Difusión de superficies y inmunotinción de cromosomas de la levadura

Introduction

La incipiente levadura Saccharomyces cerevisiae ofrece muchas ventajas para el estudio de los mecanismos moleculares de los procesos biológicos, incluyendo el estudio de las proteínas que controlan la función cromosoma. Aunque hay ventajas bien conocidas de la levadura en ciernes para estudios genéticos, moleculares, y bioquímicos, los estudios citológicos de la distribución de las proteínas en el núcleo de la célula se complica por su pequeño tamaño. El núcleo típico de levadura tiene un diámetro de menos de una micra, que está a sólo unos 5 veces el límite de resolución de la luz visible. Por lo tanto, la cantidad de información acerca de la distribución de las proteínas nucleares que se puede obtener a partir de la inmunotinción convencional o mediante el uso de etiquetas de proteínas fluorescentes, tales como la proteína fluorescente verde (GFP), es limitado. Un enfoque útil para caracterizar la distribución de las proteínas es subnuclear superficie cromosoma propagación. Este enfoque implica la eliminación de la pared celular, lo que altera las células y membranas nucleares, y unllowing los contenidos insolubles del núcleo se asienten sobre la superficie de un portaobjetos de microscopio. Estos componentes insolubles incluyen la matriz nuclear y los cromosomas. Además de permitir la eliminación de los contenidos nucleares solubles, lo que mejora la capacidad de detectar las proteínas unidas de la cromatina, el cromosoma propagación método da como resultado la descompresión sustancial de los cromosomas de tal manera que los núcleos de propagación tienen diámetros de alrededor de 3 a 5 micras (para núcleos diploides meióticas) y de 2 a 3 micras para núcleos mitóticos diploides. Esta descompresión permite la detección de la subestructura nuclear que es relativamente difícil o imposible de resolver en los núcleos intactos.

Un inconveniente obvio para el cromosoma de ensanchamiento es la posibilidad de que el procedimiento de difusión puede interrumpir parcial o totalmente la estructura de interés. De particular preocupación es que una proteína unida cromosoma particular, podría perderse como consecuencia del procedimiento de difusión. Este potencial shou complicaciónld tenerse en cuenta al interpretar los datos. Un ejemplo de una proteína que es sensible a la propagación de procedimiento es beta-tubulina. Bajo algunas condiciones, el husillo, que se compone principalmente de la tubulina, se conserva durante la extensión ^3. Visualización del husillo es a menudo útil para organizar los núcleos de interés. Sin embargo, la visualización de la tubulina requiere tratamiento con un fijador alta concentración; husillos se pierden en las condiciones estándar descritas a continuación. Este ejemplo ilustra que, al analizar la distribución de una proteína no caracterizado previamente, es importante para variar la concentración de fijador para determinar la sensibilidad de la proteína es a tal variación. A pesar de la preocupación por el impacto de las condiciones de propagación en la estructura cromosómica, la utilidad y el poder del método de propagación se ha demostrado en muchos contextos y tiene amplia utilidad en la caracterización de mitótico y, especialmente células meióticas ^4-7.

Two métodos de propagación se han utilizado ampliamente. El primero de estos métodos, desarrollados por Dresser and Giroux ^8, evita el uso de detergente y puede producir preparaciones separadas que parecen tener relativamente bien conservado morfología cromosómica cuando se tiñen para el ADN específico de tinte DAPI. Sin embargo, este método es relativamente difícil de perfeccionar y la calidad de los núcleos de propagación varía dramáticamente, cuando una región de una diapositiva se compara con otras regiones. Este problema se puede complicar enfoques cuantitativos que implican la formación de imágenes muchos núcleos no seleccionadas de una diapositiva para evitar el sesgo de datos de adquisición. El segundo cromosoma método de propagación, desarrollado por Loidl y Klein ^1, consiste en equilibrar la fijación de paraformaldehído, con la lisis y descompresión cromatina promovido por una solución de detergente. Cuando se realiza correctamente, este método da resultados muy reproducibles con menos variación de región a región en comparación con el método de Dresser y Giroux. Esta presentación se centra en un modified versión del método de Loidl y Klein, debido a su fiabilidad y la sencillez.

