Difusión de superficies y inmunotinción de cromosomas de la levadura
Summary
A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.
Abstract
The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.
Introduction
La incipiente levadura Saccharomyces cerevisiae ofrece muchas ventajas para el estudio de los mecanismos moleculares de los procesos biológicos, incluyendo el estudio de las proteínas que controlan la función cromosoma. Aunque hay ventajas bien conocidas de la levadura en ciernes para estudios genéticos, moleculares, y bioquímicos, los estudios citológicos de la distribución de las proteínas en el núcleo de la célula se complica por su pequeño tamaño. El núcleo típico de levadura tiene un diámetro de menos de una micra, que está a sólo unos 5 veces el límite de resolución de la luz visible. Por lo tanto, la cantidad de información acerca de la distribución de las proteínas nucleares que se puede obtener a partir de la inmunotinción convencional o mediante el uso de etiquetas de proteínas fluorescentes, tales como la proteína fluorescente verde (GFP), es limitado. Un enfoque útil para caracterizar la distribución de las proteínas es subnuclear superficie cromosoma propagación. Este enfoque implica la eliminación de la pared celular, lo que altera las células y membranas nucleares, y unllowing los contenidos insolubles del núcleo se asienten sobre la superficie de un portaobjetos de microscopio. Estos componentes insolubles incluyen la matriz nuclear y los cromosomas. Además de permitir la eliminación de los contenidos nucleares solubles, lo que mejora la capacidad de detectar las proteínas unidas de la cromatina, el cromosoma propagación método da como resultado la descompresión sustancial de los cromosomas de tal manera que los núcleos de propagación tienen diámetros de alrededor de 3 a 5 micras (para núcleos diploides meióticas) y de 2 a 3 micras para núcleos mitóticos diploides. Esta descompresión permite la detección de la subestructura nuclear que es relativamente difícil o imposible de resolver en los núcleos intactos.
Un inconveniente obvio para el cromosoma de ensanchamiento es la posibilidad de que el procedimiento de difusión puede interrumpir parcial o totalmente la estructura de interés. De particular preocupación es que una proteína unida cromosoma particular, podría perderse como consecuencia del procedimiento de difusión. Este potencial shou complicaciónld tenerse en cuenta al interpretar los datos. Un ejemplo de una proteína que es sensible a la propagación de procedimiento es beta-tubulina. Bajo algunas condiciones, el husillo, que se compone principalmente de la tubulina, se conserva durante la extensión 3. Visualización del husillo es a menudo útil para organizar los núcleos de interés. Sin embargo, la visualización de la tubulina requiere tratamiento con un fijador alta concentración; husillos se pierden en las condiciones estándar descritas a continuación. Este ejemplo ilustra que, al analizar la distribución de una proteína no caracterizado previamente, es importante para variar la concentración de fijador para determinar la sensibilidad de la proteína es a tal variación. A pesar de la preocupación por el impacto de las condiciones de propagación en la estructura cromosómica, la utilidad y el poder del método de propagación se ha demostrado en muchos contextos y tiene amplia utilidad en la caracterización de mitótico y, especialmente células meióticas 4-7.
Two métodos de propagación se han utilizado ampliamente. El primero de estos métodos, desarrollados por Dresser and Giroux 8, evita el uso de detergente y puede producir preparaciones separadas que parecen tener relativamente bien conservado morfología cromosómica cuando se tiñen para el ADN específico de tinte DAPI. Sin embargo, este método es relativamente difícil de perfeccionar y la calidad de los núcleos de propagación varía dramáticamente, cuando una región de una diapositiva se compara con otras regiones. Este problema se puede complicar enfoques cuantitativos que implican la formación de imágenes muchos núcleos no seleccionadas de una diapositiva para evitar el sesgo de datos de adquisición. El segundo cromosoma método de propagación, desarrollado por Loidl y Klein 1, consiste en equilibrar la fijación de paraformaldehído, con la lisis y descompresión cromatina promovido por una solución de detergente. Cuando se realiza correctamente, este método da resultados muy reproducibles con menos variación de región a región en comparación con el método de Dresser y Giroux. Esta presentación se centra en un modified versión del método de Loidl y Klein, debido a su fiabilidad y la sencillez.
Cromosoma propagación no es complicado ni requiere mucho tiempo; hasta 100 diapositivas se pueden preparar para inmunotinción en un solo día. Además, las preparaciones de cálculo se pueden almacenar en el congelador durante años antes de la inmunotinción, y por lo tanto los laboratorios pueden desarrollar un repositorio de extensiones de cromosomas congelados que se puede utilizar cuando surgen nuevas cuestiones biológicas o nuevos reactivos de tinción estén disponibles.
El método de propagación de cromosoma se usa más comúnmente en combinación con inmunotinción y microscopía de fluorescencia de campo amplio, pero también es posible preparar diapositivas para super-resolución métodos microscópicos de luz tales como el agotamiento de la emisión estimulada (STED) microscopía.
Protocol
Representative Results
Discussion
The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalize…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.
Materials
| Zymolyase | US Biological | Z1004 | Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use. |
| Lipsol | L.I.P. Ltd | no longer commercially available | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
| NP-40 | USB | 19628 | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Slides | Corning | 2948-75×25 | |
| Standard coverslip | Fisher | 12-544-E or 12-540-B | |
| High resolution coverslips | Fisher | 12-542-B | |
| Photo-Flo 200 solution | Kodak | P-7417 | Prepare 0.2% (v/v) solution in water. |
| TBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8 | ||
| BSA | Sigma | A2153 | Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month. |
| Primary antibody | |||
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit | Invitrogen | A-21206 | |
| IgG (H+L) Antibody | |||
| Vectashield mounting media with DAPI | Vector Laboratories |
H-1200 | |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Plastic slide box | Fisher | 03-448-1 | Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber. |
| Cardboard slide box | Fisher | 12-587-10 | Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C. |
| Coplin jar | Fisher | 08-816 | Use as a wash basin for slides. |
References
- Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast. Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).
- Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast. Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).
- Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes. Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).
- Bishop, D. K. RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis. Cell. 79, 1081-1092 (1994).
- Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I. Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).
- Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis. PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).
- Biggins, S., Murray, A. W. The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint. Genes & Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).
- Dresser, M. E., Giroux, C. N. Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast. The Journal of Cell Biology. , (1988).
- Lao, J. P., Cloud, V., et al. Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation. PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).
- Vonesch, C., Unser, M. A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the. IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).
