Introduction
Beaucoup d'animaux utilisent des vocalisations pour la communication intraspécifique. Dans le Mus musculus de la souris, un type important de signal de communication est vocalisations ultrasoniques (USV), qui ont des fréquences supérieures à 20 kHz. USV émis par les souris sont considérées comme un élément de reconnaissance sociale dans mâle-femelle 1-4, femelle-femelle 1, 5, et mâle-mâle 1, 6 interactions. USV sont également émis par les petits quand ils sont isolés de leur mère, ce qui augmente son comportement de chiot-récupération, et donc la survie des petits 7. Bien que de nombreux rapports ont analysé et catégorisé USV de souris 8, 9, les réponses comportementales et mécanismes neuronaux de l'animal à recevoir ont été moins documenté 10, 11. Ce dernier est nécessaire de clarifier la signification biologique des différentes caractéristiques de USV. Pour révéler ces mécanismes, l'expérience de la lecture est une méthode efficace. Études de lecture récentes ont révélé que femelleles souris sont attirés par USV 12, et qu'ils préfèrent USV de mâles qui sont différentes de leurs parents 13, 14.
Cet article explique le test de lecture utilisée pour évaluer USV préférence chez la souris. Une boîte d'essai de deux choix a été développé dans lequel deux USV différents peuvent être lues simultanément dans deux compartiments d'une enceinte d'essai, comme le montre la figure 1. Ce type de boîte d'essai empêche la contamination sonore en divisant la zone de test en trois sous-chambres , en utilisant des parois de plomb. Les émetteurs d'ultrasons sont situés à l'extérieur de chaque chambre. Dans le mur entre les chambres et les émetteurs d'ultrasons sont des trous recouverts de grillage. Les souris peuvent se déplacer librement dans les trois chambres, et montrer un comportement "la recherche de la maille", comme pour répondre à USV lus par les émetteurs d'ultrasons. Dans ce test, les souris restent pendant des périodes de durée différente à proximité de son émetteur une ou l'autre. Ces paramètres peuvent être enregistrés pour obtenir une mesu sensibles re de préférence son.
Pour jouer les USV arrière, silicium nanocristallin émetteurs thermo-acoustique (ie, «émetteur nc-Si») ont été utilisés comme dans les études précédentes 15-17. Ces dispositifs sont constitués d'une électrode à couche mince de chauffage, une couche de silicium nano-poreux, et une tranche de silicium monocristallin. Le fichier audio numérique est converti en un signal analogique et ensuite passé à travers l'électrode de chauffage. Le dispositif convertit les signaux thermiques dépendant de la tension résultant en une pression significative du niveau sonore avec une faible distorsion. Ce dispositif est unique en ce que, à la différence des générateurs de sons ordinaires qui dépendent de vibrations mécaniques, il peut reproduire le son sans la nécessité d'un diaphragme. L'émetteur présente un niveau de pression acoustique plat à des fréquences de 20 à 160 kHz (Figure 2), et peut reproduire USV murins enregistrés numériquement très précise en termes de durée, la fréquence et le niveau de pression acoustique de 15, 18, 19.
ve_content "> Dans une expérience représentative montrée sur la figure 3, C57BL / 6 (B6) femelles ont été autorisés à choisir entre des souris BALB / c (BALB) USV mâles et les bruits de fond. En outre, la figure 4 montre le choix des femelles B6 et BALB entre simultanés playbacks USV d'un BALB et un mâle B6, tel que rapporté dans une étude précédente 14. Les caractéristiques de USV hommes diffèrent entre B6 et BALB souches 20. Comme le montrent ces résultats, l'attractivité de l'USV peut être évaluée avec le présent Protocole, dans lequel les sons sont enregistrés à partir d'un individu vivant, acoustiquement analysés, et lus à d'autres personnes.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d'éthique de l'Université de Azabu. Toutes les expériences ont été réalisées dans une chambre insonorisée.
1. Préparation d'un animal
- Les mâles pour l'enregistrement
- Obtenir les souris mâles sexuellement matures rencontrées dans l'accouplement.
- Sujets féminins
- Obtenir les souris femelles vierges qui ont été logés avec 2 à 5 de la même portée par cage (généralement 8 - 12 semaines).
- Obtenir frottis vaginaux quotidienne pour déterminer la phase du cycle oestral avant le test, selon McLean 21. Des précautions doivent être prises pour minimiser la stimulation vaginale pour éviter pseudogestation.
