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Biology

Diffondere superfici e Immunostaining di cromosomi del lievito

doi: 10.3791/53081 Published: August 9, 2015

Introduction

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Il lievito Saccharomyces cerevisiae in erba offre numerosi vantaggi per gli studi di meccanismi molecolari di processi biologici, tra cui lo studio delle proteine ​​che controllano la funzione cromosoma. Anche se ci sono vantaggi ben noti di gemmazione di lievito per gli studi genetici, molecolari e biochimici, gli studi citologici della distribuzione delle proteine ​​nel nucleo della cellula è complicata dalla sua piccola dimensione. Il tipico nucleo lievito ha un diametro inferiore a un micron, che è solo circa 5 volte il limite di risoluzione di luce visibile. Pertanto, la quantità di informazioni sulla distribuzione delle proteine ​​nucleari che possono essere ottenuti da immunostaining convenzionale o utilizzando i tag proteine ​​fluorescenti come la proteina fluorescente verde (GFP), è limitata. Un approccio utile per caratterizzare la distribuzione subnucleare delle proteine ​​è superficiale cromosoma diffusione. Questo approccio comporta la rimozione della parete cellulare, interrompendo cellule e membrane nucleari, ellowing il contenuto insolubili del nucleo di stabilirsi sulla superficie di un vetrino da microscopio. Questi componenti insolubili includono matrice nucleare e cromosomi. Oltre a consentire la rimozione del contenuto nucleari solubili, che aumenta la capacità di rilevare le proteine ​​legate alla cromatina, il cromosoma diffusione metodo comporta sostanziale decompressione dei cromosomi tale che i nuclei diffusione hanno diametri di circa 3 a 5 micron (per nuclei meiotica diploidi) e 2-3 micron per nuclei mitotico diploidi. Questo permette di individuare la decompressione di sottostruttura nucleare che è relativamente difficile o impossibile da risolvere nei nuclei intatti.

Un difetto evidente al cromosoma diffusione è la possibilità che la procedura di diffusione può parzialmente o completamente distruggere la struttura di interesse. Di particolare interesse è che un particolare cromosoma vincolato proteina potrebbe essere perso come conseguenza della procedura diffusione. Questo potenziale shou complicazioneld essere tenuto presente quando si interpretano i dati. Un esempio di una proteina che è sensibile alla procedura di diffusione è la beta-tubulina. In alcune condizioni, il mandrino, che è composto principalmente di tubulina, viene preservata durante lo spandimento 3. Visualizzazione del mandrino è spesso utile per mettere in scena i nuclei di interesse. Tuttavia, visualizzando tubulina richiede un trattamento con un fissatore alta concentrazione; mandrini sono persi nelle condizioni standard descritte di seguito. Questo esempio dimostra che, quando si analizza la distribuzione di una proteina precedenza uncharacterized, è importante variare la concentrazione di fissativo per determinare la sensibilità del proteina è a tale variazione. Nonostante la preoccupazione per l'impatto delle condizioni di diffusione sulla struttura cromosomica, l'utilità e la potenza del metodo di diffusione è stata dimostrata in molti contesti e ha un ampio programma di utilità nella caratterizzazione di mitotico e, in particolare le cellule meiotiche 4-7.

Two metodi di diffusione sono stati ampiamente utilizzati. Il primo di questi metodi, sviluppato da Dresser and Giroux 8, evita l'uso di detergenti e può produrre preparati diffusione che sembrano avere relativamente ben conservato morfologia dei cromosomi durante la colorazione per lo specifico DNA colorante DAPI. Tuttavia, questo metodo è relativamente difficile da perfezionare e la qualità dei nuclei spread varia drammaticamente, quando una regione di una diapositiva viene confrontato con altre regioni. Questo problema può complicare approcci quantitativi che coinvolgono l'imaging molti nuclei non selezionati da una diapositiva per evitare distorsioni dei dati di acquisizione. Il secondo cromosoma metodo di diffusione, sviluppato da Loidl e Klein 1, comporta bilanciamento fissazione con paraformaldeide, con lisi e decompressione cromatina promosso da una soluzione detergente. Se correttamente eseguita, questo metodo dà risultati molto riproducibili con meno variazioni da regione a regione, rispetto al metodo Dresser and Giroux. Questa presentazione si concentra su un modified versione del metodo di Loidl e Klein, a causa della sua affidabilità e semplicità.

