviado. Como las secuencias altamente eficientes son raros y hay que encontrar entre miles de opciones (revisado en 14), la identificación de la secuencia correcta puede ser lento y costoso, pero los resultados pueden todavía ser decepcionante.
Una estrategia alternativa es dirigirse directamente al PDI por anticuerpos. A continuación, se ilustra el uso del carro portador de proteína (fabricado por Active Motif) para reducir la disponibilidad de proteínas celulares, y el empleo de las reconstrucciones tridimensionales para estudiar la función de proteínas después de knock-down.
El motivo activa de Chariot, en sí misma un péptido de 2,8 kDa, se utiliza para los péptidos de transporte, proteínas y anticuerpos a través de membranas de células de mamíferos 15. Los asociados de péptidos con PDI que puede formar junto no covalentes complejos macromoleculares que utilizan las interacciones hidrofóbicas, con lo cual los complejos Chariot-PDI se internalizan en las células en un endosoma-independent manera. Es importante destacar que, Chariot se indicó que era ni afectar a la localización intracelular de las proteínas transportados, ni que ejercen efectos citotóxicos o para afectar la actividad biológica de su carga 15.
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Protocol
1. Soluciones de archivo
- Resuspender el polvo motivo activo liofilizado en H2O estéril a una concentración final de 2 mg / l. Golpee suavemente para mezclar.
- Preparar alícuotas pequeñas (por ejemplo, 12 l cada uno, se requieren 2 l por reacción) y almacenar a -20 ° C.
2. Preparación de células
- De semillas de células de mamífero tales como células HEK293 o neuronas primarias en un medio de crecimiento placa de 24 pocillos en 500 l incluyendo antibióticos.
NOTA: Al usar las neuronas, sembrar las células a baja densidad y utilizar sólo las dos filas intermedias de la placa de 24 pocillos. Cada pozo tendrá así una contraparte vacía para albergar el medio durante la incubación (paso 4.2). Al manipular las neuronas, asegúrese siempre de que las células no se mantienen fuera de la incubadora durante más de unos pocos minutos. - Cultivar las células en condiciones apropiadas (humedecido, 5% de CO2 y 37 ° C) hasta que las células son aplicación. 50%confluente.
NOTA: Al usar las neuronas, cultivar las células hasta la etapa de desarrollo deseado se alcanza y cambian aplicación. 25-50% del medio dos veces a la semana. Medio: medio Neurobasal (que contiene 1x B27, 5 mM L-glutamina y 1x penicilina y estreptomicina; comparar con ref 16).
3. Formación de complejos Chariot
- Por reacción, diluir 0,1-2 g de la POI o el anticuerpo correspondiente, así como la proteína de control, o anticuerpo de control, respectivamente, en 50 l de PBS.
NOTA: La técnica también funciona con los complejos macromoleculares que consiste en anticuerpos primarios y secundarios pre-determinada (cp 'Resultados representante', Figura 1.). Mezclar y efectos. - Para cada muestra, diluir 2 l Chariot solución madre en 50 l de PBS utilizando tubos separados con el fin de evitar la auto-asociación de Chariot. Mezclar y efectos.
- La transferencia de la PDI o anticuerpo (paso 3.1) diluido a la dilución del carro mediante una pipetating. Mezclar y efectos.
- Incubar la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente (complejos Chariot-PDI formarán).
4. Transfección de células
- Diluir los complejos Chariot (paso 3.4) en 100 l de medio de crecimiento pre-calentado (37 ° C, sin aditivos). Se elimina el medio y se lavan las células una vez utilizando pre-calentado PBS 1x.
NOTA: Al usar las neuronas, no se puede desechar el medio, que se volverá a utilizar. Mantenerlo a 37 ° C. Para el lavado, utilice PBS que contenía 0,5 mM de MgCl2 y CaCl2.
