Introduction
Muitos animais usam vocalizações para a comunicação intra-específica. No musculus rato Mus, um importante tipo de sinal de comunicação é vocalizações ultra-sônicas (USVs), que têm frequências superiores a 20 kHz. USVs emitidos pelos ratos são considerados um componente de reconhecimento social em masculino-feminino 1-4, fêmea-fêmea 1, 5, e macho-macho 1, 6 interações. USVs também são emitidos por filhotes quando eles são isolados a partir de sua mãe, o que aumenta o seu comportamento de recuperação de cachorro, e, portanto, a sobrevivência dos cachorros 7. Embora muitos relatórios analisados e categorizados USVs rato 8, 9, as respostas comportamentais e mecanismos neurais do animal que recebeu foram documentados menos 10, 11. O último é necessário clarificar o significado biológico das várias características de USVs. Para revelar destes mecanismos, o experimento de reprodução é um método eficiente. Estudos recentes revelaram que a reprodução femininaratos são atraídos para USVs 12, e que eles preferem USVs de homens que são diferentes de seus pais 13, 14.
Este artigo explica o ensaio utilizado para avaliar a reprodução preferência USV em ratinhos. Uma caixa de teste de dois escolha foi desenvolvido no qual dois USVs diferentes podem ser reproduzidos simultaneamente em dois compartimentos de uma câmara de ensaio, como se mostra na Figura 1. Este tipo de caixa de teste evita a contaminação do som através da divisão da área de teste em três sub-câmaras , usando paredes de chumbo. Os emissores de ultra-som estão localizados fora cada quarto. Na parede entre os quartos e emissores de ultra-som são buracos cobertos com malha de arame. Ratos podem circular livremente nos três quartos, e mostrar uma "busca da malha" comportamento, como se para responder a USVs reproduzidos pelos emissores de ultra-som. Neste teste, os ratos permanecer por períodos de duração diferente perto de um emissor de som ou de outro. Estes parâmetros podem estar logado para obter uma sensível measu re de preferências de som.
Para reproduzir as USVs volta, silício nanocristalino emissores termo-acústicos (ie, "emissor nc-Si") foram utilizados como em estudos anteriores 15-17. Estes dispositivos são constituídos por um eléctrodo de película fina aquecedor, uma camada de silício nanoporoso, e uma pastilha de silício monocristalino. O ficheiro de som digital é convertido para um sinal analógico e, em seguida, passado através do aquecedor de eléctrodo. O dispositivo converte os sinais térmicos dependentes da voltagem, resultando em pressão sonora significativa com baixa distorção. Este dispositivo é único na medida em que, ao contrário de geradores de som comuns que dependem de vibrações mecânicas, ele pode reproduzir som sem a necessidade de um diafragma. O emissor apresenta um nível de pressão sonora plana a frequências de 20 a 160 kHz (Figura 2), e pode reproduzir USVs murino gravados digitalmente de forma muito precisa em termos de duração, freqüência e nível de pressão sonora de 15, 18, 19.
ve_content "> Em uma experiência representativa mostrada na Figura 3, C57BL / 6 (B6) fêmeas foram autorizados a escolher entre BALB / c (BALB) USVs macho e ruído de fundo. Além disso, a Figura 4 mostra a escolha das fêmeas B6 e BALB entre playbacks USV simultâneas de um BALB e um macho B6, conforme relatado em um estudo anterior 14. As características dos USVs masculinos diferem entre B6 e BALB estirpes 20. Como mostrado por estes resultados, a atratividade de USVs pode ser avaliada com o presente protocolo, em que os sons são gravados a partir de um indivíduo vivo, acústico analisado, e jogou de volta para outros indivíduos.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Azabu o. Todas as experiências foram realizadas numa câmara à prova de som.
1. Preparação de animal
- Os machos para gravação
- Obter camundongos machos sexualmente maduros experientes no acasalamento.
- Indivíduos do sexo feminino
- Obter camundongos fêmeas virgens que foram alojados com 2 a 5 ninhada por gaiola (geralmente 8 - 12 semanas de idade).
- Obter esfregaços vaginais diariamente para determinar a fase do ciclo estral antes do teste, de acordo com McLean 21. Cuidados devem ser tomados para minimizar a estimulação vaginal para evitar pseudogravidez.
