Introduction
많은 동물 종자 간 통신을위한 발성을 사용합니다. 마우스 뮤스의 musculus에서 통신 신호의 하나의 중요한 유형은 20 kHz의보다 높은 주파수가 초음파 발성 (USVs)이다. 마우스에 의해 방출 USVs는 남성 여성, 1-4 여성 - 여성 1, 5, 남성 - 남성 (1), (6) 상호 작용의 사회 인식의 구성 요소로 간주됩니다. USVs는 그녀의 강아지 - 검색 행동을 증가 어머니로부터 분리되는 경우도 새끼에 의해 방출, 따라서 생존 7 강아지 있습니다. 많은 보고서가 적은 10에 설명 된 분석 마우스 USVs 8, 9, 행동 반응 및 수신 동물의 신경 메커니즘을 분류하고 있지만 11. 후자 USVs의 다양한 특성의 생물학적 의미를 명확하게 할 필요가있다. 이러한 메커니즘을 나타 내기 위해, 재생 실험 효율적인 방법이다. 최근 재생 연구는 여성의 것으로 밝혀졌다마우스는 USVs (12)에 매료되어, 그들은 그들의 부모 (13), (14)에서 다른 남성에서 USVs을 선호.
이 문서에서는 마우스의 USV 환경을 평가하는 데 사용되는 재생 테스트를 설명합니다. 두 선택 테스트 박스가도 1에 도시 된 두 개의 다른 USVs는 테스트 케이스의 두 구획을 동시에 재생할 수있는 개발되었다. 시험 상자의이 유형은 세 개의 서브 - 챔버에서 검사 영역을 분할하여 음성 오염을 방지 납 벽을 사용하여. 초음파 방출은 각 객실 외부에 있습니다. 객실과 초음파 이미 터 사이의 벽에서 철망으로 덮여 구멍이 있습니다. 마우스는 3 방에서 자유롭게 이동하고, 초음파 에미 터에 의해 재생 USVs에 응답하는 것처럼, "메시 검색"동작을 보여줄 수있다. 이 시험에서, 생쥐는 하나의 사운드 이미 터 또는 서로 근접 상이한 지속 기간까지. 이러한 매개 변수는 민감한 measu를 얻을 기록 할 수 있습니다 사운드 환경 설정의 재.
다시 USVs를 재생하려면, 나노 결정 실리콘 열 음향 방출 (즉, "NC-시 터")는 이전의 연구 15-17에서 사용 하였다. 이러한 장치는 박막 가열기 전극, 나노 다공성 실리콘 층과 단결정 실리콘 웨이퍼로 구성된다. 디지털 사운드 파일을 아날로그 신호로 변환 한 후 히터 전극을 통과한다. 장치는 낮은 왜곡과 상당한 음압으로 인한 전위 의존성 열 신호를 변환한다. 기계적 진동에 의존하는 일반적인 소리 발생기,이 진동판의 필요없이 음향을 재생 달리이 장치는 점에서 독특하다. 이미 터 (20)로부터 160 kHz에서 (도 2)까지의 주파수에서 평면 음압 레벨을 나타내고, 그리고 시간, 주파수 및 음압 레벨 15, 18, 19의 측면에서 매우 정확하게 디지털 기록 뮤린 USVs를 재생할 수있다.
도 3에 도시 된 대표적인 실험에서 ve_content은 ">, C57BL / 6 (B6) 암컷 BALB / C (BALB) 사이 남성 USVs 및 배경 잡음을 선택하는 것이 허용되었다. 또한,도 4는 사이 B6 및 BALB 암컷의 선택을 도시 BALB 및 B6 남성에서 동시 USV의 플레이는 이전의 연구에서보고 된 14. 남성 USVs의 특성은 B6 사이의 차이와 BALB 20 종자. 이러한 결과에 의해, USVs의 매력은 본 프로토콜로 평가 될 수있다 바와 같이, 하는 소리, 라이브 개인으로부터 기록 된 음향 분석 및 기타 개인 재생됩니다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 절차가 아자 부 대학의 윤리위원회에 의해 승인되었다. 모든 실험은 방음 실에서 실시 하였다.
1. 동물 준비
- 녹음을위한 남성
- 짝짓기 경험이 성적으로 성숙한 수컷 마우스를 가져옵니다.
- 여성 주제
- (- 오래된 12 주 보통 8) 케이지 당 2-5 한배 새끼와 함께 보관 된 처녀 암컷 마우스를 가져옵니다.
- 매 클린 (21)에 따라, 검사 전 발정주기의 위상을 결정하기 위해 매일 질 얼룩을 얻습니다. 주의 pseudopregnancy 않도록 질 자극을 최소화하기 위해주의해야한다.