- Colorer les frottis avec Giemsa, et déterminer la phase du cycle oestral sur la base de la présence ou de l'absence de leucocytes, les cellules epitheliales kératinisées, et les cellules épithéliales nucléées, selon Nelson 22.
2. Dispositifs (Figure 1)
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Figure 1. Schéma de la boîte et Test Devices deux choix. Les souris peuvent accéder aux salles A et B à travers les petites portes situées entre eux et la zone neutre. La boîte à deux choix et deux émetteurs d'ultrasons sont placés sur le plancher d'une chambre insonorisée. Le microphone est suspendu à l'intérieur de la chambre insonorisée. Abréviation:. PC, d'un ordinateur personnel S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Pour l'enregistrement
- Connectez un microphone à condensateur à ultrasons à un PC via un convertisseur USB A / D.
- Réglez le niveau de gain du convertisseur A / D à "7".
- Données acoustiques records en fichiers de format 16 bits avec un taux de 400 kHz en utilisant un logiciel de capture audio d'échantillonnage.
- Pour la lecture
- Connectez un convertisseur N / A à l'ordinateur à l'aideune interface USB.
- Connectez deux amplificateurs au convertisseur D / A travers un atténuateur. (Le dernier dispositif sert à éviter la surcharge.)
- Connectez un émetteur d'ultrasons à chaque amplificateur.
3. USV Enregistrement
- Placez une souris mâle dans une petite (17 x 10 x 11 cm) ou (21 x 14 x 13 cm) cage de taille moyenne avec un trou de 6 cm de diamètre dans la paroi latérale et le trou recouvert d'un treillis métallique de 0,5 cm. Lors de l'utilisation d'une cage de taille moyenne, de construire une cloison à travers le centre de la cage afin de réduire la zone.
- Ne pas utiliser la literie dans la cage pour éviter bruissements qui pourraient contaminer les enregistrements.
- Placez un microphone à côté de la maille.
- Commencez surveillance de vocalisation ultrasonique avec la configuration d'enregistrement affiché à l'étape 2.1.
- Placez une souris femelle sexuellement matures dans les deux metestrus ou dioestrus dans la cage avec la souris mâle.
- USV record pour 3 - 5 min.
4. TEst Box
- Construire la boîte de test en utilisant conseil acrylique (Figure 1).
Remarque: La boîte d'essai (35 x 20 et x 20 cm de haut) est divisé en trois compartiments: une zone neutre (15 x 20 cm), et des chambres A et B (20 x 10 cm, chacun). Les chambres A et B ont chacun un trou de 4 cm de diamètre qui est recouvert d'un treillis métallique de 0,5 cm. Les trous et les mailles sont situés à chaque extrémité de chambres A et B. Faire portes (5 x 5 cm chacun) entre la zone neutre et les chambres A et B. - Pour empêcher une fuite du son isoler chaque émetteur d'ultrasons, à l'exception de la face tournée vers le filet, en utilisant des plaques de caoutchouc, les sceller à la boîte autour du périmètre de chaque maille.
- Phoques Lieu de plomb sur les deux côtés du mur entre les chambres A et B pour l'isolation sonore.
5. Préparation pour la lecture audio
- Création de sons de lecture
- Capter un segment de 20 secondes de USV du fichier enregistré en utilisant le logiciel d'édition audio numérique.
- Sélectionner et capturer fond pasISE (0,35 sec) à partir du fichier du segment 20 sec USV. Créer un fichier de fond de bruit de 20 sec en répétant le segment de bruit.
- Pour lire les deux fichiers sonores simultanément, de les exporter dans un fichier stéréo unique, avec un fichier pour «l'oreille gauche» et l'autre fichier pour le "oreille droite."
- Filtrer les fichiers sonores en utilisant comme filtre passe-haut avec un seuil de coupure de 40 kHz.
- Réduire le bruit à l'aide de l'outil de réduction du bruit dans les logiciels de post-traitement. Sélectionner et capturer un segment du fichier qui ne contient pas de USV que le profil de réduction du bruit, et exécuter la réduction du bruit avec le niveau 40.
- Calibrage des sons de lecture
- Assurez-vous que l'espace entre les émetteurs d'ultrasons et le microphone est de 10 cm.
- Pour calibrer les niveaux de pression acoustique des émetteurs d'ultrasons, effectuer une surveillance par ultrasons en utilisant la configuration décrite dans l'étape 2.1. Mesurer le niveau de pression acoustique par le microphone en décibels (dB).
- Using l'atténuateur et amplificateurs, régler le volume des USV générés par les émetteurs d'ultrasons au même niveau de pression acoustique que les USV masculins enregistrés à l'étape 3.
