Introduction
Många djur använder läten för intraspecifik kommunikation. I musen Mus musculus, en viktig typ av kommunikationssignal är ultraljud läten (USVs), som har frekvenser högre än 20 kHz. USVs avges av möss betraktas som en del av socialt erkännande i manligt-kvinnligt 1-4, hona-hona 1, 5, och hane-hane 1, 6 interaktioner. USVs släpps även ut från valpar när de är isolerade från sin mamma, vilket ökar hennes valp-hämtning beteende, och därför överlevnad 7. Även om många rapporter har analyserat och kategoriseras mus USVs 8, 9, beteende svar och neurala mekanismer i den mottagande djuret har mindre dokumenterat 10, 11. Det senare är nödvändigt att klargöra den biologiska betydelsen av de olika egenskaperna hos USVs. För att visa dessa mekanismer, är uppspelningsexperiment en effektiv metod. Nyligen genomförda studier uppspelning har visat att kvinnormöss lockas till USVs 12, och att de föredrar USVs från män som skiljer sig från sina föräldrar 13, 14.
Den här artikeln förklarar test uppspelning används för att utvärdera USV företräde hos möss. En två-val testlåda har utvecklats i vilka två olika USVs kan spelas upp samtidigt i två avdelningar av en test hölje, såsom visas i figur 1. Denna typ av test box förhindrar ljudförorening genom att dividera testområdet i tre underkammare , med hjälp av bly väggar. Ultraljudssändare finns utanför varje rum. I väggen mellan rummen och ultraljudssändare finns hål täckt med metallnät. Möss kan röra sig fritt i de tre rummen, och visar en "söka på nätet" beteende, som om att svara på USVs spelas upp av ultraljudssändare. Vid detta test möss bo för perioder av olika varaktighet nära en ljudsändare eller det andra. Dessa parametrar kan loggas för att erhålla ett känsligt measu re av ljud önskemål.
Att spela USVs tillbaka, nanokristallinska kisel termoakustiska sändare (dvs "nc-Si emitter") användes som i tidigare studier 15-17. Dessa anordningar består av ett tunnfilmsvärmare elektrod, en nanoporöst kiselskiktet, och en enda kristallin kiselskiva. Den digitala ljudfilen omvandlas till en analog signal och sedan leds genom värmaren elektroden. Enheten omvandlar de resulterande spänningsberoende termiska signaler till betydande ljudtryck med låg distorsion. Denna anordning är unikt genom att, till skillnad från vanliga ljudgeneratorer som är beroende av mekaniska vibrationer kan den reproducera ljud utan behov av ett membran. Sändaren uppvisar en platt ljudtrycksnivå vid frekvenser från 20 till 160 kHz (Figur 2), och kan reproducera digitalt inspelade murina USVs mycket noggrant när det gäller varaktighet, frekvens och ljudtrycksnivå 15, 18, 19.
ve_content "> I ett representativt experiment som visas i figur 3, var C57BL / 6 (B6) honor tillåtas att välja mellan BALB / c-(BALB) manliga USVs och bakgrundsbrus. Dessutom visar figur 4 valet av B6 och BALB kvinnor mellan samtidiga UPS-uppspelningar från en BALB och B6 hane, som rapporterats i en tidigare studie 14. Egenskaperna hos manliga USVs skiljer mellan B6 och BALB stammar 20. Som framgår av dessa resultat, kan attraktionskraft USVs bedömas med det nuvarande protokollet, där ljud spelas in från en levande individ, akustiskt analyseras och spelas upp för andra individer.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden godkändes av den etiska kommittén i Azabu University. Alla experiment utfördes i ett ljudisolerat kammaren.
1. Animal Förberedelse
- Handjur för inspelning
- Skaffa könsmogna hanmöss upplevt i parning.
- Kvinnliga försökspersoner
- Skaffa jungfru kvinnliga möss som har inhysts med 2 till 5 kullsyskon per bur (vanligen 8 - 12 veckor gamla).
- Skaffa vaginala smetar dagligen för att bestämma fasen hos estrous cykeln före provet enligt McLean 21. Försiktighet bör vidtas för att minimera vaginal stimulans för att undvika pseudodräktighet.
- Färga utstryk med Giemsa, och bestämma fasen hos Östrogencykeln baseras på närvaron eller frånvaron av leukocyter, cornified epitelceller, och kärnförsedda epitelieceller, enligt Nelson 22.