- 넬슨 (22)에있어서, 김사와 얼룩 얼룩 및 존재 또는 백혈구, 각질화 된 상피 세포, 상피 세포 및 핵의 유무에 기초하여 발정주기의 위상을 결정한다.
2. 장치 (그림 1)
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그림 두 선택 테스트 상자 및 장치의 도식. 마우스는 그들과 중립 지역 사이에있는 작은 문을 통해 방 A와 B에 액세스 할 수 있습니다. 두 선택 상자와 두 초음파 방사체는 방음 실의 바닥에 배치된다. 마이크는 방음 실 내부에 일시 중단됩니다. 약기 :. PC, 개인용 컴퓨터 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 기록
- USB의 A / D 컨버터를 이용하여 PC에 초음파 콘덴서 마이크로폰을 연결한다.
- "7"에 대한 A / D 컨버터의 이득 레벨을 설정한다.
- 오디오 캡처 소프트웨어를 사용하여 400 kHz의 샘플링 레이트를 갖는 16 비트 포맷 파일의 레코드 데이터 탄성.
- 재생
- D / 사용하여 PC에 컨버터를 연결USB 인터페이스.
- 감쇠기를 통해 D에 두 앰프 / A 컨버터를 연결합니다. (후자의 디바이스는 과부하를 방지하는 역할을한다.)
- 각 앰프에 초음파 이미 터를 연결합니다.
3. USV 기록
- 측벽에 6cm 직경의 구멍과 0.5 CM 철망으로 덮여 구멍에 소형 (17 × 10 X 11cm)에 남성 마우스 또는 중간 크기 (21 X 14 X 13cm) 케이지를 놓습니다. 중형 케이지를 사용할 때, 면적을 감소시키는 케이지의 중심을 가로 질러 파티션을 구성.
- 녹음을 오염시킬 수 부스럭 거리는 소음을 방지하기 위해 새장에 침대를 사용하지 마십시오.
- 메시 옆에 마이크를 배치합니다.
- 2.1 단계에 표시된 녹화 설정과 초음파 발성 모니터링을 시작합니다.
- 남성 마우스와 케이지에 metestrus 또는 diestrus 중 하나의 성적으로 성숙한 여성 마우스를 놓습니다.
- 5 분 - 3 녹음 USVs.
4. TEST 박스
- 아크릴 보드 (그림 1)를 사용하여 테스트 상자를 구축 할 수 있습니다.
참고 : (× 20 (35), 및 X 20cm 높이)를 세 구획으로 나누어 져 시험 상자 : 중립 지역 (15 X 20cm), 객실 A와 B (20 × 10cm, 각각). 방 및 B는 각각 0.5 ㎝ 철망으로 덮여 4cm 직경 홀을 갖는다. 구멍 메시는 중립 지역 및 객실 A와 B 사이의 객실 A와 B의 각 끝에 확인 게이트 (5 × 5cm 각)에 위치 - 사운드 누설은 각 메시의 둘레 상자로 밀봉 고무 플레이트를 사용하여, 메쉬에 대향 측면을 제외한 각 초음파 방사기를 절연 방지한다.
- 방음을위한 객실 A와 B 사이의 벽의 양쪽에 배치 리드 씰.
5. 사운드 재생을위한 준비
- 재생 사운드의 창조
- 디지털 오디오 편집 소프트웨어를 사용하여 기록 된 파일로부터 USV의 20 초 세그먼트를 캡처.
- 선택하지 않고 배경을 캡처이세 20 초 USV 세그먼트 파일에서 (0.35 초). 소음 세그먼트를 반복하여 20 초 배경 잡음 파일을 만듭니다.
- "왼쪽 귀"를 위해 다른 파일을 하나의 파일로, 하나의 스테레오 사운드 파일로 내보낼, 동시에 두 개의 사운드 파일을 재생하려면 "오른쪽 귀."
- 40 kHz의 컷오프와 같은 고역 통과 필터를 사용하여 사운드 파일을 필터링.
- 후 처리 소프트웨어의 노이즈 감소 도구를 사용하여 소음을 줄일 수 있습니다. 선택하고 노이즈 감소 프로파일과 더 USVs가없는 파일의 세그먼트를 캡처하고, 40 레벨과 노이즈 감소를 실행합니다.
- 재생 사운드의 교정
- 초음파 이미 터와 마이크 사이의 공간이 10cm 있는지 확인합니다.
- 에미 터에서 초음파의 음압 레벨을 교정하는 단계 2.1에 기재된 구성을 사용하여 초음파 모니터링을 수행한다. 데시벨 마이크 (dB)로 음압 레벨을 측정합니다.
- USI감쇠기 및 증폭기 겨, 3 단계에서 기록한 남성 USVs 동일한 음압 레벨 초음파 에미 터에 의해 발생 USVs의 볼륨을 조정한다.