Cromosoma propagación no es complicado ni requiere mucho tiempo; hasta 100 diapositivas se pueden preparar para inmunotinción en un solo día. Además, las preparaciones de cálculo se pueden almacenar en el congelador durante años antes de la inmunotinción, y por lo tanto los laboratorios pueden desarrollar un repositorio de extensiones de cromosomas congelados que se puede utilizar cuando surgen nuevas cuestiones biológicas o nuevos reactivos de tinción estén disponibles.

El método de propagación de cromosoma se usa más comúnmente en combinación con inmunotinción y microscopía de fluorescencia de campo amplio, pero también es posible preparar diapositivas para super-resolución métodos microscópicos de luz tales como el agotamiento de la emisión estimulada (STED) microscopía.

Protocol

NOTA: Algunos de los pasos del protocolo a continuación requieren trabajar en una campana de extracción limpia. Además, el método requiere un microscopio de disección tétrada levadura equipado con un objetivo 10X distancia larga de trabajo para supervisar formación de esferoplastos. El microscopio debe establecerse en la campana antes de tiempo. Retire el brazo micromanipulador y soporte de la placa del ámbito de aplicación y colocar estos elementos en un lugar seguro lejos de la zona de trabajo.

1. Preparación de esferoplastos

1. Crecer levadura bajo las condiciones deseadas. Utilice aproximadamente 2 x 10 ⁸ células para cada muestra, por ejemplo, 4 ml de un cultivo a DO600 = 1,4 5 x 10 ⁷ células / ml. Aunque el procesamiento inmediato de las muestras puede ser preferible en algunos casos, para la mayoría de aplicaciones, alícuotas de células pueden ser almacenadas en hielo durante hasta 8 horas antes de ser procesados.
2. Transferir la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugado en una centrifugadora clínica en la configuración 5 (2345 rpm / 857,5 xg) durante 3 min para sedimentar las células. Decantar el medio toma cuidado de no perder las células del sedimento. Resuspender las células en tampón de ZK 1 ml y luego añadir 40 l 1 M ditiotreitol (DTT). Incubar 2 minutos con agitación suave. Células de pellets como antes (ver el paso 1.2).
3. Gránulos Resuspender en tampón de ZK 1 ml. Añadir 5 l de una solución recién preparada de 100T zimoliasa que se ha mezclado a fondo. Incubar durante 20 a 30 minutos a 30 ° C para eliminar la pared celular y producir esferoplastos.
4. Ensayar una gotita de 10 l de suspensión de células en un portaobjetos de microscopio para determinar si es completa formación de esferoplastos. Las células vistos bajo el microscopio de disección sin cubreobjetos. Las células deben aparecer hinchada y redonda en lugar de un poco oblonga y deben lisar tras la adición de 20 l de agua. Si las células no pueden lisar, devolver la muestra a 30 ° C y re-ensayo cada 10 min hasta que se observa fácilmente inducida agua de lisis. Células de pellets como antes (ver el paso 1.2).
5. Resuspender suavemente y lavar las células de pellets in 2,5 ml MES / tampón sorbitol frío. Células de pellets como antes (ver el paso 1.2). Resuspender suavemente el sedimento celular en 300-400 l MES frío / tampón sorbitol. Las células se pueden mantener en el hielo en esta etapa durante varias horas.