Sugerencia: mantener el medio en los pozos vacíos, mientras que la incubación de la placa (paso 4.5). - Aplicar la solución del complejo Chariot (paso 4.1) a las células y las células oscilar suavemente para asegurar una distribución uniforme de la solución. Cultivar las células en condiciones estándar (paso 2.2) durante 1 h. Añadir suero a una concentración final de 10%. Cuando se utilizan las neuronas, añadir el medio desde el paso 4.1. Cultivar las células durante 1 a 2 horas más.
NOTA: Latiempo de incubación óptimo depende del tamaño y las propiedades de la carga y puede ser necesario ajustar empíricamente. Las siguientes sugerencias pueden servir como guía: Para los péptidos, 1 hora suele ser suficiente, para las proteínas se recomiendan 1-2 horas, para los anticuerpos de 2 horas, y para la transfección de las neuronas con anticuerpos de 4 horas. - las células del proceso de análisis, como de costumbre. Tenga en cuenta: la técnica es compatible con los experimentos que usan protocolos de fijación, así como imágenes en directo.
5. Imaging
- El uso de un microscopio de barrido láser, tomar z-pilas de células y / o compartimentos de células de interés utilizando aproximadamente 0,25 a 0,5 micras distancia. La distancia capa depende del tamaño de la estructura a ser reconstruido y necesita ser determinado individualmente.
6. Reconstrucción
- En los pasos siguientes, utilice la parte inferior Esc para alternar entre Seleccionar y Navegar, Cntr para seleccionar varios objetos o haciendo clicn ellos y tecla de mayúsculas para cortar objetos (cp. paso 6.10).
- Abra el archivo en LSM-Imaris.
- Usando el ajuste de visualización para cada canal, contrastar la imagen hasta que las estructuras más brillantes llegar a la saturación. Tenga en cuenta que este ajuste no influirá en la construcción de la superficie, que sólo sirve para ayudar al experimentador en umbralización la imagen.
- Haga clic en el icono Añadir nuevas superficies. Se abrirá un asistente.
- Seleccionar: Segmento solamente una zona de interés. Proceder al siguiente paso.
- Ajustar los márgenes de la caja de selección para adaptarse a su objeto de interés. Por favor tener en cuenta que la imagen tiene 3 dimensiones y que la selección necesita ser ajustado en el plano z también. Si la forma rectangular de la caja de selección no debe coincidir con el objeto de interés correctamente, apague el objeto y / o ampliar el cuadro hasta que todas las estructuras necesarias están incrustados. objetos no deseados pueden ser eliminados más tarde (cp. paso 6.10). Proceder.
- Seleccione la ch apropiadaannel. El nivel de detalle de la zona de superficie o diámetro de la esfera deben configurarse para que coincidan las estructuras en proceso de reconstrucción. Dependiendo de las características de la señal, ya sea intensidad absoluta o contraste local se pueden utilizar. En general, contraste local funciona mejor para las señales difusas. En cualquier caso, los ajustes deben ser ajustados por separado para cada señal o estructura de interés, respectivamente.
- Con la herramienta de umbral, reconstruir la estructura de interés.
- Completar la reconstrucción haciendo clic en la flecha verde inferior.
- Ajuste el objeto mediante el uso de la herramienta de lápiz para cortar y eliminar las superficies según sea necesario. Sólo es posible cortar en dirección norte-sur, por lo tanto, la inclinación de la imagen con el fin de cortar el objeto deseado.
- Obtener mediciones de volumen, área e intensidades para cada superficie mediante la selección de Estadística, estadísticas detalladas, y valores medios.
- (Paso opcional) Observar las estadísticas codificadas por colores (cp. Figura 2E F), seleccione la ficha Color de la superficie correspondiente y marcar 'Estadística Codificada' en lugar de 'base'. Se mostrarán varias opciones.