2. apparater (Figur 1)
_content ">
Figur 1. Schematisk av två val Test Box och enheter. Möss kan få tillgång till rum A och B genom de små portar som finns mellan dem och den neutrala zonen. De två valsrutan och två ultraljudssändare placeras på golvet i ett ljudisolerat kammare. Mikrofonen är upphängd inuti ljudisolerade kammare. Förkortning:. Dator, persondator Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- För inspelning
- Anslut en ultraljudskondensatormikrofon till en dator via en USB-A / D-omvandlare.
- Ställ in förstärkningsnivån hos A / D-omvandlaren till "7".
- Rekord akustiska data i 16-bitars-filer med en samplingshastighet på 400 kHz med hjälp av ljudinspelning programvara.
- För uppspelning
- Anslut en D / A-omvandlare till datorn med hjälp avett USB-gränssnitt.
- Ansluta två förstärkare till D / A-omvandlare med en dämpare. (Den senare anordningen tjänar till att förhindra överbelastning.)
- Anslut en ultraljudssändare till varje förstärkare.
3. USV Inspelning
- Placera en manlig mus i en små- (17 x 10 x 11 cm) eller medelstora (21 x 14 x 13 cm) bur med ett hål 6 cm diameter i sidoväggen och hålet täckt med ett 0,5 cm trådnät. Vid användning av en medelstor bur, konstruera en skiljevägg tvärs över mitten av buren för att minska området.
- Använd inte strö i buren för att undvika prasslande ljud som kan förorena inspelningarna.
- Placera en mikrofon vid nätet.
- Börja ultraljuds vocalization övervakning med inspelning inställningar visas i steg 2.1.
- Placera en sexuellt mogna kvinnor mus antingen metestrus eller diestrus i buren med manliga musen.
- Rekord USVs för 3-5 min.
4. Test Box
- Bygg testrutan med hjälp av akrylbräda (Figur 1).
Obs! Testet låda (35 x 20 och x 20 cm hög) är uppdelad i tre avdelningar: en neutral zon (15 x 20 cm), och rum A och B (20 x 10 cm, vardera). Rum A och B har vardera en 4 cm diameter hål som är täckt med en 0,5 cm trådnät. Hålen och mask är belägna vid vardera änden av rum A och B. Se grindar (5 x 5 cm vardera) mellan den neutrala zonen och rum A och B. - För att förhindra ljudläckage isolera varje ultraljudssändare, med undantag för den sida som vetter nätet, med hjälp av gummiplattor, tätning dem till rutan i ytterkanten av varje maska.
- Placera plombering på båda sidor av väggen mellan rum A och B för ljudisolering.
5. Förberedelser för ljuduppspelning
- Skapande av uppspelnings Sounds
- Fånga en 20 sek segment av USV från den inspelade fil med digitalt ljud redigeringsprogram.
- Välj och fånga bakgrund ingenISE (0,35 sek) från 20 sek USV segment fil. Skapa en 20 sek bakgrundsbrus fil genom att upprepa brussegmentet.
- För att spela upp de två ljudfiler samtidigt, exportera dem som en enda stereoljud fil med en fil för "vänster öra" och den andra filen för "höger öra."
- Filtreringsljudfiler med användning av som högpassfilter med en brytpunkten på 40 kHz.
- Minska bruset hjälp av brusreducering i efterbearbetning programvara. Välj och fånga en del av den fil som innehåller inga USVs som brusreducering profil och köra brusreducering med nivå 40.
- Kalibrering av uppspelnings Sounds
- Se till att utrymmet mellan ultraljudssändare och mikrofon är 10 cm.
- För att kalibrera ljudtrycksnivåer från ultraljudssändare, utföra ultraljuds övervakning med hjälp av konfiguration som beskrivs i steg 2.1. Mät ljudtrycksnivån av mikrofonen i decibel (dB).
- USIng dämparen och förstärkare, justera volymen på de USVs genereras av ultraljudssändare till samma ljudtrycksnivå som de manliga USVs registrerats i steg 3.
- När du använder två ultraljudssändare och en ljudfil som består av USVs och bakgrundsljud, bekräftar att de två ultraljudssändare uppvisar samma ljudtrycksnivå med hjälp av en kalibrerings ljud (t.ex. en 75-kHz ren ton) innan du utför beteende testet.
- Vid reproduktion en ljudfil som består av två strömmar av USVs, justera de två genererade ljudtrycksnivåer på samma nivå, före testning.
6. Två vals Test
- Placera ultraljudssändare bakom maskorna i testrutan.