- Lorsque vous utilisez les deux émetteurs d'ultrasons et un fichier sonore composée de USV et le bruit de fond, confirmer que les deux émetteurs d'ultrasons présentent le même niveau de pression sonore en utilisant un son d'étalonnage (par exemple, un son pur de 75 kHz) avant d'effectuer le test de comportement.
- Lors de la reproduction d'un fichier audio composé de deux courants de USV, ajuster les deux générés niveaux de pression acoustique au même niveau, avant le test.
6. Testez Deux choix
- Placez les émetteurs ultrasonores derrière les mailles de la zone de test.
- Fermez les portes de chambres A et B avec un panneau acrylique, et habituer le sujet féminin à la zone neutre pendant 30 min. Couvrir la boîte avec le conseil acrylique pour éviter que la souris ne peut échapper.
- Commencer l'enregistrement vidéo à l'aide d'un CCD caméra montée au-dessus de la boîte. L'appareil (non représenté sur la figure 1) couvre la zone de chacun des trois compartiments.
- Retirez la grille et le couvercle de bord et permettre à la femme d'explorer librement la zone de test, y compris les zones sonores.
- Une fois que la femelle a enquêté sur deux mailles, et est retourné à la zone neutre, commencer à jouer un fichier audio de 20 secondes à plusieurs reprises pendant 5 ou 10 minutes.
- Effectuer le suivi comportemental pour 5 ou 10 min.
- Afin de réduire les signaux olfactifs indésirables déposés auprès de la personne précédente, nettoyer les cages de test entre les tests avec 70% d'éthanol.
- Mettez le lieu d'émetteurs ultrasonores A et B au hasard pour éviter inhérente effet de polarisation de côté vers chambres A ou B.
7. Analyses statistiques
- Utilisation de logiciels événement scoring comportemental, analyser les paramètres suivants: nombre total d'inscriptions dans chaque chambre; durée totale de séjour dans chaque zone médiane; durée totale de séjour dans chaque zone sonore; etdurée totale de la recherche de chaque maille devant émetteur d'ultrasons. La figure 1 illustre ce que l'on entend par «zone médiane» et «zone saine."
Remarque: Dans les cas où la souris reste sur la ligne de démarcation entre les deux zones (figure 1, ligne pointillée) décider de l'emplacement par la direction de la tête. Lorsque la tête face au côté maille, il est marqué comme un séjour dans la zone de son. - Pour chaque paramètre comportemental, comparer les réponses des chambres A et B en utilisant un test-signé Wilcoxon, ou t-tests appariés avec un niveau de signification de 0,05.
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Representative Results
Les USV enregistrées à partir d'une souris BALB-mâle (161 syllabes par 20 sec), ainsi que le bruit de fond ont été utilisés comme la lecture des sons dans l'expérience représentative montrée sur la figure 3. Dans cette expérience, 7 souris B6 femelles ont été utilisées à 9 semaines d'âge . Pour déterminer la meilleure durée de l'essai de la réponse des femmes à la lecture des sons, les paramètres comportementaux ont été analysés séparément pour les cinq premières et dernières minutes du temps total d'essai de 10 min.
Tout d'abord, il n'y avait pas de différence significative dans la durée totale de séjour dans les chambres A ou B pendant la période d'enquête avant la lecture (figure 3A), ce qui démontre qu'il n'y a pas de résultats de bias.The côté ont également montré qu'il n'y avait pas de différence entre le côté de bruit de fond et le côté mâle-USV dans le nombre d'entrées de manger, analyser les 5 premières minutes, les 5 dernières minutes, et le temps total d'analyse (figure 3B). La figure 3C montre secondes cumulatifs de Duration de séjour dans chaque chambre pendant la lecture (par exemple, la durée totale du séjour dans la zone médiane, et dans la zone de son). Les sujets ont passé beaucoup plus de temps dans le côté mâle BALB-USV que dans le côté de bruit de fond lors de l'analyse les 5 premières minutes (p = 0,043), ou le temps total d'analyse (p = 0,043). Il n'y avait pas de différences significatives de ces paramètres lors de l'analyse par le dernier 5 min. Il n'y avait pas de différences significatives entre le côté de bruit de fond et le côté mâle-USV dans la zone médiane (Figure 3D). Cependant, les femelles B6 passé beaucoup plus de temps dans la zone saine et la recherche de la maille dans le côté BALB mâle-USV, par rapport au côté de bruit de fond, en analysant les 5 premières minutes (de la zone Sound, p = 0,018, figure 3E; Mesh , p = 0,018, figure 3F) ou le temps total de contrôle (zone Sound, p = 0,028, figure 3E; Mesh, p = 0,043, figure 3F). Les résultats démontrent clairement que la femelle B6des approches plus les hommes-USV reproduits que le bruit de fond, en particulier dans les 5 premières minutes.