2. Difundir Cromosoma

NOTA: Las superficies de vidrio sobre el cual los cromosomas se diapositivas o bien repartidas-cubreobjetos-debe estar preparado antes de tiempo. Cada portaobjetos o cubreobjetos deben ser sumergidos en agua, a continuación, EtOH, después se dejó secar, y se pule con papel para lentes. Si los cromosomas se repartirán en cubreobjetos, el cubreobjetos debe ser colocada en una diapositiva con cinta adhesiva o pegamento de caucho. A menos que se indique lo contrario, el resto del protocolo describirá la difusión ya sea en un portaobjetos o cubreobjetos

1. Usando una pipeta P20, pipeta de 20 l de suspensión celular sobre la superficie de un portaobjetos limpio.
2. Utilizando una pipeta P200, añadir 40 l de la PFA / solución de sacarosa al 3% y mezclar suavemente el solution por "remolinos" la diapositiva con la mano hasta que las líneas Schlieren desaparecen. Coloque diapositiva bajo el microscopio y confirmar que las células están en foco. La solución PFA debe ser recién preparado en la campana de humos en el día de uso.
   NOTA: Si la proteína de interés no ha sido examinada por el método anteriormente, es aconsejable preparar diapositivas adicionales utilizando soluciones que contienen 2 y 4% PFA para determinar si la retención de la proteína es sensible a las condiciones de fijación. Una solución / sacarosa 4% PFA se utiliza en los casos en los que es deseable para visualizar los microtúbulos de tubulina asociados. La desventaja de la concentración fijador superior es que los cromosomas serán "underspread," 2% PFA también tiende a producir cromosomas "underspread".
3. Usando una pipeta P200, añadir 80 l de 1% Lipsol, girar como antes para mezclar soluciones tan completamente como sea posible, se inicia un temporizador. Si Lipsol no está disponible, 80 l 1% NP40 o 80 l dH ₂ O, se puedensustituido (ver resultados representativos, Figura 2).
4. Ver las células con cuidado y suavemente girar la diapositiva cada 15 seg. Cuando más o menos 80% de las células se han lisado (desaparecido) detener el temporizador, retire inmediatamente el portaobjetos del microscopio, añadir 80 l de PFA / solución de sacarosa, y agitar para mezclar. Lisis debe ocurrir de entre 30 y 90 seg después de comenzar el temporizador.
   NOTA: Si varias diapositivas muestran lisis en aproximadamente el mismo tiempo, uno eventualmente puede omitir la supervisión microscópica para el resto de las diapositivas y simplemente el tiempo cuidadosamente el periodo entre la adición de lipsol y la adición de la alícuota final del fijador. Sin embargo, este atajo sólo es fiable cuando se preparan varias diapositivas de la misma muestra. Lo mejor es controlar la lisis de cada muestra microscópicamente cuando diferentes diapositivas se preparan a partir de muestras tomadas en diferentes épocas o de diferentes culturas.
5. Colocar el portaobjetos en una superficie plana y limpia y difundir el líquido a través de todo el surfac unfrostede de la corredera usando el lado de A, pipeta desechable limpio Pasto mantenido por debajo del menisco de la "charco", pero por encima de la superficie de la misma diapositiva, es decir. no "rastrillo" la superficie de la corredera con la pipeta. No vuelva a utilizar la pipeta en diferentes diapositivas para evitar la contaminación de las muestras.
6. Deja las diapositivas que se seque durante la noche en la campana de humos. Componentes nucleares insolubles se depositan sobre la superficie de deslizamiento y se unen a ella. Para grandes experimentos, la planificación del uso del espacio para la etapa de secado es importante.
7. Una vez secos, los resultados óptimos se obtienen por progresar a la etapa de inmunotinción en el mismo día. Sin embargo, la solución de sacarosa se secó incrusta los cromosomas de propagación en un "miel" que permite la congelación de las muestras: las diapositivas pueden ser transferidos a una caja de portaobjetos de plástico y se almacenaron a -20 ° C durante años.