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Representative Results
En los párrafos siguientes, los resultados de ejemplo que ilustran una caída funcional de un POI (Simiate, para más detalles, véase 16, 17) usando el reactivo Chariot y la interferencia de anticuerpos se presentan. Los resultados demuestran que la disminución de la expresión de Simiate deteriora la actividad transcripcional, y, en una forma dependiente de la dosis, induce la apoptosis, que culmina en las tasas de mortalidad de más del 99% si se aplican cantidades de anticuerpos más altos (> 1 mg de anticuerpos) (estos descubrimientos se publicaron previamente en 16). Aquí, ahora presentamos las técnicas y los protocolos empleados en detalle y, además, demostramos cómo reactivo Chariot se puede utilizar para transfectar neuronas del hipocampo disociadas en cultivos primarios.
Con el fin de investigar si los péptidos Chariot permiten una shuttling eficiente de anticuerpos y, en particular, si estos anticuerpos siguen siendo funcionales durante el procedimiento, expresamos FLAG-Simiate Durante 24 horas en células HEK293, y posteriormente se transfectaron las células que utilizan Chariot acoplados macromoléculas rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (Figura 1). El constructo de FLAG-Simiate está bien expresado por células HEK293 y se localiza en el somata, así como los núcleos de estas células (Figura 1A). Aquí, FLAG-Simiate racimos significativamente (Figura 1B), reflejando de esta manera la distribución de moteado endógeno Simiate en el núcleo.
Los complejos anticuerpo transportados a través de la membrana celular aparecen en los conjuntos (Figura 1A, en las flechas rojas, rojo), pero los anticuerpos liberados detectan FLAG-Simiate específicamente, como se muestra por una profunda colocalización de FLAG-Simiate y las macromoléculas rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (Figura 1B , en la flecha amarilla, amarillo). A partir de la nota, el experimento no sólo demuestra que los anticuerpos sigan funcionando durante un carro mediadapaso de la membrana, sino que también son capaces de entrar en el núcleo. Desde su tamaño excluye anticuerpos de emprender el núcleo a través de la difusión, es probable que la señal de localización nuclear presente en Chariot sí facilita la translocación de macromoléculas rbαSimiate-gtαrbAlexa568 en el núcleo. De hecho, los conjuntos de anticuerpos también se observan en o en, respectivamente, el compartimento nuclear (Figura 1B, flechas rojas).
Usando rbαSimiate-Chariot complejos para agotar funcionalmente Simiate endógeno en células HEK293 (Figura 2), encontramos que hemos sido capaces de apuntar hasta el 80% de los sitios de unión rbαSimiate, utilizando 2,0 g de anticuerpos 16. Curiosamente, mientras shuttling anticuerpos gtαrbAlexa568 solo en células HEK 293 no tuvo ningún efecto evidente en la aparición de motas nucleares (Figura 2A-C), la pérdida de Simiate funcional redondeada speckles nucleares (Figura 2D-F </ strong>, cp. 16) como se ilustra en las reconstrucciones tridimensionales (Figura 2 B, C vs E, F) y, en una forma dependiente de la dosis, la apoptosis inducida (Figura 3, cp. 16).
Dado que las células neuronales son muy sensibles a los efectos tóxicos, también se aplica la técnica en cultivos primarios de hipocampo (Figura 4). Usando el ensayo de TUNEL y tinción MAP2 para analizar la integridad celular, no se encontraron efectos sobre la viabilidad de las neuronas cuando se comparan las células simulados o no tratados y tratados Chariot (aprox. 20-25% de células positivas TUNEL después de 1 + 4 horas de tratamiento, cp. 4.4 -4.6). Por lo tanto, hemos probado mediada por anticuerpos carro yendo y viniendo en cultivos neuronales. Siguiendo el mismo esquema de aplicación, los conjuntos de anticuerpos gtαgpAlexa568 se observaron en mayor o menor se extiende en aproximadamente 83% de las células, en las que se produjeron en cuerpos celulares, así como núcleos (Figura 5A). Estas observaciones se deben también a bya análisis tridimensional (Figura 5B) y volver a montar de cerca la imagen observada en las células HEK293, junto ilustrando así que la técnica de Chariot se puede utilizar con éxito para transfectar disocia las neuronas del hipocampo primarias también.