- Corar as manchas com Giemsa, e determinar a fase do ciclo estral com base na presença ou ausência de leucócitos, células epiteliais cornificadas e nucleadas células epiteliais, de acordo com Nelson 22.
2. Dispositivos (Figura 1)
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Figura 1. Esquema do teste de Box e dispositivos Two-escolha. Os ratos podem acessar salas A e B através das pequenas portas localizadas entre eles ea zona neutra. A caixa-dois e dois emissores escolha de ultra-som são colocados no chão de uma câmara à prova de som. O microfone está suspenso dentro da câmara à prova de som. Abreviatura:. PC, computador pessoal Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Para Gravação
- Ligue um microfone condensador de ultra-som a um PC usando um conversor USB A / D.
- Defina o nível de ganho do conversor A / D para "7".
- Dados acústicos, discos em arquivos de formato de 16 bits com uma taxa de amostragem de 400 kHz usando o software de captura de áudio.
- Para Reprodução
- Conecte um conversor D / A para o PC usandouma interface USB.
- Conecte dois amplificadores para o conversor D / A através de um atenuador. (Este último dispositivo serve para evitar a sobrecarga.)
- Conecte um emissor de ultra-som para cada amplificador.
3. USV gravação
- Coloque um rato macho em uma pequena (17 x 10 x 11 cm) ou (21 x 14 x 13 cm) gaiola de tamanho médio com um buraco de seis centímetros de diâmetro na parede lateral eo buraco coberto com uma tela de arame de 0,5 centímetros. Quando se utiliza uma gaiola de tamanho médio, construir uma partição entre o centro da gaiola para reduzir a área.
- Não use roupas de cama na gaiola para evitar ruídos sussurrantes que podem contaminar as gravações.
- Coloque um microfone ao lado da malha.
- Iniciar o monitoramento vocalização ultra-sônica com a configuração de gravação mostrado na etapa 2.1.
- Coloque um rato fêmea sexualmente madura em qualquer metaestro ou diestro na gaiola com o rato macho.
- USVs recorde para 3-5 min.
4. Test Box
- Construir caixa de teste usando a placa de acrílico (Figura 1).
Nota: A caixa de teste (35 x 20 e 20 x cm de altura) é dividido em três compartimentos: a zona neutra (15 x 20 cm), e quartos A e B (20 x 10 cm, cada). Salas A e B cada um tem um buraco de 4 cm de diâmetro, que é coberta com uma malha de arame de 0,5 centímetros. Os buracos da malha e estão localizados em cada extremidade de salas A e B. Adicione portões (5 x 5 cm cada) entre a zona neutra e salas A e B. - Para evitar fuga de som isolar cada emissor de ultra-sons, com excepção para o lado voltado para a malha, utilizando placas de borracha, selando-os para a caixa em torno do perímetro de cada malha.
- Lugar de chumbo vedantes em ambos os lados da parede entre os quartos A e B para isolamento de som.
5. Preparação para a reprodução de som
- Criação de sons de reprodução
- Captar um segmento de 20 segundos de USV do arquivo gravado usando o software de edição de áudio digital.
- Selecione e captar o fundo nãoise (0,35 seg) do arquivo de segmento 20 seg USV. Crie um arquivo de ruído de fundo 20 segundos, repetindo o segmento de ruído.
- Para reproduzir os dois arquivos de som em simultâneo, exportá-los como um único arquivo de som estéreo, com um arquivo para a "orelha esquerda" e outro arquivo para a "orelha direita."
- Filtrar os arquivos de som usando como filtro passa-alta com um corte de 40 kHz.
- Reduzir o ruído utilizando a ferramenta de redução de ruído no software de pós-processamento. Selecione e capturar um segmento do arquivo que não contém USVs como o perfil de redução de ruído, e executar a redução do ruído com nível 40.
- Calibragem dos Sons Reprodução
- Certifique-se de que o espaço entre os emissores de ultra-som e microfone é de 10 cm.
- Para calibrar os níveis de pressão sonora de os emissores de ultra-som, realizar o monitoramento de ultra-som usando a configuração descrita no Passo 2.1. Medir o nível de pressão sonora pelo microfone em decibéis (dB).
- Using do atenuador e amplificadores, ajustar o volume dos USVs geradas pelos emissores de ultra-sons para o mesmo nível de pressão do som como os USVs macho gravados no Passo 3.