3. La inmunotinción

1. Diapositivas Dip en 0,2% Foto-Flo para 30 seg. para eliminar la miel. Diapositivas de Lean enun borde, con el borde que descansa sobre una toalla de papel, para eliminar residuos Photo-Flo.
2. Diapositivas Dip en 1x TBS durante 5 min para lavar. Retire el exceso de líquido apoyándose diapositivas en un borde, pero no deje que se sequen.
3. Coloque las diapositivas helado hacia arriba, pipeta 300 l TBS / BSA sobre el portaobjetos través de la porción no glaseado de la diapositiva.
4. Incubar en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 15 min. (Recipiente grande de plástico llena de agua saturada de toallas de papel debajo de una caja de diapositivas placa de metal o de plástico perforada con toallas de papel saturadas).
5. Escurrir diapositivas descansando un borde corto de la diapositiva en una toalla de papel y se inclina la diapositiva contra un soporte apropiado (como un bastidor de tubo de ensayo). No permita que la superficie se seque.
6. Inmediatamente aplique 80 l de tampón TBS / BSA que contiene la dilución apropiada de anticuerpo primario. Si el anticuerpo está limitando, utilice 40 ly un mm cubreobjetos de 22 x 22. Para suero de conejo crudo, esto es típicamente entre una dilución de 1/50 y 1/500.
   NOTA:Realizar las valoraciones para nuevos preparaciones de anticuerpos. Se elige la preparación más diluida que da la señal de alto por encima del fondo. Para controlar el nivel de la tinción de fondo, los núcleos deben prepararse a partir de la cepa mutante de deleción apropiado y / o diapositivas duplicados deben teñirse con suero pre-inmune.
7. Coloque una pulida 22 x 50 mm cubreobjetos sobre el portaobjetos evitando burbujas. Para ello, la celebración de la cubreobjetos entre el pulgar y el dedo índice a lo largo del borde largo en posiciones cerca de un borde corto. Sosteniendo el cubreobjetos en un ángulo de 30 ° con respecto al deslizamiento, la más alejada del borde corto de los dedos se baja hasta que descanse en la diapositiva justo dentro del borde de la "charco" más cercano a la región de esmerilado de la diapositiva. Entonces baje lentamente el cubreobjetos en un movimiento suave hasta que los dedos que sostienen el toque de diapositivas el banco, y luego suelte. No intente ajustar la posición del cubreobjetos vez aterriza.
   NOTA: Si extensiones de cromosomas se prepararon encubreobjetos adosadas (en lugar de directamente sobre la superficie de diapositivas), este cubreobjetos muestra permanecerá fijado a la corredera a través de los pasos de tinción y lavado. Un cubreobjetos adicional se colocará en la parte superior del cubreobjetos muestra para distribuir uniformemente la solución de anticuerpo durante la tinción y luego desechado.
8. Coloque los portaobjetos en una cámara húmeda sellado e incubar durante la noche a 4 ° C.
9. La celebración de la transferencia de borde esmerilado las diapositivas a un estante de tinción de portaobjetos de vidrio y sumergirse en un frasco de tinción que contiene TBS.
10. Sumergir suavemente la diapositiva arriba y abajo para quitar el cubreobjetos. Trate de no usar demasiada fuerza para hacer esto. Lave las diapositivas 2x 10 min sumergiendo en TBS. Eliminar diapositivas de cremallera y drenar el exceso de líquido al tocar el borde de la toalla de papel. No deje secar la superficie.
11. Trabajando bajo la luz tenue, añadir inmediatamente 80 l TBS / BSA que contiene una dilución veces 1/1000 del anticuerpo secundario conjugado con fluorocromo (o 40 l con un cubreobjetos de 22 x 22 mm). Una dd cubreobjetos como antes y se incuba a 4 ° C durante 2 horas en la cámara húmeda en la oscuridad.
12. Retire cubreobjetos como antes, drene diapositivas, y permitir que la superficie se seque al aire durante 1 a 2 horas en la oscuridad. Diapositivas de Lean sobre toallas de papel como antes.
    NOTA: Si la difusión se realizó en un cubreobjetos montados, separar el cubreobjetos de la corredera antes de secar. Los cubreobjetos se secan a continuación como se ha descrito para las diapositivas en el paso anterior.
13. Trabajando bajo la luz tenue, añadir unos 30 l de medio que contiene DAPI (10 gotas tres mu l) de montaje y luego baje cuidadosamente un cubreobjetos. Si los márgenes son en cubreobjetos, coloque las gotas de medio de montaje sobre un portaobjetos limpio y bajar el cubreobjetos, lado cromosoma abajo, sobre el portaobjetos.
14. Todavía bajo la luz tenue, espere 2 minutos para cubreobjetos para asentarse y sellar los bordes de cubreobjetos con esmalte de uñas transparente. Coloque las diapositivas en una caja de compuerta plana.
    NOTA: Para microscopía STED, monte con prolongar Gold. Utilice 30 l de prolongar Orosin DAPI y deje curar durante la noche. Sellado con esmalte de uñas es innecesario.
15. Ver diapositivas mediante microscopía de epifluorescencia de campo amplio con un 40 u objetivo 100X utilizando un conjunto de filtros apropiados para DAPI para enfocar. Opcionalmente almacenar el portaobjetos en la oscuridad a 4 ° C durante varias semanas. No lo congele.