- 두 초음파 에미 터 및 USVs 및 배경 잡음으로 구성된 사운드 파일을 사용하는 경우, 두 초음파 방출기 행동 시험을 수행하기 전에 보정 사운드 (예를 들어, 75 kHz의 순음)를 사용하여 동일한 음압 레벨을 나타내는 것을 확인한다.
- USVs 두 스트림으로 구성된 사운드 파일을 재생하는 경우, 실험 전에, 동일한 레벨로 생성 된 두 음압 레벨을 조정한다.
6. 두 선택 테스트
- 시험 상자의 메쉬 뒤에 초음파 이미 터를 놓습니다.
- 아크릴 보드와 함께 객실 A와 B에 문을 닫고 30 분 동안 중립 영역에 여성의 주제를 길들. 마우스를 탈출 할 수있는 방지하기 위해 아크릴 보드 상자를 커버.
- CC를 사용하여 비디오 녹화를 시작합니다D 카메라는 상자 위에 장착. 카메라 (하지 그림 1)은 세 개의 구획의 영역을 다루고 있습니다.
- 게이트와 커버 보드를 제거하고 여성의 사운드 영역을 포함하여 자유롭게 테스트 상자를 탐색 할 수 있습니다.
- 여성 모두 메쉬를 조사하였으며, 중성 영역으로 돌아 오면, 5 또는 10 분 동안 20 초 반복 사운드 파일을 재생 시작한다.
- 5 또는 10 분 동안 행동 모니터링을 실시한다.
- 이전 대상에서 침착 원하지 않는 후각 신호를 감소 70 % 에탄올과 시험 사이의 테스트 새장을 청소합니다.
- 초음파의 이미 터의 위치를 랜덤하게 전환 B 실 또는 B. 향해 고유 측 바이어스 효과를 피하기
7. 통계 분석
- 다음 매개 변수를 분석, 행동 이벤트 득점 소프트웨어를 사용하여 각 방에있는 항목의 총 수를; 각각의 중간 영역에서 체류 전체 기간; 각 사운드 영역에서 체류 전체 기간; 과초음파 방출의 앞에 각 메시의 검색의 총 시간. 그림 1은 "중간 영역"과 무엇을 의미하는지 설명 "사운드 영역을 설정합니다."
참고 경우 마우스 두 영역 사이의 분할 선 (도 1, 점선)의 머리 방향으로의 위치 결정을 유지한다. 헤드 측 메시에 직면했을 때, 그것은 사운드 존에서 머물 얻었된다. - 각각의 행동 매개 변수에 대해 0.05의 유의 수준을 갖춘 객실에 대한 반응과 B 윌 콕슨 부호 순위 테스트를 사용하여, 또는 쌍 T의 -tests를 비교합니다.
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Representative Results
USVs는도 3에 도시 된 대표적인 실험에서 사운드 재생으로 사용 하였다 한 BALB-남성 (20 초 당 161 음절)뿐만 아니라 배경 잡음에서 기록 하였다.이 실험에서, 7 여성 B6 마우스는 9 주령에 사용 하였다 . 사운드를 재생하기 위해 여성의 응답 테스트의 가장 시간을 결정하기 위해, 행동 파라미터는 총 10 분의 시험 시간의 처음과 마지막 다섯 분 동안 별도로 분석 하였다.
먼저, 어떤 측면 bias.The 결과는 배경 잡음 측면 사이에 차이가 없다고 없었다 있다는 것을 보여주는, 재생 (도 3a) 전의 조사 시간 동안 룸 또는 B의 체류 전체 기간에서 유의 한 차이가 없었다 및 제 5 분, 마지막 5 분, 총 시험 시간 (도 3b)을 분석 룸 항목 수에 남성 USVs 측은.도 3c는 durat 누적 초를 나타낸다재생하는 동안 각 방에 숙박 이온 (즉, 총 중간 영역에서 숙박 기간, 사운드 영역에서). 처음 5 분 (P = 0.043), 또는 전체 시험 시간 (p는 = 0.043)을 분석 할 때 대상은 배경 잡음 측에 비해 BALB 남성 USV 측에서 상당히 긴 시간을 보냈다. 이러한 매개 변수 마지막 5 분에 의해 분석에서 유의 한 차이가 없었다. 중간 영역 (그림 3D)에서 배경 잡음 측과 남성 USVs 측 사이에 유의 한 차이가 없었다. 그러나, B6 암컷 사운드 존에 상당히 긴 시간을 소비 및 백그라운드 잡음 측면, 제 5 분 (음성 구역, p = 0.018을 분석하고,도 3e에 비해 BALB 남성 USV 측에 메시를 검색하는 단계; 메쉬 , P = 0.018, 그림 3 층) 또는 총 시험 시간 (사운드 영역, P = 0.028, 그림 3E, 메쉬, P = 0.043, 그림 3 층). 결과는 명확 B6 암컷이 입증특히, 제 5 분에, 배경 잡음보다 재생 남성 USVs 접근한다.