- Ao usar os dois emissores de ultra-som e um arquivo de som composto por USVs e ruído de fundo, confirmar que os dois emissores de ultra-som apresentar o mesmo nível de pressão sonora utilizando um som de calibração (por exemplo, um tom puro de 75 kHz), antes de realizar o teste comportamental.
- Ao reproduzir um arquivo de som composto por duas correntes de USVs, ajuste os dois níveis de pressão sonora gerada para o mesmo nível, antes do teste.
6. Teste Duas escolha
- Coloque os emissores de ultra-som por trás das malhas da caixa de teste.
- Feche as portas para salas A e B com uma placa de acrílico, e habituar o assunto do sexo feminino para a zona neutra para 30 min. Cobrir a caixa com placa de acrílico para evitar que o rato pode escapar.
- Iniciar a gravação de vídeo usando um CCD câmara montada por cima da caixa. A câmara (não mostrada na Figura 1) abrange a área de todos os três compartimentos.
- Retire a tampa e porta-board e permitir que a fêmea para explorar livremente a caixa de teste, incluindo as zonas de som.
- Uma vez que a fêmea tem investigado as duas malhas, e voltou para a zona neutra, começar a jogar um arquivo de som 20 seg repetidamente para 5 ou 10 min.
- Realizar monitoramento comportamental para 5 ou 10 min.
- Para reduzir pistas olfactivas indesejáveis depositados a partir do objecto anterior, limpar as gaiolas de teste entre os testes com etanol a 70%.
- Mude o local de emissores de ultra-som A e B aleatoriamente para evitar o efeito de viés lado inerente no sentido de quartos A ou B.
7. Análise estatística
- Usando o software evento de scoring comportamental, analisar os seguintes parâmetros: número total de entradas em cada quarto; duração total de permanência em cada zona intermediária; duração total de permanência em cada zona de som; eduração total de busca de cada malha em frente do emissor de ultra-som. A figura 1 ilustra o que se entende por "zona central" e "zona de som."
Nota: Nos casos em que o rato permanece na linha divisória entre as duas zonas (Figura 1, linha tracejada) determinar os locais pela direcção da cabeça. Quando a cabeça voltada para o lado da malha, ele é marcado como uma estadia na zona de som. - Para cada parâmetro comportamental, comparar as respostas para as salas A e B utilizando um teste de sinais com posto Wilcoxon, ou -Testes t pareado com nível de significância de 0,05.
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Representative Results
Os USVs gravado a partir de um ratinho BALB-macho (161 sílabas por 20 seg), bem como o ruído de fundo foram usadas como a reprodução de sons na experiência representativa mostrada na Figura 3. Nesta experiência, 7 ratinhos B6 fêmeas foram usadas às 9 semanas de idade . Para determinar a melhor duração de teste de resposta feminina para reproduzir sons, os parâmetros comportamentais foram analisados separadamente para as primeira e a última de cinco minutos de tempo total de ensaio de 10 min.
Em primeiro lugar, não houve diferença significativa na duração total da estadia em salas A e B durante o período de investigação antes da reprodução (Figura 3A), o que demonstra que não houve resultados bias.The lado também mostrou que não havia nenhuma diferença entre o lado de fundo do ruído e o lado do macho-USVs no número de entradas de apartamentos, analisando os primeiros 5 minutos, a última 5 min, e o tempo de teste total (Figura 3B). A figura 3C mostra segundos cumulativas de Duracion de estadia em cada quarto durante a reprodução (ou seja, a duração total da estada na zona média, e na zona de som). Os sujeitos gasto tempo significativamente maior no lado do macho BALB-USV do que no lado do fundo por ruído quando se analisa a primeira 5 min (p = 0,043), ou o tempo de teste total (p = 0,043). Não houve diferenças significativas nesses parâmetros ao analisar pela última 5 min. Não houve diferenças significativas entre o lado do fundo de ruídos e do lado do macho-USVs na zona média (Figura 3D). No entanto, as fêmeas B6 gasto significativamente mais tempo na zona de som e busca a malha no lado do BALB macho-USV, em comparação com o lado do fundo ruído, ao analisar o primeiro 5 min (zona Sound, p = 0,018, figura 3E; malha , p = 0,018, Figura 3F) ou o tempo total de teste (zona de som, p = 0,028, Figura 3E; malha, p = 0,043, Figura 3F). Os resultados demonstram claramente que uma fêmea B6Abordagens mais o macho-USVs reproduzidas do que o ruído de fundo, em particular na primeira 5 min.