Representative Results

La aparición de núcleos de propagación depende críticamente sobre el equilibrio entre el cromosoma fijación y de-compactación. Incluso cuando los reactivos se equilibran correctamente, la variación en el grado de cromosoma de-compactación puede ocurrir en diferentes regiones de la misma diapositiva y / o entre diferentes diapositivas. Por lo tanto, la calidad de los diferenciales en una región determinada de una diapositiva debe evaluarse antes se interpretan las imágenes.

Los efectos de la "muchedumbre" y "underspreading" pueden ilustrarse utilizando anticuerpos contra las proteínas de recombinación meiótica. En la Figura 1, los núcleos son meióticas doble inmunotinción para las dos proteínas de la línea de cambio eucariotas Rad51 y Dmc1 y contador teñidas con DAPI para el ADN. Dos ejemplos de núcleos de manera óptima repartidos se muestran en la Figura 1A. La Figura 1B muestra un ejemplo de un núcleo underspread y ejemplos Figura 1C de dos núcleos overspread. Notaque un menor número de focos Rad51 y Dmc1 se observan en ambos una y underspread núcleos en comparación a difundir adecuadamente los núcleos. En el caso de núcleos underspread, algunos focos están fuera de foco debido a que la muestra no es suficientemente plana. Además, la accesibilidad epítopo puede contribuir a la falta de detección de todos los focos. Además, el diámetro más pequeño de la propagación puede impedir la resolución de las estructuras estrechamente espaciados. En el caso de núcleos overspread, la proteína se puede perder debido a la fijación insuficiente y / o tratamiento con detergente excesiva.

Variaciones del método estándar pueden evitar el uso de Lipsol. La versión original del método de propagación descrito por Loidl et al. hace uso de Lipsol, un laboratorio decoro cristalería detergente ^1. Aunque este detergente se utiliza actualmente para el cromosoma difusión en muchos laboratorios, la formulación original ya no está disponible en el mercado y el producto se vende actualmente bajo ese nombre ha sido re-formulado. Furthermore, la fórmula original para Lipsol también no está disponible (Franz Klein, comunicación personal). En un esfuerzo por superar este problema, llevamos a cabo experimentos en los que se utilizó el NP40 detergente disponible en el mercado y definido químicamente en lugar de Lipsol; Se encontraron esta modificación del protocolo estándar para dar resultados satisfactorios para un experimento en el que se extienden los núcleos meióticas se tiñeron para Rad51 y Zip1, un componente de la región central del complejo sinaptonémico (Figura 2). Curiosamente, en sustitución de la solución Lipsol con el mismo volumen de dH ₂ 0 también dado resultados satisfactorios (Figura 2B). Aunque estos resultados indican que el método de difusión descrito anteriormente se puede emplear con éxito sin Lipsol, es posible que algunos resultados descritos anteriormente dependen de uso de Lipsol y no serán reproducibles si NP40 o H ₂ 0 se utiliza en su lugar. Un individuo aprender el método de propagación millasluchar elegir razonablemente comenzar utilizando NP40 y / o H ₂ O en lugar de Lipsol. En el caso de que se encuentran dificultades, el investigador podrá solicitar una alícuota de Lipsol de un laboratorio que obtuvo un arsenal del reactivo antes de que se suspendió; Lipsol era barato y el importe mínimo se podía pedir era suficiente para generar millones de diapositivas.