Cromosoma diffusione non è complicato o che richiede tempo; fino a 100 vetrini possono essere preparate per immunocolorazione in un solo giorno. Inoltre, i preparativi di diffusione possono essere conservati in congelatore per gli anni precedenti al immunoistochimica, e quindi i laboratori in grado di sviluppare un archivio degli spread cromosomiche congelati che può essere utilizzato quando nuove questioni biologiche sorgono o nuovi reagenti di colorazione diventano disponibili.

Il metodo cromosoma diffusione è più comunemente usato in combinazione con immunocolorazione e microscopia a fluorescenza widefield, ma è anche possibile preparare vetrini per super-risoluzione leggeri metodi microscopici quali l'esaurimento emissione stimolata (STED) microscopia.

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Protocol

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NOTA: Alcune fasi del protocollo di seguito richiedono che lavora in una cappa aspirante pulito. Inoltre, il metodo richiede un microscopio di dissezione lievito tetrad dotato di un obiettivo 10X distanza di funzionamento lunga monitorare spheroplasting. Il microscopio dovrebbe essere istituito nel cofano prima del tempo. Rimuovere il braccio micromanipolatore e portatarga dal campo di applicazione e inserire questi elementi in un luogo sicuro, lontano dalla zona di lavoro.

1. Preparazione di sferoplasti

  1. Crescere lievito in condizioni desiderate. Uso circa 2 x 10 8 cellule per ogni campione, ad esempio 4 ml di una coltura a OD600 = 1,4 5 x 10 7 cellule / ml. Sebbene trasformazione immediata di campioni può essere preferibile in alcuni casi, per la maggior parte delle applicazioni, aliquote di cellule possono essere conservate in ghiaccio per 8 ore prima di essere elaborato.
  2. Trasferimento sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 ml e di spin in una centrifuga clinica a fissare 5 (2345 giri / 857,5 xg) per 3 minuti per far sedimentare le cellule. Decantare il mezzo facendo attenzione a non perdere le cellule dal pellet. Risospendere delicatamente le cellule in tampone ZK 1 ml e aggiungere 40 ml 1 M ditiotreitolo (DTT). Incubare 2 min con miscelazione delicata. Cellule pellet come prima (vedi punto 1.2).
  3. Pellet Risospendere nel buffer ZK 1 ml. Aggiungere 5 ml di una soluzione appena preparata di 100T zymolyase che è stato accuratamente miscelati. Incubare per 20-30 minuti a 30 ° C per rimuovere la parete cellulare e produrre sferoplasti.
  4. Analizzare una goccia 10 ml di sospensione cellulare su un vetrino per microscopio per determinare se spheroplasting è completa. Le cellule viste al microscopio dissezione senza un vetrino. Le cellule devono apparire gonfio e rotondo, piuttosto che un po 'allungata e dovrebbero lisare seguito all'aggiunta di 20 ml di acqua. Se le cellule non riescono a lisare, restituire il campione a 30 ° C e ri-test ogni 10 minuti fino a quando l'acqua indotta lisi è facilmente osservabili. Cellule pellet come prima (vedi punto 1.2).
  5. Risospendere delicatamente e lavare cellule pellet in 2,5 ml freddo MES / tampone sorbitolo. Cellule pellet come prima (vedi punto 1.2). Risospendere delicatamente pellet di cellule in 300-400 ml freddo MES / tampone sorbitolo. Le celle possono essere tenuti in ghiaccio in questa fase per diverse ore.

2. Diffondere Cromosoma

NOTA: Le superfici di vetro su cui si diffondono, sia cromosomi diapositive o coprioggetto-dovrebbe essere preparata in anticipo. Ogni diapositiva o coprioggetto devono essere immersi in acqua, poi EtOH, poi lasciato asciugare e lucidato con carta per lenti. Se cromosomi saranno distribuite su vetrini, il vetrino deve essere apposto su un vetrino con nastro adesivo o mastice. Se non diversamente indicato, il resto del protocollo descriverà diffusione sia su un vetrino o coprioggetto