이 두 선택 시험은 USVs의 특성을 비교하는 데 유용합니다. 이전 연구에서,이 검사는 이들 균주의 11 대 남성에서 USVs 및 B6 암컷 마우스 BALB USV의 선호도를 결정하는 데 사용되었다. B6 (133 음절 초 20 당)와 BALB 남성 (20 초 당 108 음절), 이들 균주의 각각의 암컷 마우스에서 USVs의 재생 조합을 사용하는 경우 다른 변형보다 수컷의 USVs을위한 시간을 검색 이상 보여 주었다 자신의 하나의 (그림 4).
그림 2. 측정 된 음압 레벨 (SPL) 주파수의 함수로 NC - 네 에미 터에 의해 생성 된 약 80의 거의 일정 SPL -. 90 dB의 40과 160 kHz의 사이에 관찰된다. AC 입력 펑어이 경우 1.3 W입니다. 에미 터는 고주파 콘덴서 마이크로폰에서 20mm의 거리에 배치되고 그 중앙에 정렬되었다. 이 그림은 키하라 (19)에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 배경 잡음 및 BALB 남성 USVs에 B6 여성 응답. (A)를 재생하기 전에 조사 기간 동안 객실 A 또는 B에 체류 전체 기간. (B) 재생 중에 방 항목의 수입니다. (C) 객실에서 숙박 총 기간. (D) 중간 영역에서 체류 전체 기간 . (E)의 사운드 존에서의 총 체류 시간. (F) 망을 검색하는 총 지속. 각각의 측정개인은 도트 플롯에 나와있다; 각 플롯의 수평 막대는 평균을 나타냅니다; N = 7; * 배경 잡음 분석 매개 변수에 대한 남성 USVs 사이에 유의 한 차이 (P <0.05)를 나타냅니다; 윌 콕슨 부호 순위 테스트합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 여성 같은 변형 대 다른 균주로부터 남성의 USVs에 응답. B6 (N = 6)과 BALB (N = 10) 시험 전에 남성 오염 된 침구에 노출 diestrus에 여성이 보였다 더 긴 기간 검색 시간 다른 변형 USVs. 표시된 값은 평균 ± 표준 오차이다; * 유의 한 차이 (P <0.05)를 나타냅니다; 윌 콕슨 부호 순위 테스트합니다. 이 수치는 아사바에서 수정되었습니다
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Acknowledgments
이 작품은에 의해 지원되었다 그랜트 - 에이드에서 AA에 JSPS 휄로우; 보조금 인 원조 과학 연구에 대한 JSPS 휄로우위한 혁신적인 분야 (제 4501 호 및 제 25132712) TK에에 의해; 와 아자 부 대학. 그림 2에 의해 수여 연구 프로젝트 부여하여 키하라, 토니, 하라다, T., Koshida, N. 웨이퍼 호환 제조 및 나노 결정 실리콘 열 유도 초음파 이미 터의 특성에서 다시 인쇄됩니다. 센서 및 액추에이터 :에서 물리적 볼륨 (125), 엘스 비어, P. (426), (2006), 엘스 비어의 허가.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Soundproof chamber | Muromachi Kikai | ||
| Small cage | CLEA Japan | CL-0113-1 | |
| Middle cage | CLEA Japan | CL-0103-1 | |
| Ultrasound condenser microphones | Avisoft Bioacoustics | CM16/CMPA | |
| A/D converter | Avisoft Bioacoustics | UltraSoundGate116H | |
| Audio software | Avisoft Bioacoustics | RECORDER USGH | |
| Adobe Audition 3.0 / Audio editing software | Adobe Systems | Adobe Audition 3.0 | |
| Nc-Si emitter | Original | not commercially available but it is planned to be so in near future | |
| D/A converter | National Instruments | NI USB-6251 BNC | |
| Attenuator | Original | ||
| Amplifier | Yamatake | ||
| PC | Windows 7 professional | Intel® core i7-2600K CPU @ 3.4GHz, 8GB RAM, 64-bit operating system | |
| Event recorder Excel-macro / Event-scoring software | original | Programmed by Naoto Akagawa & Takeru Yamamoto | |
| CCD Camera | |||
| Rubber plates (made of elastomer resin) | Tokyo bouon | TI-75BK B4 | Cut them to the proper size http://www.piano-bouon.jp/shopping/?pid=1329272401-447630&ca=6&p=3 |
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 |
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