- Stäng grindarna till rum A och B med en akrylbräda och vänja den kvinnliga föremål för den neutrala zonen för 30 minuter. Täck lådan med akrylkortet för att undvika att musen kan fly.
- Starta videoinspelning med hjälp av en CCD kamera monterad ovanför rutan. Kameran (ej visad i fig 1) omfattar området av alla tre facken.
- Ta grinden och täck ombord och låta honan att utforska fritt testrutan, inklusive ljudzoner.
- När honan har undersökt båda maskor, och har återgått till den neutrala zonen, börja spela en 20 sek ljudfil upprepade gånger för 5 eller 10 min.
- Genomföra beteendeövervakning för 5 eller 10 min.
- För att minska oönskade doftsignaler avsatta från föregående ämne, rengör Burarnas mellan provningarna med 70% etanol.
- Slå på platsen för ultraljudssändare A och B slumpmässigt för att undvika inneboende sido partiskhet effekt mot rum A eller B.
7. Statistiska analyser
- Med hjälp av beteendehändelse poäng programvara, analysera följande parametrar: det totala antalet poster i varje rum; Totalt Vistelsen i varje mittzon; Totalt Vistelsen i varje ljud zon; ochtotal varaktighet på sökning av varje maska framför ultraljuds emittern. Figur 1 illustrerar vad som avses med "mittområde" och "ljud zon."
Obs: I de fall där musen stannar på skiljelinjen mellan de två områdena (Figur 1, streckad linje) bestämma plats genom riktning mot huvudet. När huvudet vänd mot mask sidan, det gjorde som en vistelse i ljudzonen. - För varje beteende parameter jämföra svar för rum A och B med användning av ett Wilcoxon signed-rank test, eller parade t -tests med en signifikansnivå på 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De USVs spelats in från en BALB-hane (161 stavelser per 20 sek), samt bakgrundsbrus användes som uppspelning ljud i representativt experiment visas i Figur 3. I detta experiment, var 7 kvinnliga B6-möss användes vid 9 veckors ålder . För att bestämma den bästa varaktighet för försöket av kvinnlig respons vill spela upp ljud, var de beteendeparametrar analyseras separat för de första och sista fem minuter av den totala 10 min provtid.
Först fanns det ingen signifikant skillnad i total Vistelsen i rum A eller B under utredningstiden före uppspelning (Figur 3A), vilket visar att det fanns inga sido bias.The Resultaten visade också att det inte fanns någon skillnad mellan bakgrundsbrus sida och han-USVs sida av antalet rumsanteckningar, analysera den första 5 min, de sista 5 min och den totala testtiden (figur 3B). Figur 3C visar kumulativa sekunders Duratjon vistelse i varje rum under uppspelning (dvs. totalt Vistelsen i mittzonen, och i ljudzonen). Försökspersonerna tillbringade betydligt längre tid i BALB mans USV sida än i bakgrunden brus sida när man analyserar de första 5 min (p = 0,043), eller den totala testtiden (p = 0,043). Det fanns inga signifikanta skillnader i dessa parametrar vid analys av förra 5 min. Det fanns inga signifikanta skillnader mellan bakgrundsbrus sidan och manliga-USVs sida i mittzonen (Figur 3D). Men tillbringade B6 kvinnor betydligt längre tid i ljudzonen och söka på nätet i BALB mans USV sida, jämfört med bakgrundsbrus sidan, när man analyserar de första 5 min (Sound zon, p = 0,018, Figur 3E; Mesh , p = 0,018, Figur 3F) eller total testtid (Sound zonen, p = 0,028, Figur 3E, Mesh, p = 0,043, Figur 3F). Resultaten visar tydligt att en B6 honanärmar sig mer de reproducerade manliga-USVs än bakgrundsbullret, särskilt i de första 5 min.
Denna två-val Testet är användbart för att jämföra egenskaperna hos USVs. I en tidigare studie, var detta prov användes för att bestämma USV preferens av B6 och BALB honmöss för USVs från hanar av dessa stammar 11. När du använder en uppspelnings kombination av USVs från en B6 (133 stavelser per 20 sekunder) och BALB (108 stavelser per 20 sek) manlig, honmöss av var och en av dessa stammar visade längre söktiden för USVs av män i den andra stammen än av sin egen en (figur 4).