  1. Usando una pipetta P20, pipetta 20 ml di sospensione cellulare sulla superficie di un vetrino pulito.
  2. Utilizzando una pipetta P200, aggiungere 40 ml di PFA / soluzione di saccarosio 3% e mescolare delicatamente la solution da "agitando" il vetrino con la mano fino a quando le linee Schlieren scompaiono. Mettere vetrino sotto il microscopio e confermano che le cellule sono a fuoco. La soluzione PFA deve essere appena preparata nella cappa il giorno di utilizzo.
    NOTA: Se la proteina di interesse non è stato esaminato con il metodo precedentemente, è consigliabile preparare diapositive utilizzando soluzioni contenenti 2 e 4% PFA per determinare se la ritenzione della proteina è sensibile alle condizioni di fissazione. Una soluzione / di saccarosio 4% PFA viene utilizzato nei casi in cui è auspicabile visualizzare microtubuli di tubulina associati. Lo svantaggio della maggiore concentrazione fissativo è che i cromosomi saranno "underspread," 2% PFA tende anche a produrre cromosomi "underspread".
  3. Usando una pipetta P200, aggiungere 80 ml di 1% Lipsol, agitare come prima per miscelare soluzioni più completamente possibile, avviare un timer. Se Lipsol non è disponibile, 80 microlitri 1% NP40 o 80 ml ​​dH 2 O possono esseresostituito (vedi Rappresentante dei risultati, figura 2).
  4. Guarda con attenzione e delicatamente le cellule agitare il vetrino ogni 15 secondi. Quando circa l'80% delle cellule ha lisato (scomparsi) fermare il timer, rimuovere immediatamente il vetrino da microscopio, aggiungere 80 ml di PFA / soluzione di saccarosio, e agitare per mescolare. Lysis dovrebbe verificarsi di tra 30 e 90 sec dopo aver avviato il timer.
    NOTA: Se più diapositive mostrano lisi a circa lo stesso tempo, si può eventualmente omettere monitoraggio microscopico per il resto delle diapositive e semplicemente il tempo accuratamente periodo tra aggiunta di lipsol e l'aggiunta della parte aliquota finale del fissativo. Tuttavia, questa scorciatoia è affidabile soltanto durante la preparazione più diapositive dallo stesso campione. E 'meglio monitorare lisi di ciascun campione microscopicamente quando diverse diapositive sono preparati da campioni prelevati in momenti diversi o da culture diverse.
  5. Posizionare il vetrino su una superficie piana e pulita e diffondere il liquido su tutta la surfac unfrostede della slitta con il lato di un pulito monouso pipetta pascolo tenuto sotto del menisco del "pozza", ma al di sopra della superficie della slitta stessa, cioè. non "rastrello" la superficie del vetrino con la pipetta. Non riutilizzare pipetta su diapositive diverse per evitare la contaminazione dei campioni.
  6. Lasciare i vetrini ad asciugare durante la notte nella cappa. Componenti nucleari insolubili si depositerà sulla superficie di scorrimento e si legano ad esso. Per grandi esperimenti, pianificare l'uso dello spazio per la fase di asciugatura è importante.
  7. Una volta essiccato, i risultati migliori si ottengono procedendo alla fase immunocolorazione lo stesso giorno. Tuttavia, la soluzione di saccarosio essiccato incorpora i cromosomi diffusione in un "miele" che permette congelamento dei campioni: vetrini possono essere trasferiti ad una cassa scorrevole plastica e conservati a -20 ° C per anni.