Figura 1.-FLAG Simiate se detecta por anticuerpos específicos Simiate transportados en células HEK293 usando reactivo Chariot. Para los experimentos de interferencia de anticuerpos, anticuerpos rbSimiate-gtrbAlexa568 se monta previamente antes de la formación del complejo anticuerpo-carro. A) HEK293 células que expresan Simiate bandera de etiquetado. ensamblajes de anticuerpos Simiate entran en el soma, así como el núcleo después de la aplicación, donde colocalize específicamente con FLAG-Simiate. puntos redondos: ensambles de carro-rbSimiate-gtrbAlexa568 (flechas rojas). B) Un gran aumento de potencia de la región en cajaen (A) ilustra la colocalización de FLAG-Simiate y carro de señal mediada Simiate (flechas amarillas). Por favor, tenga en cuenta la presencia de un conjunto de anticuerpos Chariot en el núcleo (flecha roja). Barra de escala: 10 micras.
Figura 2. anticuerpos Simiate específicos transportados en células HEK293 interferir con las funciones celulares de endógeno Simiate. A, B) HEK293 células tratadas con Chariot-gtrbAlexa568 (1 g) sirven como control. En rojo, endógena Simiate se muestra en color falso, mientras que los conjuntos de carros gtrbAlexa568 no se muestran. speckles nucleares se marcaron usando el SC35 proteína marcadora (en verde), mientras que las células apoptóticas se identificaron mediante un ensayo de TUNEL (en azul). B) La reconstrucción de manchas nucleares de la región en caja en A. C) Reconstrucción de la misma región que ilustran los volúmenes y áreas superficiales de moteadode una manera codificada color. D, E) HEK293 células después del tratamiento Chariot-rbSimiate (0,5 g). Simiate endógeno, así como carro-rbSimiate-gtrbAlexa568 conjuntos se muestran en rojo, mientras que manchas nucleares y las células apoptóticas se muestran de acuerdo con A y B. E) motas nucleares reconstruidas a partir de la región en caja en el D. F) La misma región se muestra como esbozado para C. Tenga en cuenta la apariencia redondeada y la agregación de motas (todas las reconstrucciones: software de Imaris). La barra de escala en C, F: 2 micras. Todas las demás barras de escala: 10 micras. 1) Para la reconstrucción en tres dimensiones, se utilizaron células sólo no apoptóticas.
Figura 3. Las altas dosis de carro-rbSimiate-gtrbAlexa568 inducen la muerte celular masiva. HEK293 células fueron tratadas con 2 g de carro-gtrbAlexa568 o carro-rbSimiate-gtrbAlexa568, respectivamente (ambos borrador Lexes mostrados en verde y indicadas por las flechas, así como aumentos). Se aplicó la señal de TUNEL (en azul) para identificar las células apoptóticas. Barra de escala: 10 micras.
Figura 4. Chariot no es tóxico para las neuronas del hipocampo primaria. AB) DIV 7 neuronas eran o modelo de tratamiento (media, A) o sometida al reactivo Chariot (B) como se indica en el protocolo para el anticuerpo yendo y viniendo (1 + 4 horas; cp. 4.4 a 4.6). Mientras SC-35, una proteína marcadora de manchas nucleares, sirvió para etiquetar la maquinaria de transcripción y empalme, se aplicó la tinción de TUNEL para identificar células apoptóticas (flechas verdes). C) no tratados y tratados Chariot DIV 16/17 neuronas. tinción MAP2 se aplicó para visualizar los árboles dendríticos. Barras de escala: 10 m.
