A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.
The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.
שמרי ניצני Saccharomyces cerevisiae מציעים יתרונות רבים ללימודים של מנגנונים מולקולריים של תהליכים ביולוגיים, כוללים המחקר של חלבונים השולטים פונקצית כרומוזום. למרות שיש יתרונות ידועים של שמרי ניצנים למחקרים גנטיים, מולקולריים, וביוכימיים, מחקרי ציטולוגית של ההפצה של חלבונים בגרעין התא מסובך על ידי גודלו הקטן. יש שמרי הגרעין הטיפוסי בקוטר של פחות ממיקרון אחד, וזה רק על 5 פעמים גבול הרזולוציה של אור הנראה. לפיכך, כמות המידע על ההפצה של חלבונים גרעיניים שניתן להשיג מimmunostaining הקונבנציונלי או באמצעות תגי חלבון פלואורסצנטי, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), מוגבלת. גישה שימושית לאפיון הפצת subnuclear של חלבונים היא משטח כרומוזום הפצה. גישה זו כרוכה בהסרת קיר התא, שיבוש תא וקרום גרעין, וllowing תוכן בלתי מסיס של הגרעין להתיישב על פני השטח של שקופיות מיקרוסקופ. רכיבים מסיסים אלה כוללים את המטריצה הגרעינית וכרומוזומים. בנוסף מאפשר הסרת תוכן גרעיני מסיס, אשר משפרת את היכולת לזהות חלבונים מחויבים הכרומטין, כרומוזום הפצת תוצאות שיטה בלחץ משמעותי של כרומוזומים כך שיש לי גרעיני התפשטות קטרים של 3 עד הסביבות 5 מיקרומטר (לגרעיני meiotic דיפלואידי) ו 2 עד 3 מיקרומטר לגרעיני mitotic דיפלואידי. לחץ זה מאפשר זיהוי של מסד גרעיני שקשה יחסית או בלתי אפשרי לפתרון בגרעינים שלמים.
חסרון ברור לכרומוזום הפצה הוא האפשרות שהליך הפצה עשוי באופן חלקי או לחלוטין לשבש את המבנה של עניין. מדאיג במיוחד הוא שחלבון כרומוזום מחויב מסוים עלול ללכת לאיבוד כתוצאה מההליך מתפשט. שו סיבוך פוטנציאלי זהLD לזכור כאשר לפרש נתונים. דוגמא אחת של חלבון שהוא רגיש להליך הפצה היא בטא טובולין. בתנאים מסוימים, הציר, המורכב בעיקר מטובולין, נשמר במהלך הפצת 3. ויזואליזציה של הציר היא לעתים קרובות שימושית לשלב גרעינים של עניין. עם זאת, הדמיה טובולין דורשת טיפול עם מקבע ריכוז גבוה; צירים הולכים לאיבוד בתנאים הסטנדרטי המתוארים להלן. דוגמא זו ממחישה כי, בעת ניתוח ההפצה של חלבון uncharacterized בעבר, חשוב לגוון את הריכוז של מקבע כדי לקבוע כיצד רגיש החלבון הוא וריאציה כזו. למרות הדאגה לגבי ההשפעה של תנאי הפצה במבנה הכרומוזומים, השירות וכוחה של שיטת הפצה הודגם בהקשרים רבים ויש לו שירות רחב באפיון של mitotic ו, במיוחד תאי meiotic 4-7.
Two שיטות הפצה נעשתה שימוש נרחב. הראשון של שיטות אלה, שפותחו על ידי השידה וג'ירו 8, ימנע את השימוש בחומרי הניקוי ויכול להניב הכנות התפשטות שנראה שיש לי מורפולוגיה כרומוזום יחסית השתמרה היטב כאשר מוכתם עבור DAPI צבע DNA הספציפי. עם זאת, שיטה זו היא קשה יחסית למושלם והאיכות של גרעיני ההתפשטות משתנה באופן דרמטי, כאשר אזור אחד של שקופית בהשוואה לאזורים אחרים. בעיה זו יכולה לסבך גישות כמותיות שכרוכות הדמיה רבות גרעינים שלא נבחרו משקופית אחת, כדי למנוע הטיה רכישת נתונים. כרומוזום השני הפצת שיטה, שפותח על ידי Loidl ו1 קליין, כרוך איזון קיבעון על ידי paraformaldehyde, עם תמוגה ולחץ הכרומטין מקודם על ידי תמיסת ניקוי. כאשר מבוצעים כהלכה, שיטה זו נותנת תוצאות מאוד לשחזור עם פחות וריאציה אזור לאזור בהשוואה לשיטת השידה וג'ירו. מצגת זו מתמקדת בmodifieגרסת ד של השיטה של Loidl וקליין, בגלל האמינות והפשטות שלה.
כרומוזום הפצה היא לא מסובכת או זמן רב; ניתן להכין עד 100 שקופיות עבור immunostaining ביום אחד. יתר על כן, הכנות ההתפשטות ניתן לאחסן במקפיא במשך שנים לפני immunostaining, ובכך מעבדות יכולות לפתח מאגר של ממרחי כרומוזום קפוא, שניתן להשתמש בי שאלות ביולוגיות חדשות להתעורר או חומרים כימיים צביעה חדשות הופכים לזמינים.
שיטת כרומוזום הפצה היא נפוצה ביותר בשילוב עם immunostaining ומיקרוסקופ פלואורסצנטי widefield, אבל אפשר גם להכין שקופיות לשיטות אור ברזולוציה סופר מיקרוסקופיות כגון דלדול פליטה המאולץ מיקרוסקופיה (STED).
The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalize…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.
Zymolyase | US Biological | Z1004 | Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use. |
Lipsol | L.I.P. Ltd | no longer commercially available | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
NP-40 | USB | 19628 | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
Tween 20 | Sigma | P2287 | |
Slides | Corning | 2948-75×25 | |
Standard coverslip | Fisher | 12-544-E or 12-540-B | |
High resolution coverslips | Fisher | 12-542-B | |
Photo-Flo 200 solution | Kodak | P-7417 | Prepare 0.2% (v/v) solution in water. |
TBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8 | ||
BSA | Sigma | A2153 | Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month. |
Primary antibody | |||
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit | Invitrogen | A-21206 | |
IgG (H+L) Antibody | |||
Vectashield mounting media with DAPI | Vector Laboratories |
H-1200 | |
ProLong Gold | Invitrogen | P36930 | |
Plastic slide box | Fisher | 03-448-1 | Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber. |
Cardboard slide box | Fisher | 12-587-10 | Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C. |
Coplin jar | Fisher | 08-816 | Use as a wash basin for slides. |