3. Immunostaining

  1. Immergere i vetrini in 0,2% Foto-Flo per 30 sec. per rimuovere il miele. Diapositive Lean Onun bordo, con il bordo di riposo su un tovagliolo di carta per rimuovere residui Photo-Flo.
  2. Immergere i vetrini in 1x TBS per 5 minuti per lavare. Rimuovere il liquido in eccesso appoggiandosi diapositive su uno spigolo, ma non lasciarli asciugare.
  3. Posare diapositive glassato lato alto, pipetta 300 ml di TBS / BSA sul vetrino attraverso la porzione unfrosted della diapositiva.
  4. Incubare in una camera umida a temperatura ambiente per 15 min. (Grande contenitore di plastica rivestito con acqua satura di tovaglioli di carta sotto una lastra di metallo o di plastica scivolo box traforata con tovaglioli di carta saturi).
  5. Drain diapositive appoggiando una breve bordo del vetrino su un tovagliolo di carta e appoggiato la slitta contro un supporto appropriato (ad esempio un tubo cremagliera test). Non lasciare asciugare la superficie.
  6. Applicare immediatamente 80 ml di tampone TBS / BSA contenente la diluizione appropriata di anticorpo primario. Se l'anticorpo è limitante, utilizzare 40 ml e un coprioggetto mm 22 x 22. Per siero di coniglio greggio, questo è in genere tra una diluizione 1/50 e 1/500.
    NOTA:Eseguire titolazioni di nuovi preparati di anticorpi. La preparazione più diluita che produce segnale alto sopra sfondo è scelto. Per controllare il livello di colorazione di fondo, i nuclei devono essere preparati dal ceppo mutante di delezione appropriati e / o diapositive duplicati deve essere macchiato con siero pre-immune.
  7. Posizionare un lucido 22 x 50 mm coprioggetto sul vetrino evitando bolle. A tale scopo, tenendo il vetrino tra il pollice e l'indice sul lato lungo in posizioni vicino a uno lato corto. Tenendo il vetrino a 30 ° rispetto a scivolare, la breve lontano bordo dalle dita si abbassa fino ad appoggiarlo sul vetrino appena all'interno del bordo della "pozza" vicino alla regione smerigliato della diapositiva. Poi abbassare lentamente il vetrino in un movimento fluido fino a quando le dita che reggono il tocco diapositiva in panchina, e poi rilasciarlo. Non tentare di regolare la posizione del vetrino, una volta che atterra.
    NOTA: Se spread cromosomiche sono stati preparati sucoprioggetto apposti (anziché direttamente sulla superficie di diapositive), questo campione coprioggetto rimarranno apposta sulla slitta durante la procedura di colorazione e lavaggio. Un vetrino supplementare sarà posto sulla parte superiore del vetrino campione per distribuire uniformemente la soluzione di anticorpi durante la colorazione e quindi scartato.
  8. Posizionare i vetrini in una camera umida sigillata e incubare una notte a 4 ° C.
  9. Tenendo il trasferimento bordo smerigliato i vetrini in una colorazione rack di vetrino e immergere in una vaschetta di colorazione contenente TBS.
  10. Immergere delicatamente il vetrino su e giù per rimuovere il vetrino. Cercate di non usare troppa forza per farlo. Lavare le diapositive 2x 10 min immergendo in TBS. Togliere i vetrini dalla rastrelliera e drenare i liquidi in eccesso toccando bordo di un tovagliolo di carta. Non lasciare che la superficie asciutta.
  11. Lavorando sotto la luce soffusa, aggiungere immediatamente 80 microlitri TBS / BSA contenente un 1 / 1.000 volte diluizione fluorocromo anticorpo secondario coniugato (o 40 ml con un coprioggetto 22 x 22 mm). Annunciod coprioggetto come prima e incubare a 4 ° C per 2 ore nella camera umida al buio.
  12. Rimuovere coprioggetto come prima, scolare scivoli, e consentire superficie asciugare per 1 a 2 ore al buio. Diapositive Lean On asciugamani di carta come prima.
    NOTA: se la diffusione è stata eseguita su un vetrino montato, staccare il vetrino dalla diapositiva prima di asciugare. I vetrini vengono poi essiccati come descritto per diapositive nel passaggio precedente.
  13. Lavorando sotto la luce soffusa, aggiungere circa 30 ml di mezzo contenente DAPI (tre 10 gocce microlitri) di montaggio e poi con attenzione abbassare un vetrino. Se gli spread sono su vetrini, posizionare le gocce di mezzo di montaggio su un vetrino pulito ed abbassare il vetrino, lato cromosoma verso il basso, sul vetrino.
  14. Sempre sotto la luce soffusa, attendere 2 minuti per vetrino di stabilirsi e sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente. Mettere i vetrini in una scatola di guida piatta.
    NOTA: Per la microscopia STED, montare con Prolong oro. Utilizzare 30 ml di prolungare Orosenza DAPI e permettono di curare tutta la notte. Tenuta con smalto non è necessaria.
  15. Lettura dei vetrini di epifluorescenza widefield con 40 o un obiettivo 100X utilizzando un set di filtri appropriati per DAPI per mettere a fuoco. Facoltativamente memorizzare il vetrino al buio a 4 ° C per diverse settimane. Non congelare.