El método de propagación es adecuado para su uso con los métodos de microscopía de luz super-resolución. El complejo sinaptonémico consta de dos elementos laterales axiales / lineales cada uno de los cuales organiza un par de cromátidas hermanas en un conjunto de matrices de bucle, con la base de cada bucle unido a un elemento. Cromosomas Paquiteno han synapsed pares de elementos laterales mantenidos en paralelo a una distancia de 100 nm por las proteínas que forman la región central de la compleja synaptonemal. Estos elementos laterales pareados no pueden resolverse mediante microscopía de epifluorescencia widefield convencional, pero pueden ser resueltos por super-resolumétodos de. En la Figura 3, se muestra un núcleo pachytene que se tiñe con el mismo anticuerpo para la proteína Zip1, utilizado para el experimento en la figura 2. La muestra también se tiñó para la proteína Red1, un componente de elementos laterales axiales /. El resultado revela que el anticuerpo Zip1 reconoce la región de unión al elemento lateral de Zip1, en lugar de la alfa helicoidal alargada espiral de la bobina de dominio que se encuentra entre las regiones de unión de los elementos laterales. Por lo tanto, el patrón de tinción observado con este anticuerpo Zip1 revela los caminos paralelos de los elementos laterales pareadas. La distribución de Red1 focos a lo largo de los elementos laterales es relativamente escaso en comparación con Zip1 focos, pero el método de doble tinción muestra que Red1 focos generalmente se encuentran cerca de las trayectorias lineales definidas por Zip1 focos. Estos hallazgos son consistentes con el trabajo previo en el que se utilizó el mismo método de difusión para preparar muestras para el análisis por microscopía electrónica; la estructura tripartita del borrador sinaptonémicolex se conserva durante el procedimiento de difusión. La imagen mostrada en la Figura 3 se generó por microscopía STED ^9.

Figura 1: Ejemplos de núcleos propagación de núcleos teñidos para meióticos Dmc1 (verde), Rad51 (rojo), y el ADN (DAPI, azul).. Bar = 1 m. (A) 2 ejemplos de núcleos de manera óptima repartidas. (B) Un ejemplo de un núcleo underspread. (C) Dos ejemplos de núcleos cubrió. El ejemplo de la izquierda es un núcleo en el que se cubrió sólo la parte superior.

Figura 2: meióticos núcleos preparados sin el uso de Lipsol Spread núcleos meióticas de las etapas indicadas tiñeron para Rad51 (rojo),.Zip1 (verde), y el ADN (DAPI, azul). Tenga en cuenta que la compactación cromosoma que se produce como células transición de leptonema a paquinema se conserva en gran parte.

Figura 3: Visualización de la compleja synaptonemal a través de microscopía STED Un núcleo pachytene manchado para Zip1 (verde) y Red1 (rojo).. Los datos fueron procesados ​​utilizando el plugin DeconvolutionLab ImageJ ¹⁰ para ejecutar 100 iteraciones utilizando el modelo de Richardson-Lucy con un PSF STED medido.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zymolyase	US Biological	Z1004	Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use.
Lipsol	L.I.P. Ltd	no longer commercially available	Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
NP-40	USB	19628	Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
Tween 20	Sigma	P2287
Slides	Corning	2948-75x25
Standard coverslip	Fisher	12-544-E or 12-540-B
High resolution coverslips	Fisher	12-542-B
Photo-Flo 200 solution	Kodak	P-7417	Prepare 0.2% (v/v) solution in water.
TBS			137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8
BSA	Sigma	A2153	Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month.
Primary antibody
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit	Invitrogen	A-21206
IgG (H+L) Antibody
Vectashield mounting media with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
ProLong Gold	Invitrogen	P36930
Plastic slide box	Fisher	03-448-1	Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber.
Cardboard slide box	Fisher	12-587-10	Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C.
Coplin jar	Fisher	08-816	Use as a wash basin for slides.