Figur 2. Uppmätt ljudtrycksmätare (SPL) som genereras av nc-Si Sändare som en funktion av frekvens En nästan konstant SPL på cirka 80 -. 90 dB observeras mellan 40 och 160 kHz. AC-ingång power är 1,3 W i detta fall. Emittern placerades på ett avstånd av 20 mm från en högfrekvent kondensatormikrofon och i linje med sitt centrum. Denna siffra har modifierats Kihara 19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. B6 Kvinna svar på bakgrundsljud och BALB Male USVs. (A) Total Vistelsen i rum A eller B under utredningstiden före uppspelning. (B) Antal poster rum under uppspelning. (C) Totalt Vistelsen i rummen. (D) Totalt Vistelsen i mittzonen . (E) Total Vistelsen i ljudzonen. (F) Total längd söka maskorna. Mätningar av varjeindivid ges i punktdiagrammen; horisontella staplar i varje tomt visar medelvärdet; n = 7; * Indikerar signifikanta skillnader (p <0,05) mellan bakgrundsbrus och manliga USVs för de parametrar analyserade; Wilcoxon signed-rank test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Kvinna svar på USVs av män från en annan stam kontra samma stam. B6 (n = 6) och BALB (n = 10) kvinnor i diestrus exponerats för mans nedsmutsade sängkläder innan testning visade längre varaktighet söktider för andra stam USVs. Värden som visas är medelvärdet + standardfel; * Indikerar signifikanta skillnader (p <0,05); Wilcoxon signed-rank test. Denna siffra har ändrats från Asaba
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en Grant-i-Stöd för JSPS Fellows till AA; genom bidrag-i-Aid för vetenskaplig forskning om innovativa områden för JSPS Fellows (nr 4501 och nr 25132712) till TK; och ett forskningsprojekt bidrag som beviljats av Azabu University. Figur 2 återges från Kihara, T., Harada, T. & Koshida, N. Wafer-kompatibel tillverkning och egenskaper hos nanokristallina kiseltermiskt inducerade ultraljudssändare. I: Sensors and Actuators A: Fysiska, volym 125, Elsevier, s. 426, (2006), med tillstånd från Elsevier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Soundproof chamber | Muromachi Kikai | ||
| Small cage | CLEA Japan | CL-0113-1 | |
| Middle cage | CLEA Japan | CL-0103-1 | |
| Ultrasound condenser microphones | Avisoft Bioacoustics | CM16/CMPA | |
| A/D converter | Avisoft Bioacoustics | UltraSoundGate116H | |
| Audio software | Avisoft Bioacoustics | RECORDER USGH | |
| Adobe Audition 3.0 / Audio editing software | Adobe Systems | Adobe Audition 3.0 | |
| Nc-Si emitter | Original | not commercially available but it is planned to be so in near future | |
| D/A converter | National Instruments | NI USB-6251 BNC | |
| Attenuator | Original | ||
| Amplifier | Yamatake | ||
| PC | Windows 7 professional | Intel® core i7-2600K CPU @ 3.4GHz, 8GB RAM, 64-bit operating system | |
| Event recorder Excel-macro / Event-scoring software | original | Programmed by Naoto Akagawa & Takeru Yamamoto | |
| CCD Camera | |||
| Rubber plates (made of elastomer resin) | Tokyo bouon | TI-75BK B4 | Cut them to the proper size http://www.piano-bouon.jp/shopping/?pid=1329272401-447630&ca=6&p=3 |
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 |
References
- Panksepp, J. B., et al. Affiliative behavior, ultrasonic communication and social reward are influenced by genetic variation in adolescent mice. PLoS One. 2 (4), e351 (2007).
- Scattoni, M. L., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual repertoire of vocalizations in adult BTBR T+tf/J mice during three types of social encounters. Genes Brain Behav. 10 (1), 44-56 (2010).
- Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. The structure and usage of female and male mouse ultrasonic vocalizations reveal only minor differences. PLoS One. 7 (7), e41133 (2012).
- Merten, S., Hoier, S., Pfeifle, C., Tautz, D. A role for ultrasonic vocalisation in social communication and divergence of natural populations of the house mouse (Mus musculus domesticus). PLoS One. 9 (5), e97244 (2014).
- Amato, F. R., Moles, A. Ultrasonic vocalizations as an index of social memory in female mice. Behav. Neurosci. 115 (4), 834-840 (2001).
- Chabout, J., et al. Adult male mice emit context-specific ultrasonic vocalizations that are modulated by prior isolation or group rearing environment. PLoS One. 7 (1), e29401 (2012).
- Ehret, G. Infant rodent ultrasounds–a gate to the understanding of sound communication. Behav. Genet. 35 (1), 19-29 (2005).