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Figura 5. Chariot transfección mediada es compatible con cultivos neuronales. A) Una neurona del hipocampo primario representante de div 5. La imagen muestra z proyecciones de pilas tomadas usando un microscopio de barrido láser (Laser Scanning Microscope 710, Zeiss). Barra de escala: 10 micras. Por favor, tenga en cuenta la aparición de complejos Chariot-gtgpAlexa568 (rojo) en el núcleo y el soma de la célula. B) Reconstrucción tridimensional (software Imaris) del núcleo, así como los conjuntos gtgpAlexa568 se muestra en A. Soma y dendritas de la neurona se indican con puntos grises, que son destilados de etiquetado de endógeno Simiate. Barra de escala: 10 micras. cantidad de anticuerpos transfectadas: 0,25 g.
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Discussion
A continuación, se presenta un protocolo para estudiar la importancia de los niveles de expresión de proteínas en el control de las funciones celulares de una manera impulsada dosis. El protocolo descrito permite una manipulación afinado de expresión de la proteína en varios tipos de células de mamíferos, incluyendo las neuronas del hipocampo, por lo tanto, facilitar los estudios detallados de función de la proteína en el nivel celular.
A pesar de la interferencia de ARN representa una estrategia bien conocida para regular a la baja PDI, tiene sus desventajas (cp. 14). No sólo la identificación de una secuencia altamente específica y eficiente puede ser costoso y consume mucho tiempo, sino también la biogénesis de transcripción dentro de la célula puede producir resultados impredecibles ya que la acumulación de las construcciones de ARN tóxicos, una sobrecarga de la maquinaria de exportación nuclear, así como una saturación del ARNi endógena sistemas de procesamiento pueden resultar en efectos o ineficiencia desviado. Además, altas cantidades de RNAi vectores exógenos pueden inducir unsefectos Específicos, así, y perturban la homeostasis celular.
Anticuerpos, por el contrario, no requieren más procesamiento por mecanismos endógenos una vez que han entrado en la célula, y son efectivos inmediatamente, lo que apoya no sólo la experimentación de ahorro de tiempo, sino también las investigaciones de los procesos celulares inmediatos. A pesar de que pueden tener efectos fuera de la meta inespecíficos, también, el número cada vez mayor de anticuerpos bien caracterizados y altamente específicos disponibles hace que esta alternativa merece una reflexión. Desde la entrega de complejos macromoleculares en células representa un obstáculo importante, diferentes técnicas de transfección se han desarrollado en los últimos años, incluyendo los péptidos R8 y azoR8 18, así como microesferas 19 shuttling mediada. Si bien R8 y azoR8 se indicaron a comportarse de manera similar a Chariot 18, se encontraron microesferas para requerir 24 horas para la absorción 19, que es considerablemente más largo que mem-Chariot mediadapasajes de branas y pueden causar dificultades en el estudio de las respuestas celulares dependientes de la dosis más rápido y más.
Sorprendentemente, la técnica de Chariot resultó ser aplicable a cultivos de hipocampo primarias, que son muy sensibles a los tratamientos y difíciles de transfectar. Hasta el momento, los portadores Chariot se han utilizado para analizar la función de proteínas en cultivos de osteoblastos primarios 20, así como en la línea celular de neuroblastoma-glioma NG108-15 21, culturas de la raíz dorsal de pollo ganglios de 21, o en células PC12 22, que se originan a partir de la neural cresta, pero no hay informes de cualquier aplicación en cultivos de células derivadas del sistema nervioso central están disponibles todavía. Dado que los reactivos de transfección Lipofectamine tradicionales como son ineficientes en estas células y transfecciones virales intrincados, Chariot podría representar una alternativa interesante.