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Representative Results

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La comparsa di nuclei di diffusione dipende in modo critico sul bilanciamento tra cromosomi fissazione e de-compattazione. Anche quando i reagenti sono correttamente bilanciati, variazione del grado del cromosoma de-compattazione può verificarsi in diverse regioni della stessa diapositiva e / o tra diverse diapositive. Pertanto, la qualità di spread in una data regione di un vetrino deve essere valutato prima immagini vengono interpretati.

Gli effetti della "invadendo" e "underspreading" possono essere illustrati con anticorpi contro le proteine ​​di ricombinazione meiotica. Nella figura 1, nuclei meiotica sono doppie immunostained per le due proteine ​​eucariotiche cambio filo RAD51 e DMC1 e contatore colorate per DNA con DAPI. Due esempi di nuclei sparsi ottimale sono mostrati nella Figura 1A. Figura 1B mostra un esempio di un nucleo underspread ed esempi Figura 1C di due nuclei overspread. Notache un minor numero di focolai di Rad51 e DMC1 si osservano in entrambi oltre e underspread nuclei rispetto a diffondere correttamente nuclei. Nel caso di nuclei underspread, alcuni foci sono fuori fuoco perché il campione non è sufficientemente piana. Inoltre, epitopo accessibilità può contribuire al fallimento di rilevare tutti i focolai. Inoltre, il diametro più piccolo della diffusione può precludere risoluzione di strutture ravvicinati. Nel caso di nuclei overspread, proteina può essere perso a causa di fissaggio insufficiente e / o il trattamento detergente eccessiva.

Variazioni del metodo standard può evitare l'uso di Lipsol. La versione originale del metodo descritto da diffondere Loidl et al. si avvale di Lipsol, un laboratorio di proprietà vetreria detergente 1. Anche se questo detergente è attualmente utilizzato per il cromosoma diffusione in molti laboratori, la formulazione originaria non è più disponibile in commercio e il prodotto attualmente venduti sotto questo nome è stato riformulato. Fnoltre, la formula originale per Lipsol non è disponibile (Franz Klein, comunicazione personale). Nel tentativo di superare questo problema, abbiamo condotto esperimenti in cui il detersivo NP40 disponibili in commercio e chimica definita è stato utilizzato al posto di Lipsol; questa modifica del protocollo standard è stato trovato per dare risultati soddisfacenti per un esperimento in cui diffondono nuclei meiotica sono state colorate per Rad51 e ZIP1, un componente della regione centrale del sinaptonemico complesso (Figura 2A). È interessante notare, sostituendo la soluzione Lipsol con lo stesso volume di dH 2 0 anche dato risultati soddisfacenti (Figura 2B). Sebbene questi risultati indicano che il metodo di diffusione sopra descritto può essere impiegato con successo senza Lipsol, è possibile che alcuni risultati precedentemente descritti dipende dall'utilizzo di Lipsol e non saranno riproducibili se viene usato NP40 o H 2 0 al suo posto. Un individuo imparare le diffusione mi metodoght ragionevolmente decidere di iniziare utilizzando NP40 e / o H 2 O al posto di Lipsol. Nel caso in cui si incontrano difficoltà, l'investigatore può richiedere una aliquota di Lipsol da un laboratorio che ha ottenuto una riserva del reagente prima che fosse interrotto; Lipsol era costoso e l'importo minimo si poteva ordinare era sufficiente per generare milioni di diapositive.