- Holy, T. E., Guo, Z. Ultrasonic songs of male mice. PLoS Biol. 3 (1), e386 (2005).
- Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 46 (1), 28-34 (2007).
- Holfoth, D. P., Neilans, E. G., Dent, M. L. Discrimination of partial from whole ultrasonic vocalizations using a go/no-go task in mice. J. Acoust. Soc. Am. 136 (6), 3401 (2014).
- Neilans, E. G., Holfoth, D. P., Radziwon, K. E., Portfors, C. V., Dent, M. L. Discrimination of ultrasonic vocalizations by CBA/CaJ mice (Mus musculus) is related to spectrotemporal dissimilarity of vocalizations. PLoS One. 9 (1), e85405 (2014).
- Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic ‘songs’ with approach behaviour. Biol. Lett. 5 (5), 589-592 (2009).
- Musolf, K., Hoffmann, F., Penn, D. J. Ultrasonic courtship vocalizations in wild house mice, Mus musculus musculus. Anim. Behav. 79 (3), 757-764 (2010).
- Asaba, A., et al. Developmental social environment imprints female preference for male song in iice. PloS one. 9 (2), e87186 (2014).
- Uematsu, A., et al. Maternal approaches to pup ultrasonic vocalizations produced by a nanocrystalline silicon thermo-acoustic emitter. Brain Res. 1163, 91-99 (2007).
- Okabe, S., et al. The effects of social experience and gonadal hormones on retrieving behavior of mice and their responses to pup ultrasonic vocalizations. Zoolog. Sci. 27 (10), 790-795 (2010).
- Okabe, S., et al. Pup odor and ultrasonic vocalizations synergistically stimulate maternal attention in mice. Behav. Neurosci. 127 (3), 432-438 (2013).
- Shinoda, H., Nakajima, T., Ueno, K., Koshida, N. Thermally induced ultrasonic emission from porous silicon. Nature. 400 (6747), 853-855 (1999).
- Kihara, T., Harada, T., Koshida, N. Wafer-compatible fabrication and characteristics of nanocrystalline silicon thermally induced ultrasound emitters. Sensor. Actuat. A-Phys. 125 (2), 422-428 (2006).
- Kikusui, T., et al. Cross fostering experiments suggest that mice songs are innate. PloS One. 6 (3), e17721 (2011).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. J. Vis. Exp. (67), e4389 (2012).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biol. Reprod. 27 (2), 327-339 (1982).
- Tomihara, K., et al. Effect of ER-beta gene disruption on estrogenic regulation of anxiety in female mice. Physiol. Behav. 96 (2), 300-306 (2009).
- Zheng, Q. Y., Johnson, K. R. Hearing loss associated with the modifier of deaf waddler (mdfw) locus corresponds with age-related hearing loss in 12 inbred strains of mice. Hear. Res. 154 (1-2), 45-53 (2001).
- Haga, S., et al. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466 (7302), 118-122 (2010).
- Grimsley, J. M., Monaghan, J. J., Wenstrup, J. J. Development of social vocalizations in mice. PLoS One. 6 (3), e17460 (2011).
- Sugimoto, H., et al. A role for strain differences in waveforms of ultrasonic vocalizations during male-female interaction. PLoS ONE. 6 (7), (2011).
- Hanson, J. L., Hurley, L. M. Female presence and estrous state influence mouse ultrasonic courtship vocalizations. PLoS One. 7 (7), e40782 (2012).
- Wang, H., Liang, S., Burgdorf, J., Wess, J., Yeomans, J. Ultrasonic vocalizations induced by sex and amphetamine in M2, M4, M5 muscarinic and D2 dopamine receptor knockout mice. PLoS One. 3 (4), (2008).
- Moles, A., Kieffer, B. L., D'Amato, F. R. Deficit in attachment behavior in mice lacking the mu-opioid receptor gene. Science. 304 (5679), 1983-1986 (2004).
- Hiramoto, T., et al. Tbx1: identification of a 22q11.2 gene as a risk factor for autism spectrum disorder in a mouse. Hum. Mol. Genet. 20 (24), 4775-4785 (2011).
- Ey, E., et al. Absence of deficits in social behaviors and ultrasonic vocalizations in later generations of mice lacking neuroligin4. Genes Brain Behav. , (2012).
- Roy, S., Watkins, N., Heck, D. Comprehensive analysis of ultrasonic vocalizations in a mouse model of fragile X syndrome reveals limited, call type specific deficits. PLoS One. 7 (9), e44816 (2012).