Cabe destacar que, en sí Chariot se observó para localizar al núcleo 15, probablementedebido a su PKKKRKV señal de localización nuclear (cp. 23). De acuerdo con estas observaciones, hemos encontrado que Chariot transfección mediada por macromoléculas rbαSimiate-gtαrbAlexa568 dio lugar a un claro etiquetado de los compartimentos nucleares tales como manchas nucleares. De hecho, también se detectaron anticuerpos de control, tales como gtαgpAlexa568 en el núcleo de ambos, HEK293 y células primarias del hipocampo. Dado que los anticuerpos, en particular en conjuntos, son demasiado grandes para embarcar en el núcleo por difusión y desde sí mismo Simiate no contiene ninguna señal de localización nuclear conocido, sino más bien entra en el núcleo a través de la difusión, es probable que la señal de Chariot está implicado en la localización nuclear de anticuerpos. Alternativamente, un transporte en ensamblajes más grandes de proteína también podría ser posible, aunque esto no explicaría la presencia de gtαgpAlexa568 en el núcleo de las neuronas del hipocampo cultivadas de ratas, como no hay un objetivo para este anticuerpo en estas células. Además, siNCE Chariot se encontró que no interfiere con la localización natural de péptidos y proteínas 15 transportados, estas observaciones sugieren que los anticuerpos se comportan de manera diferente.
De hecho, cuando yendo y viniendo complejos de anticuerpos tales como carro-rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (Figura 1) o carro-gtαgpAlexa568 (Figura 5) a través de las membranas celulares, que aparecen en racimos, que sólo se disuelve, cuando las proteínas diana apropiadas, tales como Simiate endógena o FLAG-Simiate están presentes (sólo en la Figura 1). El uso de Chariot complejos de anticuerpos en los osteoblastos, Selim y colegios observaron el mismo efecto 20. Dado que Chariot se demostró que no interfiere con la localización de los péptidos y las proteínas de 15, estas observaciones indican que Chariot montado anticuerpos desmontan sólo si hay un mecanismo molecular, tal como una interacción anticuerpo-objetivo, que vence al inter hidrófoboacciones entre carro y su carga de anticuerpos y, por lo tanto, alienta el desmontaje. Debido a que los anticuerpos son más pesados que los péptidos o la mayoría de las otras proteínas y tienen, debido a su forma, una gran superficie, que puede asociarse con un mayor número de moléculas de los carros, y / o interactuar de forma más firme con péptidos carro, que de este modo promover una más Chariot impulsada el comportamiento de los anticuerpos. Por tanto, una falta de un mecanismo de desmontaje resultaría en un aspecto agrupado y una localización nuclear de la carga de anticuerpos (Figura 5).
Tomados en conjunto, los datos muestran que Chariot es especialmente adecuado para hacer frente a la función de proteínas que residen en el núcleo y que es aplicable en una variedad de tipos de células de mamíferos que incluyen neuronas del hipocampo primarias.
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Acknowledgments
El trabajo presentado fue apoyado en parte por la financiación de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud / Fundación para la Investigación del cromosoma X frágil del programa de asociación de Canadá a RD, la Fundación Jérôme Lejeune a RD, la Interdisziplinäres Zentrum für klinische Forschung de la Universidad de Erlangen-Nuremberg a RD y de la Deutsche Forschungsgemeinschaft a RD y RE. Los autores desean agradecer a Ingrid Zenger para la asistencia técnica con el mantenimiento del cultivo celular, así como el Prof. M. Wegner para la fabricación de un vector pCMV5-FLAG disponible. Los autores desean más Agradece en especial a Nadja Schroeder por el apoyo útil en la grabación de vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chariot | Active Motif | 30025 | store at -20 °C |
| Neurobasal medium | Life technologies | 21103-049 | warm up to 37 °C before using |
| 1x B27 | Life technologies | 17504044 | store at -20 °C |
| L-glutamine | Life technologies | 25030-149 | store at -20 °C |
| Penicillin and Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | store at -20 °C |
| Imaris software | Bitplane | n.a. | expensive, but unmatched |
| Laser Scanning Microscope | Zeiss | n.a. |
References
- Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. Abbas, A. K., Galli, S. J., Howley, P. M. 7, Annual Review. 219-245 (2012).