Este teste de dois escolha é útil para comparar as características de USVs. Em um estudo anterior, foi utilizado este teste para determinar USV preferência de camundongos fêmeas BALB B6 e para USVs de machos destas estirpes 11. Quando se utiliza uma combinação de reprodução de USVs de um B6 (133 sílabas por 20 seg) e um ratinho BALB (108 sílabas por 20 seg) do sexo masculino, ratos fêmeas de cada uma destas estirpes demonstrou mais vezes procurando os USVs de machos da outra estirpe de do seu próprio um (Figura 4).
Figura 2. Medida Nível de Pressão Sonora (SPL) Gerado pelo nc-Si Emitter como uma função da frequência Um SPL quase constante de cerca de 80 -. 90 dB é observada entre 40 e 160 kHz. Pow entrada ACer é de 1,3 W no presente caso. O emissor foi colocado a uma distância de 20 mm a partir de um microfone de condensador de alta frequência e alinhado com o seu centro. Este valor foi modificado a partir Kihara 19. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. B6 Feminino resposta ao ruído de fundo e BALB Masculino USVs. (A) Duração total de estadia em quartos A ou B durante o tempo de investigação antes da reprodução. (B) Número de entradas quarto durante a reprodução. (C) Duração total de estadia nos quartos. (D) Duração total de estadia na zona média . (E) Duração total de permanência na zona de som. (F) Duração total de procurar as malhas. As medições de cadaindivíduo são dadas em gráficos de pontos; barras horizontais em cada parcela indicam a média; n = 7; * Indicam diferença significativa (p <0,05) entre o ruído de fundo e USVs masculinos para os parâmetros analisados; Wilcoxon testes signed-rank. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Feminino Response to USVs de machos a partir de uma cepa diferente vs. da mesma estirpe. B6 (n = 6) e BALB (n = 10) do sexo feminino em diestro expostos a cama suja-macho antes do teste apresentaram tempos de busca duração mais longos para o outros USVs tensão. Os valores apresentados são a média + erro padrão; * Indicam diferenças significativas (p <0,05); Testes signed-rank de Wilcoxon. Este valor foi modificado a partir Asaba
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por um Grant-in-Aid para JSPS Fellows para AA; por Grants-in-Aid para a Investigação Científica em áreas inovadoras para jsps Fellows (No. 4501 e nº 25132712) para TK; e por um subsídio concedido pelo projeto de pesquisa Azabu University. Figura 2 é reproduzido a partir de Kihara, T., Harada, T., & Koshida, fabricação e características de silício nanocristalino emissores de ultra-som induzido termicamente compatível-Wafer N.. Em: sensores e atuadores A: físico, volume 125, Elsevier, p. 426, (2006), com a permissão da Elsevier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Soundproof chamber | Muromachi Kikai | ||
| Small cage | CLEA Japan | CL-0113-1 | |
| Middle cage | CLEA Japan | CL-0103-1 | |
| Ultrasound condenser microphones | Avisoft Bioacoustics | CM16/CMPA | |
| A/D converter | Avisoft Bioacoustics | UltraSoundGate116H | |
| Audio software | Avisoft Bioacoustics | RECORDER USGH | |
| Adobe Audition 3.0 / Audio editing software | Adobe Systems | Adobe Audition 3.0 | |
| Nc-Si emitter | Original | not commercially available but it is planned to be so in near future | |
| D/A converter | National Instruments | NI USB-6251 BNC | |
| Attenuator | Original | ||
| Amplifier | Yamatake | ||
| PC | Windows 7 professional | Intel® core i7-2600K CPU @ 3.4GHz, 8GB RAM, 64-bit operating system | |
| Event recorder Excel-macro / Event-scoring software | original | Programmed by Naoto Akagawa & Takeru Yamamoto | |
| CCD Camera | |||
| Rubber plates (made of elastomer resin) | Tokyo bouon | TI-75BK B4 | Cut them to the proper size http://www.piano-bouon.jp/shopping/?pid=1329272401-447630&ca=6&p=3 |
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 |
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