Il metodo di diffusione è adatto per l'uso con super-risoluzione metodi microscopia ottica. Il complesso sinaptonemico costituito da due elementi lineari assiali / laterali ciascuna delle quali organizza una coppia di cromatidi fratelli in una serie di matrici di loop, con la base di ogni ciclo legato ad un elemento. Cromosomi pachytene hanno synapsed coppie di elementi laterali tenuti in parallelo ad una distanza di 100 nm da proteine ​​che formano la regione centrale del complesso sinaptonemalico. Questi elementi laterali accoppiati non possono essere risolti da microscopia convenzionale widefield epifluorescenza, ma possono essere risolti da super-risoluMetodi zione. In figura 3, un nucleo pachytene è dimostrato che è colorato con lo stesso anticorpo per la proteina ZIP1, utilizzata per l'esperimento in Figura 2. Il campione è stato anche macchiato per proteine ​​Red1, un componente di elementi laterali assiali /. Il risultato mostra che l'anticorpo ZIP1 riconosce la regione di legame elemento laterale ZIP1, piuttosto che l'alfa elicoidale allungata coiled-coil dominio che si estende tra le regioni di legame dei laterali. Così, il pattern di colorazione osservata con questo anticorpo ZIP1 rivela i percorsi paralleli degli elementi laterali accoppiati. La distribuzione dei Red1 focolai lungo elementi laterali è relativamente scarsa rispetto agli ZIP1 focolai, ma il metodo doppia colorazione indica che Red1 focolai generalmente si trovano in prossimità dei percorsi lineari definiti da ZIP1 focolai. Questi risultati sono coerenti con il lavoro precedente in cui lo stesso metodo di diffusione è stato utilizzato per preparare i campioni per l'analisi al microscopio elettronico; la struttura tripartita del sinaptonemalico complex è conservato durante la procedura di diffusione. L'immagine illustrata nella figura 3 è stato generato da STED microscopio 9.

Figura 1
Figura 1: Esempi di nuclei spread nuclei meiotico colorate per DMC1 (verde), Rad51 (rosso), e il DNA (DAPI, blu).. Bar = 1 micron. (A) 2 esempi di nuclei sparsi ottimale. (B) Un esempio di un nucleo underspread. (C) Due esempi di nuclei si diffuse. L'esempio a sinistra è un nucleo in cui solo la parte superiore è overspread.

Figura 2
Figura 2: nuclei meiotic preparati senza uso di Lipsol Distribuire nuclei meiotiche dalle fasi indicate colorate per Rad51 (rosso),.ZIP1 (verde), e il DNA (DAPI, blu). Si noti che la compattazione cromosoma che si verifica come cellule transizione da Leptonema al pachynema è largamente conservata.

Figura 3
Figura 3: Visualizzazione del complesso sinaptonemico tramite microscopia STED Un nucleo pachitene colorate per ZIP1 (verde) e Rosso1 (rosso).. I dati sono stati elaborati utilizzando il plugin DeconvolutionLab ImageJ 10 per eseguire 100 iterazioni utilizzando il modello di Richardson-Lucy con un STED PSF misurato.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zymolyase US Biological  Z1004 Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use.
Lipsol  L.I.P. Ltd  no longer commercially available Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
NP-40 USB 19628 Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
Tween 20 Sigma P2287
Slides Corning 2948-75x25
Standard coverslip Fisher 12-544-E or 12-540-B
High resolution coverslips Fisher 12-542-B
Photo-Flo 200 solution Kodak P-7417 Prepare 0.2% (v/v) solution in water. 
TBS 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8
BSA Sigma A2153 Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month.
Primary antibody
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit Invitrogen A-21206
IgG (H+L) Antibody
Vectashield mounting media with DAPI Vector
Laboratories
H-1200
ProLong Gold Invitrogen P36930
Plastic slide box Fisher 03-448-1 Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber.
Cardboard slide box Fisher 12-587-10 Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C.
Coplin jar Fisher 08-816 Use as a wash basin for slides. 

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References

  1. Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast. Chromosoma. 100, (4), 221-228 (1991).
  2. Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast. Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).
  3. Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes. Nature. 383, (6603), 840-843 (1996).
  4. Bishop, D. K. RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis. Cell. 79, 1081-1092 (1994).
  5. Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I. Cell. 103, (7), 1155-1168 (2000).
  6. Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis. PNAS. 98, (15), 8411-8418 (2001).
  7. Biggins, S., Murray, A. W. The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint. Genes & Development. 15, (23), 3118-3129 (2001).
  8. Dresser, M. E., Giroux, C. N. Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast. The Journal of Cell Biology. (1988).
  9. Lao, J. P., Cloud, V., et al. Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation. PLOS Genetics. 9, (12), e1003978-e1003978 (2013).
  10. Vonesch, C., Unser, M. A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the. IEEE Signal Processing Society. 17, (4), 539-549 (2008).
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Grubb, J., Brown, M. S., Bishop, D. K. Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes. J. Vis. Exp. (102), e53081, doi:10.3791/53081 (2015).More

Grubb, J., Brown, M. S., Bishop, D. K. Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes. J. Vis. Exp. (102), e53081, doi:10.3791/53081 (2015).

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