- Jiang, T. F., Chen, S. D. Dysfunction of two lysosome degradation pathways of alpha-synuclein in Parkinson's disease: potential therapeutic targets? Neurosci Bull. 28, 649-657 (2012).
- Howlett, D. R., Richardson, J. C. The pathology of APP transgenic mice: a model of Alzheimer's disease or simply overexpression of APP? Histol Histopathol. 24, 83-100 (2009).
- Carlson, G. A., et al. Genetic Modification of the Phenotypes Produced by Amyloid Precursor Protein Overexpression in Transgenic Mice. Human molecular genetics. 6, 1951-1959 (1997).
- Jiao, X. F., Wang, Z., Kiledjian, M. Identification of an mRNA-secapping regulator implicated in X-linked mental retardation. Mol. Cell. 24, 713-722 (2006).
- Fukami, M., et al. A member of a gene family on Xp22.3, VCX-A, is deleted in patients with X-linked nonspecific mental retardation. Am. J. Med. Genet. 67, 563-573 (2000).
- Van Esch, H., et al. Deletion of VCX-A due to NAHR plays a major role in the occurrence of mental retardation in patients with X-linked ichthyosis. Human molecular genetics. 14, 1795-1803 (2005).
- Sebat, J., et al. Strong association of de novo copy number mutations with autism. Science. 316, 445-449 (2007).
- Tartaglia, G. G., Pechmann, S., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. Life on the edge: a link between gene expression levels and aggregation rates of human proteins. Trends Biochem Sci. 32, 204-206 (2007).
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
- Uchino, K., Ochiya, T., Takeshita, F. RNAi therapeutics and applications of microRNAs in cancer treatment. Jpn J Clin Oncol. 43, 596-607 (2013).
- Li, T., Wu, M., Zhu, Y. Y., Chen, J., Chen, L. Development of RNA interference-based therapeutics and application of multi-target small interfering RNAs. Nucleic Acid Ther. 24, 302-312 (2014).
- DeVincenzo, J. P. The promise, pitfalls and progress of RNA-interference-based antiviral therapy for respiratory viruses. Antivir Ther. 17, 213-225 (2012).
- Fellmann, C., Lowe, S. W. Stable RNA interference rules for silencing. Nat Cell Biol. 16, 10-18 (2014).
- Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotechnol. 19, 1173-1176 (2001).
- Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Identification and Characterisation of Simiate, a Novel Protein Linked to the Fragile X Syndrome. PLoS One. 8, e83007 (2013).
- Derlig, K., et al. Simiate is an Actin binding protein involved in filopodia dynamics and arborisation of neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, (2014).
- Loudet, A., et al. Non-covalent delivery of proteins into mammalian cells. Org Biomol Chem. 6, 4516-4522 (2008).
- Nagel, D., et al. Polymeric microspheres as protein transduction reagents. Mol Cell Proteomics. 13, 1543-1551 (2014).
- Selim, A. A., et al. Anti-osteoactivin antibody inhibits osteoblast differentiation and function in vitro. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 13, 265-275 (2003).
- Jain, A., Brady-Kalnay, S. M., Bellamkonda, R. V. Modulation of Rho GTPase activity alleviates chondroitin sulfate proteoglycan-dependent inhibition of neurite extension. J Neurosci Res. 77, 299-307 (2004).
- Watanabe, S., Wakasugi, K. Neuroprotective function of human neuroglobin is correlated with its guanine nucleotide dissociation inhibitor activity. Biochem Biophys Res Commun. 369, 695-700 (2008).
- Eguchi, A., et al. Optimization of nuclear localization signal for nuclear transport of DNA-encapsulating particles. J Control Release. 104, 507-519 (2005).