Ce test de deux choix est utile de comparer les caractéristiques de USV. Dans une étude précédente, ce test a été utilisé pour déterminer USV préférence des souris femelles B6 et BALB pour USV des mâles de ces souches 11. Lors de l'utilisation d'une combinaison de lecture de USV à partir d'une B6 (133 syllabes par 20 sec) et une souris BALB (108 syllabes par 20 sec) mâle, les souris femelle de chacune de ces souches montrait plus fois la recherche des USV des mâles de l'autre souche de de leur propre une (figure 4).
Figure 2. Niveau de pression sonore mesuré (SPL) généré par le nc-Si l'émetteur en tant que fonction de la fréquence d'un SPL à peu près constante de l'ordre de 80 -. 90 dB est observée entre 40 et 160 kHz. Pow entrée ACER est de 1,3 W dans ce cas. L'émetteur est placé à une distance de 20 mm à partir d'un microphone à condensateur à haute fréquence et aligné avec son centre. Ce chiffre a été modifié depuis Kihara 19. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. B6 Réponse Femme au bruit de fond et BALB Homme USV. (A) de la durée totale du séjour dans les chambres A ou B pendant la période d'enquête avant la lecture. (B) Nombre d'entrées de manger pendant la lecture. (C) de la durée totale de séjour dans les chambres. (D) de la durée totale du séjour dans la zone médiane . (E) Durée totale du séjour dans la zone de son. (F) Durée totale de la recherche les mailles. Les mesures de chaqueindividuelle sont donnés dans les parcelles de points; barres horizontales dans chaque parcelle indiquent la moyenne; n = 7; * Indiquer des différences significatives (p <0,05) entre le bruit de fond et USV masculins pour les paramètres analysés; Essais signée-Wilcoxon. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Réponse Femme à USV des hommes à partir d'une souche différente par rapport à la même souche. B6 (n = 6) et BALB (n = 10) femmes dans dioestrus exposées à la literie mâle souillés avant les essais ont montré des durées de recherche de durée pour le autres USV de contrainte. Les valeurs indiquées sont la moyenne + erreur standard; * Indiquer des différences significatives (p <0,05); Essais signée-Wilcoxon. Ce chiffre a été modifié depuis Asaba
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de l'État pour les JSP Fellows à AA; Subventions par-in-Aid pour la recherche scientifique sur des domaines innovants pour les JSP Fellows (n ° 4501 et n ° 25132712) aux savoirs traditionnels; et par une subvention de projet de recherche décerné par l'Université Azabu. Figure 2 est tiré à part de Kihara, T., Harada, T., & Koshida, la fabrication et les caractéristiques du silicium nanocristallin induites thermiquement émetteurs ultrasonores compatible Wafer N.. Dans: Sensors and Actuators A: physique, un volume 125, Elsevier, p. 426, (2006), avec la permission d'Elsevier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Soundproof chamber | Muromachi Kikai | ||
| Small cage | CLEA Japan | CL-0113-1 | |
| Middle cage | CLEA Japan | CL-0103-1 | |
| Ultrasound condenser microphones | Avisoft Bioacoustics | CM16/CMPA | |
| A/D converter | Avisoft Bioacoustics | UltraSoundGate116H | |
| Audio software | Avisoft Bioacoustics | RECORDER USGH | |
| Adobe Audition 3.0 / Audio editing software | Adobe Systems | Adobe Audition 3.0 | |
| Nc-Si emitter | Original | not commercially available but it is planned to be so in near future | |
| D/A converter | National Instruments | NI USB-6251 BNC | |
| Attenuator | Original | ||
| Amplifier | Yamatake | ||
| PC | Windows 7 professional | Intel® core i7-2600K CPU @ 3.4GHz, 8GB RAM, 64-bit operating system | |
| Event recorder Excel-macro / Event-scoring software | original | Programmed by Naoto Akagawa & Takeru Yamamoto | |
| CCD Camera | |||
| Rubber plates (made of elastomer resin) | Tokyo bouon | TI-75BK B4 | Cut them to the proper size http://www.piano-bouon.jp/shopping/?pid=1329272401-447630&ca=6&p=3 |
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 |
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